CN109207360B - 一种数字pcr芯片及其使用方法以及基于该芯片的试剂分割系统 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种数字PCR芯片及其使用方法、以及基于该芯片的试剂分割系统。包括：基底层，其上表面刻蚀有指定数量的独立的微腔体；所述基底层由不可压缩的不透气且导热性好的材质制成；中间层，其下表面设置有流道，所述流道与所述微腔体相通；将所述流道与所述微腔体对准后，将所述中间层的底部与所述基底层的上表面键合；其中，所述中间层上还设置有与所述流道的两端口相通的试剂注入口；其中，所述中间层由可压缩的内部疏松多孔的透明材质制成；上层，设置于所述中间层的上表面；其中，所述上层由耐受高于95℃高温且透明的密封材质制成。由上，本申请在实现对PCR样品试剂的分割的基础上，又可以实现有效地防止高温液体的蒸发，且简单易操作。

Description

一种数字PCR芯片及其使用方法以及基于该芯片的试剂分割 系统

技术领域

本发明涉及生物化学与分子生物学技术应用领域，具体涉及一种数字PCR芯片及其使用方法以及基于该芯片的试剂分割系统。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是指DNA在体外95℃高温下变性分解成单链，低温(通常为55至65℃)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，同时，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5’-3’)的方向合成互补链。因此，通过重复此温度循环，即可以实现对目标DNA片段的指数式扩增。

PCR自上世纪80年代被提出来后，极大地推动了生命科学各个领域的发展。现在，PCR已经成为了分子生物学领域的一种关键技术和常规技术。第一代传统的PCR技术采用琼脂糖凝胶电泳的方法来对PCR产物进行分析，但这种方法只能获得半定量的结果。第二代PCR，即实时荧光定量PCR，通过在反应体系中加入荧光探针或染料，检测反应中发出的荧光信号达到阈值的循环数即循环阈值(cycle threshold，Ct)，来计算目标核酸序列的含量。因为实时荧光定量PCR依赖于Ct值和标准曲线，所以其定量依然是相对的。当目标DNA含量低或反应体系中含有大量背景序列或抑制物等情况下，实时荧光定量PCR的灵敏度和准确度都会受到很大的影响。

如今，PCR技术已经发展至第三代，即数字PCR。数字PCR是在有限稀释的条件下将反应体系均匀分配至大量的反应单元中，使得每个反应单元只存在不包含或至多包含一个目标DNA两种情况，然后对所有单元独立地进行扩增。扩增结束后，检测每个反应单元的荧光信号，并根据泊松分布和荧光信号阳性反应单元所占比例来计算目标DNA的拷贝数。因此，数字PCR真正意义上地实现了对目标DNA的绝对定量，其在分子生物学领域的发展趋势已经势不可挡。

数字PCR的关键在于两点，一是均匀地将样本分配至大量的反应单元；二是在升降温过程中保持反应单元内液体的稳定性。目前进行数字PCR的方法主要分为液滴式和芯片式，此二者各有自己独特的优势。对于芯片式而言，大多是采用聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)通过软光刻的方法制成反应腔室和流道，然后利用负压的方式进样，并采用油相分割液相的方式将样品分割并封闭在各个小腔室内，然后进行PCR。然而，因为PDMS是一种疏松多孔的材料，具有透气性，水分子可以透过PDMS扩散至外界。而在PCR过程中，DNA的变性温度为95℃，已经接近水的沸点，这就导致大量的水分子透过PDMS蒸发掉了，最终导致PCR失败。为了解决该技术问题，现有的技术采用了如下两种方法：1、在芯片上下面设置玻璃片；虽然玻璃片是不透气的，即水分子不会透过芯片的上下表面蒸发，但是芯片的四周是没有任何防护的。当温度升高时，芯片内的水就会通过PDMS的四周蒸发掉，导致PCR失败。2、在PDMS表面镀膜，一般都是镀一层派瑞林(Parylene)或者其他不透气且透明的薄膜。但是这种方法不仅增加了制造成本，而且防蒸发的效果并不好。此外，通过油相分割液相的方法还需要很好地密封住芯片的出口和入口，以防止高温高压下油水界面被破坏。因此，这种方式本身就具有一定的不稳定性，而且操作比较复杂。

因此，目前亟需一种数字PCR芯片及其使用方法，在实现对PCR样品试剂的分割的基础上，又可以实现有效地防止高温下液体的蒸发，且简单易操作。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供了一种数字PCR芯片及其使用方法以及基于该芯片的试剂分割系统，在实现对PCR样品试剂的分割的基础上，又可以实现有效地防止高温下液体的蒸发，且简单易操作。

本发明提供一种数字PCR芯片，包括：

基底层，其上表面刻蚀有指定数量的独立的微腔体；所述基底层由不可压缩的不透气且导热性好的材质制成；

中间层，其下表面设置有流道，所述流道与所述微腔体相通；将所述流道与所述微腔体对准后，将所述中间层的底部与所述基底层的上表面键合；其中，所述中间层上还设置有与所述流道的两端口相通的试剂注入口；其中，所述中间层由可压缩的内部疏松多孔的透明材质制成；

上层，设置于所述中间层的上表面；其中，所述上层由耐受高于DNA变性温度且透明的密封材质制成。

由上，本发明将微腔体设计在由不可压缩的不透气且导热性好的材质制成的基底层上，并将其和可压缩的内部疏松多孔的透明材质制成的中间层结合起来，通过向下压中间层，将其上的流道压塌以使其中的试剂挤出，以完成样品液体在各个微腔体的分割。因为基底为导热性能良好的材质，所以可以利用一温控装置通过基底传热来对微腔体内部的PCR液体进行升温和降温的控制。使用透明材质是为了有利于观察微腔体的进样情况和微腔体内PCR试剂荧光强度。与传统的油相分割液相的方式相比，这种方式的优点包括：1.不需要用油，节约了成本，且操作更加简便。2.这种分割方式不用担心芯片在高温高压下油水界面稳定性的问题，因此更加稳定。同时，本申请减小了微腔体内样品液体与中间层的接触面积，而基底层是不透气的，所以样品液体不会透过基底层向下或者向四周蒸发掉。因为上层为密封层，同时中间层受压后，其内部密度变大，使得液体透过中间层蒸发掉的几率降低。使得本发明所提出的芯片在高温情况下依然能保证样品液体很好地被限制在微腔体内部，而不受蒸发的影响。克服了传统的数字PCR芯片一般将微腔体设计在PDMS上，导致温度循环过程中，大量PCR液体中的水透过PDMS蒸发掉了的缺陷。

其中，基底层上表面刻蚀的微腔体的形状可以为方形、圆形或其他任意形状。

优选地，所述流道包括：

主流道和分支流道；

其中，所述主流道的两端与所述试剂注入口连接相通；

所述分支流道与所述微腔体连接相通；

其中，每一所述分支流道的全部或者部分与其相通的微腔体相接。

由上，如图2所示，流道包括主流道201和分支流道203，为本申请的一种芯片结构(流道设置方式为分为主流道和分支流道)。

优选地，所述流道为沿着所述微腔体的设置的多条流道，每条流道和与其所相通的微腔体采用流道覆盖每一所述微腔体方式设置；或者

所述流道为沿着所述微腔体的设置的多条流道，每条流道和与其所相通的微腔体采用流道部分覆盖每一所述微腔体方式设置。

由上，为另外两种芯片结构(流道设置方式不同)，如图3中的(c)所示，为沿着所述微腔体的设置的多条流道，每条流道和与其所相通的微腔体采用流道覆盖每一所述微腔体的方式设置；以及，如图3中的(a)和(b)所示，为沿着所述微腔体的设置的多条流道，每条流道和与其所相通的微腔体采用流道部分覆盖每一所述微腔体方式设置。

优选地，所述流道为覆盖全部所述微腔体的整个区域的一流道。

由上，如图3中的(d)所示，为本申请的另一种芯片结构。

本申请还提供一种基于上述的芯片PCR样品试剂分割系统，在基于上述芯片结构的基础上还包括：

进样装置，用于将试剂样品从所述试剂注入口注入；

一容器，用于将所述基底层、所述中间层及所述上层组成的芯片结构容纳于其中；

一排气装置，与所述容器连接，用于对所述容器抽真空；

一进气装置，与所述容器连接，用于在所述排气装置对所述容器抽真空一指定时间之后向所述容器内通气。

由上，在样品进样后，通过排气装置抽真空排气一指定时间后，由进气装置向真空容器内通气；可以使得PCR样品试剂在气体压力作用下流向处于负压状态的芯片内部的流道和微腔体并在中间层(例如PDMS)内部的负压的作用下进一步地向各个微腔体填充(在经过排气装置排气后，中间层内部的气体分子也被排出，排气后流道和微腔体中仍然还会存在一些空气，在通气时，流道和微腔体中残留的空气会被处于负压状态的中间层PDMS吸收，以使得PCR样品试剂能够更好的填充流道和微腔体)。该进样方式简单，不需要注射泵等设备即可完成芯片进样填充。

优选地，所述系统还包括：

压力施加装置，用于向所述芯片的上层施加由上至下的压力以使所述中间层被压缩形变，所述流道被压塌，所述流道内的试剂被挤压出，使得所述基底层上的各个微腔体相互独立。

由上，通过设置一压力施加装置，该装置可以自动实现对压力施加的大小及压力施加的时间的控制，从而可以更好地实现对中间层的压缩形变，使得所述基底层上的各个微腔体完全相互独立，以及使得压缩后的微腔体的具有良好的密封性。该压力施加装置可以是任意一可以对所述芯片结构施加压力使得中间层被压缩形变，所述流道被压塌，所述流道内的试剂被挤压出，所述基底层上的各个微腔体完全相互独立的压力施加装置。

优选地，所述上层与所述压力施加装置之间还设置一耐高温高压的透明板。

由上，此处设置透明板的作用是使芯片受力更加均匀。

综上所述，本发明将微腔体设计在由不可压缩的不透气材质制成的基底层上，并将其和可压缩材质制成的中间层结合起来，通过向下压中间层，将其上的流道压塌以使其中的试剂挤出，以完成样品液体在各个微腔体的分割。因为基底为导热性能良好的材质，所以可以利用一温控装置通过基底传热来对微腔体内部的PCR液体进行升温和降温的控制。与传统的油相分割方式相比，这种方式的优点包括：1.不需要用油，节约了成本，且操作更加简便。2.这种分割方式不用担心芯片在高温高压下油水界面稳定性的问题，因此更加稳定。同时，本申请减小了微腔体内样品液体与中间层的接触面积，而基底层是不透气的，所以样品液体不会透过基底层向下或者向四周蒸发掉。因为上层为密封层，同时中间层受压后，其内部密度变大，使得液体透过中间层蒸发掉的几率降低。使得本发明所提出的芯片在高温情况下依然能保证样品液体很好地被限制在微腔体内部，而不受蒸发的影响。克服了传统的数字PCR芯片一般将微腔体设计在PDMS上，导致温度循环过程中，大量PCR液体中的水透过PDMS蒸发掉了的缺陷。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1a为本发明实施例的数字PCR芯片在抽真空状态下的主视剖视图(此处也可以理解为实施例二中的试剂分割系统的示意图)；图1b为图1a的A-A处的侧视剖视图；

图1c为本申请实施例的数字PCR芯片在通气状态下的主视剖视图(此处也可以理解为实施例二中的试剂分割系统的示意图)；图1d为图1c的B-B处的侧视剖视图；

图1e为本申请实施例的数字PCR芯片在被按压状态下的主视剖视图(此处也可以理解为实施例二中的试剂分割系统的示意图)；图1f为图1e的C-C处的侧视剖视图；

图2a为本申请实施例的数字PCR芯片的基底层(其上刻蚀有指定数量的微腔体)的俯视图，图2b为图2a的A-A处的侧视剖面图；

图2c为本申请实施例的数字PCR芯片的中间层(其上设置有流道)的仰视图，图2d为图2c的B-B处的侧视剖面图；

图2e为本申请实施例的数字PCR芯片的整体结构(上层、中间层、基底层)的俯视透视图，图2f为图2e的C-C处的侧视剖面图；

图3a为本申请实施例的一数字PCR芯片的中间层和基底层结合的的俯视透视图(左图)以及左图A-A处的侧视剖视图；

图3b为本申请实施例的一数字PCR芯片的中间层和基底层结合的的俯视透视图(左图)以及左图B-B处的侧视剖视图；

图3c为本申请实施例的一数字PCR芯片的中间层和基底层结合的的俯视透视图(左图)以及左图C-C处的侧视剖视图；

图3d为本申请实施例的一数字PCR芯片的中间层和基底层结合的的俯视透视图(左图)以及左图D-D处的侧视剖视图；

图4为本申请实施例的数字PCR芯片结构的爆炸视图；

图5为本申请实施例的一种数字PCR芯片的使用方法。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的区间。

实施例一

如图1-4所示，本发明提供一种数字PCR芯片，包括：

基底层100，其上表面刻蚀有一指定数量的独立的微腔体101；所述基底层由不可压缩的不透气且导热性好的材质制成；例如，所述基底层可以是由硅片或玻璃制成。其中，基底层100上表面刻蚀的微腔体101的形状可以使为方形、圆形或其他任意形状。

中间层200，其下表面设置有流道201，所述流道201与所述微腔体101相通；将所述流道201与所述微腔体101对准后，将所述中间层200的底部与所述基底层100的上表面键合；其中，所述中间层200上还设置有与所述流道的两端口相通的试剂注入口；其中，所述中间层为可压缩的的内部疏松多孔的透明材质制成；例如，所述中间层可以是由聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)材质制成。

上层300，设置于所述中间层200的上表面；其中，所述上层为耐高温且透明的密封材质制成。例如，所述密封层可以是由具有耐高温(不低于DNA变性温度95摄氏度)且透明(有利于观察微腔体的进样情况和微腔体内PCR试剂荧光强度)的特性的玻璃或者耐高温透明胶带制成。

其中，如图2中的(c)所示，所述流道包括：

主流道201和分支流道203；

其中，所述主流道201的两端与所述试剂注入口202连接相通；

所述分支流道203与所述微腔体101连接相通；

其中，每一所述分支流道的全部或者部分和与其相通的微腔体相接。

另外，还存在如下几种芯片结构(流道设置方式不同)：

如图3中的(a)和(b)所示，所述流道为沿着所述微腔体的设置的多条流道，每条流道和与其所相通的微腔体采用流道部分覆盖每一所述微腔体的方式设置。

如图3中的(c)所示，所述流道为沿着所述微腔体的设置的多条流道，每条流道和与其所相通的微腔体采用流道覆盖每一所述微腔体的方式设置；或者

如图3中的(d)所示，所述流道为覆盖全部所述微腔体的整个区域的一流道。

综上所述，本发明将微腔体设计在由不可压缩的不透气且导热性好的材质制成的基底层上，并将其和可压缩材质制成的中间层结合起来，通过向下压中间层(下压的力量的来源可以是任意可将中间层的流道压塌的力量)，将其流道被压塌以使其中的试剂挤出，以完成样品液体在各个微腔体的分割和密封。因为基底为导热性能良好的材质，所以可以利用一温控装置通过基底传热来对微腔体内部的PCR液体进行升温和降温的控制。与传统的油相分割方式相比，这种方式的优点包括：1.不需要用油，节约了成本，且操作更加简便。2.这种分割方式不用担心芯片在高温高压下油水界面稳定性的问题，因此更加稳定。同时，本申请减小了微腔体内样品液体与中间层的接触面积，而基底层是不透气的，所以样品液体不会透过基底层向下或者向四周蒸发掉。上层为密封层，同时中间层受压后，其内部密度变大，使得液体透过中间层蒸发掉的几率降低。使得本发明所提出的芯片在高温情况下依然能保证样品液体很好地被限制在微腔体内部，而不受蒸发的影响。克服了传统的数字PCR芯片一般将微腔体设计在PDMS上，导致温度循环过程中，大量PCR液体中的水透过PDMS蒸发掉了的缺陷。

实施例二

如图1所示，本申请还提供一种基于实施例一的芯片的PCR样品试剂分割系统，在基于实施例一芯片结构的基础上，还包括：

进样装置，用于将试剂样品从所述试剂注入口注入；

一容器400，用于将所述基底层、所述中间层及所述上层组成的芯片结构容纳于其中；

一排气装置，与所述容器400连接，用于对所述容器400抽真空；

一进气装置，与所述容器400连接，用于在所述排气装置对所述容器抽真空一指定时间之后向所述容器内通气。

由上，在样品进样后，通过排气装置抽真空排气一指定时间后，由进气装置向真空容器内通气；可以使得PCR样品试剂在气体压力作用下流向处于负压状态的芯片内部的流道和微腔体并在中间层(例如PDMS)内部负压的作用下进一步地向各个微腔体填充。该进样方式简单，不需要注射泵等设备即可完成芯片进样填充。

其中，所述系统还包括：

压力施加装置，用于向所述芯片的上层施加由上至下的压力以使所述中间层被压缩形变，所述流道被压塌，所述流道内的试剂被挤压出，使得所述基底层上的各个微腔体相互独立。

通过设置该压力施加装置，该装置可以自动实现对压力施加的大小及压力施加的时间的控制，从而可以更好地实现对中间层的压缩形变，使得所述基底层上的各个微腔体完全相互独立，以及使得压缩后的微腔体的具有良好的密封性。该压力施加装置可以是任意一可以对所述芯片结构施加压力使得中间层被压缩形变，所述流道被压塌，所述流道内的试剂被挤压出，所述基底层上的各个微腔体完全相互独立的压力施加装置。

其中，所述上层与所述压力施加装置之间还设置一耐高温高压的透明板。此处设置透明板的作用是使得受力更加均匀。

实施例三

如图5所示，基于实施例一中的数字PCR芯片，本申请还提供一种数字PCR芯片的使用方法(也可以理解为是实施例二提供的基于实施例一的芯片的PCR样品试剂分割系统的使用方法)，包括以下步骤：

S501，将PCR样品试剂注入数字PCR芯片的试剂注入口中。

S502，将芯片结构整体放置在一真空容器中抽真空排气。

其中，所述芯片结构包括：其上刻蚀有一指定数量的独立的微腔体的基底层；与所述基底层键合的中间层，该中间层的底部设置有与所述微腔体相通的流道；其中，所述流道的两端部分别与试剂注入口相通；其中，所述中间层为可压缩的内部疏松多孔的透明材质制成；上层，设置于所述中间层的上表面；其中，所述上层为耐高温且透明的密封材质制成；

S503，抽真空排气一指定时间后，向真空容器内通气；以使得PCR样品试剂在气体压力作用下流向处于负压状态的芯片内部的流道和微腔体并在中间层(例如PDMS)内部负压的作用下进一步地向各个微腔体填充。

S504，通气一指定时间至所有微腔体都填充完成后，将所述芯片结构从所述真空容器内取出。

S505，将一耐高温高压的透明板置于所述芯片结构上层表面，并通过一压力施加装置施加至所述透明板一从上至下的压力，以使得所述中间层被压缩，所述流道被压塌，使得硅片上的各个微腔体完全相互独立，以完成对PCR样品试剂的分割和密封。

S506、使用密封装置(例如密封胶带)密封所述试剂注入口。

上述方法中，本申请通过按压的方式将流道内的试剂挤出，且中间层被压缩后密度变大，不易使得液体透过其挥发，并且本申请的基底层为不透气材料、上层为密封层以及使用密封胶带密封试剂注入口，由此，实现了在对PCR样品试剂的简单易操作分割的基础上，又可以实现有效地防止高温液体的蒸发。上述步骤S501-S503，在样品进样后，通过排气装置抽真空排气一指定时间后，由进气装置向真空容器内通气；可以使得PCR样品试剂在气体压力作用下流向处于负压状态的芯片内部的流道和微腔体并在中间层(例如PDMS)内部的负压的作用下进一步地向各个微腔体填充(在经过排气装置排气后，中间层内部的气体分子也被排出，排气后流道和微腔体中仍然还会存在一些空气，在通气时，流道和微腔体中残留的空气会被处于负压状态的中间层PDMS吸收，以使得PCR样品试剂能够更好的填充流道和微腔体)。该进样方式简单，不需要注射泵等设备即可完成芯片进样填充。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种数字PCR芯片，其特征在于，包括：

基底层，其上表面刻蚀有指定数量的独立的微腔体；所述基底层由不可压缩的不透气且导热性好的材质制成；

中间层，其下表面设置有流道，所述流道与所述微腔体相通；将所述流道与所述微腔体对准后，将所述中间层的底部与所述基底层的上表面键合；其中，所述中间层上还设置有与所述流道的两端口相通的试剂注入口；其中，所述中间层由可压缩的内部疏松多孔的透明材质制成；

上层，设置于所述中间层的上表面；其中，所述上层由耐受高于DNA变性温度且透明的密封材质制成；

其中，在样品进样后，数字PCR芯片放置在一真空容器中通过排气装置抽真空排气一指定时间后，向真空容器内通气；以使得PCR样品试剂在气体压力作用下流向处于负压状态的数字PCR芯片内部的流道和微腔体，并在中间层内部的负压的作用下进一步地向各个微腔体填充；

向所述数字PCR芯片的上层施加由上至下的压力以使所述中间层被压缩形变，所述流道被压塌，所述流道内的试剂被挤压出，使得所述基底层上的各个微腔体相互独立，其中，所述中间层被压缩后密度变大，不易使得液体透过其挥发。

2.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述流道包括：

主流道和分支流道；

其中，所述主流道的两端与所述试剂注入口连接相通；

所述分支流道与所述微腔体连接相通；

其中，每一所述分支流道的全部或者部分和与其相通的微腔体相接。

3.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述流道为沿着所述微腔体的设置的多条流道，每条流道和与其所相通的微腔体采用流道覆盖每一所述微腔体的方式设置；或者

所述流道为沿着所述微腔体的设置的多条流道，每条流道和与其所相通的微腔体采用流道部分覆盖每一所述微腔体方式设置。

4.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述流道为覆盖全部所述微腔体的整个区域的一流道。

5.一种PCR样品试剂分割系统，其特征在于，包括：

权利要求1-4任一项所述的数字PCR芯片；

进样装置，用于将试剂样品从所述试剂注入口注入；

一容器，用于将所述基底层、所述中间层及所述上层组成的所述数字PCR芯片容纳于其中；

一排气装置，与所述容器连接，用于对所述容器抽真空；

一进气装置，与所述容器连接，用于在所述排气装置对所述容器抽真空一指定时间之后向所述容器内通气。

6.根据权利要求5所述的PCR样品试剂分割系统，其特征在于，还包括：

压力施加装置，用于向所述数字PCR芯片的上层施加由上至下的压力以使所述中间层被压缩形变，所述流道被压塌，所述流道内的试剂被挤压出，使得所述基底层上的各个微腔体相互独立。

7.根据权利要求6所述的PCR样品试剂分割系统，其特征在于，所述上层与所述压力施加装置之间还设置一耐高温高压的透明板。

8.一种数字PCR芯片的使用方法，基于权利要求5-7任一项所述的PCR样品试剂分割系统，其特征在于，包括以下步骤：

A、将PCR样品试剂注入数字PCR芯片的试剂注入口中；

B、将数字PCR芯片放置在一容器中抽真空排气；

C、抽真空排气一指定时间后，向所述容器内通气；以使得PCR样品试剂在气体压力作用下流向处于负压状态的数字PCR芯片内部的流道和微腔体，并在中间层内部的负压的作用下进一步地向各个微腔体填充；

D、通气一指定时间至所有微腔体都填充完成后，将所述数字PCR芯片从所述容器内取出；

E、将一耐高温高压的透明板置于所述数字PCR芯片上层表面，并通过一压力施加装置施加至所述透明板一从上至下的压力，以使得所述中间层被压缩，所述流道被压塌，使得所述基底层上的各个微腔体完全相互独立，以完成对PCR样品试剂的分割和密封。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤E之后，还包括：

F、使用密封装置密封所述试剂注入口。