CN107603866B

CN107603866B - 检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN107603866B
Application number: CN201710879415.4A
Authority: CN
Inventors: 许行尚; 杰弗瑞·陈; 于沛; 朱滔; 张蓉蓉
Original assignee: Nanjing Lanyu Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Lanyu Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-08-07
Filing date: 2017-09-26
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2037-09-26
Also published as: CN107603866A

Abstract

本发明提供一种检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒及其使用方法，该试剂盒采用Taqman探针荧光PCR技术与微流控芯片相结合，针对10种常见的呼吸道感染病原体进行检测，能够在2小时内获得检测结果，特异性强，灵敏度可达100copies/μL；包括进样腔室、反应腔室以及微流控流道；反应腔室至少包括有10个，各个反应腔室相互独立，均预置有用于扩增一种呼吸道病原体的试剂干粉，该试剂干粉包括用于扩增相应呼吸道病原体的引物、TaqMan探针；预置于各个反应腔室中的试剂干粉能够分别扩增10种呼吸道病原体中的任意一种，所有反应腔室中的试剂干粉扩增出的呼吸道病原体能够囊括10种呼吸道病原体。

Description

检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片检测用试剂盒及其使用方法。

背景技术

呼吸道感染是世界范围内最常见的疾病之一，发病率在各国居民发病率总体结构中占主要地位，每年流行高峰期约有10％的居民患有呼吸道感染。呼吸道感染会导致鼻炎、流涕、鼻塞、咳嗽、轻度咽炎、全身发热等症状，严重的会导致呼吸困难甚至死亡。急性呼吸道感染已经成为国内外儿童重要感染性疾病之一，其发病率已居儿童各类疾病的首位。引起儿童呼吸道感染的病原体主要有病毒、细菌、支原体和衣原体等，快速和准确的诊断以及适当的治疗，是减少儿童住院和不必要的抗菌药物使用的重要前提。因此，呼吸道病原体的快速检测，对临床早期诊断有着非常重要的意义。

微流控芯片(microfluidics)或称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备，生物与化学反应，分离、检测等基本操作单元或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。这种技术原则上适用于从核酸、蛋白质直到有机、无机小分子的各种不同类型分子的反应、分离和检测。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点,它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析,并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程。

目前市场上针对呼吸道感染病原体的检测方法主要有荧光PCR法、免疫法和细菌培养法。荧光PCR法是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时监测，定性或定量检测目的基因；免疫法是通过抗原抗体发生特异性结合来检测目的蛋白；细菌培养法是把病原体细菌在特定培养基上进行培养，再对产生的细菌菌落进行观察检测。

普通荧光PCR检测试剂虽然具有较好的灵敏度和特异性，但是多是针对单项或几项病原体，想要检测多种病原体就要采用多套不同的检测试剂盒搭配，操作不便且成本较高；而免疫法检测试剂虽然可以同时检测多项病原体，但是由于免疫法检测的是样本中病原体引起机体产生的特异性抗体，因此存在一个较长的空窗期，并且灵敏度相对较低；而对于细菌类病原体的检测，采用细菌培养法虽然准确率高，但是耗时较长，培养效果差，很多细菌无法培养，延误了最佳治疗时机。

发明内容

本发明针对10种常见的呼吸道感染病原体，包括肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、鼻病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、合胞病毒、副流感病毒等，提供一种用于微流控芯片检测的试剂盒及其使用方法，以实现同时快速检测10种呼吸道感染病原体的检测需求。

为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒，包括试剂盒本体，该试剂盒本体包括进样腔室、反应腔室以及实现进样腔室、反应腔室连通的微流控流道；

所述反应腔室至少包括有10个，各个反应腔室相互独立，且各反应腔室中均预置有用于扩增一种呼吸道病原体的试剂干粉，该试剂干粉包括用于扩增相应呼吸道病原体的引物、TaqMan探针；

预置于各个反应腔室中的试剂干粉能够分别扩增如下的10种呼吸道病原体中的任意一种，同时，所有反应腔室中的试剂干粉扩增出的呼吸道病原体能够囊括如下10种呼吸道病原体：

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)、鼻病毒(Human Rhino virus)、呼吸道腺病毒(Adenovirus)、甲型流感病毒(Influenza A virus)、乙型流感病毒(Influenza B virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)和副流感病毒(human parainfluenza virus)；

进样腔室设置于试剂盒本体的中部位置处，且进样腔室具有进样孔、出样口、进气孔、排气孔；

微流控流道包括进样主流道、进样分流道、排气主流道、排气分流道以及溢流通道，其中：进样分流道、排气分流道以及溢流通道的数目与反应腔室的数目一致；

进样腔室的出样口与进样主流道的一端连通，而进样主流道的另一端设置有数目与反应腔室数目一致的样本分流出口，进样主流道的各样本分流出口均通过一条进样分流道与相应的反应腔室的进样口一一连通；各进样分流道上均安装有加样单向阀；

进样腔室的进气孔与排气主流道的一端连通，排气主流道的另一端设置有数目与反应腔室数目一致的排气汇聚口，排气主流道的各排气汇聚口均依次通过排气分流道、排气单向阀、透气阻水滤芯、溢流通道与相应的反应腔室的进气孔一一连通。

作为本发明的进一步改进，所述引物的序列为：肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)，SEQ ID NO.1-2；肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)，SEQ ID NO.4-5；嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)，SEQ ID NO.7-8；百日咳杆菌(Bordetellapertussis)，SEQ ID NO.10-11；鼻病毒(Human Rhino virus)，SEQ ID NO.13-14；呼吸道腺病毒(Adenovirus)，SEQ ID NO.16-17；甲型流感病毒(Influenza Avirus)，SEQ ID NO.19-20；乙型流感病毒(Influenza B virus)，SEQ ID NO.22-23；呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytial virus)，SEQ ID NO.25-26；副流感病毒(human parainfluenza virus)，SEQ IDNO.28-29；

所述TaqMan探针的序列为：肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)，SEQ ID NO.3；肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)，SEQ ID NO.6；嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)，SEQ ID NO.9；百日咳杆菌(Bordetella pertussis)，SEQ ID NO.12；鼻病毒(Human Rhino virus)，SEQ ID NO.15；呼吸道腺病毒(Adenovirus)，SEQ ID NO.18；甲型流感病毒(Influenza Avirus)，SEQ ID NO.21；乙型流感病毒(Influenza B virus)，SEQ IDNO.24；呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)，SEQ ID NO.27；副流感病毒(human parainfluenza virus)，SEQ ID NO.30。

作为本发明的进一步改进，所述引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nM；所述TaqMan探针在扩增体系中的终浓度为50-500nM。

作为本发明的进一步改进，所述进样腔室中预置有RT-PCR buffer、混合酶液和阳性质控品。

作为本发明的进一步改进，所述RT-PCR buffer包括PCR缓冲液、dATP、dUTP、dCTP、dGTP和MgCl₂。

作为本发明的进一步改进，所述混合酶液包括HotStart Taq酶、逆转录酶和UNG酶。

作为本发明的进一步改进，所述阳性质控品中含有对应上述10项呼吸道病原体扩增基因序列的质粒。

作为本发明的进一步改进，所述试剂盒本体为三片式结构，包括从上到下依次密封键合的上层膜片、中层膜片和底层膜片；其中：

进样腔室包括进样槽，且进样腔室的进样孔、排气孔均为贯穿上层膜片、中层膜片后与反应槽连通的通孔；反应腔室包括反应槽；

加样主流道、排气主流道分别与进样槽连通，且进样槽、加样主流道、排气主流道均设置于底层膜片，同时加样主流道、排气主流道皆为T形流道，分设在进样槽的两侧；

T形流道包括横直段流道和竖直段流道，横直段流道设置于底层膜片的中部位置处，并与进样槽连通，而竖直段流道则沿着底层膜片的侧边布置；

加样主流道的各样本分流出口设置于加样主流道的竖直段流道，排气主流道的各排气汇聚口设置于排气主流道的竖直段流道；

所述反应槽，设置于底层膜片，并位于加样主流道的竖直段流道内侧，同时各反应槽对称分布在加样主流道的横直段流道两侧；

所述进样分流道、排气分流道以及溢流通道，分别设置于中层芯片，其中：

每条进样分流道的出口均通过相应的加样导向孔与对应的反应槽连通；

每条溢流通道的进口均通过相应的溢流导向进液孔与对应的反应槽连通，而溢流通道的出口则分别通过相应的溢流导向出液孔与对应排气单向阀的进液口连通；

每个排气单向阀的出口均通过相应的排气导向孔与排气分流道的入口相连接，每个排气分流道的出口与对应透气阻水滤芯的入口相连通，每个透气阻水滤芯的出口均与排气主流道对应的排气汇聚口相连通；

所述排气单向阀，设置于底层膜片，并位于排气主流道的竖直段流道内侧，同时各排气单向阀对称分布在排气主流道的横直段流道两侧；

所述加样单向阀，设置于中层芯片，且各加样单向阀在中层芯片上的位置与加样主流道的各样本分流出口的位置一一对应设置；

所述的加样导向孔、溢流导向进液孔、溢流导向出液孔、排气导向孔分别竖向贯穿地开设于中层芯片；

所述透气阻水滤芯，设置于中层芯片，且各透气阻水滤芯在中层芯片上的位置与排气主流道的各排气汇聚口的位置一一对应设置。

作为本发明的进一步改进，所述的排气单向阀包括膜片，膜片的一端压设在中层膜片和底层膜片之间，另一端悬置，且底层膜片在膜片悬置端对应的位置处设置有膜片嵌槽；所述膜片悬置端与排气导向孔正对，且膜片悬置端的外边缘尺寸大于排气导向孔的孔径、小于膜片嵌槽的内缘尺寸，同时膜片悬置端的外边缘与膜片嵌槽的内壁之间存在仅容许气体穿行的缝隙。

本发明的另一技术目的是提供一种上述的检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将样品DNA/RNA共提取模板用无RNase水稀释；

(2)将稀释后的样品DNA/RNA共提取模板，通过加样腔室的加样孔进样，使得样品DNA/RNA共提取模板与预置于加样腔室中的混合酶液、RT-PCR buffer混合后，依次通过加样主流道、加样单向阀、进样分流道后，同时向各反应腔室进样，直至流入各反应腔室的样品充满溢流通道后，停止加样；此时，试剂盒本体在排气单向阀、加样单向阀的共同作用下，使得反应腔室整体处于液体截流状态，同时反应腔室仅在输出后端处于气体通行的状态；

(3)处于反应腔室中的样品，与预置于反应腔室中的试剂干粉，进行PCR扩增反应；

PCR扩增反应的条件为：50℃逆转录15-30min；92-97℃预变性1-10min；92-97℃变性10-15s；58-62℃退火35-50s；40-45个循环。

有益效果：

本发明提供一种微流控芯片试剂盒，其具有10个以上的反应腔室，通过设计特殊的微流控流道以及在微流控流道上安装加样单向阀、排气单向阀，使得各个反应腔室在加样时，能够通过一个加样腔室同时向多个反应腔室加样；加样结束后，通过加样单向阀、排气单向阀的控制，使得各反应腔室进行PCR扩增反应时能够相互独立，相互间不污染，不干扰，检测结束后也没有扩增产物外漏；另外，在各个反应腔室中分别预置常见10种呼吸道病原体PCR扩增试剂干粉中的一种，因此，使用本发明所述微流控芯片试剂盒，可以一次就能够检测出从加样腔室中加入的样本是否具有前述10种呼吸道病原体，快速，方便；

本发明的试剂盒采用Taqman探针荧光PCR技术与微流控芯片相结合，针对10种常见的呼吸道感染病原体进行检测，能够在2小时内获得检测结果，特异性强，灵敏度可达100copies/μL。

本发明采用了UNG酶/dUTP防污染体系，能减少前次PCR反应产物带来的污染干扰。

本发明将逆转录酶与HotStart Taq酶混合使用，先进行逆转录过程合成出cDNA，再进行PCR扩增，没有添加随机引物，过程全由仪器完成，既能减少实验操作步骤，节省时间，同时还避免了可能带来的样本污染。

本发明所使用的探针为5’端FAM标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核昔酸。在探针完整时，即随机状态和无PCR产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在荧光PCR扩增过程中，当特异的PCR产物与TaqMan探针发生杂交反应时HotStart Taq酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板RNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。

综上所述，本发明与普通荧光PCR法、免疫法和细菌培养法等相比，具有以下优势：

1.特异性强：本发明的引物探针针对10种常见呼吸道感染病原体的特异性保守区域序列设计，特异性强。

2.敏感性高：本发明能检测到100copies/μL浓度的目的基因序列。

3.通量高：本发明能够同时检测10种常见呼吸道感染病原体。

4.检测过程为闭管反应，并将逆转录过程和PCR扩增过程结合，减少实验步骤，并大大降低了污染及结果偏差的可能性。

5.操作简单快速，从标本送检到得出结果可在3个小时以内完成。

6.结果判读明确、客观；若需要亦可对结果进行定量分析。

7.安全：整个体系中不包含有毒有害物质，无需PCR产物的后处理，对操作员和环境都无危害。

说明书附图

图1显示了本发明一种用于核酸扩增检测的微流控芯片的整体结构示意图。

图2显示了底层膜片的结构示意图。

图3显示了中层膜片的结构示意图。

图4显示了上层膜片的结构示意图。

图5显示了排气单向阀在底层膜片上的安装示意图。

图6显示了排气单向阀的结构示意图。

图7显示了膜片的结构示意图。

其中有：

10.上层膜片；

11.加样孔一；12.排气孔一；13.进样分流道；14.溢流流道；15.排气分流道；

20.中层膜片；

21.加样孔二；22.排气孔二；23.加样单向阀；24.加样导向孔；25.溢流导向孔一；26.溢流导向孔二；27.排气导向孔；28.透气阻水滤芯；

30.底层膜片；

31.加样主流道一；32.加样主流道二；33.反应腔；34.排气主流道一；35.排气主流道二；36.排气单向阀；

40.膜片；41.膜片连接端；42.膜片悬置端；43.膜片悬置端间隙；44.膜片嵌槽。

具体实施方式

如图1所示，本发明所述的检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒，试剂盒本体，该试剂盒本体包括进样腔室、反应腔室以及实现进样腔室、反应腔室连通的微流控流道；所述反应腔室至少包括有10个，各个反应腔室相互独立，且各反应腔室中均预置有用于扩增一种呼吸道病原体的试剂干粉，该试剂干粉包括用于扩增相应呼吸道病原体的引物、TaqMan探针；

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)、鼻病毒(Human Rhino virus)、呼吸道腺病毒(Adenovirus)、甲型流感病毒(Influenza Avirus)、乙型流感病毒(Influenza B virus)、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytial virus)和副流感病毒(human parainfluenza virus)；

本发明实施例公开的试剂盒本体为三片式结构，包括三层膜片，三层膜片之间均采用密封键合；优选为热键合或超声键合等密封形成一个整体，以满足核酸扩增及检测的需要。

三层膜片均优选为透明硬质材料，透明硬质材料优选为高分子聚合物、石英玻璃和硅片等中的一种。

三层膜片从上至下依次为上层膜片10、中层膜片20和底层膜片30。

以下详细地介绍每一层膜片的具体结构。

如图2所示，底层膜片30上设置有进样槽、加样主流道、排气主流道、若干个反应槽33和与反应槽数量相等的排气单向阀36；其中：进样腔室包括进样槽，进样腔室的进样孔、排气孔均为贯穿上层膜片、中层膜片后与反应槽连通的通孔；反应腔室包括反应槽；

加样主流道、排气主流道分别与进样槽连通，加样主流道为加样主流道一31、加样主流道二32构成的T形流道，排气主流道为排气主流道一34、排气主流道二35构成的T形流道；加样主流道一31、排气主流道一34为T形流道的横直段流道，而加样主流道二32、排气主流道二35为T形流道的竖直段流道。

加样主流道二沿底层膜片的一个长度边布设，也即加样主流道二与底层膜片的长度边相平行。

加样主流道一设置在底层膜片的中部，加样主流道一与加样主流道二相垂直，加样主流道一的出口与与加样主流道二相连通。

若干个反应槽并列设置在加样主流道一的两侧，若干个反应槽优选相互平行，且位于同一根直线，若干个反应槽所在直线与加样主流道二相平行。

排气主流道一沿底层膜片的另一个长度边布设，也即排气主流道一与底层膜片的长度边相平行。

本发明中，加样主流道一和排气主流道二优选同轴设置。

排气主流道二也设置在底层膜片的中部，排气主流道二与排气主流道一相垂直，排气主流道二的入口与排气主流道一相连通。

排气单向阀并列设置在排气主流道二的两侧，每个排气单向阀对应一个反应槽，反应槽优选与对应的排气单向阀同轴设置。

排气单向阀能够阻水但能使气体通过，如图5、图6和图7所示，排气单向阀包括膜片，膜片的一端压设在中层膜片和底层膜片之间，另一端悬置，且底层膜片在膜片悬置端对应的位置处设置有膜片嵌槽；所述膜片悬置端与排气导向孔正对，且膜片悬置端的外边缘尺寸大于排气导向孔的孔径、小于膜片嵌槽的内缘尺寸，同时膜片悬置端的外边缘与膜片嵌槽的内壁之间存在仅容许气体穿行的缝隙。

为了安装方便，本发明所述排气单向阀的各膜片集成一体，具体是膜片压设在中层膜片和底层膜片的那一端集成一体，以形成膜片连接端41，膜片悬置端42等距地间隔设置于膜片连接端41，相邻的两个膜片悬置端42之间存在膜片悬置端间隙43，每个膜片悬置端间隙43仅能允许气体通过，液体水分子不能通过。

膜片优选采用弹性膜材料制成，膜片悬置端的截面优选为矩形。

当液体水分子从排气分流道通过排气导向孔，进入排气单向阀的入口时，膜片悬置端会被液体水分子的压力打开，使液体水分子正常通过。当气体从排气分流道或排气单向阀的入口通过时，会由膜片悬置端间隙通过，双向均可正常通过。当液体水分子从溢流导向孔流入排气单向阀的入口，并向排气分流道行进时，会把膜片悬置端向上顶起，堵住排气导向孔，封闭流道，阻止液体水分子通行。

如图4所示，上层膜片10上设置有加样孔一11、排气孔一12、若干个并列设置的进样分流道13、若干个并列设置的溢流流道14和若干个并列设置的排气分流道15。

如图3所示，中层膜片包括加样孔二21、排气孔二22、加样单向阀23、加样导向孔24、溢流导向孔一25、溢流导向孔二26、排气导向孔27和透气阻水滤芯28。

进样腔室的进样孔由加样孔一11、加样孔二21构成；

进样腔室的排气孔由排气孔一12、排气孔二22构成；

溢流导向孔一25为溢流通道的溢流导向进液孔；

溢流导向孔二26为溢流通道的溢流导向出液孔；

上述进样分流道、溢流流道、排气分流道、加样单向阀、加样导向孔、溢流导向孔一、溢流导向孔二、排气导向孔和透气阻水滤芯的数量均与反应槽的数量相等，并均与反应槽相对应。也即每个反应槽所在的纵向平面上，均包括进样分流道、溢流流道、排气分流道、加样单向阀、加样导向孔、溢流导向孔一、溢流导向孔二、排气导向孔和透气阻水滤芯各一个。

加样孔一和加样孔二竖向贯通，加样孔二底部与加样主流道一相连通。

加样孔一和加样孔二内优选设有弹性材料的塞子，从而防止加样漏液。

每个加样单向阀的底部进口端均与加样主流道二相连通，每个加样单向阀的顶部出口端均与对应的进样分流道的入口相连通。

上述加样单向阀结构主要由弹性材料构成，如硅胶、橡胶等，加样单向阀的设置，能使各个进样分流道间的阻力达到平衡，起到将加样孔试样均匀分配至各个进样分流道的作用。

每个进样分流道的出口均与加样导向孔的顶端相连接，每个加样导向孔的底端均指向对应的反应槽。

每个溢流导向孔一的底端指向对应的反应槽，每个溢流导向孔一的顶端与对应溢流通道的入口相连通。

每个溢流导向孔二的顶端与对应溢流通道的出口相连接，每个溢流导向孔二的底端均与对应排气单向阀的入口相连通。

每个排气单向阀的出口均通过对应的排气导向孔与排气分流道的入口相连接，每个排气分流道的出口与对应透气阻水滤芯的入口相连通，每个透气阻水滤芯的出口均与排气主流道一相连通。

换句话说，本发明所述的微流控芯片试剂盒中，每条进样分流道的出口均通过相应的加样导向孔与对应的反应槽连通；

透气阻水滤芯材质优选为三维孔状结构的特殊材质，如玻璃纤维、聚乙烯等，进一步优选为Biocomma型号F10-14-16的20um滤芯。

排气主流道二的出口与排气孔二底部相连通，排气孔二与排气孔一竖向贯通。

进一步，进样分流道和溢流流道均为热熔结构流道。热熔结构流道的设置，是芯片多个反应腔密闭的主要结构，替代多而复杂的阀门结构，为多反应结构芯片提供了快捷的密闭方式。

试验时，将提取好的核酸样品由加样孔一进入芯片，流经底层膜片上的加样主流道一和加样主流道二，通过加样单向阀，经过进样分流道进入反应腔，芯片内气体由排气单向阀、透气阻水滤芯通过排气孔排出。

不同的反应腔内可以预先固定有用于检测不同靶基因的引物、荧光探针、酶等试剂干粉，核酸进入反应腔后与试剂混合，形成反应液可以进行PCR扩增反应。

待所有反应腔充满液体，多余的液体会在排气单向阀位置被堵住，无法继续流动，然后通过仪器对位于上层膜片上的进样分流道和溢流流道等用热封刀片熔化阻断，使所有反应腔与其他部分完全隔绝，之后开始在不同温度的加热模块之间，如95℃和60℃，按照反应程序移动芯片，进行PCR扩增反应。扩增完成后，对反应腔内的反应液进行荧光定量或定性分析，确定检测结果。

以下通过实施例较为详细地说明本发明所述微流控芯片试剂盒的使用方法。

所述引物和探针通过干燥方法如低温烘干、真空抽干、冷冻干燥等方法制作成干粉，并分别固定于各个反应孔内。

进一步地，所述干粉制作时需要特定的试剂溶解引物探针，试剂内包含有甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、吐温-20等成分。

进一步地，所述固定方法可以采用加热熔化石蜡成液体，滴加或喷涂到引物探针干粉表面，冷却后凝固，保证干粉固定在反应孔内。

实施例1

检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片检测用试剂盒，该试剂盒由引物探针混合液、RT-PCR buffer、混合酶液、阳性质控品和无RNase水组成；RT-PCR buffer包括PCR缓冲液、dATP、dUTP、dCTP、dGTP和MgCl₂；混合酶液包括HotStart Taq酶、逆转录酶和UNG酶；阳性质控品中含有对应上述10项呼吸道病原体的扩增基因序列的质粒。

所述引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为50-500nM。

试剂盒的操作和结果判定

(1)将样品DNA/RNA共提取模板(从人的痰液、咽拭子等中提取)50μL、用无RNase水稀释到500μL加入芯片的样品孔中，与样品孔内预装的混合酶液、RT-PCR buffer混合，然后把微流控芯片放入到芯片检测仪中，混合液通过流道加压流入到10个分别预装有引物探针(1-10)的反应孔内，开始运行PCR反应及检测。

(2)PCR扩增反应的条件为：50℃逆转录30min；95℃预变性2min；95℃变性10s；60℃退火35s；40个循环。

(3)有效性判定：

阴性对照孔是未加引物探针的空白孔，检测结果应为阴性，且阳性对照孔检测出为阳性，否则实验视为无效；

(4)结果判读：

1-10号孔分别对应10种呼吸道感染病原体，机器自动读取每个检测孔的荧光强度值判定阴性阳性结果。

实施例2

用微流控芯片检测15个样品，5个阴性样品编号1～5，分别含有10种病原体阳性菌株核酸的10个阳性样品编号6～15。6号样品含有肺炎支原体核酸，7号样品含有肺炎衣原体核酸，8号样品含有嗜肺军团菌核酸，9号样品含有百日咳杆菌核酸，10号样品含有鼻病毒核酸，11号样品含有呼吸道腺病毒核酸，12号样品含有甲型流感病毒核酸，13号样品含有乙型流感病毒核酸，14号样品含有呼吸道合胞病毒核酸，15号样品含有副流感病毒核酸。按照实施例1相同的方法进行检测操作，检测结果见表1。

表1

检测结果表明本试剂盒用在微流控芯片检测特异性良好，只检出对应的病原体，不会对其他病原体的核酸产生交叉反应。

实施例3

用微流控芯片分别检测十种病原体质粒混合样本，按照稀释浓度10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10copies/μL五个梯度进行灵敏度试验。按照与实施例1相同的方法进行检测。

检测结果表明本发明试剂盒在微流控芯片中灵敏度良好，并且Ct值随浓度减少呈梯度改变，结果见表2。

表2

试验结果表明本试剂盒在微流控芯片中对于呼吸道病原体肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、鼻病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、合胞病毒、副流感病毒的诊断具有高度的灵敏性，各项目检测灵敏度均能达到100copies/μL。

序列表

<110> 南京岚煜生物科技有限公司

<120> 检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒及其使用方法

<150> 2017106650261

<151> 2017-08-07

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae人工序列)

<400> 1

gtggtgaagt gaaaggactc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae人工序列)

<400> 2

ccctatctaa tgataagttg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae人工序列)

<400> 3

cgccactaca cacggaatca 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae人工序列)

<400> 4

gtggtgaagt gatgcatct 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae人工序列)

<400> 5

ctaatgatcc gtttggcctg 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae人工序列)

<400> 6

cggagctaac gtgttaag 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 嗜肺军团菌(Legionella pneumophila人工序列)

<400> 7

cggaaagctg tatttgatc 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 嗜肺军团菌(Legionella pneumophila人工序列)

<400> 8

ccgatatctg tgccatatc 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 嗜肺军团菌(Legionella pneumophila人工序列)

<400> 9

cggtctatgt aatgggtta 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 百日咳杆菌(Bordetella pertussis人工序列)

<400> 10

gacactcctc cacttatc 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 百日咳杆菌(Bordetella pertussis人工序列)

<400> 11

caccaagaga caattacc 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 百日咳杆菌(Bordetella pertussis人工序列)

<400> 12

catccacatc cgagtctt 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 鼻病毒(Human Rhino virus人工序列)

<400> 13

atgcgaagag ccatatca 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 鼻病毒(Human Rhino virus人工序列)

<400> 14

gacagtaaag gcagaatg 18

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 鼻病毒(Human Rhino virus人工序列)

<400> 15

cggatgtagt gctgatctc 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 呼吸道腺病毒(Adenovirus人工序列)

<400> 16

aggtattgga acggatgatg 20

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 呼吸道腺病毒(Adenovirus人工序列)

<400> 17

ggagtctctt agtgatga 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 呼吸道腺病毒(Adenovirus人工序列)

<400> 18

ccatctcctt cgataaag 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus人工序列)

<400> 19

gaagcccgtt gaagacta 18

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus人工序列)

<400> 20

cagccaatta gtacragtta g 21

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus人工序列)

<400> 21

ataggcgagg tgtggaag 18

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 乙型流感病毒(Influenza B virus人工序列)

<400> 22

gagatggagt caggtggtt 19

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 乙型流感病毒(Influenza B virus人工序列)

<400> 23

cgcaagaatt cagaaccaga g 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 乙型流感病毒(Influenza B virus人工序列)

<400> 24

gggagtcagg ttcttcaaca a 21

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus人工序列)

<400> 25

gctcaggaag gtctgctcc 19

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus人工序列)

<400> 26

tcctgcacta gaggctctgc 20

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus人工序列)

<400> 27

aggaccttaa attcagacaa cgttct 26

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 副流感病毒(human parainfluenza virus人工序列)

<400> 28

gattacgttt gcgattacca agact 25

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 副流感病毒(human parainfluenza virus人工序列)

<400> 29

agttcccatt gctttcggag ta 22

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 副流感病毒(human parainfluenza virus人工序列)

<400> 30

ccggctgtgt ctataccaat atcc 24

Claims

1.一种检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒，包括试剂盒本体，该试剂盒本体包括进样腔室、反应腔室以及实现进样腔室、反应腔室连通的微流控流道；其特征在于：所述反应腔室至少包括有10个，各个反应腔室相互独立，且各反应腔室中均预置有用于扩增一种呼吸道病原体的试剂干粉，该试剂干粉包括用于扩增相应呼吸道病原体的引物、TaqMan探针；

预置于各个反应腔室中的试剂干粉能够分别扩增如下的10种呼吸道病原体中的任意一种，同时，所有反应腔室中的试剂干粉扩增出的呼吸道病原体能够囊括如下10种呼吸道病原体：肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）、肺炎衣原体（Chlamydophilapneumoniae）、嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）、百日咳杆菌（Bordetellapertussis）、鼻病毒（Human Rhino virus）、呼吸道腺病毒（Adenovirus）、甲型流感病毒（Influenza A virus）、乙型流感病毒（Influenza B virus）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus）和副流感病毒（human parainfluenza virus）；

进样腔室的进气孔与排气主流道的一端连通，排气主流道的另一端设置有数目与反应腔室数目一致的排气汇聚口，排气主流道的各排气汇聚口均依次通过排气分流道、排气单向阀、透气阻水滤芯、溢流通道与相应的反应腔室的进气孔一一连通；

所述引物的序列为：肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae），SEQ ID NO.1-2；肺炎衣原体（Chlamydophila pneumoniae），SEQ ID NO.4-5；嗜肺军团菌（Legionellapneumophila），SEQ ID NO.7-8；百日咳杆菌（Bordetella pertussis），SEQ ID NO.10-11；

鼻病毒（Human Rhino virus），SEQ ID NO.13-14；呼吸道腺病毒（Adenovirus），SEQ IDNO.16-17；甲型流感病毒（Influenza A virus），SEQ ID NO.19-20；乙型流感病毒（Influenza B virus），SEQ ID NO.22-23；呼吸道合胞病毒（respiratory syncytialvirus），SEQID NO.25-26；副流感病毒（human parainfluenza virus），SEQ ID NO.28-29；

所述TaqMan探针的序列为：肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae），SEQ ID NO.3；肺炎衣原体（Chlamydophila pneumoniae），SEQ ID NO.6；嗜肺军团菌（Legionellapneumophila），SEQ ID NO.9；百日咳杆菌（Bordetella pertussis），SEQ ID NO.12；鼻病毒（Human Rhino virus），SEQ ID NO.15；呼吸道腺病毒（Adenovirus），SEQ ID NO.18；甲型流感病毒（Influenza A virus），SEQ ID NO.21；乙型流感病毒（Influenza B virus），SEQ IDNO.24；呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus），SEQ ID NO.27；副流感病毒（human parainfluenza virus），SEQ ID NO.30。

2.根据权利要求1所述的检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒，其特征在于：所述引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nM；所述TaqMan探针在扩增体系中的终浓度为50-500nM。

3.根据权利要求1所述的检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒，其特征在于：所述进样腔室中预置有RT-PCR buffer、混合酶液和阳性质控品。

4.根据权利要求3所述的检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒，其特征在于：所述RT-PCR buffer包括PCR缓冲液、dATP、dUTP、dCTP、dGTP和MgCl₂。

5.根据权利要求3所述的检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒，其特征在于：所述混合酶液包括HotStart Taq酶、逆转录酶和UNG酶。

6.根据权利要求3所述的检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品中含有对应上述10项呼吸道病原体扩增基因序列的质粒。

7.根据权利要求1所述的检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒，其特征在于：所述试剂盒本体为三片式结构，包括从上到下依次密封键合的上层膜片、中层膜片和底层膜片；其中：进样腔室包括进样槽，且进样腔室的进样孔、排气孔均为贯穿上层膜片、中层膜片后与反应槽连通的通孔；反应腔室包括反应槽；

8.根据权利要求7所述的检测10种呼吸道感染病原体的微流控芯片试剂盒，其特征在于：所述的排气单向阀包括膜片，膜片的一端压设在中层膜片和底层膜片之间，另一端悬置，且底层膜片在膜片悬置端对应的位置处设置有膜片嵌槽；所述膜片悬置端与排气导向孔正对，且膜片悬置端的外边缘尺寸大于排气导向孔的孔径、小于膜片嵌槽的内缘尺寸，同时膜片悬置端的外边缘与膜片嵌槽的内壁之间存在仅容许气体穿行的缝隙。