CN109069672A - 腺相关病毒载体传递微肌营养不良蛋白以治疗肌营养不良症 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含小型化人类微肌营养不良蛋白基因的重组AAV载体和使用所述重组载体减少或预防患有肌营养不良症的受试者中纤维化的方法。

Description

腺相关病毒载体传递微肌营养不良蛋白以治疗肌营养不良症

本申请要求2016年4月15日提交的美国临时申请第62/323,163号和2017年3月17日提交的美国临时申请第62/473,253号的优先权权益，两者均通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明提供基因治疗载体，例如腺相关病毒(AAV)载体，以表达小型化的人类微肌营养不良蛋白基因，和使用这些载体以减少和预防患有肌营养不良症的受试者的纤维化的方法。本发明还提供组合基因治疗方法，以保护肌纤维免受损伤、增加肌肉力量。

背景技术

肌肉质量和力量对于日常活动(例如运动和呼吸)和全身代谢的重要性是明确的。肌肉功能缺陷产生肌营养不良症(MD)，其特点是肌肉无力和消瘦，并对生活质量产生严重影响。最有特征性的MD是由编码肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(DAPC)成员的基因突变引起的。这些MD是由与DAPC引起的肌膜-细胞骨架的缺失相关的膜脆性引起的。杜氏肌营养不良症(DMD)是影响5000名新生男性中1人的最具破坏性的肌肉疾病之一。

本申请包括开发DMD治疗的两种转化方法。纤维化浸润在DMD中是影响深远的，并且是任何潜在疗法的重要障碍。同样重要的是，要考虑到仅基因替代受到纤维化严重程度的阻碍，其已经存在于患有DMD非常年幼的儿童中。事实上，在4至5岁之间的通常的诊断年龄的肌肉活检显示出非常显著的纤维化水平。

DMD由DMD基因的突变引起，导致mRNA的减少和肌营养不良蛋白的缺失，肌营养不良蛋白是与肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(DAPC)相关的427kD肌膜蛋白(Hoffman等人《细胞(Cell)》1987年；51(6):919-28)。DAPC由肌肉肌膜上的多种蛋白组成，其在细胞外基质(ECM)和细胞骨架之间通过肌营养不良蛋白形成结构连接，肌营养不良蛋白是一种肌动蛋白结合蛋白、和α-肌营养不良蛋白聚糖、一种层粘连蛋白结合蛋白。这些结构连接用于在收缩期间稳定肌细胞膜并防止收缩引起的损伤。随着肌营养不良蛋白缺失，膜脆性导致肌膜撕裂和钙的流入，引发钙激活蛋白酶和节段性纤维坏死(Straub等人《神经病学的最新观点(Curr Opin.Neurol.)》1997年；10(2):168-75)。这种不受控制的肌肉退化和再生循环最终耗尽肌肉干细胞群(Sacco等人《细胞(Cell)》2010年；143(7):第1059-71页；Wallace等人《生理学年评(Annu Rev Physiol)》2009年；71:第37-57页)，导致进行性肌肉无力、肌内膜炎症和纤维化瘢痕形成。

如果没有肌营养不良蛋白或微肌营养不良蛋白的膜稳定化，DMD将表现出不受控制的组织损伤和修复循环，并最终通过结缔组织增殖用纤维化瘢痕组织代替缺失的肌纤维。纤维化的特征在于ECM基质蛋白的过量沉积，包括胶原蛋白和弹性蛋白。ECM蛋白主要由细胞因子如TGFβ产生，其是由活化的成纤维细胞对压力和炎症的反应释放的。尽管DMD的主要病理特征是肌纤维变性和坏死，但纤维化作为病理后果具有相同的影响。纤维化组织的过度产生限制了肌肉再生并且导致了DMD患者的进行性肌肉无力。在一项研究中，最初的DMD肌肉活检中纤维化的存在与10年随访时的不良运动结果高度相关(Desguerre等人《神经病理学与实验神经病学杂志(J Neuropathol Exp Neurol)》2009年；68(7):第762-7页)。这些结果表明纤维化是DMD肌肉功能障碍的主要原因，并强调需要开发减少纤维化组织的疗法。已经在mdx小鼠中测试的大多数抗纤维化疗法通过抑制TGFβ途径以阻断纤维化细胞因子信号传导。微核糖核酸(miRNA)是约22个核苷酸的单链RNA，其通过与mRNA的3'UTR内的碱基配对而在转录后水平介导基因沉默，从而抑制翻译或促进mRNA降解。miRNA的5'末端的7bp的种子序列靶向miRNA；目标序列的其余部分以及其二级结构提供了额外的识别。miRNA在肌肉疾病病理学中起重要作用，并且表现出独特依赖于所讨论的肌营养不良症类型的表达谱(Eisenberg等人《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》2007年；104(43):第17016-21页)。越来越多的证据表明，miRNA参与包括心脏、肝脏、肾脏和肺在内的许多器官的纤维化过程(Jiang等人《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》2007年；104(43):第17016-21页)。最近，miR-29的下调被证明导致心脏纤维化(Cacchiarelli等人《细胞代谢(Cell Metab)》2010年；12(4):第341-51页)，并且miR-29的表达降低与人类DMD患者肌肉遗传相关(Eisenberg等人《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》2007年；104(43):第17016-2页)。miR-29家族由两个双顺反子miRNA簇表达的三个家族成员组成。MiR-29a与miR-29b(miR-29b-1)共表达；miR-29c与第二复制的miR-29b(miR-29b-2)共表达。miR-29家族共享保守的种子序列，并且miR-29a和miR-29b各自仅与miR-29c的一个碱基不同。此外，miR-29质粒(一组miR-29a和miR-29b-1)电穿孔到mdx小鼠肌肉中，降低了ECM组分、胶原蛋白和弹性蛋白的表达水平，并在治疗后25天内强烈减少肌肉切片中的胶原蛋白沉积。(Cacchiarelli等人《细胞代谢(Cell Metab)》2010年；12(4):第341-51页)。

腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组长度为约4.7kb，包括145个核苷酸的反向末端重复(ITR)。AAV有多种血清型。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV血清型2(AAV2)基因组的核苷酸序列在Srivastava等人《病毒学杂志(JVirol)》1983年；45:555-564中提出，由Ruffing等人《普通病毒学杂志(J Gen Virol)》1994年；75:3385-3392校正。作为其他实例，AAV-1的完整基因组载于GenBank登录号为NC_002077中；AAV-3的完整基因组载于GenBank登录号为NC_1829中；AAV-4的完整基因组载于GenBank登录号为NC_001829中；AAV-5的基因组载于GenBank登录号为AF085716中；AAV-6的完整基因组载于GenBank登录号为NC_001862中；至少部分AAV-7和AAV-8基因组分别载于GenBank登录号为AX753246和AX753249中(也参见与AAV-8有关的美国专利第7,282,199号和第7,790,449号)；AAV-9基因组载于Gao等人《病毒学杂志(J Virol.)》2004年；78:6381-6388中；AAV-10基因组载于《分子治疗(Mol.Ther.)》2006年；13(1):67-76中；AAV-11基因组载于《病毒学(Virology)》2004年；330(2):375-383中。在Rodino-Klapac等人《转化医学杂志(J.Trans.Med.)》2007年；5:45中描述了AAVrh74血清型。指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在ITR中。三个AAV启动子(其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p19)，加上单个AAV内含子的差异剪接(例如，在AAV2核苷酸2107和2227处)，导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)。rep蛋白具有多种酶特性，最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且它编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。选择性剪接和非共有翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单一共有多聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95。在Muzyczka《当今微生物学和免疫学主题(Current Topics in Microbiology and Immunology)》1992年；158:97-129中综述了AAV的生命周期和遗传学。

AAV具有独特的特征，使其，例如在基因治疗中，作为用于将外源DNA递送至细胞的载体具有吸引力。培养基中细胞的AAV感染是非细胞病变的，人类和其他动物的自然感染是沉默的和无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，使得在体内靶向许多不同组织成为可能。此外，AAV转导缓慢分裂和非分裂细胞，并且可以作为转录活性核游离基因(染色体外因子)基本上维持这些细胞的寿命。AAV原病毒基因组作为质粒中的克隆DNA具有感染性，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号包含在AAV基因组的ITR中，部分或全部内部约4.3kb的基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以用外源DNA替换，例如含有启动子、目标DNA和多聚腺苷酸化信号的基因盒。rep蛋白和cap蛋白可以是反式提供。AAV的另一个重要特征是它是一种非常稳定和可靠的病毒。它轻易忍受用于灭活腺病毒的条件(56至65℃持续数小时)，使得AAV的冷保存不那么重要。甚至可以将AAV冻干。最后，AAV感染的细胞不耐受重复感染。

多项研究已经证明在肌肉中长期(>1.5年)重组AAV介导的蛋白质表达。参见Clark等人《人类基因治疗(Hum Gene Ther)》1997年；8:659-669；Kessler等人《美国国家科学院院刊(Proc Nat.Acad Sc.USA)》1996年；93:14082-14087；和Xiao等人《病毒学杂志(JVirol)》1996年；70:8098-8108。还参见Chao等人《分子治疗(Mol Ther)》2000年；2:619-623和Chao等人《分子治疗(Mol Ther)》2001年；4:217-222。此外，由于肌肉高度血管化，重组AAV转导导致肌内注射后在体循环中出现转基因产物，如Herzog等人《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》1997年；94:5804-5809和Murphy等人《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》1997年；94:13921-13926中所述。此外，Lewis等人《病毒学杂志(J Virol)》2002年；76:8769-8775证明骨骼肌纤维具有正确的抗体糖基化、折叠和分泌所必需的细胞因子，表明肌肉能够稳定表达分泌的蛋白质治疗药物。

患有DMD和其他肌营养不良症的患者的功能改善需要基因恢复和纤维化的减少。需要有减少纤维化的方法，其可以与基因修复方法相结合，以更有效地治疗DMD和其他肌营养不良症。miR29是一种潜在的基因调节因子，并且是减少肌肉纤维化的理想候选药物。

发明内容

本发明涉及通过递送microRNA miR29直接减少结缔组织(胶原蛋白1、胶原蛋白3和纤连蛋白)的三种主要组分的基因治疗方法。在此系统中，miR29与胶原蛋白和纤连蛋白基因的3'UTR结合以下调表达。本发明涉及表达microRNA miR29的引导链的基因治疗载体，例如AAV，和将miR29递送至肌肉以减少和/或预防纤维化的方法。

此外，本发明提供了用于减少和预防纤维化的组合疗法和方法，其使用基因治疗载体递送miR-29以抑制纤维化以及微肌营养不良蛋白以解决在DMD中观察到的基因缺陷。如实例5至7所示，组合治疗使得纤维化的更大减少、肌肉尺寸增加和肌肉力量增加。

在一个实施例中，本发明提供了表达miR-29的rAAV载体。例如，rAAV载体包含表达miR29c的多核苷酸序列，例如包含SEQ ID NO:3的miR-29c靶向引导链、SEQ ID NO:4的miR-29c引导链和天然miR-30骨架和茎环(SEQ ID NO:5)的核苷酸序列。包含miR-30骨架中的miR-29c cDNA的示例性多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示(图1)。

本发明的示例性rAAV是pAAV.CMV.Mir29C，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列；其中CMV启动子跨越核苷酸120-526，EF1a内含子跨越核苷酸927-1087和核苷酸1380-1854，miR-29c的引导链跨越核苷酸1257-1284和具有原始种子序列的shRNA-miR29-c跨越核苷酸1088-1375，并且poly A序列跨越核苷酸1896-2091。在一个方面，本发明的rAAV载体是AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh.74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13。

本发明的另一个示例性rAAV是pAAV.MHC.Mir29C，其包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列；其中MCK增强子跨越核苷酸190-395，MHC启动子跨越核苷酸396-753，EF1a内含子跨越核苷酸1155-1315和核苷酸1609-2083，miR-29c的引导链跨越核苷酸1487-1512和具有原始种子序列的shRNA-miR29-c跨越核苷酸1316-1608，并且poly A序列跨越核苷酸2094-2146。在一个方面，本发明的rAAV载体是AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh.74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13。

在另一个方面，本发明的rAAV载体可以与肌肉特异性控制元件可操作地连接。例如，肌肉特异性控制元件是人类骨骼肌动蛋白基因元件、心肌肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子MEF、肌肉肌酸激酶(MCK)、tMCK(截短的MCK)、肌球蛋白重链(MHC)、C5-12(合成启动子)、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白C基因元件、慢缩心肌肌钙蛋白C基因元件、慢缩肌钙蛋白I基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素响应元件(GRE)。

例如，本发明的任何rAAV载体与包含SEQ ID NO:10的MCK增强子核苷酸序列和/或SEQ ID NO:11的MCK启动子序列的肌肉特异性控制元件可操作地连接。

本发明还提供了包含本发明的任何rAAV载体的药物组合物(或有时在本文中简称为“组合物”)。

在另一个实施例中，本发明提供了产生rAAV载体颗粒的方法，包含培养已用本发明的任何rAAV载体转染的细胞，并从转染细胞的上清液中回收rAAV颗粒。本发明还提供了包含本发明的任何重组AAV载体的病毒颗粒。

在另一个实施例中，本发明提供了减少有需要的受试者的纤维化的方法，包含施用治疗有效量的表达miR-29的本发明的任何rAAV载体。例如，将本发明的任何rAAV施用于患有肌营养不良症的受试者以减少纤维化，特别是减少受试者的骨骼肌或心肌中的纤维化。这些方法可以进一步包含施用表达微肌营养不良蛋白的rAAV的步骤。

“纤维化”是指细胞外基质(ECM)组分的过度或不受调节的沉积和损伤后组织中的异常修复过程，包括骨骼肌、心肌、肝脏、肺、肾脏和胰腺。沉积的ECM组分包括纤连蛋白和胶原蛋白，例如胶原蛋白1、胶原蛋白2或胶原蛋白3。

在另一个实施例中，本发明提供了预防有需要的受试者的纤维化的方法，包含施用治疗有效量的表达miR-29的本发明的任何重组AAV载体。例如，将本发明的任何rAAV施用于患有肌营养不良症的受试者以预防纤维化，例如在受试者中观察到纤维化之前施用表达miR-29的本发明的rAAV。另外，将表达miR-29的本发明的rAAV施用于有发展纤维化风险的受试者，例如患有或诊断患有肌营养不良症的那些，例如DMD。将本发明的rAAV施用于患有肌营养不良症的受试者，以预防这些受试者的新纤维化。这些方法可以进一步包含施用表达微肌营养不良蛋白的rAAV的步骤。

本发明还提供了增加患有肌营养不良症的受试者的肌肉力量和/或肌肉质量的方法，包含施用治疗有效量的表达miR-29的本发明的任何rAAV载体。这些方法可以进一步包含施用表达微肌营养不良蛋白的rAAV的步骤。

术语“组合疗法”和“组合治疗”是指施用表达miR-29的本发明的rAAV载体和表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体。

在本发明的任何方法中，受试者可能患有肌营养不良症，例如DMD，贝克肌营养不良症或其他任何肌营养不良蛋白相关的肌营养不良症。此外，在本发明的任何方法中，受试者可能患有肌营养不良蛋白病。

在另一个实施例中，本发明提供了重组AAV载体，其包含编码微肌营养不良蛋白的核苷酸序列。本发明提供了rAAV，其包含a)具有与SEQ ID NO:7的核苷酸序列至少85％同一性并编码功能性微肌营养不良蛋白的核苷酸序列，b)SEQ ID NO:7的核苷酸序列，或c)SEQID NO:9的核苷酸序列。

表达微肌营养不良蛋白的本发明的示例性rAAV是pAAV.mck.微肌营养不良蛋白，其包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列并显示于图10和11中。这种rAAV载体包含MCK启动子、嵌合内含子序列、微肌营养不良蛋白基因的编码序列、polyA、氨苄青霉素抗性和具有pBR322起点或复制的pGEX质粒骨架。在一个方面，本发明的重组AAV载体是AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh.74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13。

本发明提供了编码微肌营养不良蛋白的rAAV载体，也就是，例如具有与SEQ IDNO:8至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、更典型的至少90％、91％、92％、93％、或94％、以及甚至更典型的至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中蛋白质保留微肌营养不良蛋白活性。微肌营养不良蛋白在肌肉收缩期间为肌膜提供稳定性，例如微肌营养不良蛋白在肌肉收缩期间充当减震器。

本发明提供了表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体，其包含具有与SEQ ID NO:7至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、或89％、更典型的至少90％、91％、92％、93％、或94％、甚至更典型的至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且编码功能性微肌营养不良蛋白的核苷酸序列。

本发明提供了表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体，其包含在严格条件下与SEQ IDNO:7的核酸序列或其互补物杂交，并编码功能性微肌营养不良蛋白的核苷酸序列。

术语“严格”用于指本领域通常理解为严格的条件。杂交严格性主要由温度、离子强度和变性剂如甲酰胺的浓度决定。用于杂交和洗涤的严格条件的实例是0.015M氯化钠、在65至68℃下0.0015M柠檬酸钠或0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和在42℃下50％甲酰胺。参见Sambrook等人《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)》，第2版，冷泉港实验室，(纽约冷泉港，1989年)。还可以使用更严格的条件(例如更高的温度、更低的离子强度、更高的甲酰胺或其他变性剂)，但是会影响杂交速率。在涉及脱氧寡核苷酸杂交的情况下，另外的示例性严格杂交条件包括在37℃(对于14碱基寡核苷酸)、48℃(对于17碱基寡核苷酸)、55℃(对于20碱基寡核苷酸)和60℃(对于23碱基寡核苷酸)下，于6x SSC 0.05％焦磷酸钠中洗涤。

为了减少非特异性和/或背景杂交，可以在杂交和洗涤缓冲液中包含其他试剂。实例是0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％焦磷酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠、NaDodSO4、(SDS)、聚蔗醣、邓哈特溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(或其他非互补DNA)和硫酸葡聚糖，当然也可以使用其他合适的试剂。可以改变这些添加剂的浓度和类型，而基本上不影响杂交条件的严格性。杂交实验通常在pH 6.8-7.4下进行，然而，在典型的离子强度条件下，杂交速率几乎与pH无关。参见Anderson等人《核酸杂交：实用方法(Nucleic Acid Hybridisation:A Practical Approach)》第4章，IRL有限公司(英国牛津)。本领域技术人员可以调节杂交条件以适应这些变量并允许不同序列相关性的DNA形成杂交体。

在另一个方面，表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体包含与肌肉特异性控制元件可操作地连接的微肌营养不良蛋白基因的编码序列。例如，肌肉特异性控制元件是人类骨骼肌动蛋白基因元件、心肌肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子MEF、肌肉肌酸激酶(MCK)、tMCK(截短的MCK)、肌球蛋白重链(MHC)、C5-12(合成启动子)、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白C基因元件、慢缩心肌肌钙蛋白C基因元件、慢缩肌钙蛋白I基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素响应元件(GRE)。

此外，本发明提供了表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体，其包含肌肉特异性控制元件，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的核苷酸序列。

本发明还提供了包含本发明的任何rAAV载体的药物组合物(或有时在本文中简称为“组合物”)。

在另一个实施例中，本发明提供了产生rAAV载体颗粒的方法，包括培养已用本发明的任何rAAV载体转染的细胞，并从转染细胞的上清液中回收rAAV颗粒。本发明还提供了包含本发明的任何重组AAV载体的病毒颗粒。

本发明还提供了产生功能性微肌营养不良蛋白的方法，其包含用本发明的表达微肌营养不良蛋白的重组AAV载体感染宿主细胞，并且在宿主细胞中表达功能性微肌营养不良蛋白。

在另一个实施例中，本发明提供减少有需要的受试者的纤维化的方法，包含施用治疗有效量的表达微肌营养不良蛋白的本发明的任何rAAV载体。例如，将本发明的任何rAAV施用于患有肌营养不良症或肌营养不良蛋白病的受试者以减少纤维化，特别是减少受试者的骨骼肌或心肌中的纤维化。

在另一个实施例中，本发明提供了预防有需要的受试者的纤维化的方法，包含施用治疗有效量的表达微肌营养不良蛋白的本发明的任何重组AAV载体。例如，将本发明的任何rAAV施用于患有肌营养不良症或肌营养不良蛋白病的受试者以预防纤维化，例如在受试者中观察到纤维化之前施用表达微肌营养不良蛋白的本发明的rAAV。另外，将表达微肌营养不良蛋白的本发明的rAAV施用于有发展纤维化风险的受试者，例如患有或诊断患有肌营养不良蛋白病或肌营养不良症(例如DMD或贝克肌营养不良症)的那些。将本发明的rAAV施用于患有肌营养不良蛋白病或肌营养不良蛋白病肌营养不良症的受试者，以预防这些受试者的新纤维化。

本发明还提供了增加患有肌营养不良症或肌营养不良蛋白病的受试者的肌肉力量和/或肌肉质量的方法，包含施用治疗有效量的表达miR-29的本发明的任何rAAV载体。

包含施用本发明的表达miR-29c的rAAV的步骤的任何前述方法可以包含施用本文所述的表达微肌营养不良蛋白的任何rAAV的进一步的步骤。术语“组合疗法”和“组合治疗”是指施用表达miR-29的本发明的rAAV载体和表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体。

在施用表达miR-29的rAAV载体和表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体的方法中，这些rAAV载体可以同时施用、或在表达微肌营养不良蛋白的rAAV之前立即施用表达miR29的rAAV载体的连续施用、或与在表达微肌营养不良蛋白的rAAV之后立即施用表达miR29的rAAV载体的连续施用。或者，实施本发明的方法，其中表达微肌营养不良蛋白的AAV载体在施用表达miR-29的rAAV后约1至5小时或5至12小时或12至15小时或15至24小时内施用；或实施本发明的方法，其中表达微肌营养不良蛋白的AAV载体在施用表达miR-29的rAAV之前约1至5小时或5至12小时或12至15小时或15至24小时内施用。或者，实施本发明的方法，其中表达微肌营养不良蛋白的AAV载体在施用表达miR-29的rAAV后约1或6或12或24小时内施用；或实施本发明的方法，其中表达微肌营养不良蛋白的AAV载体在施用表达miR-29的rAAV之前约1或6或12或24小时内施用。

本发明考虑在受试者中观察到纤维化之前或在受试者中肌肉力量减少之前或者在受试者的肌肉质量减少之前，将本发明的任何AAV载体施用于诊断患有肌营养不良蛋白病或肌营养不良症(例如DMD或贝克肌营养不良症)的患者。

本发明还考虑将本发明的任何rAAV施用于已经表现出纤维化的患有肌营养不良蛋白病或肌营养不良症(例如DMD或贝克肌营养不良症)的受试者，以预防这些受试者中的新纤维化。本发明还提供了将本发明的任何rAAV施用于已经具有减小的肌肉力量或具有减少的肌肉质量的患有肌肉营养不良症的患者，以保护肌肉免受进一步的损伤。

在本发明的任何方法中，通过肌内注射或静脉注射施用rAAV载体。

另外，在本发明的任何方法中，全身施用rAAV载体或组合物。例如，rAAV载体或组合物通过注射、输注或植入进行肠胃外给药。

在另一个实施例中，本发明提供了包含表达miR29的任何rAAV载体或表达微肌营养不良蛋白的任何rAAV载体或包含表达miR-29的rAAV载体和表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体的组合物，用于降低有需要的受试者的纤维化。另外，本发明提供了包含表达miR29的任何重组AAV载体或表达微肌营养不良蛋白的任何rAAV载体或包含表达miR-29的rAAV载体和表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体的组合物，用于预防患有肌营养不良蛋白病或肌营养不良症(例如DMD或贝克肌营养不良症)的患者的纤维化。

本发明还提供了包含表达miR29的本发明的任何rAAV载体或表达微肌营养不良蛋白的任何rAAV载体或包含表达miR-29的rAAV载体和表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体的组合物，用于增加患有肌营养不良蛋白病或肌营养不良症(例如DMD或贝克肌营养不良症)的受试者的肌肉力量和/或肌肉质量。

在另一个实施例中，本发明提供了包含表达miR29的本发明的任何rAAV载体或表达微肌营养不良蛋白的任何rAAV载体或包含表达miR-29的rAAV载体和表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体的组合物，用于治疗肌营养不良蛋白病或肌营养不良症，如DMD或贝克肌营养不良症。

调配本发明的组合物用于肌内注射或静脉注射。本发明的组合物还调配用于全身给药，例如通过注射、输注或植入进行肠胃外给药。另外，任何组合物都调配用于施用于患有肌营养不良蛋白病或肌营养不良症(如DMD、贝克肌营养不良症或任何其他肌营养不良蛋白相关的肌营养不良症)的受试者。

在另一个实施例中，本发明提供了表达miR29的本发明的任何rAAV载体或表达微肌营养不良蛋白的任何rAAV载体或包含表达miR-29的rAAV载体和表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体的用途，以制备用于减少有需要的受试者的纤维化的药物。例如，患有肌营养不良蛋白病或肌营养不良症(例如DMD、贝克肌营养不良症或任何其他肌营养不良蛋白相关的肌营养不良症)的受试者是有需要的。

在另一个实施例中，本发明提供了表达miR29的本发明的任何rAAV载体或表达微肌营养不良蛋白的任何rAAV载体或包含表达miR-29的rAAV载体和表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体的用途，以制备用于预防患有肌营养不良症的受试者的纤维化的药物。另外，本发明提供了表达miR29的本发明的重组AAV载体或表达微肌营养不良蛋白的任何rAAV载体或包含表达miR-29的rAAV载体和表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体的用途，以制备用于增加患有肌营养不良蛋白病或肌营养不良症(例如DMD或贝克肌营养不良症)的受试者的肌肉力量和/或肌肉质量的药物。

本发明考虑了本发明的任何AAV载体的用途以制备药物，所述药物用于在受试者中观察到纤维化之前或在受试者中肌肉力量减小之前或在受试者的肌肉质量减少之前施用于诊断患有DMD的患者。

本发明还考虑了本发明的任何AAV载体的用途以制备药物，所述药物用于施用以将本发明的任何rAAV施用于已经表现出纤维化的患有肌营养不良症的受试者，以预防这些受试者的新纤维化。本发明还提供了将本发明的任何rAAV施用于已经具有减小的肌肉力量或具有减少的肌肉质量的患有肌肉营养不良症的患者，以保护肌肉免受进一步的损伤。

本发明还提供了表达miR296的本发明的rAAV载体或表达微肌营养不良蛋白的任何rAAV载体或包含表达miR-29的rAAV载体和表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体的用途以制备用于治疗肌营养不良症的药物。

在本发明的任何用途中，调配药物用于肌内注射。另外，任何药物可以制备用于施用于患有肌营养不良症(例如DMD或任何其他肌营养不良蛋白相关的肌营养不良症)的受试者。

另外，本发明的任何药物可以是组合疗法，其中表达miR-29的rAAV载体和表达微肌营养不良蛋白的rAAV载体同时施用，或者在表达微肌营养不良蛋白的rAAV之前立即施用表达miR29的rAAV载体的连续施用、或在表达微肌营养不良蛋白的rAAV之后立即施用表达miR29的rAAV载体的连续施用。或者，所述药物包含在施用表达miR-29的rAAV后约1至5小时内施用表达微肌营养不良蛋白的AAV载体，或者所述药物包含在施用表达miR-29的rAAV前约1至5小时内施用表达微肌营养不良蛋白的AAV载体。

附图说明

图1提供了rAAV载体scAAVCrh.74.CMV.miR29c的示意图和天然miR-30骨架中的miR-29c的核苷酸序列以及预测的发夹结构的核苷酸序列。

图2A至CD说明将miR-29c注射到肌肉中减少了整个肌肉中的胶原蛋白并且恢复miR-29c表达。

图3A至3C证明注射miR-29c改善了绝对肌肉力量(图A)和特定肌肉力量(图B)，但不能防止收缩诱导的损伤(图C)。

图4A至4C显示肌纤维表达微肌营养不良蛋白的数量，以测量转基因递送的功效。

图5A至5C证明miR-29c与微肌营养不良蛋白的共递送降低了胶原蛋白表达(图A)和纤维化诱导的肌营养不良蛋白表达。

图6A至6D说明肌内注射miR-29c/微肌营养不良蛋白抑制了mdx/utrn^+/-小鼠中的细胞外基质(ECM)，如通过胶原蛋白1α(图A)、胶原蛋白3α(图B)、纤连蛋白(图C)和TGF-β(图D)测量的。

图7A至7C显示肌内注射miR-29c增加了绝对力(图A)、归一化比力(图B)和增加了对肌肉中收缩诱导损伤(图C)的保护。

图8说明miR-29c/μ-dys组合增加了在3个月大处理的小鼠的肌肉大小。显示了用苦味酸天狼星红处理的和未处理的mdx/utrn^+/-腓肠肌的切片以染色胶原蛋白。纤维化区域为粉红色，完整肌肉为绿色。在宏观层面上，miR-29c/μ-dys组合减少了纤维化并增加了总横截面积。

图9A至F证明，与单独注射的任一个相比，与微肌营养不良蛋白共同递送的miR-29c治疗增加了肌肉肥大和增生，如所注射的腓肠肌的总重量的增加(图A)、平均纤维大小增加(图B)、肌肉横截面积增加(图D；未注射：24.6对比miR-29c：26.3对比micro-dys：26.6对比micro-dys/miR-29c：33.1)和肌纤维数量的增加(图E)所示，但每单位面积的肌纤维数量没有受到影响(图F)。图C比较了对照组mdx/utrn^+/-与miR-29c/μ-dys处理的mdx/utrn^+/-，平均直径从25.96增加到30.97μm。

图10A至G证明AAV.miR-29c/微肌营养不良蛋白组合疗法的早期治疗在减少纤维化和ECM表达方面更有效。图A显示野生型的未经注射的AAV.miR-29c、AAV.微肌营养不良蛋白和在4至5周龄注射、注射后第12周取出的小鼠的AAV.miR-29c/AAV.微肌营养不良蛋白的苦味酸天狼星红染色。图B提供了对苦味酸天狼星红染色的定量，显示与未注射的GAS肌肉相比，共处理的肌肉的胶原蛋白具有51.1％的减少。图C证明qRT-PCR证实了治疗组中miR-29c转录水平的增加。半定量qRT-PCR显示与对侧肢体相比，AAV.miR-29c/AAV.微肌营养不良蛋白处理的肌肉中的胶原蛋白I和III(图d、e)、fbn(图f)和TGF-β1(图g)水平显著降低，并且每种单一疗法误差线为，SEM为n＝5(scAAVrh.74.CMV.miR-29c)，n＝5(scAAVrh.74.CMV.miR-29c/ssAAVrh.74.MCK.微肌营养不良蛋白)，n＝6(ssAAVrh.74.MCK.微肌营养不良蛋白)，n＝9(mdx/utrn^+/-小鼠)。单因素方差分析(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)

图11展示了早期组合疗法恢复力量并防止收缩诱导的损伤。与未处理的mdx/utrn^+/-肌肉(图C)相比，在所有三种治疗注射的GAS肌肉中，在强直性收缩后绝对(图A)和归一化比力(图b)的测量有显著增加。然后评估肌肉在重复的离心收缩后的力损失。与未处理的mdx/utrn^+\-肌肉(蓝色)相比，仅用miR-29c/微肌营养不良蛋白共处理的和单独的微肌营养不良蛋白处理的小鼠显示出对力的损失的保护。双因素方差分析表明在衰减曲线中显著性的误差线，SEM为n＝5(rAAVrh.74.CMV.miR-29c)，n＝6(rAAVrh.74.CMV.miR-29c/rAAVrh.74.MCK.微肌营养不良蛋白)，n＝5(rAAVrh.74.MCK.微肌营养不良蛋白)，n＝15(mdx/utrn^+/-小鼠)。单因素方差分析(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。

图12说明miR-29c/微肌营养不良蛋白组合治疗增加了在1个月大处理的小鼠的肌肉大小。对处理的和未处理的mdx/utrn^+/-GAS肌肉进行切片并用苦味酸天狼星红染色以染色胶原蛋白。纤维化区域为粉红色，完整肌肉为绿色。在宏观层面上，miR-29c/微肌营养不良蛋白组合减少了纤维化并且增加了总横截面积。

图13A至13G证明AAV.MCK.miR-29c/微肌营养不良蛋白组合疗法的早期治疗(在4至5周)在减少纤维化和ECM表达方面更有效。图A提供了未注射的和4至5周龄注射、注射后第12周取出的小鼠的AAV.MCK.miR-29c/AAV.MCK.微肌营养不良蛋白的苦味酸天狼星红染色。原始放大倍数，20倍放大图B提供了对苦味酸天狼星红染色的定量，证明与未处理的GAS肌肉相比，共处理的肌肉的胶原蛋白具有50.9％的减少。图C提供了qRT-PCR，证实治疗组中miR-29c转录水平的增加。半定量qRT-PCR显示与对侧肢体疗法相比，AAV.MCK.miR-29c/AAV.微肌营养不良蛋白处理的肌肉中胶原蛋白1A(Col1A；图D)和胶原蛋白3A(Col3A；图E)、纤连蛋白(Fbn；图F)和Tgfβ1(图G)水平显著降低。(*P<0.05，****P<0.0001)。

图14A至14G证明用AAV.MCK.miR-29c/微肌营养不良蛋白组合疗法的晚期治疗(在12周治疗)可有效减少纤维化和ECM表达。图A提供了未处理的、注射后第12周的AAV.MCK.miR-29c和AAV.MCK.miR-29c/AAV.微肌营养不良蛋白的苦味酸天狼星红染色。原始放大倍率，20倍放大。图B提供了对苦味酸天狼星红染色的定量，其表明与未处理的GAS肌肉相比，共处理的肌肉的胶原蛋白具有30.3％的减少。图C提供qRT-PCR，证实治疗组中miR-29c转录水平的增加。半定量qRT-PCR显示与对侧肢体相比，AAV.miR-29c/AAV.微肌营养不良蛋白处理的肌肉中的胶原蛋白1A(Col1A；图D)、胶原蛋白3A(Col3A；图E)、纤连蛋白(Fbn；图F)和Tgfβ1(图G)水平显著降低。单因素方差分析。所有数据均代表平均值±SEM。(**p<0.01，****p<0.0001)。

图15A至15C证明早期组合疗法(在4至5周的治疗)恢复力量并且防止收缩诱导的损伤。与未处理的mdx/utrn^+/-肌肉(C)相比，MCK.miR-29c/微肌营养不良蛋白注射的GAS肌肉在强直性收缩后绝对(图A)和归一化比力(图B)的测量有显著增加。然后评估肌肉在重复的离心收缩后的力损失。与未处理的mdx/utrn^+\-肌肉(红色)相比，使用miR-29c/微肌营养不良蛋白共处理的和单独使用微肌营养不良蛋白处理的小鼠显示出对力的损失的保护。双因素方差分析。所有数据代表平均值±SEM(****p<0.0001)。

图16A至16C表明晚期联合治疗恢复了力并且保护免受收缩引起的损伤。与未处理的mdx/utrn^+/-肌肉相比，rAAV.MCK.miR-29c和表达微肌营养不良蛋白的rAAV注射的GAS肌肉在强直收缩后绝对(图A)和标准化比力(图B)的测量显着增加。在图C中，然后评估肌肉在重复的偏心收缩后的力损失。与未处理的mdx/utrn^+/-肌肉(红色)相比，用表达微肌营养不良蛋白的rAAV.MCK.miR-29c/rAAV共处理的小鼠显示出对力的损失的保护。双因素方差分析。所有数据均代表平均值±SEM(**p<0.01，****p<0.0001)。

图17A至17D证明组合治疗在注射后第3个月增加肌肉肥大。图A显示了与表达微肌营养不良蛋白的rAAV共同递送的rAAV.MCK.miR-29c未能增加注射的GAS的总重量。图B证明了表达微肌营养不良蛋白的rAAV.MCK.miR-29c/rAAV组合治疗引起平均纤维大小的增加。将对照组mdx/utrn^+/-与miR-29c/微肌营养不良蛋白处理的mdx/utrn^+/-进行比较，平均直径从28.96增加至36.03μm。图C显示共同递送产生向野生型纤维尺寸分布的转变。图D提供了miR-29c/微肌营养不良蛋白组合治疗中每平方毫米的肌纤维的数量显著低于未处理的小鼠和野生型的(***p<0.01，****p<0.0001)。

图18A至18B提供了示例性rAAV载体的核酸序列(SEQ ID NO:1pAAV.CMV.Mir29C)，其包含miR-29c(核苷酸1257-1284)的成熟引导链和天然mi-30骨架(核苷酸1088-1375)。所述构建体还包含CMV启动子(核苷酸120-526)、核苷酸927-1087和1380-1854处的两个EF1a内含子和核苷酸1896-2091处的polA。

图19提供了rAAV载体pAAV.MCK.微肌营养不良蛋白的示意图。

图20A至D提供了表达微肌营养不良蛋白的示例性rAAV载体的核酸序列(SEQ IDNO:9；pAAV.MCK.微肌营养不良蛋白)。

图21A至D提供了人类微肌营养不良蛋白核苷酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)。

图22提供了示例性rAAV载体的核苷酸序列(SEQ ID NO:12pAAV.MCK.Mir29C)，其包含miR-29c(核苷酸1487-1512)的成熟引导链和天然mi-30骨架(核苷酸1088-1375)。所述构建体还包含MCK增强子(核苷酸190-395)、MCK启动子(核苷酸396-753)、核苷酸1155-1315和1609-2083处的两个EF1a内含子和核苷酸2094-2148处的polA。

具体实施方式

本发明提供了基因治疗载体，例如rAAV载体，以过表达miR-29微RNA，和减少和预防肌营养不良患者纤维化的方法。本发明还提供了组合基因治疗方法，其包含将表达miR-29的基因治疗载体与表达在DMD患者中缺失的微肌营养不良蛋白的基因治疗载体组合施用。

在诊断DMD的最早年龄时采取的肌肉活检显示突出的结缔组织增殖。肌肉纤维化在多种方面都是有害的。它通过结缔组织屏障减少肌内营养物质的正常转运、减少血液流动并剥夺肌肉血管来源的营养成分、以及在功能上通过肢体挛缩导致早期的行走能力丧失。随着时间的推移，治疗挑战因肌肉中明显的纤维化而成倍增加。在连续的时间点比较结缔组织增殖的肌肉活检中可以观察到这一点。这个过程继续恶化导致丧失行走能力和加速失控，特别是在依赖轮椅的患者中。

如果没有减少纤维化的平行方法，则不可能完全实现外显子跳跃、终止密码子通读或基因替代疗法的益处。如果没有减少肌肉纤维化的方法，即使是小分子或蛋白质替代策略也可能会失败。先前用AAV.微肌营养不良蛋白治疗现存纤维化的老年mdx小鼠的研究表明我们无法实现全功能恢复(《人类分子遗传学(Human molecular genetics)》2013年；22,4929-4937)。还已知DMD心肌病的进展伴随着心室壁中的疤痕形成和纤维化。由于缺乏免疫屏障和递送相对容易，微RNA递送特别具有创新性。微RNA是很小的(约200bp)，因此可以与治疗盒一起包装在AAV中以纠正或绕过遗传缺陷。

如本文所用，术语“AAV”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是一种单链DNA细小病毒，其仅在由共感染辅助病毒提供某些功能的细胞中生长。目前已有13种已表征的AAV血清型。AAV的基本信息和综述可参见，例如，Carter《细小病毒手册(Handbook ofParvoviruses)》1989年，第1卷，第169-228页和Berns《病毒学(Virology)》1990年，第1743-1764页，Raven出版社(纽约)。然而，可完全预期这些相同的原理将适用于额外的AAV血清型，因为众所周知，即使在基因水平上，各种血清型在结构和功能上都非常密切相关。(参见，例如，Blacklowe《细小病毒和人类疾病(Parvoviruses and Human Disease)》1988年，第165-174页，J.R.Pattison，主编；和Rose《综合病毒学(Comprehensive Virology)》1974年；3:1-61)。例如，所有AAV血清型似乎都表现出由同源rep基因介导的非常相似的复制特性；并且所有都含有三种相关的衣壳蛋白，例如在AAV2中表达的那些。异源双链分析进一步表明了相关程度，其揭示了沿着基因组长度的血清型之间的广泛交叉杂交；并且在末端存在类似的自退火区段，其对应于“反向末端重复序列”(ITR)。类似的感染模式还表明每种血清型中的复制功能受到类似的调节控制。

如本文所用的“AAV载体”是指包含一个或多个目标多核苷酸(或转基因)的载体，其侧翼为AAV末端重复序列(ITR)。当这种AAV载体存在于已经用编码和表达rep和cap基因产物的载体转染的宿主细胞中时，可以复制并且包装成感染性病毒颗粒。

“AAV病毒粒子”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化多核苷酸AAV载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即除了野生型AAV基因组之外的多核苷酸，例如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则其通常被称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，因为这样的载体包含在AAV载体颗粒内。

AVV

本发明的重组AAV基因组包含本发明的核酸分子和侧接核酸分子的一个或多个AAV ITR。rAAV基因组中的AAV DNA可以来自可以衍生重组病毒的任何AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12和AAV-13。假型rAAV的产生公开在例如WO 01/83692中。还考虑了其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见，例如，Marsic等人《分子治疗(MolecularTherapy)》2014年；22(11):1900-1909。如上文背景技术部分所述，各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。为了促进骨骼肌特异性表达，可使用AAV1、AAV6、AAV8或AAVrh.74。

本发明的DNA质粒包含本发明的rAAV基因组。将DNA质粒转移到允许用AAV的辅助病毒(例如，腺病毒、E1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞中，以将rAAV基因组装配成感染性病毒颗粒。产生rAAV颗粒的技术是本领域的标准，其中待包装的AAV基因组、rep和cap基因、以及辅助病毒功能被提供给细胞。rAAV的产生需要以下组分存在于单个细胞内(在本文中表示为包装细胞)：rAAV基因组、与rAAV基因组分开(即不在其中)的AAV rep和cap基因、以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可以来自可以衍生重组病毒的任何AAV血清型，并可以来自与rAVV基因组ITR不同的AVV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAVrh.74、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12和AAV-13。假型rAAV的产生公开在例如WO 01/83692中，其通过引用整体并入本文。

产生包装细胞的方法是创建稳定地表达AAV颗粒产生所需的所有组分的细胞系。例如，包含缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因组、与rAAV基因组分开的AAV rep和cap基因、以及选择标记(例如新霉素抗性基因)的质粒(或多个质粒)被整合到细胞的基因组中。AAV基因组已经通过步骤引入到细菌质粒中，诸如GC加尾(Samulski等人《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》1982年；79:2077-2081)、添加含有限制性内切核酸酶切割位点的合成接头(Laughlin等人《基因(Gene)》1983年；23:65-73)或通过直接平末端连接(Senapathy&Carter《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》1984年；259:4661-4666)。然后用辅助病毒如腺病毒感染包装细胞系。这种方法的优点是细胞是可选择的并且适合于大规模生产rAAV。其他合适的方法的实例使用腺病毒或杆状病毒而不是质粒将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。

rAAV产生的一般原理综述于例如Carter《生物技术最新观点(Current Opinionsin Biotechnology)》1992年；1533-539；和Muzyczka《当今微生物学和免疫学(Curr.Topicsin Microbial.and Immunol.)》1992年；158:97-129。各种方法描述于Ratschin等人《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》1984年；4:2072；Hermonat等人《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》1984年；81:6466；Tratschin等人《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》1985年；5:3251；McLaughlin等人《病毒学杂志(J.Virol.)》1988年；62:1963；和Lebkowski等人《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》1988年；7:349。Samulski等人(《病毒学杂志(J.Virol.)》1989年；63:3822-3828)；美国专利第5,173,414号；WO 95/13365和相应的美国专利第5,658,776号；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人《疫苗(Vaccine)》1995年；13:1244-1250；Paul等人《人类基因治疗(Human Gene Therapy)》1993年；4:609-615；Clark等人《基因治疗(Gene Therapy)》1996年；3:1124-1132；美国专利第5,786,211号；美国专利第5,871,982号；和美国专利第6,258,595号。前述文献在此通过引用整体并入本文，特别强调与rAAV产生有关的文献的那些部分。

因此，本发明提供了产生感染性rAAV的包装细胞。在一个实施例中，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，例如HeLa细胞、293细胞和PerC.6细胞(同源293系)。在另一个实施例中，包装细胞是其为未转化的癌细胞的细胞，例如低传代293细胞(用腺病毒E1转化的人类胎儿肾细胞)、MRC-5细胞(人类胎儿成纤维细胞)、WI-38细胞(人类胎儿成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胎儿肺细胞)。

本发明的重组AAV(即，感染性衣壳化的rAAV颗粒)包含rAAV基因组。在示例性实施例中，两种rAAV的基因组缺乏AAV rep和cap DNA，即，在基因组的ITR之间不存在AAV rep或cap DNA。可构建为包含本发明的核酸分子的rAAV的实例载于国际专利申请第PCT/US2012/047999(WO2013/016352)号，其通过引用整体并入本文。

可以通过本领域标准方法纯化rAAV，例如通过柱色谱法或氯化铯梯度。从辅助病毒中纯化rAAV载体的方法是本领域已知的，并且包括公开在例如Clark等人《人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)》1999年；10(6):1031-1039；Schenpp和Clark《分子医学方法(MethodsMol.Med.)》2002年；69 427-443；美国专利第6,566,118号和WO 98/09657中的方法。

在另一个实施例中，本发明涉及包含本发明的rAAV的组合物。本发明的组合物包含rAAV和药学上可接受的载体。所述组合物还可包含其他成分，例如稀释剂和佐剂。可接受的载体、稀释剂和佐剂对接受者是无毒的，并且在所用的剂量和浓度下是优选是惰性的，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如吐温、普朗尼克类或聚乙二醇(PEG)。

在本发明的方法中施用的rAAV的滴度将根据例如特定的rAAV、施用模式、治疗目标、个体和靶向的细胞类型而变化，并且可以通过本领域标准方法确定。rAAV的滴度范围可以从约1×10⁶、约1×10⁷、约1×10⁸、约1×10⁹、约1×10¹⁰、约1×10¹¹、约1×10¹²、约1×10¹³至约1×10¹⁴或更多DNase抗性颗粒(DRP)每毫升。剂量也可以以病毒基因组(vg)为单位表示。

本发明考虑了在体内或体外用rAAV转导靶细胞的方法。在体内的方法包含向有需要的动物(包括人类)施用有效剂量或有效多剂量的包含本发明rAAV的组合物的步骤。如果在失调/疾病发展前施用剂量，则施用是预防性的。如果在失调/疾病发展后施用剂量，则施用是治疗性的。在本发明的实施例中，有效剂量是减轻(消除或减少)与所治疗的失调/疾病状态相关的至少一种症状的剂量，其减缓或预防进展至失调/疾病状态，减缓或预防失调/疾病状态的进展，减轻疾病的程度，使得疾病缓解(部分或全部)，和/或延续生命。本发明的方法考虑用于预防或治疗的疾病的实例是FSHD。

本发明还考虑了组合疗法。本文使用的组合包括同时治疗和顺序治疗。特别考虑了本发明方法与标准药物治疗(例如皮质类固醇)的组合，如与新疗法的组合一样。

有效剂量的组合物的施用可以通过本领域的标准途径，包括但不限于肌内、肠胃外、静脉内、口服、口腔、鼻、肺、颅内、骨内、眼内、直肠或阴道。考虑到感染和/或待治疗的疾病状态和表达miR-29miRNA和/或微肌营养不良蛋白的靶细胞/组织，本领域技术人员可以选择和/或匹配本发明的rAAV的AAV组分(特别是AAV ITR和衣壳蛋白)的给药途径和血清型。

本发明提供了有效剂量的rAAV和本发明的包括本发明的组合治疗的组合物用于局部给药和全身给药。例如，全身给药是施用于循环系统以使整个身体受到影响。全身给药包括肠内给药，例如通过肠道吸收和通过注射、输注或植入进行肠胃外给药。

特别地，本发明的rAAV的实际施用可以通过使用将rAAV重组载体转运到动物的靶组织中的任何物理方法来实现。根据本发明，给药包括但不限于注射到肌肉、血流和/或直接注射到肝脏中。简单地将rAAV重新悬浮在磷酸盐缓冲溶液中已经被证明足以提供用于肌肉组织表达的载体，并且对可以与rAAV共同施用的载体或其他组分没有已知的限制(尽管通常应该避免降解DNA的组合物与rAAV使用)。可以修饰rAAV的衣壳蛋白，以使rAAV靶向特定的目标靶组织，例如肌肉。参见，例如，WO 02/053703，其公开内容通过引用并入本文。药物组合物可以制备成可注射制剂或局部制剂，通过透皮转运递送至肌肉。先前已经开发了许多用于肌内注射和透皮转运的制剂，并且这些制剂可以用于本发明的实践中。rAAV可与任何药学上可接受的载体一起使用，以便于给药和处理。

以本文公开的方法施用的rAAV的剂量将根据例如特定的rAAV、施用方式、治疗目标、个体和靶向的细胞类型而变化，并且可以通过本领域标准方法确定。施用的每种rAAV的滴度范围可以从约1×10⁶、约1×10⁷、约1×10⁸、约1×10⁹、约1×10¹⁰、约1×10¹¹、约1×10¹²、约1×10¹³、约1×l0¹⁴或至约1×10¹⁵或更多DNase抗性颗粒(DRP)每毫升。剂量也可以以病毒基因组(vg)为单位表示(即，分别为1×10⁷vg、1×10⁸vg、1×10⁹vg、1×10¹⁰vg、1×10¹¹vg、1×10¹²vg、1×10¹³vg、1×l0¹⁴vg、1×10¹⁵vg)。剂量也可以以每千克(kg)体重的病毒基因组(vg)为单位表示(即，分别为1×10¹⁰vg/kg、1×10¹¹vg/kg、1×10¹²vg/kg、1×10¹³vg/kg、1×10¹⁴vg/kg、1×10¹⁵vg/kg)。滴定AAV的方法描述于Clark等人《人类基因治疗(Hum.GeneTher.)》1999年；10:1031-1039。

特别地，本发明的rAAV的实际施用可以通过使用将rAAV重组载体转运到动物的靶组织中的任何物理方法来实现。根据本发明，给药包括但不限于注射到肌肉、血流和/或直接注射到肝脏中。简单地将rAAV重新悬浮在磷酸盐缓冲溶液中已经被证明足以提供用于肌肉组织表达的载体，并且对可以与rAAV共同施用的载体或其他组分没有已知的限制(尽管通常应该避免降解DNA的组合物与rAAV使用)。可以修饰rAAV的衣壳蛋白，以使rAAV靶向特定的目标靶组织，例如肌肉。参见，例如，WO 02/053703，其公开内容通过引用并入本文。药物组合物可以制备成可注射制剂或局部制剂，通过透皮转运递送至肌肉。先前已经开发了许多用于肌内注射和透皮转运的制剂，并且这些制剂可以用于本发明的实践中。rAAV可与任何药学上可接受的载体一起使用，以便于给药和处理。

为了肌内注射的目的，可以使用佐剂(如芝麻油或花生油)或丙二醇水溶液中的溶液，以及无菌水溶液。如果需要，所述水溶液可以被缓冲，并且首先将所述液体稀释剂用盐水或葡萄糖进行等渗。作为游离酸(DNA含有酸性磷酸基)或药学上可接受盐的rAAV溶液可以在合适地与表面活性剂(如羟丙基纤维素)混合的水中制备。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和油中制备rAAV的分散体。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。在这方面，所用的无菌水性介质都可通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。

适于注射使用的药物载体、稀释剂或赋形剂包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的并且必须是流动的，以便达到易于注射的程度。它在制备和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。所述载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层、通过在分散体的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂可以维持适当的流动性。微生物作用的预防可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等来实现。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

无菌可注射溶液通过在适当的溶剂中将rAAV以所需量与根据需要的上面列举的各种其他成分混合，随后过滤灭菌来制备。通常，通过将灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤溶液的任何其他所需成分。

用rAAV转导也可以在体外进行。在一个实施例中，从受试者中取出所需的靶肌肉细胞、用rAAV转导并重新引入受试者。或者，可以使用同源或异种肌细胞，其中这些细胞不会在受试者中产生不适当的免疫应答。

用于将转导细胞转导和再引入受试者的合适方法是本领域已知的。在一个实施例中，细胞可以通过将rAAV与肌肉细胞组合(例如，在适当的介质中)在体外转导，并使用常规技术例如Southern印迹和/或PCR，或通过使用选择标记筛选携带目标DNA的那些细胞。然后可将转导细胞配制成药物组合物，并通过各种技术将组合物引入受试者，例如通过肌内注射、静脉注射、皮下注射和腹膜内注射，或通过使用例如导管注射到平滑肌和心肌中。

用本发明的rAAV转导细胞引起miR-29或微肌营养不良蛋白的持续表达。因此，本发明提供了向动物、优选人类施用/递送表达miR-29和/或微肌营养不良蛋白的rAAV的方法。这些方法包括用一种或多种本发明的rAAV转导组织(包括但不限于诸如肌肉的组织、诸如肝脏和脑的器官、以及诸如唾液腺的腺体)。可以用包含组织特异性控制元件的基因盒进行转导。例如，本发明的一个实施例提供了转导由肌肉特异性控制元件指导的肌肉细胞和肌肉组织的方法，包括但不限于衍生自肌动蛋白基因家族和肌球蛋白基因家族的那些，例如来自myoD基因家族[参见Weintraub等人《科学(Science)》1991年；251:761-766]、肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2[Cserjesi和Olson《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》1991年；11:4854-4862]、人类骨骼肌动蛋白基因控制元件[Muscat等人《分子细胞生物学(MolCell Biol)》1987年；7:4089-4099]、心肌肌动蛋白基因、肌肉肌酸激酶序列元件[参见Johnson等人《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》1989年；9:3393-3399]和鼠肌酸激酶增强子(mCK)元件、骨骼快缩肌钙蛋白C基因控制元件、慢缩心肌肌钙蛋白C基因和慢缩肌钙蛋白I基因：缺氧诱导核因子(Semenza等人《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》1991年；88:5680-5684)、类固醇诱导元件或包括糖皮质激素响应元件(GRE)的启动子(参见Mader和White《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》1993年；90:5603-5607)、和其他控制元件。

肌肉组织是用于体内DNA递送的有吸引力的靶标，因为它不是生命器官并且易于接近。本发明考虑了从转导的肌纤维中持续表达miRNA。

“肌肉细胞”或“肌肉组织”是指源自任何种类的肌肉的细胞或细胞群(例如，骨骼肌和平滑肌，例如来自消化道、膀胱、血管或心脏组织)。这些肌肉细胞可以是分化的或未分化的，例如成肌细胞、肌细胞、肌管、心肌细胞和成心肌细胞。

术语“转导”用于指在体内或体外将miiR29引导链或微肌营养不良蛋白的编码区施用/递送至受体细胞，通过本发明的复制缺陷型rAAV，使得受体细胞表达miR29或微肌营养不良蛋白。

因此，本发明提供了向有需要的患者施用有效剂量(或基本上同时施用的剂量或间隔施用的剂量)rAAV的方法，所述rAAV编码miR29和/或微肌营养不良蛋白。

实例

实例1

杜氏肌营养不良症模型的确认

mdx小鼠提供方便但不完整的动物模型用以研究DMD发病机理。这个模型是含有肌营养不良蛋白相关蛋白基因的杂合敲除的mdx小鼠的杂交(mdx:utrn^+/-)，其表现出纤维化增加并且更忠实地概括了人类DMD的病理学。mdx小鼠在DMD的外显子23中具有无义突变，其引起相对温和的表型和接近正常的寿命。到3周龄时，mdx小鼠的膈肌和肢体肌出现肌内膜炎症的迹象。在小鼠到达成年后这些症状在肢体肌中消退，而膈肌中的炎症继续逐渐恶化。在缺乏端粒酶的mdx小鼠中，肌营养不良症随着年龄的增长而逐渐恶化；缺乏肌营养不良蛋白相关蛋白(DKO)的mdx小鼠具有更多人类DMD特征的表型，包括早发性肌肉无力、严重纤维化和过早死亡。肌营养不良蛋白相关蛋白是肌营养不良蛋白的常染色体旁系同源物，它具有高度的序列同源性，可以弥补双敲除(肌营养不良蛋白和肌营养不良蛋白相关蛋白)中mdx小鼠中肌营养不良蛋白的缺乏；早死亡的严重表型被观察到。尽管DKO小鼠的过早死亡排除了炎症和纤维化的进展，但是mdx:utrn^+/-小鼠呈现出与人类疾病相似的模型，表现出惊人的纤维化程度，并且存活时间比DKO更长，为我们提出的转化研究提供了更好的模型。最近的一份报告证实了使用mdx:utrn^+/-小鼠是作为研究DMD背景下纤维化的理想模型。在本研究中，通过天狼星红染色测量的纤维化增加伴随着胶原蛋白转录水平的增加和mir29c水平的降低。

实例2

将miR29递送至DMD小鼠减少纤维化

初步研究已经证明，在人类DMD患者和mdx/utrn^+/-小鼠中，天狼星红染色胶原蛋白显著增加并且miR-29c水平降低。使用肌肉特异性AAV载体基因递送miR-29可能是安全和有效的。为了产生rAAV载体(本文中被称为rAAVrh.74.CMV.miR29c)，将22个核苷酸的miR29c序列(靶链SEQ ID NO:3和引导链SEQ ID NO:4)克隆到由CMV启动子驱动的miR-30支架中。将表达盒(SEQ ID NO:2)克隆到自身互补的AAV质粒中，并使用已知在肌肉中表达良好的血清型AAVrh.74包装。在miR-30骨架中，使用含有miR-29c靶(正义)链、miR-30茎环和miR-29c引导(反义)链的定制引物合成miR-29c cDNA。修改了miR-29c序列的三个碱基。然后将此序列克隆到含有由CMV启动子和polyA序列驱动的质粒的自身互补的AAV ITR中。

如图1所示，pAAV.CMV.miR29C质粒在miR-30茎环骨架中含有mir29c cDNA，其侧翼为AAV2反向末端重复序列(ITR)。正是这个序列被衣壳化到AAVrh.74病毒粒子中。另外，miR-29c靶序列中的一些核苷酸在此位点被改变为模拟Watson-crick配对，如在shRNA-miR(luc)中。根据ShRNA-luc设计，发夹应在其整个长度上完全互补。此外，过客链的变化越多，消除任何调节miR-29加工的内源性机制的可能性就越大，这种机制可以通过茎识别miRNA。引导链的第19个碱基被修改为一个胞嘧啶以模仿在天然mi-29C序列中先于裂解位点的核苷酸并且在另一链上的相应碱基被改变以保留配对。

将基因治疗载体scrAAVrh.74.CMV.miR29c(1×10¹¹vgs)注射到3个月大的mdx/utrn^+/-小鼠的股四头肌中。通过天狼星红染色分析注射后第3个月的股四头肌并通过NIHImageJ软件分析，其被描述于Nevo等人《公共科学图书馆：综合(PloS One)》2011年；6:el8049。通过RT-PCR定量miR29c、胶原蛋白和弹性蛋白水平。将miR-29c递送至年轻mdx/utrn^+/-小鼠显著增加mir-29c水平和6个月大的mdx/utrn^+/-小鼠(注射后第3个月)的股四头肌中的天狼星红染色的显著降低。当通过RT-PCR评估时，处理的肌肉中的胶原蛋白和弹性蛋白水平降低。

在mdx/utrn^+/-小鼠和肌营养不良蛋白缺陷患者中增加的纤维化和降低的miR29表达的示范证实了小鼠模型作为人类疾病的代表。使用AAV递送的miR29作为抗纤维化疗法的初步结果表明，在天狼星红染色和胶原蛋白和弹性蛋白水平中的降低具有显着的有益效果，这些是纤维化的关键因素。

实例3

注射MiR-29c减少胶原蛋白并且恢复miR-29c

为了确定rAAVrh.74.CMV.MiR-29c是否可以减少纤维化，12周龄的mdx/utrn^+\-小鼠以5x10¹¹vgs的量接受肌内注射rAAVrh.74.CMV.MiR-29c到左侧腓肠肌(GAS)。在注射后第12周分析小鼠。与未处理的对侧mdx/utrn^+/-GAS肌肉相比，苦味酸天狼星红染色显示整个GAS肌肉中的胶原染色显著降低(图2a)。苦味酸天狼星红染色的定量显示，与未处理的肌肉相比，处理的肌肉的胶原蛋白减少了18.3％(处理的23.3％±1.3对比未处理的29.5％±0.7)(图2b)。为了确认miR-29c在处理肌肉中的过表达，从24周龄WT、miR-29c处理的和mdx/utrn^+/-小鼠的GAS肌肉中提取总RNA，并进行miR-29c表达的定量逆转录-PCR(qRT-PCR)分析。结果显示，与未处理的小鼠相比，处理的小鼠的GAS肌肉中miR-29c显著增加(图2d)。

实例4

MiR-29c改善绝对和特异性肌肉力量但不能防止收缩诱导的损伤

已知纤维化可影响肌肉功能，我们想通过增加MiR-29c的表达以减少纤维化测试是否可以防止mdx/utrn^+/-肌肉免受收缩诱导的损伤并增加整体力量。评估了用rAAVrh.74.CMV.MiR-29c处理的mdx/utrn^+/-小鼠的腓肠肌的功能特性。注射后第12周，分离GAS以进行体内力测量。

GAS程序遵循列于(Hakim等人《分子医学方法(Methods Mol Biol.)》2011年；709:75-89)中的方案，其用于分析横向腹部肌肉生理学但适用于GAS。简而言之，使用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠。移除后肢皮肤以暴露GAS肌肉和跟腱。解剖出远端肌腱，并且围绕肌腱用4-0缝线绑一个双方结，缝线尽可能靠近肌肉，另一个第二个双方结紧贴在第一个结的旁边，然后切断肌腱。暴露的肌肉不断用盐水沾湿。然后将小鼠转移到热控平台并保持在37°。通过髌骨肌腱(将肌腱缝合到力传感器(Aurora Scientific，加拿大安大略省奥罗拉)的水平臂上)用针将膝盖固定在平台上，并用胶带固定足部。通过双极铂电极刺激坐骨神经引发GAS肌肉收缩。一旦肌肉稳定，通过逐渐拉伸肌肉直到达到最大抽搐力以确定最佳长度。休息3分钟后，在50、100、150和200Hz下刺激GAS，每次刺激之间有1分钟的休息时间，以确定最大的强直力。测量肌肉长度。在休息5分钟后，评估GAS肌肉对收缩诱导的损伤的易感性。刺激500毫秒后，肌肉延长了最佳长度的10％。这包括在150Hz下刺激肌肉700毫秒。刺激后，肌肉恢复到最佳长度。每分钟重复所述循环，总共5个循环。通过将最大强直力除以GAS肌肉横截面积以计算比力。在离心收缩后，然后使小鼠安乐死并解剖出GAS肌肉、称重并冷冻用于分析。

对每个GAS进行一系列重复的离心收缩。通过比较每次收缩与第一次收缩的力比，显示在第五次收缩后，未处理的肌肉衰退至0.56±0.05对比处理的0.50±0.04(p≤0.0001)。与WT对照相比，注射组显示保护程度略微降低，其衰减至0.92±0.02(图3c)。此数据显示，通过增加miR-29c的表达以减少纤维化导致绝对力和比力的增加，但是不能显著保护肌肉免受收缩诱导的损伤。

当与未处理的mdx/utrn^+/-GAS肌肉相比时，rAAVrh.74.MiR-29c处理的GAS肌肉显示出绝对力的显著改善(rAAV.miR-29c的2277±161.7对比mdx/utrn^+/-未处理的1722±145.7；图3a)，并且当与未处理的GAS肌肉相比时，rAAVrh.74.miR-29c处理的GAS肌肉中的归一化比力特定改善(rAAV.miR-29c的204.7±11.7对比mdx/utrn^+/-未处理的151.6±14.5；图3b)。与野生型对照相比，力仍然显着降低(rAAV.miR-29c的204.7±11.7对比野生型的312.0±34.1)。

实例5

与微肌营养不良蛋白共同递送进一步减少纤维化

为了确定miR-29c/微肌营养不良蛋白联合基因治疗方法是否对减少纤维化更有益，12周龄的mdx/utrn^+\-小鼠以5x10¹¹vgs的量接受肌内注射rAAVrh.74.CMV.MiR-29c到左腓肠肌。将以下基因治疗载体通过肌内注射(IM)施用于3月龄mdx/utrn^+/-小鼠(DMD鼠模型)的左腓肠肌(GAS)肌肉中：单独的scAAVrh.74.CMV.miR-29c、与rAAVrh.74.MCK.微肌营养不良蛋白共同递送和单独的rAAVrh.74.MCK.微肌营养不良蛋白。

pAAV.MCK.微肌营养不良蛋白质粒含有侧翼为AAV2反向末端重复序列(ITR)的人类微肌营养不良蛋白cDNA表达盒，如图10所示。正是这个序列被衣壳化到AAV rh.74病毒粒子中。通过将驱动密码子优化的人类微肌营养不良蛋白cDNA序列的MCK表达盒插入AAV克隆载体中构建pAAV.MCK.微肌营养不良蛋白质粒，如在Rodino-Klapac等人《分子治疗(MolTher.)》2010年1月；18(1):109-17中所述。MCK启动子/增强子序列用于驱动肌肉特异性基因表达，并且由与351bp MCK核心启动子(近端)融合的小鼠MCK核心增强子(206bp)组成。核心启动子之后，存在的53bp内源小鼠MCK外显子1(非翻译的)用于有效转录起始，接着是SV40晚期16S/19S剪接信号(97bp)和小5'UTR(61bp)。内含子和5'UTR衍生自质粒pCMVβ(Clontech)。微肌营养不良蛋白盒在ATG开始和用于mRNA终止的小的53bp合成polyA信号前立即具有共识Kozak。人类微肌营养不良蛋白盒含有(R4-R23/Δ71-78)结构域。互补DNA经人工密码子优化，并由GenScript(新泽西州皮斯卡塔韦)合成。

在注射后第12周和第24周分析小鼠。首先，使用表达微肌营养不良蛋白的肌纤维的数量来评估转基因递送的功效并确保我们在每组中具有相似水平的微肌营养不良蛋白表达。我们发现，与miR-29c/微肌营养不良蛋白联合治疗(75.03±1.91％)相比，单独使用微肌营养不良蛋白治疗组(71.85±2.25％)的微肌营养不良蛋白没有差异(图4)。

在注射后第12个月分析GAS肌肉以通过天狼星红染色和随后的ImageJ定量评估胶原蛋白积累。其他结果包括miR-29c和胶原蛋白转录水平、GAS肌肉力测量、纤维直径测量和参与肌肉再生(MyoD、肌细胞生长素)的蛋白质的Western印迹分析。通过苦味酸天狼星红染色分析纤维化的量，其显示与未治疗的对侧mdx/utrn^+/-GAS肌肉或单独的微肌营养不良蛋白相比，在所有治疗组中整个GAS肌肉中的胶原染色显著降低(图5a)。对苦味酸天狼星红染色的定量显示，与未处理的肌肉相比，共处理的肌肉的胶原蛋白具有40.8％的减少(处理的17.47％±0.75对比未处理的29.5％±0.7)(图5b)。为了确认miR-29c的表达，对GAS肌肉进行qRT-PCR，并且与未处理的肌肉相比，所有治疗组的miR-29c均增加(图5c)。

类似于DMD组织，观察到mdx/utrn^+/-肌肉中miR-29c水平显著降低，其与通过苦味酸天狼星红染色测量的增加的纤维化相关。单独用scAAV.miR-29c治疗3个月后，GAS肌肉中的纤维化显著减少(处理的23.5％±1.3对比未处理的27.8％±0.6)。当与微肌营养不良蛋白共同递送时，通过苦味酸天狼星红染色观察到胶原蛋白的进一步减少(41％)(联合治疗的：17.47％±0.75对比未处理的：29.5％±0.7)(p<0.0001)(图5b)。为了确认miR-29c的表达，对GAS肌肉进行qRT-PCR，并且与未处理的肌肉相比，所有治疗组的miR-29c均增加(图5b)。

在注射后第24周，结果与注射后第12周观察到的结果相似。与未处理的肌肉相比，苦味酸天狼星红染色使胶原蛋白减少47％(联合治疗的：16.5±1.23对比未处理的：31.07±0.93；p<0.0001)和miR-29c转录水平的同时增加。

为了进一步验证通过苦味酸天狼星红染色观察到的胶原蛋白减少，对肌肉进行qRT-PCR以量化Col1A、Col3A和另一种ECM组分、纤连蛋白(Fbn)的转录水平。qRT-PCR分析检测到每次治疗后Col1A和Col3A的减少，但是只有用微肌营养不良蛋白和miR-29c处理的组显示出显著的减少(图6a和6b)。分析显示Fbn仅在共处理的组中显著降低(图6c)。

先前已显示TGF-β1在营养不良肌肉中上调，其可能在纤维化级联的起始中起作用。TGF-β1是已知的促纤维化细胞因子，其下调miR-29c并且负责将成肌细胞转化为肌成纤维细胞，同时增加胶原蛋白和肌纤维化发生。qRT-PCR分析显示，与未注射的肌肉和单独任一处理相比，共处理的肌肉具有显著更低水平的TGF-β1(图6d)。在注射后第6个月，共处理的肌肉继续显示降低的Col1A、Col3A、Fbn和TGF-β1水平，而在miR-29和微肌营养不良蛋白的单独组中仅观察到Col1A mRNA水平的轻微降低。

与未处理的肢体相比，仅用miR-29c处理的肌肉中观察到比力和绝对力的增加，当与微肌营养不良蛋白结合时，导致绝对力和比力与野生型没有显著差异。我们还观察到共处理的那些肌肉中腓肠肌重量的显著增加。

使用rAAV.miR-29c作为抗纤维化疗法的初步结果表明，对胶原水平(纤维化的关键因素)降低具有有益效果。此外，当与微肌营养不良蛋白结合以改善膜稳定性时，miR29上调使肌肉力量正常化。

实例6

进一步增加绝对力并增加保护以免受收缩诱导的损伤

已知miR-29处理的肌肉的绝对力和比力具有适度但显著的增加，研究了miR-29c过表达和微肌营养不良蛋白基因替代对肌肉功能的影响的组合疗法。注射后第12周，我们分离了我们进行体内力测量的GAS。上述实例2中描述的rAAVrh.74.MiR-29c载体和rAAV

当与未处理的mdx/utrn^+/-GAS肌肉相比时，共处理的rAAVrh.74.MiR-29c和表达Micro-Dys的rAAV处理的GAS肌肉显示出绝对力的显著改善(共处理的3582.4±79.4nM对比mdx/utrn^+/-未处理的1722±145.7nM对比野生型的3005±167.3nM)(图7)，并且当与未经处理的GAS肌肉相比时，rAAVrh.74.miR-29c/micro-dys处理的GAS肌肉中的归一化比力具有特定改善(共处理小鼠的244.2±6.6nM/mm²对比mdx/utrn^+/-未处理的151.6±14.5nM/mm²对比312.0±34.1nM/mm²)(图7)。绝对力和比力与野生型对照没有显著差异。

对每个GAS进行一系列重复的离心收缩。通过比较每次收缩与第一次收缩的力比，显示在第五次收缩后，未处理的肌肉衰退至0.54±0.06，而共处理的0.66±0.04(p≤0.0001)，这可能是由于微肌营养不良蛋白，因为单独的微肌营养不良蛋白也衰减至0.66±0.04。处理组仍显著低于野生型，野生型衰减至0.92±0.02(图7c)。在注射后第24周观察到类似的发现。此数据显示减少纤维化和基因替代使得绝对力和比力增加并且显着保护肌肉免受收缩诱导的损伤。

实例7

组合治疗增加肌肉肥大和增生

与在三个月大时与单独注射任一种相比，与微肌营养不良蛋白共同递送的MiR-29c增加了注射的腓肠肌的总重量(图8、图9a)。为了研究肌肉质量增加的来源，测量肌纤维直径。miR-29c/μ-dys组合治疗表明平均纤维尺寸增加。比较mdx/utrn^+/-对照与miR-29c/μ-dys处理的mdx/utrn^+/-，平均直径从25.96增加到30.97μm(图9b)。共同递送产生向野生型纤维尺寸分布的转变(图9c)。虽然平均纤维大小增加并不能解释总肌肉重量增加约30％。还测量了肌肉的总横截面积。所有组的腓肠肌全玻片扫描并测量总面积。与未处理和单独任一种处理相比，用micro-dys/miR-29c共处理的肌肉的横截面积显著增加(未注射的：24.6对比miR-29c：26.3对比micro-dys：26.6对比micro-dys/miR-29c：33.1)(图8、图9d)。

已经报道miR-29c在myoD/Pax7/肌细胞生成素途径中起作用，并且假设miR-29c可能影响卫星细胞(肌肉干细胞)的再生和活化以在肌原性谱系中分化。为了测试这一点，计算来自全玻片扫描图像的肌纤维总数。miR-29c/μ-dys组合治疗后肌纤维数量增加(图9e)。最后，考虑到mdx/utrn^+/-小鼠中的肌纤维直径与许多小纤维和一些肥大纤维是异质的，确定每单位面积的纤维数(细胞/平方毫米)是否受到治疗的影响。miR-29c/μ-dys组合治疗与野生型没有差异(图9f)。

实例8

组合早期治疗预防纤维化

鉴于组合miR-29c和微肌营养不良蛋白作为DMD的预防性治疗的潜在重要性，在4周龄时处理一组较年轻的mdx/utrn^+/-小鼠。使用与本文所述的其他组相同的范例，比较以下治疗通过肌内注射GAS预防纤维化的功效：单独scAAVrh.74.CMV.miR-29c、ssAAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白和scAAVrh.74.CMV.miR-29c组合治疗、或单独使用相同剂量的ssAAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。注射后第12周对小鼠进行尸检。观察到与未处理的对侧mdx/utrn^+/-GAS肌肉相比，所有处理组的整个GAS肌肉中胶原蛋白染色显著减少(图10A)。苦味酸天狼星红染色的定量显示，与未处理的肌肉相比，用微肌营养不良蛋白/miR-29c共处理的肌肉的胶原蛋白减少了51％(处理的11.32％±1.18对比未处理的23.15％±0.90)(p<0.0001)(图10)并且qRT-PCR证实组合疗法后的Col1A、Col3A、Fbn和TGF-β1减少(图10D和E)。

实例9

早期组合治疗比晚期治疗恢复力和保护免受收缩诱导的损伤更好

如实例8中所述，在用组合疗法早期治疗的小鼠的GAS上进行体内力测量。与未处理的mdx/utrn^+/-小鼠相比，在4周龄的mdx/utrn^+/-小鼠中使用miR-29c/微肌营养不良蛋白共处理显示出绝对力的显著改善，并且与野生型无差异(共处理的：2908±129.5mN对比未处理的：1639.4±116.9mN对比野生型的：3369.73±154.1mN)。在组合治疗后，比力也归一化为野生型水平(共处理的338.9±22.34mN/mm²对比未处理的184.3±13.42mN/mm²对比WT364.3±7.79mN/mm²)(图11A和B和12)。

接下来，对每个GAS进行一系列重复的离心收缩。通过比较每次收缩与第五次收缩的力比，未处理的肌肉衰减至0.53±0.04，而共处理的0.82±0.04(p<0.0001)。组合治疗组略低于野生型但没有显著差异，野生型衰减至0.93±0.01(图11C)。这些数据表明，减少纤维化和基因替代导致绝对力和比力的增加，并显著保护肌肉免受收缩诱导的损伤。

这些实验表明基因替代应该在新生期开始。努力显然正朝着在新生期识别DMD和其他肌营养不良症的方向发展。俄亥俄州新生儿筛查研究表明使用CK7Neurol.作为具有在相同的干血斑上进行DNA确证的生物标志物(>2000U/L)鉴定新生儿DMD的可能性(Mendell等人《神经学年鉴(Ann.Neurol.)》2012年；71:304-313)。这种方法现在正在扩展到美国其他州(PPMD 2016年5月16日：新生儿筛查的后续步骤)和其他国家，特别是英国(英国国家筛查委员会)和中国(Perkin Elmer^TM在中国开展筛查)。

miR-29还显示出作为治疗心脏、肺和肝脏纤维化的方式的前景。小鼠和人类的心肌梗塞与miR-29下调有关。Rooij等人(《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci,USA)》2008年；105:13027-13032)证明，将成纤维细胞暴露于miR-29b模拟物减少了胶原蛋白转录，为心脏纤维化的临床转化提供了途径。随后的研究表明，在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中，使用基于睡美人(SB)转座子系统的miR-29b.14的递送可以实现纤维化的减弱。目前，miR-29b模拟物处于健康志愿者中的临床1期安全性-耐受性局部皮内试验(miRagen治疗学^TM MRG-201)。对比与寡核苷酸半衰期相关的miR-29寡核苷酸递送需要重复给药，AAV基因治疗可能为单次递送基因转移提供了途径。

实例10

miR-29和微肌营养不良蛋白的肌肉特异性表达治疗减少纤维化和ECM表达

还产生包含miR29c序列和肌肉特异性启动子MCK的AAV载体，并且所述AAV载体与表达微肌营养不良蛋白的AAV载体作为组合疗法进行测试。为了产生rAAV载体(本文中称为rAAV.MCK.miR29c)，将22个核苷酸的miR29c序列(靶链SEQ ID NO:3和引导链SEQ ID NO:4)克隆到由MCK启动子驱动的miR-30支架中(SEQ ID NO:11)。将表达盒(SEQ ID NO:12)克隆到单链AAV质粒中，并使用已知在肌肉中良好表达的血清型AAVrh74包装。在miR-30骨架中使用含有miR-29c靶(正义)链、miR-30茎环和miR-29c引导(反义)链的定制引物合成miR-29c cDNA。修改了miR-29c序列的三个碱基。然后将此序列克隆到含有由MCK启动子和polyA序列驱动的质粒的单链AAV ITR中。

pAAV.MCK.miR29C质粒在miR-30茎环骨架中含有mir29c cDNA，其侧翼为AAV2反向末端重复序列(ITR)。正是这个序列被衣壳化到AAVrh74病毒粒子中。另外，miR-29c靶序列中的一些核苷酸在此位点被改变为模拟Watson-crick配对，如在shRNA-miR(luc)中。根据ShRNA-luc设计，发夹应在其整个长度上完全互补。此外，过客链的变化越多，消除任何调节miR-29加工的内源性机制的可能性就越大，这种机制可以通过茎识别miRNA。引导链的第19个碱基被修改为胞嘧啶以模仿在天然mi-29c序列中先于裂解位点的核苷酸并且在另一链上的相应碱基被改变以保留配对。

AAV.MCK.miR-29c/微肌营养不良蛋白组合疗法的早期治疗在减少纤维化和ECM表达方面更有效。4至5周龄的mdx/utrn^+\-小鼠以5x10¹¹vgs的量接受肌内注射rAAVrh.74.MCK.MiR-29c和rAAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白到左侧腓肠肌，如实例5中所述。注射后第12周收获肌肉。从未注射的和用rAAV.MCK.miR-29c/rAAV.MCK.微肌营养不良蛋白组合治疗注射的小鼠中收获的肌肉的苦味酸天狼星红红染色显示，与未处理的GAS肌肉相比，共处理的肌肉的胶原蛋白具有50.9％的减少(参见图13a和13b)。qRT-PCR证实了治疗组中miR-29c转录水平的增加(图13c)。半定量qRT-PCR显示与对侧肢体疗法相比，AAV.MCK.miR-29c/AAV.微肌营养不良蛋白处理的肌肉中胶原蛋白A1和胶原蛋白3A(图13d、e)、纤连蛋白(图13f)和Tgfβ1(图13g)水平显著降低。(*p<0.05，****p<0.0001)。AAV.MCK.miR-29c/微肌营养不良蛋白组合疗法的晚期治疗可有效减少纤维化和ECM表达。三个月大的mdx/utrn^+\-小鼠以5x10¹¹vgs的量接受肌内注射rAAVrh.74.MCK.MiR-29c和rAAVrh.74.MCK.微肌营养不良蛋白到左侧腓肠肌，如实例5中所述。注射后第12周收获肌肉。未注射的、AAV.MCK.miR-29c和AAV.MCK.miR-29c/AAV.微肌营养不良蛋白处理的肌肉的苦味酸天狼星红红染色显示，与未处理的GAS肌肉相比，共处理的肌肉的胶原蛋白具有30.3％的减少(参见图14a和14b)。qRT-PCR证实了治疗组中miR-29c转录水平的增加(图14c)。半定量qRT-PCR显示与对侧肢体相比，AAV.miR-29c/AAV.微肌营养不良蛋白处理的肌肉中胶原蛋白1A和胶原蛋白3A(图14d、e)、纤连蛋白(图14f)和Tgfβ1(图14G)水平显著降低。单因素方差分析。所有数据均代表平均值±SEM。(**p<0.01，****p<0.0001)。

实例11

早期组合治疗比晚期治疗恢复力和保护免受收缩诱导的损伤更好

如在实例8和9中所述，在早期用miR-29和微肌营养不良蛋白的肌肉特异性表达处理的小鼠的GAS上进行体内力测量。与未处理的mdx/utrn^+/-小鼠相比，在4周龄的mdx/utrn^+/-小鼠中使用rAAV.MCK.miR-29c/和表达微肌营养不良蛋白的rAAV共处理显示出绝对力的显著改善，并且与野生型无差异(图15a)。在组合治疗后，比力也归一化为野生型水平(图15b)。

然后如实例9中所述评估肌肉在重复的离心收缩后的力损失。与未处理的mdx/utrn^+\-肌肉相比，用rAAV.MCK.miR-29c/rAAV.MCK.微肌营养不良蛋白共处理的和单独的rAAV.MCK.微肌营养不良蛋白处理的小鼠显示出对力的损失的保护(图15c)。

在12周龄的mdx/utrn^+\-小鼠中，使用rAAV.MCK.miR-29c/和表达微肌营养不良蛋白的rAAV的共同治疗恢复了力并且保护免受收缩诱导的损伤。与未处理的mdx/utrn^+/-肌肉相比，rAAV.MCK.miR-29c和表达微肌营养不良蛋白的rAAV注射的GAS肌肉在强直性收缩之后绝对力(图16a)和归一化比力(图16b)的测量值显著增加。随后，如实例9中所述，评估肌肉在重复的离心收缩后的力损失。与未处理的mdx/utrn^+\-肌肉相比，用MCK.miR-29c/微肌营养不良蛋白共处理的小鼠显示出对力的损失的保护(图16c)。这些数据表明，减少纤维化和基因替代导致绝对力和比力的增加，并显著保护肌肉免受收缩诱导的损伤。

实例12

早期组合治疗增加肌肉肥大和增生

注射后三个月与任一单独注射相比，rAAV.MCK.miR-29与表达微肌营养不良蛋白的rAAV的共同递送不会增加注射的腓肠肌的总重量(图17a)。还测量了肌纤维直径。miR-29c/微肌营养不良蛋白组合治疗表明平均纤维尺寸增加。将mdx/utrn^+/-对照与miR-29c/微肌营养不良蛋白处理的mdx/utrn^+/-进行比较，平均直径从28.96增加至36.03μm(图17b)。共同递送产生向野生型纤维尺寸分布的转变(图17c)。miR-29c/微肌营养不良蛋白组合治疗中每平方毫米的肌纤维的数量显著低于未处理的小鼠和野生型(图17d；***p<0.01，****p<0.0001)。

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Claims (24)

1.一种重组AAV载体，其包含

a)与核苷酸序列SEQ ID NO:7具有至少85％同一性并编码功能性微肌营养不良蛋白的核苷酸序列，

b)SEQ ID NO:7的核苷酸序列，或

c)SEQ ID NO:9的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组AAV载体，其中所述载体是血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13。

3.根据权利要求1或2所述的重组AAV载体，其中所述多核苷酸序列与肌肉特异性控制元件可操作地连接。

4.根据权利要求3所述的重组AAV载体，其中所述肌肉特异性控制元件是人类骨骼肌动蛋白基因元件、心肌肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子mef、肌肉肌酸激酶(MCK)、截短的MCK(tMCK)、肌球蛋白重链(MHC)、C5-12、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白c基因元件、慢缩心肌肌钙蛋白c基因元件、慢缩肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素响应元件(gre)。

5.根据权利要求3或4所述的重组AAV载体，其中所述肌肉特异性控制元件包含SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11的核苷酸序列。

6.一种组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的重组AAV载体。

7.一种治疗肌营养不良症或肌营养不良蛋白病的方法，其包含施用治疗有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的重组AAV载体或根据权利要求6所述的组合物。

8.一种减轻或预防患有肌营养不良症或肌营养不良蛋白病的受试者的纤维化的方法，其包含施用治疗有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的重组AAV载体或根据权利要求6所述的组合物。{3}

9.一种增加患有肌营养不良症或肌营养不良蛋白病的受试者的肌肉力量或肌肉质量的方法，其包含施用治疗有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的重组AAV载体或根据权利要求6所述的组合物。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述重组AAV载体或所述组合物通过肌内注射、静脉内注射、肠胃外给药或全身给药来施用。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述重组AAV在所述受试者中观察到纤维化之前或在所述受试者中肌肉力量减少之前或在所述受试者中肌肉质量减少之前施用。

12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述肌营养不良症是杜氏肌营养不良症或贝克肌营养不良症。

13.一种组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的重组AAV载体，用于治疗肌营养不良症。

14.一种组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的重组AAV载体，用于减轻或预防患有肌营养不良症的受试者的纤维化。

15.一种组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的重组AAV载体，用于增加患有肌营养不良症的受试者的肌肉力量。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的组合物，其中所述组合物在所述受试者中观察到纤维化之前或在所述受试者中肌肉力量减少之前或在所述受试者中肌肉质量减少之前施用。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的组合物，其中所述受试者患有杜氏肌营养不良症或贝克肌营养不良症。

18.根据权利要求1至5中任一项所述的重组AAV载体或根据权利要求6所述的组合物在制备用于治疗肌营养不良症的药物中的用途。

19.根据权利要求1至5中任一项所述的重组AAV载体或根据权利要求6所述的组合物在制备用于减轻或预防患有肌营养不良症的受试者中的纤维化的药物中的用途。

20.根据权利要求1至5中任一项所述的重组AAV载体或根据权利要求6所述的组合物在制备用于增加患有肌营养不良症的受试者的肌肉力量或肌肉质量的药物中的用途。

21.根据权利要求16至18中任一项所述的用途，其中所述药物在所述受试者中观察到纤维化之前或在所述受试者中肌肉力量减少之前或在所述受试者中肌肉质量减少之前施用。

22.根据权利要求18至21中任一项所述的用途，其中所述受试者患有杜氏肌营养不良症或贝克肌营养不良症。

23.根据权利要求13至22中任一项所述的组合物或用途，其中所述组合物或药物被配制用于肌内给药、静脉内注射、肠胃外给药或全身给药。

24.一种产生功能性微肌营养不良蛋白的方法，其包含用根据权利要求1至5中任一项所述的重组AAV载体感染宿主细胞，并且在所述宿主细胞中表达功能性微肌营养不良蛋白。