CN109061022A - 一种茵陈解毒颗粒中绿原酸和栀子苷同时定量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种茵陈解毒颗粒中绿原酸和栀子苷同时定量测定方法。其特征：用简便、快捷的前处理方法得到供试品溶液，采用普通的色谱柱、等度洗脱方式，以体积比为11∶8∶91的乙腈‑甲醇‑0.1％磷酸为流动相，在235±1nm处，同时测定了样品中的绿原酸和栀子苷含量，波峰分离良好，两峰峰面积大小适宜，绿原酸波峰保留时间9分钟左右，栀子苷的保留时间11分钟左右，进样一针，12分钟出峰完毕。实现了定量指标翻倍，监督力度提升，但检测时间和费用并不增加的有益效果。方法简便、快捷、准确、成本低、实用范围广，易于普及掌握。

Description

一种茵陈解毒颗粒中绿原酸和栀子苷同时定量测定方法

技术领域

本发明涉及一种茵陈解毒颗粒中绿原酸和栀子苷同时定量测定方法。

背景技术

茵陈解毒颗粒由茵陈、栀子、虎杖、黄芩和钩藤组成，具有清热解毒，疏肝解痉之功效。作为动物用药，主治雏鸭病毒性肝炎。每1g颗粒相当于原生药1.6g。其君药是茵陈、臣药为栀子，原质量标准有茵陈、栀子、虎杖、黄芩的薄层鉴别和茵陈中的绿原酸定量测定，为确保制剂的质量，拟增加臣药栀子苷的定量测定指标。

茵陈解毒颗粒的组方与制备工艺如下：

【处方】茵陈500～550g、栀子250～275g、虎杖278～330g、黄芩250～275g、钩藤278～330g

【制法】取处方中5味中药，加水煎煮2次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约1500ml，加2倍量乙醇，静置(4℃)24小时，滤过，滤液回收乙醇后浓缩至相对密度1.30～1.35(80℃)的稠膏，加蔗糖、糊精适量，混匀，制粒，低温干燥，制得成品1000g。

处方中茵陈为君药，栀子为臣药。茵陈活性成分主要为挥发油、蒿属香豆素、色原酮类、黄酮类、绿原酸等。中国药典2015年版一部绵茵陈项下，就是以绿原酸为定量测定指标，进行质量控制的。栀子主含环烯醚萜类化合物，有4种主要类型：环烯醚萜烷类、环烯醚萜苷类、环烯醚萜二缩醛酯类和裂环烯醚萜苷类。环烯醚萜基本骨架经环氧化、羟基化及由莽草酸途径得到的芳香酸酯化。导致了该类化合物的多样性，同时也导致其药理活性的多样性。其代表性成分有栀子苷，中国药典2015年版一部栀子项下，就是以栀子苷为定量测定指标，进行质量控制的。在本制剂原质量标准中已增订了君药绿原酸的含量测定方法，但鉴于臣药栀子中的栀子苷含量限度是茵陈中绿原酸的3.6倍，所以拟再增订臣药栀子苷的含量测定指标，以达到高标准地控制茵陈解毒颗粒质量的目的。

为提高检测效率，降低检测成本，本着检测指标增加，效率不减、成本不增加的原则，拟将绿原酸及栀子苷采用同一流动相，同时测定。为此查阅文献得知，有关绿原酸和栀子苷的含量测定，多是采用HPLC法的梯度洗脱的方式进行测定^【1.2】，但要求测定仪器必须带梯度洗脱装置，仪器成本提高，测定范围受到设备的限制。仅查阅到一篇采用等度洗脱，测定茵栀黄(粉针)中绿原酸和栀子苷含量的文章^【3】，其流动相的组合是乙腈-0.4％磷酸溶液-四氢呋喃(9∶91∶0.8)。该流动相的最大缺陷是：磷酸的浓度0.4％太高，其酸性在pH2以下(作者曾精密测定过0.1％的磷酸pH值约为2.1)，不符合中国药典所规定的流动相pH值应在2～8的要求，其次含有刺激性的油状液体四氢呋喃，这两点缺陷，都极易造成色谱柱的C₁₈链的随机卷曲，致使色谱柱理论踏板数快速降低、寿命缩短。

在上述背景情况下，为简便、快捷、科学、规范、多指标控制制剂的质量，发明了采用普通的色谱柱及常用的流动相体系、等度洗脱方式，测定了茵陈解毒颗粒中绿原酸和栀子苷含量。

发明内容

采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为11∶8∶ 81的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相，采用等度洗脱的方式，在235±1nm处，同时测定了茵陈解毒颗粒中的绿原酸和栀子苷含量，波峰分离良好，两峰峰面积大小适宜，绿原酸波峰保留时间9分钟左右，栀子苷的保留时间11分钟左右，进样一针，12分钟出峰完毕。方法简便、快捷、准确、成本低、实用范围广，易于普及掌握。

通过方法学考察，绿原酸的进样量在0.0943～0.7544μg，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝1704378.9X+1220，r＝0.999999(见表1、图1)；栀子苷的进样量在0.19708～1.5766μg，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝1523429.8X+788， r＝0.999999(见表2、图2)；采用加样回收实验，结果表明其平均回收率(n＝6)：绿原酸的为99.25％，RSD为0.62％(见表3)；栀子苷为99.56％，RSD为0.62％(见表4)；精密度(见表5)；稳定性(见表6)；重复性(见表7)；专属性(见图5、6、7、8)等实验数据均符合方法学要求。适用于茵陈解毒颗粒中绿原酸和栀子苷的同时HPLC定量测定。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：

A.色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为11∶8∶81的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；检测波长：235nm；柱温为30℃；理论板数按栀子苷峰计算不低于3000；

B.对照品溶液制备 称取绿原酸和栀子苷对照品适量，加70％甲醇制成每1mL约含绿原酸0.015mg、栀子苷0.026mg的溶液，作为对照品溶液；

C.供试品溶液制备 取茵陈解毒颗粒适量，研细，取约0.4～0.6g，精密称定，精密加70％的甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)15分钟，取下，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤纸滤过，再取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；

D.测定法 分别精密吸取对照品溶液20μl、供试品溶液各10～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明的原理如下：

从绿原酸(图3)和栀子苷(图4)的光谱扫描图谱得知，绿原酸的最大吸收波长在325nm处，而栀子苷的最大吸收波长则在239nm处，若将检测波长都设定在各自的最大波长吸收处，一般要配备二极管阵列检测器，测定仪器成本提高，普及的范围缩小。但如若选择同一吸收波长，且各自的吸收值又都比较大，不但可以调节两成分的波峰面积，使其大小都比较合适，而且只需一台普通的带紫外检测器的仪器，即可完成双成分测定，测定成本降低、普及范围扩大。所以依据图3、4的光谱信息，将测定波长选择在 235nm，该处占栀子苷最大吸收的95％、绿原酸的56.5％，使两波峰的面积大小适宜。而且各自的波峰面积，在一定的范围内，与进样量呈现良好的线性关系，而用于定量测定。

本发明的创新点及有益效果如下：

(1)采用高效液相色谱法，以常用的流动相体系，体积比为11∶8∶81的乙腈- 甲醇-0.1％磷酸为流动相，以等度洗脱的方式，在235±1nm处，同时测定了茵陈解毒颗粒中的绿原酸和栀子苷含量，波峰分离良好，两峰峰面积大小适宜，绿原酸波峰保留时间9分钟左右，栀子苷的保留时间11分钟左右，进样一针，12分钟出峰完毕。方法简便、快捷、准确、成本低、实用范围广，易于普及掌握。

(2)本发明与已报道的梯度洗脱方法相比，不但仪器成本降低、实施普及范围扩大，运行时间比报道文献1和2分别缩短了20分钟和33分钟，两种成分的同时测定，仅需12分钟，是目前运行时间最短的方法(图中给出的整体运行时间是19分钟，目的是为了确认在12分钟之后，已无波峰出现，测定时运行时间可截止在12分钟)。而且供试品溶液的两波峰附近与其他成分波峰分离良好，基线平稳，优于报道文献。

(3)本发明与已报道文献3的等度洗脱方法相比，以常用的流动相体系，乙腈- 甲醇-0.1％磷酸(11∶8∶81)取代了文献中的乙腈-0.4％磷酸-四氢呋喃(9∶91∶0.8)，使流动相的酸性由极易损害色谱柱的pH值2以下提升到色谱柱能承受的符合要求的2 以上，删除了有刺激气味的油状四氢呋喃，有效降低了对色谱柱的损害，延长了其寿命，克服了报道文献的缺陷。不仅如此，还利用了甲醇具有延缓相似相溶成分波峰保留时间，而乙腈具有前提相似相溶成分波峰保留时间的特性，配以磷酸溶液使酸性成分以分子体存在，收缩波峰拖尾的性能，通过无限次甲醇、乙腈和多浓度磷酸间的优选配比研究，寻找到绿原酸波峰保留时间9分钟左右，栀子苷的保留时间11分钟左右，且两波峰附近无无杂质干扰。比参考文献的栀子苷的保留时间14分钟，提前了3分钟，总运行时间至少节约5～8分钟，因为参考文献未给出样品的整体运行图谱，仅是靠提供的样品色谱峰推测的。另对比文献，要求理论板数按绿原酸峰计算不低于10000，该数字说明了报道文献对色谱柱的要求是非常苛刻的，一般的色谱柱是很难达到要求的，也就是难以将各波分彻底分离，导致实用性差。而本申请正好克服了这点，具有很好的实用性。

附图说明

图1 为绿原酸线性关系图。

图2 为栀子苷线性关系图。

图3 为绿原酸酸光谱扫描图。

图4 为栀子苷光谱扫描图。

图5 为绿原酸、栀子苷对照品HPLC色谱图。

图6 为茵陈解毒颗粒HPLC色谱图。

图7 缺茵陈药材的空白样品HPLC色谱图。

图8 缺栀子药材的空白样品HPLC色谱图。

图1、图2中，纵坐标为峰面积；横坐标为进样量(μg)。

图3、图4中，纵坐标为吸收强度(mAU)；横坐标为吸收波长(nm)。

图5、6、7、8中，横坐标为保留时间(分钟)，纵坐标为响应值(uV)，1为绿原峰，2为栀子苷峰。

本发明具体实施方式

实施例

A.色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为11∶8∶81的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；检测波长：235nm；柱温为30℃；理论板数按栀子苷峰计算不低于3000；

B.对照品溶液制备 称取绿原酸和栀子苷对照品适量，加70％甲醇制成每1mL约含绿原酸0.015mg、栀子苷0.026mg的溶液，作为对照品溶液；

C.供试品溶液制备 取茵陈解毒颗粒适量，研细，取约0.4～0.6g，精密称定，精密加70％的甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)15分钟，取下，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤纸滤过，再取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；

D.测定法 分别精密吸取对照品溶液20μl、供试品溶液各10～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得(结果见表8)。

表1 绿原酸进样量与峰面积

表2 栀子苷进样量与峰面积

表3 样品中绿原酸的回收率试验结果

表4 样品中栀子苷的回收率试验结果

表5 精密度试验结果(峰面积)

表6 稳定性试验结果(峰面积)

表7 重复性试验结果(mg/g，n＝2)

表8 茵陈解毒颗粒中绿原酸和栀子苷含量测定结果(n＝2)

参考文献

[1]于红艳，张宾“HPLC法同时测定退黄丸中绿原酸、栀子苷含量”[J]中医学报，2014.29(8) 1170～1171

[2]郝乘仪，冯波，郭淑英等“HPLC法同时测定退黄丸中绿原酸、栀子苷含量”[J]吉林医药学院学报，2017.38(2)93-94

[3]刘影，张磊，于治国等“Rp-HPLC法同时测定茵栀黄(粉针)中绿原酸、栀子苷含量”，[J]药物分析杂志，2006.26(3)352～354。

Claims (2)

1.一种茵陈解毒颗粒中绿原酸和栀子苷同时定量测定方法，其特征在于：

A.色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为11∶8∶81的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；检测波长：235nm；柱温为30℃；理论板数按栀子苷峰计算不低于3000；

B.对照品溶液制备称取绿原酸和栀子苷对照品适量，加70％甲醇制成每1mL约含绿原酸0.015mg、栀子苷0.026mg的溶液，作为对照品溶液；

C.供试品溶液制备取茵陈解毒颗粒适量，研细，取约0.4～0.6g，精密称定，精密加70％的甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)15分钟，取出，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤纸滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；

D.测定法分别精密吸取对照品溶液20μl、供试品溶液10～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.根据权利要求1所述的一种茵陈解毒颗粒中绿原酸和栀子苷同时定量测定方法，其特征在于所述的茵陈解毒颗粒由茵陈、栀子、虎杖、黄芩和钩藤组成，每1g颗粒含1.6g生药材。