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CN109021093B - 聚乙二醇修饰的glp-1衍生物及其药用盐 - Google Patents

聚乙二醇修饰的glp-1衍生物及其药用盐 Download PDF

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CN109021093B
CN109021093B CN201810995139.2A CN201810995139A CN109021093B CN 109021093 B CN109021093 B CN 109021093B CN 201810995139 A CN201810995139 A CN 201810995139A CN 109021093 B CN109021093 B CN 109021093B
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Abstract

本发明提供了聚乙二醇修饰的GLP‑1衍生物及其药用盐。所述的GLP‑1衍生物的序列为HX1EGTFTSDVSSYLEX2QAAKEFIAWLVKGRGCX3‑NH2，其中X1选自Aib、Ala、Ser或D‑Ala，X2为Gly或Glu，X3为Gly或无。本发明的修饰型GLP‑1衍生物具有优秀的降血糖功效且在体内的半衰期长，不易被肾脏清除或酶降解，此外，还具有人体异源性较小，不易引起免疫应答，生理毒性小，安全性更高等优点。

Description

聚乙二醇修饰的GLP-1衍生物及其药用盐
技术领域
本发明涉及GLP-1衍生物及其药用盐，具体涉及一种修饰型的GLP-1衍生物及其药用盐及其制备方法。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是人小肠远端L细胞分泌的具有降血糖功效的肠肽激素，其氨基酸序列为HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。GLP-1的主要生理作用机制包括增强血糖依赖性胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌和减慢胃排空速率。GLP-1的促胰岛素分泌作用还具有血糖依赖性，避免低血糖风险。胃排空速率下降，葡萄糖吸收速率也随之减缓，则餐后血糖的波动幅度减小，因此GLP-1在控制餐后血糖方面比胰岛素起着更为重要的作用。此外，GLP-1还可增加饱腹感、降低食欲，进而减轻体重。而且，二型糖尿病的治疗过程中，体重增加会加重患者体内胰岛素抵抗，导致多种代谢紊乱，因此GLP-1能减轻体重的独特优势使其在二型糖尿病治疗方面极具市场竞争力。然而，虽然GLP-1具有突出的降糖活性，但其体内半衰期很短无法成为良好的二型糖尿病用药物。除调控血糖外，GLP-1受体激动剂还具有刺激β细胞增生、抑制β细胞凋亡、减轻胰岛素抵抗、保护心血管系统等作用。
目前已有对GLP-1序列进行改造，虽相对未改造序列具有较长的体内半衰期，但这些GLP-1衍生物仍然易于从肾脏清除且会被体内广泛存在的二酰基肽酶-4、NEP-24.11酶降解，因而体内半衰期不理想。此外，现有的改进体内半衰期的方法一般为更改GLP-1序列，以提高体内半衰期。但是序列与人体的异源性越大，人体的免疫反应越强，使得现有的经过改进GLP-1序列的进而提升了体内半衰期的衍生物还不能满足治疗需要。因此，目前已有的GLP-1衍生物在应用于二型糖尿病治疗时，其体内半衰期仍不理想。例如，市售药物百泌达为化学合成艾塞那肽，需一天给药两次。
综上所述，本领域迫切需要开发具有优秀降血糖功效并且体内半衰期理想且异源性较小的修饰型GLP-1衍生物及其药用盐。
发明内容
本发明的目的就是提供具有优秀降血糖功效并且体内半衰期理想且异源性较小的修饰型GLP-1衍生物及其药用盐。
在本发明的第一方面，提供了一种修饰型GLP-1衍生物及其药用盐，其中，所述的修饰型GLP-1衍生物的序列为：
HX1EGTFTSDVSSYLEX2QAAKEFIAWLVKGRGCX3-NH2，
其中，X1选自Aib，Ala、Ser或D-Ala，X2为Gly或Glu，X3为Gly或无；
且序列上的一个或多个(1、2或3个)氨基酸残基经聚乙二醇(PEG)修饰。
在另一优选例中，所述的聚乙二醇为分枝型聚乙二醇。
在另一优选例中，所述的聚乙二醇为马来酰亚胺聚乙二醇。
在另一优选例中，所述的聚乙二醇的分子量为10KD～60KD。
在另一优选例中，所述的聚乙二醇的分子量为20KD～40KD。
在另一优选例中，所述的聚乙二醇的分子量为10KD～30KD。
在另一优选例中，所述的聚乙二醇的分子量为30KD～50KD。
在另一优选例中，所述的聚乙二醇为二分枝型聚乙二醇。
在另一优选例中，所述的聚乙二醇通过GLP-1衍生物的半胱氨酸(Cys)残基修饰于所述的GLP-1衍生物上。
在另一优选例中，所述的聚乙二醇的结构为：
Figure BDA0001781694430000021
在另一优选例中，X1为Aib,，Ala或Ser。
在另一优选例中，所述的修饰型GLP-1衍生物为
His——Ala——Glu——Gly——Thr——Phe——Thr——Ser——Asp——Val——Ser——
Ser——Tyr——Leu——Glu——Gly——Gln——Ala——Ala——Lys——Glu——Phe——
Ile——Ala——Trp——Leu——Val——Lys——Gly——Arg——Gly——Cys-NH2
Figure BDA0001781694430000031
本发明的第二方面提供了一种制备一种修饰型GLP-1衍生物及其药用盐的方法，包括步骤：
用GLP-1衍生物和聚乙二醇进行偶联反应，得到经修饰的GLP-1衍生物。
在另一优选例中，所述的偶联反应在pH＝6～9的缓冲溶液中进行，优选为缓冲溶液pH＝7～8。
在另一优选例中，所述的偶联反应的反应时间为0.5～6h；优选地，所述的偶联反应的反应时间为3～5h。
在另一优选例中，所述的偶联反应的反应温度为0～25℃；优选地，为0～15℃；更优选地，为1～6℃。
在另一优选例中，所述的GLP-1衍生物与所述聚乙二醇的摩尔比为1∶0.5～1∶5。
在另一优选例中，所述的GLP-1衍生物与所述聚乙二醇的摩尔比为1∶1～1∶4，优选为1∶2～1∶3。
在另一优选例中，所述方法包括下述步骤：
a.取所述的GLP-1衍生物和修饰用聚乙二醇；其中，所述的GLP-1衍生物与所述的修饰用聚乙二醇的摩尔比为1∶0.5～1∶5；
b.将所述的GLP-1衍生物与所述的修饰用聚乙二醇溶于pH＝6～9的缓冲溶液中，获得反应混合物；
c.0～25℃下，所述的反应混合物在搅拌下反应0.5～6h；
d.分离获得经修饰的GLP-1衍生物。
在另一优选例中，步骤b中，所述的反应混合物中，所述的GLP-1衍生物的浓度为0.3～5mg/ml，优选为0.5～2mg/ml。
在另一优选例中，步骤b中，所述的缓冲溶液为磷酸缓冲液。
在另一优选例中，步骤c中，所述的反应混合物在0～15℃下反应，优选地，在1～6℃下反应。
在另一优选例中，所述的GLP-1衍生物的聚乙二醇修饰率为70～99％。
本发明的第三方面提供了一种药物组合物，其包含如本发明第一方面所提供的修饰型GLP-1衍生物及其药用盐。
在另一优选例中，所述的药物组合物为用于治疗二型糖尿病的药物组合物。
本发明的第四方面提供了一种如第一方面所述的修饰型GLP-1衍生物及其药用盐和如第三方面所述的药物组合物的用途，用于治疗糖尿病(优选地二型糖尿病)。
本发明的第五方面提供了一种体外非治疗性控制和/或降低血糖浓度的方法，所述的方法包括：向非人目标施用如第一方面所述的修饰型GLP-1衍生物及其药用盐或如第三方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的方法为以100～1000nmol/kg(优选地，以200～600nmol/kg)(修饰型GLP-1衍生物及其药用盐/目标重量)的量向非人目标施用所述修饰型GLP-1衍生物及其药用盐或所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述血糖浓度包括空腹血糖浓度及急性血糖浓度。
本发明的第六方面提供了一种治疗糖尿病(优选地，二型糖尿病)的方法，所述方法包括：施用如第一方面所述的修饰型GLP-1衍生物及其药用盐或如第三方面所述的药物组合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为未修饰的GLP-1衍生物小鼠体内急性血糖测试结果。
图2为未修饰的GLP-1衍生物的EC50曲线。
图3为本发明的PEG20KD-GLP-1的EC50曲线。
图4为本发明的PEG40KD-GLP-1的EC50曲线。
图5为小鼠体内急性血糖实验结果。
图6为本发明修饰型GLP-1衍生物质谱图
图7为本发明修饰型GLP-1衍生物HPLC图谱
具体实施方式
发明人在经过广泛而深入的研究后，意外地发现了与人体异源性较小但又有优异半衰期及治疗效果的GLP-1衍生物。此外还通过高分子量分枝型马来酰亚胺聚乙二醇修饰如式(I)所示的GLP-1衍生物(序列为HX1EGTFTSDVSSYLEX2QAAKEFIAWLVKGRGCX3-NH2；其中，X1为Abi/Ala/Ser/D-Ala，X2为Gly或Glu，X3为Gly或无)，在不影响降糖活性的情况下大大延长了GLP-1衍生物的体内半衰期，从而获得长时间的降血糖效果。基于此，完成了本发明。
具体地，本发明采用的多肽链的C端都存一个半胱氨酸残基，具有游离巯基。同时采用具有马来酰亚胺活化的分枝型聚乙二醇。在pH 6.5-7.5缓冲溶液中，马来酰亚胺分子中的活性基团与多肽链上的游离巯基形成稳定的共价键，得到PEG-GLP-1化合物。在酸性缓冲液中，该PEG-GLP-1可吸附在阳离子交换层析柱，最后再通过盐溶液线形梯度洗脱，得到PEG-GLP-1复合物(即本发明的修饰型GLP-1衍生物)。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的修饰型GLP-1衍生物半衰期长，给药频次小。
(b)本发明的修饰型GLP-1衍生物所用的序列与人体异源性小，不易产生免疫反应。
(c)本发明的修饰型GLP-1衍生物不易被人体中的酶降解或从肾脏排出。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明涉及GLP-1衍生物由杭州中肽生化有限公司合成，所用分枝状马来酰亚胺聚乙二醇购自赛诺邦格生物有限公司
实施例1
GLP-1衍生物单体健康昆明鼠体内急性血糖实验
将健康雌性昆明小鼠(体重20～22g)称重、编号。在实验前一天晚上禁食(12h左右)，仅给予饮水。次日早上测量基础血糖值，并记为0min时血糖值。挑选血糖值相近的小鼠随机分组：
1、对照组6nmol/kg葡萄糖(n＝10)；
2、A8GLP-1组6nmol/kg A8GLP-1(n＝10)；A8GLP-1序列如HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGC-NH2(SEQ ID NO.1)所示；即式(I)所示序列中X1为Ala、X2为Gly和X3为无。
3、S8GLP-1组6nmol/kg S8GLP-1(n＝10)；S8GLP-1序列如HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGC-NH2(SEQ ID NO.2)所示；即式(I)所示序列中X1为Ser、X2为Gly和X3为无。
4、dA8GLP-1组6nmol/kg dA8GLP-1(n＝10)；dA8GLP-1序列如HdAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGC-NH2(基本同SEQ ID NO.1其中，第二位为D-Ala)所示；即式(I)所示序列中X1为D-Ala、X2为Gly和X3为无。
根据小鼠体重，经腹腔注射葡萄糖、A8GLP-1、S8GLP-1及dA8GLP-1样品。在30min、100min、165min、250min、350min时小鼠尾部取血，用血糖试纸条测定血糖值。每次测血糖前30min补充200μL 37％葡萄糖。所得数据用GraphPad Prism 5统计软件进行t检验并绘制图表。统计结果如表1及图1所示：
表1
Figure BDA0001781694430000061
本发明实施例中所用的GLP-1衍生物单体(SEQ ID NO.1)的质谱数据如图6所示，高压液相色谱图谱如图7及表2所示。
表2
Figure BDA0001781694430000071
高压液相色谱(HPLC)条件为：
流动相:A:水+0.1％三氟乙酸
B:(80％乙腈+20％水)+0.09％三氟乙酸
流速:1.0mL/min
检测UV 220nm
线性梯度:
流动相A 流动相B
0min 54％ 44％
20min 44％ 54％
21min 5％ 95％
色谱柱:SepaxGP-5u 120A 4.6*150mm
实施例2
分枝型20KD PEG-马来酰亚胺与GLP-1衍生物的反应
用马来酰亚胺活化的20KD支链PEG在GLP-1衍生物(SEQ ID NO.1，即式(I)所示序列中X1为Ala、X2为Gly和X3为无)所引入的半胱氨酸残基上选择性的聚乙二醇化，形成稳定结合的硫醚共价键。称取化学合成的10mg GLP-1衍生物和100mg支链20KD PEG-马来酰亚胺溶于5ml 200mM pH7.4磷酸缓冲液，4℃条件下搅拌反应4hr(多肽与PEG的摩尔比为1:2)。
通过阳离子交换层析柱使用酸性pH的Nacl梯度在MacroCap SP柱(GE)上将聚乙二醇化的化合物与游离PEG及游离多肽分离，得到PEG20KD-GLP-1。该聚乙二醇化化合物用RP-HPLC、SEC-HPLC定性分析并检测其活性。
实施例3
分枝型40KD PEG-马来酰亚胺与GLP-1衍生物的反应
用马来酰亚胺活化的40KD支链PEG在GLP-1衍生物(SEQ ID NO.1，即式(I)所示序列中X1为Ala、X2为Gly和X3为无)所引入的半胱氨酸残基上选择性的聚乙二醇化，形成稳定结合的硫醚共价键。称取化学合成的10mg GLP-1衍生物200mg支链40KD PEG-马来酰亚胺溶于5ml 200mM pH7.4磷酸缓冲液，4℃条件下搅拌反应4hr(多肽与PEG的摩尔比为1:2)。
通过阳离子交换层析柱使用酸性pH的Nacl梯度在MacroCap SP柱(GE)上将聚乙二醇化的化合物与游离PEG及游离多肽分离，得到PEG40KD-GLP-1。该聚乙二醇化化合物用RP-HPLC、SEC-HPLC定性分析并检测其活性。
实施例4
GLP-1衍生物的PEG修饰产物体外活性测定
根据GLP-1R信号转导通路，建立了瞬时转染表达GLP-1R和由cAMP驱动的碱性磷酸酶报告基因的HEK293细胞系，用于GLP-1R激动剂的筛选。当GLP-1R与激动剂结合，细胞cAMP浓度升高，由cAMP驱动的碱性磷酸酶报告基因的表达就会上调。通过对碱性磷酸酶活性的检测即可判断化合物激动GLP-1R活性的能力。
接种HEK-293细胞至24孔板，细胞密度为1.0*105个/ml。将表达GLP-1R和SEAP报告基因的质粒转染至细胞中。转染6小时后，更换新培养基，同时加入不同浓度梯度的待测样品。44小时后取细胞上清至96孔板中，并置于65℃烘箱内加热30分钟，以除去内源性碱性磷酸酶。取80ul细胞上清液至96孔板中，每孔加入120ul预混检测工作液。酶标仪405nm处检测样品吸光值并计算酶活。
数据处理和统计分析
EC50为引起50％最大效应时的浓度值，可以反映出配体对受体的激动活性，是研究配体和受体之间结合、激动的一个重要指标。利用SEAP的表达量对应药物刺激的浓度可以用GraphpadPrism5.0软件绘制出GLP-1衍生物(SEQ ID NO.1)、PEG20KD-GLP-1(实施例2制备)和PEG40KD-GLP-1(实施例3制备)的EC50曲线，如图2所示，其中显示了未修饰的GLP-1衍生物的EC50曲线，而实施例2、3中的产物的EC50曲线分别如图3及图4所示。
计算方法为：EC50＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)))
体外活性测定的实验结果，如表3所示：
表3
GLP-1衍生物 PEG<sub>20KD</sub>-GLP-1 PEG<sub>40KD</sub>-GLP-1
EC50(Log(nM)) 0.7321 1.349 1.519
实施例5
GLP-1衍生物的PEG修饰产物健康昆明鼠体内急性降血糖实验
将健康雌性昆明小鼠(体重20～22g)称重、编号。在实验前一天晚上禁食(12h左右)，仅给予饮水。次日早上测量基础血糖值，并记为0min时血糖值。挑选血糖值相近的小鼠随机分组：
1)葡萄糖对照组；
2)10nmol/kg GLP-1衍生物组(GLP-1衍生物序列如SEQ ID NO.1所示)；
3)10nmol/kg PEG20KD-GLP-1组(PEG20KD-GLP-1实施例2制备)；
4)10nmol/kg PEG40KD-GLP-1组(PEG40KD-GLP-1实施例3制备)。
根据小鼠体重，经腹腔注射葡萄糖、GLP-1衍生物、PEG20KD-GLP-1、PEG40KD-GLP-1样品。在2h、5h、8h、11h、13h时小鼠尾部取血，用血糖试纸条测定血糖值。每次测血糖前30min补充200μL 37％葡萄糖。所得数据用GraphPad Prism 5统计软件进行t检验并绘制图表。
表4
Figure BDA0001781694430000091
如表4、表5和图5所示，本发明的GLP-1衍生物的PEG修饰产物在11小时内降糖效果不变且能够使血糖浓度保持与在禁食12h后血糖浓度基本一致。而未修饰的GLP-1衍生物在2小时后降糖效果就已经减弱。本发明的修饰型GLP-1衍生物在第13小时的效果才减弱至2h后的未修饰的GLP-1衍生物的效果，而此时(13h)未修饰的GLP-1衍生物对血糖浓度几乎没有影响。具体地，本发明的GLP-1衍生物PEG的修饰产物降血糖效果如表5所示，相对未修饰的GLP-1在半衰期方面具有6.5倍的提升效果。
表5
Figure BDA0001781694430000101
实施例6
GLP-1衍生物的PEG修饰产物单次给药对db/db小鼠每日空腹血糖影响
6周龄25只雄性db/db小鼠单笼饲养，每日定量喂以正常饲料，至8周龄开始实验。在给药前一天，早上9点禁食(不禁水)，6h后测定小鼠空腹血糖，其空腹血糖介于15-30mmol/L之间。根据上述空腹血糖值将小鼠随机分组：
1)PBS对照组；
2)50nmol/kg PEG40KD-GLP-1组；
3)250nmol/kg PEG40KD-GLP-1组；
4)500nmol/kg PEG40KD-GLP-1组。(PEG40KD-GLP-1实施例3中制备)
根据小鼠体重(40g±3g)，经皮下注射样品。在1h、2h、3h、4h、24h、48h时小鼠尾部取血，用血糖试纸条测定血糖值。所得数据用GraphPad Prism 5统计软件进行t检验并绘制图表。
表6
Figure BDA0001781694430000102
如表6所示，db/db小鼠单次皮下注射低、中、高三个不同剂量的PEG40KD-GLP-1。50nmol/kg低剂量组未表现出降血糖效果，但中剂量组与高剂量组都在给药1h后表现出明显降血糖效果，且500nmol/kg PEG40KD-GLP-1剂量组在24小时仍表现出显著的降血糖效果。由此可见，PEG40KD-GLP-1具有明显的降血糖优势，且其降血糖效应具有浓度依赖性，给药浓度越高，降血糖效果越明显，时间越持久。
实施例7
高剂量皮下给药对db/db小鼠的急性毒性试验
按照实施例3中方法用马来酰亚胺活化的40KD支链PEG分别修饰GLP-1衍生物(SEQID NO.1)和对比例Exenatide序列反应，纯化后得到高纯度的PEG40K-GLP-1与PEG40K-Exenatide，用于后续动物实验。
其中，实验用对比例的Exenatide序列由杭州中肽生化有限公司合成，纯度为>95％，Exenatide的序列如下所示：
His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Nle-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Gln-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-NH2。
约12周龄db/db小鼠20只随机分为两组：
1)1000nmol/kg PEG40KD-GLP-1组；
2)1000nmol/kg PEG40KD-Exenatide组。
根据小鼠体重(40g±3g)，单次腹部皮下给药。观察给药14天内小鼠死亡情况。直至观察期结束，本发明组无一例小鼠死亡，均活动自如，而对比例组中则出现2只小鼠死亡。
结果表明：对比例小组的生理毒性要大于本发明组。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海生物制品研究所有限责任公司
<120> 聚乙二醇修饰的GLP-1衍生物及其药用盐
<130> P2017-2344
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys
20 25 30
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys
20 25 30

Claims (5)

1.一种修饰型GLP-1衍生物及其药用盐，其特征在于，所述的GLP-1衍生物的序列为：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGC-NH2；
并且聚乙二醇通过GLP-1衍生物的半胱氨酸残基修饰于所述的GLP-1衍生物上；
其中，所述的聚乙二醇的结构为：
Figure 695965DEST_PATH_IMAGE001
；
并且所述的聚乙二醇的分子量为40KD。
2.如权利要求1所述的修饰型GLP-1衍生物及其药用盐，其特征在于，所述的修饰型GLP-1衍生物为
Figure 41496DEST_PATH_IMAGE002
。
3.一种制备如权利要求1所述的修饰型GLP-1衍生物及其药用盐的方法，其特征在于，包括步骤：
用GLP-1衍生物和聚乙二醇进行偶联反应，得到经修饰的GLP-1衍生物。
4.一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的修饰型GLP-1衍生物及其药用盐。
5.一种如权利要求1所述的修饰型GLP-1衍生物及其药用盐和如权利要求4所述的药物组合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
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