CN109001452A - α-突触核蛋白积聚的检测探针的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种α‑突触核蛋白积聚的检测探针的制备方法及其产品和应用，以磁性四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4 NPs）为载体，通过正硅酸乙酯（TEOS）和3‑氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES）对Fe3O4 NPs表面氨基化改性；进一步地，以1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨丙基)‑碳化二亚胺（EDC）和N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）为偶联剂，连接α‑突触核蛋白单克隆抗体。利用Fe3O4 NPs自身催化活性，以Fe3O4 NPs为载体，包附二氧化硅外壳，进而连接α‑突触核蛋白单克隆抗体，合成一种靶向帕金森病，并且可定点清除细胞内ROS，延缓α‑突触核蛋白进一步积聚的检测探针。探针结合靶向、成像及治疗为一体，合成方法简单，所用原料生物安全性高，催化活性较佳、物理稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种α-突触核蛋白积聚的检测探针的制备方法及其产品和应用。本发明属于生物检测领域。
背景技术
帕金森病是一种老年人常见的神经系统退行性疾病，其主要临床特征为静止性震颤、行动迟缓、肌强直、姿势步态异常，给患者及家属带来极大的痛苦。帕金森病患者中脑部“黑质”中多巴胺神经元大量变性丢失，伴随神经元胞浆中大量lewy小体生成。研究表明α-突触核蛋白的积聚与lewy小体形成息息相关。α-突触核蛋白是一种140个氨基酸，含量丰富、缺少半胱氨酸和色氨酸残基的脑蛋白。其存在于神经细胞末端，主要负责通过脂质结合进行神经元细胞间的信息交流。在一定条件下，α-突触核蛋白单体间结合形成具有β-折叠的原纤维，进一步积聚形成不可溶的Lewy小体，损害黑质纹状体多巴胺系统。
研究表明alpha-突触核蛋白的积聚与细胞内ROS水平相关。在MPTP建立的帕金森动物模型中，细胞内ROS水平升高，诱导α-突触核蛋白在细胞内积聚，形成原纤维、纤维，进一步折叠形成积聚体；同时原纤维进一步诱导ROS生成，导致神经元细胞死亡。因此，降低细胞内ROS水平，可有效缓解α-突触核蛋白的积聚，在一定程度上减轻对神经元细胞的损伤，达到减轻帕金森病的效果。
目前传统的检测方法主要涉及免疫法（中国发明专利：一种丝氨酸129位磷酸化alpha-突触核蛋白聚集体的ELISA检测方法，公开号：CN20160913085.1；一种检测血红蛋白结合磷酸化alpha-突触核蛋白的方法，公开号：CN201410477919.X; 一种检测血红蛋白结合alpha-突触核蛋白的方法，公开号：CN201410477971.5）。虽然许多研究表明这些检测方法的优良性，但是目前仍缺乏一种方法在有效检测的基础上，可减缓alpha-突触核蛋白的进一步聚集。
磁性纳米颗粒的模拟酶活性得到日益重视，磁性纳米颗粒具有内在的类似于辣根过氧化物酶的活性，可以有效氧化一系列有机底物。然而目前针对磁性纳米颗粒，更多的被用于分离蛋白、DNA及细胞；药物和基因载体；组织工程；磁共振成像；检测及癌症治疗。而利用其模拟酶活性，开发一种集检测及缓解帕金森的探针，具有较高的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明目的在于提供一种α-突触核蛋白积聚的检测探针的制备方法，提出在以α-突触核蛋白单克隆抗体为靶向，结合磁性纳米颗粒为载体。
本发明的再一目的在于：提供一种上述方法制备的α-突触核蛋白积聚的检测探针产品。
本发明的又一目的在于：提供一种上述产品的应用。
本发明目的通过下述方案实现：一种α-突触核蛋白积聚的检测探针的制备方法，以磁性四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4 NPs）为载体，通过正硅酸乙酯（TEOS）和3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES）对Fe3O4 NPs表面氨基化改性；进一步地，以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）为偶联剂，连接α-突触核蛋白单克隆抗体，包括以下步骤：
（1）磁性四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4 NPs）颗粒生成及表面氨基化改性。
采用化学共沉淀法合成小粒径Fe3O4 NPs：称取0.6-1.2g的Fe Cl3和0.38-0.76g的Fe SO4，溶解在50 mL去离子水中。20 mL 1.5 M Na OH迅速加入含铁溶液中，室温搅拌10min。采用乙醇清洗黑色沉淀，真空干燥过夜。
采用水热法合成大粒径Fe3O4 NPs：称取1.3-2.6g Fe Cl3 Fe Cl3 溶解于40 mL乙二醇中，均匀搅拌形成亮黄色溶液。3.6 g Na Ac和1.0 g PEG加入溶液中，室温搅拌30min。混合液转入反应釜中，200℃反应18 hr。生成的黑色沉淀采用乙醇清洗，真空干燥过夜。
Fe3O4 NPs@SiO2合成：2.0 mg Fe3O4 NPs在室温下分散在10 mL的环己烷中，随后，1.8 g Triton-X 100，1.6 mL正己醇以及0.34 mL H2O在搅拌条件下加入到上述溶液中，形成反相微乳液。15 min后加入10-50 μL的 TEOS到微乳液，30 min后0.1 mL 25~28%氨水加入到上述混合液，作用24 h后，乙醇沉淀Fe3O4 NPs@SiO2纳米粒子。 Fe3O4 NPs@SiO2纳米粒子通过离心分离，然后乙醇和水分别洗涤5次，60℃真空干燥。
Fe3O4 NPs@SiO2表面氨基化改性：0. 4 g二氧化硅包裹的四氧化三铁粒子与0.1-1mL的APTES，100mL异丙醇混合并超声分散均匀。通氮气30分钟后，加热到70°C，机械搅拌6hr。纳米粒子进行磁分离，然后用乙醇和水重复洗涤，60℃真空干燥，得到复合物I。
（2）连接α-突触核蛋白：
100 mg复合物I溶于10 mL超纯水中， 加入一定质量的EDC和NHS，室温搅拌24 hr。加入3-5 mmol的α-突触核蛋白单克隆抗体，室温搅拌24 hr，采用磁分离，用超纯水清洗三次，冷冻干燥，即获得可靶向α-突触核蛋白并缓解α-突触核蛋白积聚的探针。
所述的Fe3O4 NPs可以为本领域常规的Fe3O4 NPs，优选的粒径为10 nm，30 nm和200 nm。
所述的TEOS用量可以为本领域常规的用量，优选的用量范围为10-50 μL，较佳的为40 μL。
所述的APTES用量可以为本领域常规的用量，优选的用量范围为0.1-1 mL，较佳的为0.2 mL。
所述的EDC与NHS用量可以为本领域常规的用量，优选EDC用量范围为0.3-0.5g，NHS用量范围为0.5-0.6 g，较佳的EDC用量为0.3 g，NHS用量为0.5 g。
所述的α-突触核蛋白单克隆抗体用量可以为本领域常规的用量，优选的用量范围为3-5 mmol。
本发明一种α-突触核蛋白积聚的检测探针，根据上述任一所述方法制备得到。以α-突触核蛋白单克隆抗体为靶向，结合磁性纳米颗粒为载体的模拟酶活性，建立一种集检测α-突触核蛋白及缓解α-突触核蛋白积聚为一体的探针。
本发明提供一种上述α-突触核蛋白积聚的检测探针在检测及缓解帕金森中的应用。
本发明方法所得产品具有较小的粒径、极好的靶向性、优良且稳定的催化活性及成像效果。所得产物能满足临床应用的需求。
本发明的优点在于：
（1）本发明利用Fe3O4 NPs自身催化活性，以Fe3O4 NPs为载体，包附二氧化硅，进而连接α-突触核蛋白单克隆抗体，合成一种靶向帕金森病，并且可定点清除细胞内ROS，延缓α-突触核蛋白进一步积聚的检测探针。
（2）本发明所合成的探针结合靶向、成像及治疗为一体，合成方法简单，所用原料生物安全性高，催化活性较佳、物理稳定性好。
附图说明
图1为实施案例1 Fe3O4 NPs的XRD表征图；
图2为实施案例1合成检测探针的TEM表征图；
图3位实施案例2合成检测探针的TEM表征图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
实施例1
1、磁性四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4 NPs）颗粒生成及表面氨基化改性。
采用化学共沉淀法合成粒径Fe3O4 NPs： 称取0.6 g的Fe Cl3和0.38 g Fe SO4，溶解在50 mL去离子水中。20 mL 1.5 M Na OH迅速加入含铁溶液中，室温搅拌10 min。采用乙醇清洗黑色沉淀，真空干燥过夜。称取适量Fe3O4 NPs进行XRD表征，附图1可以看到2θ值为30.3︒、35.7︒、43.5︒、53.9︒、57.5︒、63.2︒出现6个明显的衍射峰，其位置与Fe3O4 NPs能较好的匹配，分别对应于立方晶相的（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面。
Fe3O4 NPs@SiO2合成：2.0 mg Fe3O4 NPs在室温下分散在10 mL的环己烷中，随后，1.8 g Triton-X 100，1.6 mL正己醇以及0.34 mL H2O在搅拌条件下加入到上述溶液中，形成反相微乳液。15 min后加入40 μL TEOS到微乳液，30 min后加入0.1 mL 28%氨水到上述混合液，作用24 h后，乙醇沉淀Fe3O4 NPs@SiO2纳米粒子。 Fe3O4 NPs@SiO2纳米粒子通过离心分离，然后乙醇和水分别洗涤5次，60℃真空干燥。
Fe3O4 NPs@SiO2表面氨基化改性：0. 4 g二氧化硅包裹的四氧化三铁粒子与0.2mL的APTES，100mL异丙醇混合并超声分散均匀。通氮气30分钟后，加热到70°C，机械搅拌6hr。纳米粒子进行磁分离，然后用乙醇和水重复洗涤，60 ℃真空干燥，得到复合物I。
2、连接α-突触核蛋白抗体：
100 mg复合物I溶于10 mL超纯水中， 分别加入0.3g的EDC和0.5g NHS，室温搅拌24hr。加入3 mmol的α-突触核蛋白单克隆抗体，在此搅拌24 hr，采用磁分离，用超纯水清洗三次，真空干燥，即获得靶向α-突触核蛋白、磁共振成像，并缓解α-突触核蛋白积聚的多功能探针。TEM对探针进行，可发现内核Fe3 O4 NPs尺寸约10 nm，外层硅壳厚度约为10 nm。
见Fe3O4 NPs的XRD表征图如图1和合成检测探针的TEM表征图如图2。
实施例2
1、磁性四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4 NPs）颗粒生成及表面氨基化改性。
采用化学共沉淀法合成粒径Fe3O4 NPs： 0.6 g的Fe Cl3和0.38g Fe SO4，溶解在50mL去离子水中。20 mL 1.5 M Na OH迅速加入含铁溶液中，室温搅拌10 min。采用乙醇清洗黑色沉淀，真空干燥过夜。
Fe3O4 NPs@SiO2合成：2.0 mg Fe3O4 NPs在室温下分散在10 mL的环己烷中，随后，1.8 g Triton-X 100，1.6 mL正己醇以及0.34 mL H2O在搅拌条件下加入到上述溶液中，形成反相微乳液。15 min后加入40 μL TEOS到微乳液，30 min后加入0.1 mL 28%氨水到上述混合液，作用24 h后，乙醇沉淀Fe3O4 NPs@SiO2纳米粒子。 Fe3O4 NPs@SiO2纳米粒子通过离心分离，然后乙醇和水分别洗涤5次，60℃真空干燥。
Fe3O4 NPs@SiO2表面氨基化改性：0. 4 g二氧化硅包裹的四氧化三铁粒子与0.4mL的APTES，100mL异丙醇混合并超声分散均匀。通氮气30分钟后，加热到70°C，机械搅拌6hr。纳米粒子进行磁分离，然后用乙醇和水重复洗涤，60℃真空干燥，得到复合物I。
2、连接α-突触核蛋白抗体：
100 mg复合物I溶于10 mL超纯水中， 分别加入0.5g的EDC和0.53g NHS，室温搅拌24hr。加入5 mmol的α-突触核蛋白单克隆抗体，在此搅拌24 hr，采用磁分离，用超纯水清洗三次，真空干燥，即获得可靶向α-突触核蛋白并缓解α-突触核蛋白积聚的探针。图3为本实施例合成检测探针的TEM表征图。
实施例3
1、磁性四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4 NPs）颗粒生成及表面氨基化改性。
采用水热法合成200 nm Fe3O4 NPs：1.35g Fe Cl3 溶解于40 mL乙二醇中，均匀搅拌形成亮黄色溶液。3.6 g Na Ac和1.0 g PEG加入溶液中，室温搅拌30 min。混合液转入反应釜中，200℃反应18 hr。生成的黑色沉淀采用乙醇清洗，真空干燥过夜。
Fe3O4 NPs@SiO2合成：2.0 mg Fe3O4 NPs在室温下分散在10 mL的环己烷中，随后，1.8 g Triton-X 100，1.6 mL正己醇以及0.34 mL H2O在搅拌条件下加入到上述溶液中，形成反相微乳液。15 min后加入40 μL TEOS到微乳液，30 min后加入0.1 mL 28%氨水到上述混合液，作用24 h后，乙醇沉淀Fe3O4 NPs@SiO2纳米粒子。 Fe3O4 NPs@SiO2纳米粒子通过离心分离，然后乙醇和水分别洗涤5次，60℃真空干燥。
Fe3O4 NPs@SiO2表面氨基化改性：0. 4 g二氧化硅包裹的四氧化三铁粒子与0.2mL的APTES，100mL异丙醇混合并超声分散均匀。通氮气30分钟后，加热到70°C，机械搅拌6hr。纳米粒子进行磁分离，然后用乙醇和水重复洗涤，60℃真空干燥，得到复合物I。
3、连接α-突触核蛋白抗体：
100 mg复合物I溶于10 mL超纯水中， 分别加入0.3g的EDC和0.5 g NHS，室温搅拌24hr。加入3 mmol的α-突触核蛋白单克隆抗体，在此搅拌24 hr，采用磁分离，用超纯水清洗三次，真空干燥，即获得可靶向α-突触核蛋白并缓解α-突触核蛋白积聚的探针。
Claims (7)
1.一种α-突触核蛋白积聚的检测探针的制备方法，其特征在于以磁性四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4 NPs）为载体，通过正硅酸乙酯（TEOS）和3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES）对Fe3O4 NPs表面氨基化改性；进一步地，以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）为偶联剂，连接α-突触核蛋白单克隆抗体，包括以下步骤：
（1）磁性四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4 NPs）颗粒生成及表面氨基化改性：
采用化学共沉淀法合成小粒径Fe3O4 NPs：称取0.6-1.2g的FeCl3和0.38-0.76g的 FeSO4溶解在50 mL去离子水中，20 mL 1.5 M Na OH迅速加入含铁溶液中，室温搅拌10 min，采用乙醇清洗黑色沉淀，真空干燥过夜得小粒径Fe3O4 NP；
采用水热法合成大粒径Fe3O4 NPs：称取1.3-2.6g FeCl3 溶解于40 mL乙二醇中，均匀搅拌形成亮黄色溶液，3.6 g Na Ac和1.0 g PEG加入溶液中，室温搅拌30 min，混合液转入反应釜中，200℃反应18 hr，生成的黑色沉淀采用乙醇清洗，真空干燥过夜得大粒径Fe3O4 NPs；
Fe3O4 NPs@SiO2合成：2.0 mg Fe3O4 NPs在室温下分散在10 mL的环己烷中，随后，1.8 gTriton-X 100，1.6 mL正己醇以及0.34 mL H2O在搅拌条件下加入到上述溶液中，形成反相微乳液，15 min后加入10-50 μL TEOS到微乳液，30 min后0.1 mL 25~28%氨水加入到上述混合液，作用24 h后，乙醇沉淀Fe3O4 NPs@SiO2纳米粒子，Fe3O4 NPs@SiO2纳米粒子通过离心分离，然后乙醇和水分别洗涤5次，60℃真空干燥得Fe3O4 NPs@SiO2；
Fe3O4 NPs@SiO2表面氨基化改性：0. 4 g二氧化硅包裹的四氧化三铁粒子与0.1-1 mL的APTES，100mL异丙醇混合并超声分散均匀，通氮气30分钟后，加热到70°C，机械搅拌6 hr；纳米粒子进行磁分离，然后用乙醇和水重复洗涤，60℃真空干燥，得到复合物I；
（2）连接α-突触核蛋白：
100 mg复合物I溶于10 mL超纯水中， 加入0.3-0.5g的EDC和0.5-0.6 g 的NHS，室温搅拌24 hr，加入3-5 mmol的α-突触核蛋白单克隆抗体，室温搅拌24 hr，采用磁分离，用超纯水清洗三次，冷冻干燥，即获得可靶向α-突触核蛋白并缓解α-突触核蛋白积聚的探针。
2.根据权利要求1所述α-突触核蛋白积聚的检测探针的制备方法，其特征在于，所述的Fe3O4 NPs的粒径为10 nm，30 nm和200 nm。
3.根据权利要求1所述α-突触核蛋白积聚的检测探针的制备方法，其特征在于，所述的TEOS用量为40 μL。
4.根据权利要求1所述α-突触核蛋白积聚的检测探针的制备方法，其特征在于，所述的APTES用量为0.2 mL。
5.根据权利要求1所述α-突触核蛋白积聚的检测探针的制备方法，其特征在于，、所述的EDC用量为0.3 g，NHS用量为0.5 g。
6.一种α-突触核蛋白积聚的检测探针的制备方法，其特征在于，根据权利要求1-5任一所述方法制备得到。
7.一种根据权利要求6所述α-突触核蛋白积聚的检测探针在检测及缓解帕金森中的应用。
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