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CN108970659A - 固液分离方法和装置及在其中使用的移液器吸头、粒子及试剂盒 - Google Patents

固液分离方法和装置及在其中使用的移液器吸头、粒子及试剂盒 Download PDF

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CN108970659A
CN108970659A CN201810547116.5A CN201810547116A CN108970659A CN 108970659 A CN108970659 A CN 108970659A CN 201810547116 A CN201810547116 A CN 201810547116A CN 108970659 A CN108970659 A CN 108970659A
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CN
China
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solid
particle
suction
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Application number
CN201810547116.5A
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岸本聪美
加畑博幸
香月隆伸
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Mitsubishi Kasei Corp
Original Assignee
Sysmex Corp
Mitsubishi Kasei Corp
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Publication date
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Abstract

本发明提供无需有滤器等的复杂的结构的管嘴的固液分离方法、固液分离装置及在其中使用的移液器吸头、粒子及试剂盒。本发明从上述开口向在尖端形成开口的抽吸管嘴的内部抽吸含粒子的悬浮液，使抽吸的悬浮液中所含的粒子的至少一部分沉降到至达到尖端开口的开口近前侧而在上述抽吸管嘴内阻塞，经尖端开口而排出内部的液体的固液分离方法。

Description

固液分离方法和装置及在其中使用的移液器吸头、粒子及试 剂盒
【技术领域】
本发明涉及固液分离方法、固液分离装置及在其中使用的移液器吸头、粒子及试剂盒。
【背景技术】
提取试样液中的特定的成分时，已知用滤器过滤或添加吸附特定的成分的固体，分离固体和液体的方法(BF分离)。BF分离一般是分离液体和个体的固液分离之一。作为BF分离的方法，进行离心沉降法或由磁力的分离等。
但是，在分析装置内实施这些方法时，复杂的机构和控制是必要的。
从而，提议在分注管嘴(移液器吸头)设置作为吸附剂的个体或滤器，在抽吸－排出动作时提取特定的成分(参照例如专利文献1、2)。
【现有技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】特开2013-47680号公报
【专利文献2】特开2003-254877号公报
【发明概要】
【发明要解决的课题】
由于如专利文献1、2一样的分注管嘴有在管嘴内部进行细加工的必要，制造工序复杂。进而，有增加制造成本的方面。
本发明是考虑如上所述的事情而进行的，提供无需有滤器等的复杂的结构的管嘴的固液分离方法、固液分离装置及在其中使用的试剂盒。
【用于解决课题的手段】
本发明提供固液分离方法，其从上述开口向在尖端形成开口的抽吸管嘴的内部抽吸含粒子的悬浮液，使抽吸的悬浮液中所含的粒子的至少一部分沉降而在上述抽吸管嘴内阻塞，经阻塞上述粒子的抽吸管嘴的开口而排出内部的液体。
再者，从不同的观点来看，本发明提供固液分离装置，其具备：安装了在尖端形成开口的抽吸管嘴的抽吸部，控制上述抽吸部的动作的控制部，及支持收容含粒子的液体的容器的容器支持体，上述控制部以将上述悬浮液的至少一部分从上述开口抽吸到抽吸管嘴的内部，使抽吸的悬浮液中所含的粒子的至少一部分沉降而在上述抽吸管嘴内阻塞，经内部阻塞上述粒子的抽吸管嘴的开口而排出内部的液体的方式控制。
另外，本发明提供在上述的固液分离方法中使用、在尖端开口附近无滤器的作为抽吸管嘴的移液器吸头。
再者，本发明提供在上述的固液分离方法中使用的粒子。
再另外，本发明提供固液分离用试剂盒，其含：在上述的固液分离方法中使用、在尖端开口附近无滤器的作为抽吸管嘴的移液器吸头和在上述固液分离方法中使用的粒子，上述移液器吸头的最小的开口直径比上述粒子的最大直径大，并且比上述粒子的最大直径的6倍小。
【发明效果】
根据本发明的固液分离方法由于使抽吸的悬浮液中所含的粒子的至少一部分沉降而阻塞，经阻塞上述粒子的抽吸管嘴的开口而排出内部的液体，伴随液体的排出，粒子残留在抽吸管嘴的内部，与排出的液体分离。
对于根据本发明的固液分离装置而也发挥同样的作用效果。
【附图说明】
【图1】是显示本实施方式的固液分离装置的一例的图。
【图2】是本实施方式的固液分离装置的(a)柱塞的移动，(b)显示注射器内压的Pt曲线、(c)显示固液分离的样式的图。
【图3】是显示本实施方式的试剂盒的外观的一例的图。
【图4A】是在本实施方式的固液分离的成功事例中的Pt曲线的一例。
【图4B】是在本实施方式的固液分离的失败事例中的Pt曲线的一例。
【图4C】是在本实施方式的固液分离的失败事例中的Pt曲线的一例。
【图5A】是显示在实施例中使用的载体的制作中使用的筛的网目尺寸的图。
【图5B】是显示在实施例中使用的第1～第10载体的粒度分布的表。
【图5C】是显示在实施例中使用的载体及管的特征的图。
【图5D】是显示在实施例中固液分离成功的载体和管的组合的表。
【图6A】是显示连续重复100次本实施方式的固液分离时的第11～15次的Pt曲线的图。
【图6B】是显示连续重复100次本实施方式的固液分离时的第13次的Pt曲线的图。
【图6C】是显示连续重复100次本实施方式的固液分离时的第14次的Pt曲线的图。
【图7】是显示在本实施方式的固液分离中变更排液速度时的各排液速度的Pt曲线的图。
【图8A】是显示在实施例中设为载体浓度60％时的Pt曲线的图。
【图8B】是显示在实施例中设为载体浓度5％时的Pt曲线的图。
【图8C】是显示在实施例中设为载体浓度0.1％时的Pt曲线的图。
【图9A】是显示在实施例中将载体的比重设为7.9时的Pt曲线的图。
【图9B】是显示在实施例中将载体的比重设为6.0时的Pt曲线的图。
【图9C】是显示在实施例中将载体的比重设为4.0时的Pt曲线的图。
【图9D】是显示在实施例中将载体的比重设为1.1时的Pt曲线的图。
【图10A】是显示在实施例中将溶剂的比重设为1.9时的Pt曲线的图。
【图10B】是显示在实施例中将溶剂的比重设为1.2时的Pt曲线的图。
【图10C】是显示在实施例中将溶剂的比重设为0.7时的Pt曲线的图。
【图11A】是显示在实施例中将溶剂的粘度设为400cP时的Pt曲线的图。
【图11B】是显示在实施例中将溶剂的粘度设为60cP时的Pt曲线的图。
【图11C】是显示在实施例中将溶剂的粘度设为1cP时的Pt曲线的图。
【图11D】是显示在实施例中将溶剂的粘度设为0.3cP时的Pt曲线的图。
【图12A】是显示在实施例中将悬浮液的温度设为0.5℃时的Pt曲线的图。
【图12B】是显示在实施例中将悬浮液的温度设为25℃时的Pt曲线的图。
【图12C】是显示在实施例中将悬浮液的温度设为98℃时的Pt曲线的图。
【图13A】是显示在实施例中使用含20％表面活性剂的悬浮液时的Pt曲线的图。
【图13B】是显示在实施例中使用含8％表面活性剂的悬浮液时的Pt曲线的图。
【图13C】是显示在实施例中使用不含表面活性剂的悬浮液时的Pt曲线的图。
【图14A】是在实施例中组合使用不合格的载体和合格的支持体时的闭塞(阻塞)的概念图。
【图14B】是显示在实施例中使用不合格的载体时的Pt曲线的图。
【图14C】是显示在实施例中以合格的支持体作为载体单独使用时的Pt曲线的图。
【图14D】是显示在实施例中组合使用不合格的载体和合格的支持体时的Pt曲线的图。
【图15】是对在实施例中连续稀释式的BF分离操作进行说明的图。
【图16】是显示实施例13的荧光强度测定的结果的图。
【图17】是显示实施例14的荧光强度测定的结果的图。
【图18】是实施例15的凝胶荧光成像的照片。
【图19】是实施例15的银染色的照片。
【图20】是实施例16的凝胶荧光成像的照片。
【图21】是实施例16的银染色的照片。
【图22】是显示实施例17的TMR-ACTH部分肽的荧光强度测定的结果的图。
【图23】是显示实施例17的全血来源肽的荧光强度测定的结果的图。
【图24】是对保留回(Retention Back)式的BF分离操作进行说明的图。
【图25】是显示使用实施例18的无修饰氧化硅载体的脱盐处理前后的TMR-ACTH部分肽的荧光强度测定的结果的图。
【图26】是显示使用实施例18的无修饰氧化硅载体的脱盐处理前后的全血来源肽的荧光强度测定的结果的图。
【图27】是显示使用实施例18的ODS修饰氧化硅载体的脱盐处理前后的TMR-ACTH部分肽的荧光强度测定的结果的图。
【图28】是显示使用实施例18的ODS修饰氧化硅载体的脱盐处理前后的全血来源肽的荧光强度测定的结果的图。
【图29】是显示使用实施例18的氨基甲硅烷基修饰氧化硅载体的脱盐处理前后的TMR-ACTH部分肽的荧光强度测定的结果的图。
【图30】是显示使用实施例18的氨基甲硅烷基修饰氧化硅载体的脱盐处理前后的全血来源肽的荧光强度测定的结果的图。
【具体实施方式】
《固液分离方法》
本实施方式的固液分离方法包括从上述开口向在尖端形成开口的抽吸管嘴的内部抽吸含粒子的悬浮液的工序。
抽吸管嘴优选在尖端形成开口，随着向尖端而内径变得向尖部越来越细。抽吸管嘴可为大致管状。也将形成在上述抽吸管嘴的尖端的开口称为尖端开口。将上述尖端开口的直径称为开口直径。开口直径对应于内径变得向尖部越来越细的上述抽吸管嘴的尖端的内径。通过随着向尖端而内径变得向尖部越来越细，阻塞(闭塞)粒子变得可能。结果，阻塞的粒子变得不从抽吸管嘴的尖端的开口排出，而通过作为悬浮液的溶剂的液体从开口排出，达成固液分离。其中，“阻塞”是指粒子集中在尖端开口的近前侧的位置而受到管壁或其他粒子制约而成为无法自由移动的状态，其他粒子无法通过该位置。但是，比阻塞的粒子充分小的分子因为可通过粒子和粒子的间隙或粒子和管壁的间隙，不妨碍向排出的液体混入粒子。另外，本说明书中所说的粒子“阻塞”是指液体可通过的程度的状态。本发明人不要求向抽吸管嘴、特别移液器吸头的尖端安装滤器，利用粒子的阻塞而具有高的再现性，成功对粒子和液体进行分离。
抽吸管嘴的最小的开口直径优选比粒子的最大直径大，并且，比粒子的最大直径的6倍小。抽吸管嘴的“最小”开口直径是指在抽吸管嘴被固定在注射器时，该固定的抽吸管嘴的开口直径的值。一方面，在抽吸管嘴是能取下的管嘴时，抽吸管嘴的“最小”开口直径是指在一系列的固液分离操作中使用的1个以上的抽吸管嘴的开口直径之中，显示最小的值的管嘴的开口直径。抽吸管嘴的开口直径可根据公知的方法测定。
抽吸管嘴被设计为，对应于抽吸管嘴内的压力变化，可将液体从该尖端的开口抽吸及排出。上述压力变化也可例如，通过在抽吸管嘴的后端设置注射器，柱塞在该注射器内移动而发生。抽吸管嘴可为固定在注射器上的，也可为能取下的。作为抽吸管嘴，可举出不设置移液器吸头而抽吸的抽吸管或能取下的管嘴、例如移液器吸头等，优选为能取下的移液器吸头，更优选为在尖端开口附近无滤器的能取下的移液器吸头。
抽吸管嘴的开口直径优选为0.70～2.4mm、更优选为0.80～1.6mm。
抽吸管嘴的最大容量优选为500～2000μL、更优选为1000～1500μL。
悬浮液是指肉眼可见的程度的粒子分散到液体中的。其中，肉眼可见的程度的粒子一般是指平均粒径10μm量级的粒子。悬浮液优选为混合含目标物质的试样液和使吸附目标物质的粒子的。
粒子的材质只要是不妨碍固液分离，就不特别限定。可举出例如氧化硅、氧化铝、氧化锆等的无机材料、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等的有机材料、多孔性材料、磁性材料等。
粒子的形状只要是不妨碍固液分离，就不特别限定。例如可举出有球状、大致球状、正多面体、正多角形状的开口形状的蜂巢结构等。
粒子也可例如被氨基甲硅烷基或十八烷基甲硅烷基(ODS)等表面修饰。
再者，本实施方式的固液分离因为可应用于BF分离，粒子优选为对于纯化期望的肽或核酸适宜的粒子。
粒径只要是不妨碍固液分离，就不特别限定，其最大直径优选比抽吸管嘴的最小的开口直径小，并且，比最小的开口直径的6分之1大。作为具体的粒径的数值，优选为70～700μm、更优选为100～700μm。在本实施方式中，粒径由公知的激光衍射－散射法进行测定。
粒子的最大直径是指粒径的最大值。粒子的最大直径只要是不妨碍固液分离，就不特别限定，优选为150μm以上、更优选为250μm以上。
粒子的D90只要是不妨碍固液分离，就不特别限定。D90是指关于粒径的数值而粒径的累积分布成为90％的点，即，表示将粉体以某粒径为基准而分成大小2个时，大的侧和小的侧成为1:9的粒径。D90优选为105μm以上、更优选为110μm以上。
粒子的D10只要是不妨碍固液分离，就不特别限定。D10是指关于粒径的数值而粒径的累积分布成为10％的点，即，表示将粉体以某粒径为基准而分成大小2个时，大的侧和小的侧成为9:1的粒径。D90优选为150μm以上、更优选为170μm以上。
粒子的D90-D10是D90和D10的差异。D90-D10只要是不妨碍固液分离，就不特别限定，优选为90μm以上、更优选为120μm以上。
粒子的D50只要是不妨碍固液分离，就不特别限定。D50是指累积分布成为50％的点，即，表示将粉体以某粒径为基准而分成大小2个时，大的侧和小的侧成为等量的粒径。粒子的D50优选为150μm以上、更优选为170μm以上。
粒子的比重只要是不妨碍固液分离，就不特别限定，本领域技术人员可考虑成为溶剂的液体的比重等而适宜设定。粒子的比重优选比成为溶剂的液体的比重大。
在本实施方式中，使用最小的开口直径0.80mm的抽吸管嘴。在此实施方式中，粒子有优选为120μm以上的D90-D10。另外，在此实施方式中，粒子有优选为170μm以上的D50。
成为悬浮液的溶剂的液体只要是能使粒子分散，就不特别限定，优选不使目标物质解离的。作为液体，例如可举出水、磷酸缓冲液(PBS)等。液体优选可伴随排出而通过阻塞粒子的抽吸管嘴。液体也可含目标物质、优选为期望纯化的期望的肽或核酸。另外，这样的液体也可含期望的肽或核酸以外的肽及/或核酸、盐。再者，液体也可在不妨碍固液分离的范围内含优选为20％以下，更优选为8％以下的表面活性剂。这样的液体优选为全血、血清或血浆，更优选为通过对全血、血清或血浆进行加热，优选为通过用微波炉加热，更优选为通过用微波炉加热到150～180℃而得到的上清。这样的上清也可进一步脱盐而作为脱盐处理液。
成为悬浮液的溶剂的液体的种类只要是不妨碍固液分离，就不特别限定。液体的比重只要是不妨碍固液分离，就不特别限定，本领域技术人员可考虑粒子的比重等而适宜设定。液体的比重优选比粒子的比重小。另外，液体的粘度只要是不妨碍固液分离，就不特别限定。
粒子也可与支持体组合使用。其中，支持体是指在与使用的抽吸管嘴的关系上，能阻塞该单独不在抽吸管嘴阻塞的粒子的物质、特别是显示那样的特性的粒状的物质。支持体的材质及各种性质对于粒子而与上述同样。这样的支持体的使用在与使用的抽吸管嘴的关系上，在使用其单独不在抽吸管嘴阻塞的粒子进行本实施方式的固液分离时特别有利。这样的支持体优选为比粒子比重大的物质或与粒子形成强固的块的物质。本领域技术人员可适宜选择适宜于使用的粒子的支持体。
在后述的实施例12中，在作为抽吸管嘴使用在图5C中记载的管B、作为粒子使用第10载体时，作为支持体使用第2载体。在此实施方式中，第10载体其本身不在管B内阻塞而与液体一同排出，无法达成固液分离。但是，通过与作为支持体的第2载体组合，通过第2载体在管B阻塞，或者，通过与第2载体一同在管B阻塞而变得可在排液时停留在抽吸管嘴内而达成固液分离。
悬浮液中的粒子的浓度只要是不妨碍固液分离，就不特别限定，优选为5～100mg/mL。另外，悬浮液的温度只要是不妨碍固液分离，就不特别限定，优选为0.5～100℃、更优选为20～98℃。
悬浮液的抽吸例如，将抽吸管嘴的尖端浸到悬浮液中，通过使抽吸管嘴内的气压相对于外部的气压成为负压而进行。例如抽吸管嘴内的气压的控制通过在抽吸管嘴的后端连接含柱塞的注射器的状态下控制柱塞的位置而进行时，悬浮液的抽吸通过使柱塞移动而使含抽吸管嘴的注射器内部的容积增大而进行。
悬浮液的抽吸工序也可包含通过重复向抽吸管嘴的内部抽吸粒子和溶剂的混液再排出而搅拌(搅拌)粒子和溶剂的混液而调制悬浮液。抽吸及排出例如，将抽吸管嘴的尖端浸到混液中，通过使抽吸管嘴内的气压相对于外部的气压成为负压而抽吸混液，其后，通过使抽吸管嘴内的气压相对于外部的气压成为正压而通过排出混液而进行。也可多次重复这样的抽吸和排出。另外，抽吸管嘴内的气压的控制也可通过在抽吸管嘴的后端连接含柱塞的注射器的状态下控制柱塞的位置而进行。此时的悬浮液的吸吐的速度不特别限定，优选为用一定的速度重复吸吐。吸吐的速度优选为液体的排出的速度更快。另外，此时的抽吸和排出的次数也不特别限定。再者，此时的抽吸和排出也可使用1个以上的抽吸管嘴进行。
作为别的方法，搅拌也可通过涡旋等，或由使用搅拌机而搅拌粒子和溶剂的混液进行。或者，搅拌及抽吸也可通过将仅在抽吸中使用的第1管(抽吸管)和仅在吐出中使用的第2管经管或导管等连接，将第1管及第2管浸到粒子和溶剂的混液而回流来进行。
本实施方式的固液分离方法包括使抽吸的悬浮液中所含的粒子的至少一部分沉降而阻塞的工序。由沉降在抽吸管嘴内形成粒子的块(栓)被认为是粒子阻塞。粒子被认为在粒子的沉降中或沉降后，后述的液体的排出前、或者液体的排出中之任一时间点阻塞。
沉降是指通过重力或离心分离作用等对于粒子以一定方向作用的力战胜由布朗运动的粒子的扩散作用而粒子集中在某位置而分散变得不均一的现象。粒子的分散变得不均一与否的判断可通过对在离尖端开口最远部的粒子浓度的降低进行观察而进行，也可通过对尖端开口附近和离尖端开口最远部的粒子浓度的差异进行观察而进行。或者，也可通过观察粒子和液体的边界变得明确而进行。另外，这样的观察也可由目测进行。沉降优选为，通过放置对于抽吸到抽吸管嘴的内部的粒子大致均一地分散的悬浮液的尖端开口附近和离尖端开口最远部发生由沉降导致的粒子浓度的差异充分的时间来进行。本领域技术人员为了使这样的粒子浓度的差异发生，可适宜设定必要的放置时间。再者，最远部是指抽吸到抽吸管嘴的液体之中与尖端开口相反侧的液相和气相的界面附近。
粒子的沉降例如，通过保持抽吸管嘴内的气压一定来进行。此间，对于悬浮液加压和减压均不进行，悬浮液被放置或静止，悬浮液中的粒子受重力等的作用而沉降。抽吸管嘴内的气压的控制通过在抽吸管嘴的后端连接具备柱塞的注射器的状态下控制柱塞的位置而进行时，粒子的沉降通过使柱塞静止而保持相同的位置而进行。
本实施方式的固液分离方法包括经阻塞粒子的抽吸管嘴的开口而排出内部的液体的工序。
液体的排出(射出)优选为，在抽吸到抽吸管嘴的内部的粒子大致均一地分散的悬浮液的尖端开口附近和离尖端开口最远部发生由沉降导致的粒子浓度的差异之后退行。在本实施方式的固液分离中，由沉降，或者，伴随液体的排出，粒子在抽吸管嘴内阻塞而停留，另一方面，液体通过在抽吸管嘴内阻塞的粒子而排出。由此，本实施方式的固液分离变得可能。液体的排出优选为，以使吸附目标物质的粒子留在开口近前侧的方式进行。开口近前侧是指从尖端开口的最远部向尖端开口的方向。
液体的排出例如，通过使抽吸管嘴内的气压相对于外部的气压成为正压而进行。抽吸管嘴内的气压的控制通过在抽吸管嘴的后端连接含柱塞的注射器的状态下控制柱塞的位置而进行时，液体的排出通过使柱塞移动而使含抽吸管嘴的注射器内部的容积减少之后，使柱塞静止而保持相同的位置而进行。液体的排出的速度优选比吸吐的速度慢。
在别的观点，本实施方式的固液分离方法也可用于BF分离。
更具体而言，排出上述液体之后，通过将从吸附目标物质的粒子溶出目标物质的溶出液抽吸到抽吸管嘴内，使由抽吸的溶出液混合的粒子的至少一部分沉降到开口近前侧，将溶出液和溶出的目标物质经尖端开口排出，将得到的液体根据必要进一步纯化，可以本实施方式的固液分离方法作为BF分离方法使用。
溶出液只要是可从吸附目标物质的粒子溶出目标物质，就不特别限定。作为这样的溶出液，可举出乙腈或己烷等的有机溶剂、或者，缓冲生理盐水或配体试样等的水溶液、或者，含甲醇的水或含三氟醋酸的水等的混合液、或者，离子液体等。
本发明涉及的抽吸管嘴可为大致管状。随着向尖端而内径变得向尖部越来越细是指在抽吸管嘴的一端(尖端)的内径比另一端(连接器端)的内径小，并且，在至少上述一端附近管嘴的截面的内径越接近尖端越小。
根据本发明的固液分离装置的抽吸部通过使抽吸管嘴的内部的压力改变而在抽吸管嘴内将含粒子的液体从外部抽吸或向外部排出。
另外，控制部，在悬浮液的抽吸后，使抽吸的悬浮液中所含的粒子的至少一部分沉降到抽吸管嘴的内部而阻塞，其中至少一部分的沉降是指排出液体时抽吸管嘴阻塞的程度的沉降。
其中，至少排出经形成在抽吸管嘴的尖端的开口(尖端开口)而进行。抽吸部作为从安装的抽吸管嘴的外部向内部，另外，从抽吸管嘴的内部向外部传送液体的泵发挥作用。抽吸部的典型的结构是使柱塞往复而进行抽吸和排出的柱塞型的泵，但不限于此。例如，能应用隔膜型或齿轮型等、各种类型的泵。
控制部是控制上述抽吸部，由此控制含粒子的液体的向抽吸管嘴的抽吸及从其排出。控制部也可例如，通过CPU或微计算机(以下，将这些总称为计算机)执行控制用的软件而实现该功能。但是，不限于该构成。例如，还考虑作为计算机、即不由软件处理的构成，组合硬件电路而实现控制部的功能的实施方式。
描述在上述的固液分离装置中的几个优选的实施方式。
上述控制部也可如下所述控制上述抽吸部。即，在基于上述悬浮液的抽吸后至在抽吸管嘴内粒子大致均一地分散的悬浮液的尖端开口附近和离尖端开口最远部发生由沉降导致的粒子浓度的差异的期间而预先确定的静止期间，停止上述悬浮液的抽吸而使上述粒子的至少一部分沉降。再者，在经过上述静止期间后，经在内部阻塞上述粒子的抽吸管嘴的开口而排出内部的液体。
如上所述，在抽吸管嘴内抽吸悬浮液，预先测定至在抽吸管嘴的尖端开口附近和离尖端开口最远部发生由沉降导致的粒子浓度的差异的期间而确定静止期间，则其后的固液分离可通过结束抽吸之后经过上述静止期间之后，开始排出来实现。即，由于在静止期间粒子沉降，从而可在粒子在抽吸管嘴的内部阻塞的状态下排出内部的液体，由此固液分离变得可能。
另外，上述容器可收容含目标物质的试样液和使吸附该目标物质的粒子，上述控制部也可通过排出内部的液体而将吸附目标物质的粒子留在抽吸管嘴的内部。
再另外，上述抽吸部也可包括含柱塞的注射器和使该柱塞移动的运作器，上述控制部以控制运作器而使含抽吸管嘴的注射器内部的容积增大的方式移动柱塞而进行上述悬浮液的抽吸之后，以在上述静止期间保持相同的位置的方式使柱塞静止，在经过上述静止期间后，以使含抽吸管嘴的注射器内部的容积减少的方式移动柱塞之后使柱塞静止。
当这样时，通过控制柱塞的移动及静止而可抽吸悬浮液，在抽吸管嘴内使粒子沉降，排出内部的液体而在抽吸管嘴内留下粒子。
上述控制部也可比抽吸上述悬浮液的柱塞的移动速度缓慢地使上述柱塞移动而排出内部的液体。
当这样时，可用抽吸时搅拌的粒子分散到悬浮液中的程度的速度移动柱塞，用排出时沉降的粒子不搅拌的程度的速度移动柱塞。其中的速度不含方向，是指每单位时间的位置的变化的大小。
另外，上述抽吸管嘴也可能与抽吸部连离。
再另外，也可还具备将抽吸管嘴搬送到向上述抽吸部安装的位置的管嘴搬送机构和使安装到上述抽吸部的抽吸管嘴的尖端向支持在上述容器支持体的容器内的悬浮液下降的升降机构。
这些优选的实施方式可适宜组合。
以下，使用附图而进一步详述本发明。再者，以下的说明在全部的方面是例示，不应解释为限定本发明。
《固液分离装置的构成》
图1是显示在此实施方式中的固液分离装置的概略构成的说明图。如图1所示，固液分离装置11具备抽吸部13、控制部15及容器支持体17，它们是对于固液分离装置11必须的构成。在图1中，将对于固液分离装置11的固液分离必要的构成用虚线的框表示。
在此实施方式中，抽吸部13含柱塞13a，含在下端安装抽吸管嘴21(移液器吸头)的注射器13b。
柱塞驱动电机13c是使柱塞13a在注射器13b内移动的驱动源。
控制部15是以计算机作为中心而由存储器、输入输出电路等的硬件构成的电路。通过计算机执行预先储存到存储器的控制程序(软件)来实现柱塞驱动电机13c的控制。
容器支持体17支持收容含粒子的液体的容器23。进而，决定容器23的位置。容器23由容器支持体17能更换地支持。搅拌收容在容器23的粒子和液体则成为悬浮液。但是，粒子和液体比重不同，静置则粒子缓慢地沉降。
在注射器13b的下端形成向下方突出的连接器，在连接器的下端开有吸吐口。抽吸管嘴21是管状，一端侧随着向尖端而内径变得向尖部越来越细，在该尖端形成开口。另一端侧以能与注射器13b的上述连接器连离的形状形成。抽吸管嘴21的另一端安装到注射器13b上，则注射器13b和抽吸管嘴21气密并且液密地接合。再者，抽吸管嘴21是单管状。即，无过滤粒子的滤器等的结构。在进行固液分离时，向注射器13b安装抽吸管嘴21而使用。固液分离的结束后也可从固液分离装置11拆下所使用的抽吸管嘴21，而在以后的固液分离处理中将别的抽吸管嘴安装到注射器13b上。即，抽吸管嘴21是一次性用或能更换的。具体而言，抽吸管嘴21也可为以在溶剂的抽吸或吐出等中使用的所谓的移液器为代表的一次性用移液器吸头。安装到注射器13b的连接器上的抽吸管嘴21是自由拆下的。
优选为，固液分离装置11还具备用于使抽吸管嘴21的下端浸渍于收容在容器23的液体的升降机构29。升降机构29由螺旋轴29a、螺母29b、轴承29c及轴驱动电机29d构成。螺旋轴29a配置在垂直方向，由轴驱动电机29d能正逆转地驱动。螺旋轴29a旋转，则嵌合的螺母29b升降。注射器13b及抽吸管嘴21与螺母29b一体升降。轴驱动电机29d由控制部15控制。
另外，固液分离装置11优选还具备管嘴支架25a及工作台驱动电机25b。管嘴支架25a保持要安装到注射器13b上的抽吸管嘴21。容器支持体17承载移动管嘴支架25a。同时承载移动容器23。工作台驱动电机25b使容器支持体17移动。控制部15控制工作台驱动电机25b。管嘴支架25a及工作台驱动电机25b使保持在管嘴支架25a的抽吸管嘴21向要向抽吸部13安装的位置、即，注射器13b下端的连接器的正下方移动。
管嘴支架25a及工作台驱动电机25b构成将抽吸管嘴21搬送到要向上述抽吸部13安装的位置的管嘴搬送机构。
在将抽吸管嘴21安装到注射器13b上时，控制部15以使另一端向上方而保持在管嘴支架25a的抽吸管嘴21位于注射器13b的连接器的正下方的方式控制工作台驱动电机25b。进而，控制部15控制轴驱动电机29d而使注射器13b降低至向抽吸管嘴21的另一端插入注射器13b下端的连接器的位置。由这些动作，向注射器13b安装抽吸管嘴21。
另外固液分离装置11也可具备压力传感器31。压力传感器31检测(测量)注射器13b内的压力。压力传感器31检测的信号输入到控制部15。
控制部15通过控制柱塞的13a的移动，控制收容在容器23的含粒子的液体的抽吸及吐出。
另外，根据优选的构成，控制部15控制承载管嘴支架25a及容器支持体27的容器支持体17的移动。由此，将抽吸管嘴21安装到注射器13b上变得可能。另外，分注到向容器支持体17承载收容在容器23的含粒子的液体的别的容器变得可能。
根据优选的构成，控制部15也可基于压力传感器31检测的注射器13b的内压P而控制柱塞13a的移动、停止、动作期间等。或者，也可将伴随时间的经过的注射器内压P的变化(Pt曲线)，例如，显示于图1中未图示的显示装置。
《柱塞的控制》
接下来，对于由控制部15的柱塞13a的控制进行说明。
图2是显示为了固液分离而控制部15使柱塞13a移动的样式的说明图。图2的(a)显示注射器13b内的柱塞13a的移动，(b)显示注射器内压P的变化的例，(c)显示抽吸管嘴21内的粒子和液体的样式的例。(b)的曲线是对应于固液分离装置11具备压力传感器31时的Pt曲线。
在图2(a)中，“TDC”表示柱塞13a能移动的上端的位置(上死点)，“BDC”表示柱塞13a能移动的下端的位置(下死点)。
控制部15首先使柱塞13a在注射器13b的上死点和下死点的中间的位置停止。但是，作为一例，也可使停止在这以外的位置。
在该状态下，抽吸管嘴21的尖端浸渍到收容在容器23的含粒子的液体中。根据优选的构成，升降机构29基于控制部15的控制而向液体浸渍抽吸管嘴21的尖端，在固液分离装置11不具备升降机构29的情况，使用者使抽吸管嘴21或容器23的位置手动移动。再者，升降机构29可通过使抽吸管嘴21降低而使浸渍，也可代替其或除了其之外，通过使容器23升高而使浸渍。
<搅拌(搅拌)及抽吸>
其后，控制部15使柱塞13a向注射器内压P成为负压的方向、即，上死点移动。伴随移动，向抽吸管嘴21的内部抽吸收容在容器23的粒子和液体。
再者，控制部15使柱塞13a在上死点和下死点之间往复。以下，将柱塞13a从上死点向下死点的移动也称为前进、将从下死点向上死点的移动也称为后退。在图2的例中使柱塞13a往复5次之后在上死点停止。
在图2(b)中，将柱塞13a达上死点时的注射器内压P的极小值以Ptdc表示，将柱塞13a达下死点时的注射器内压P的极大值以Pbdc表示。
由柱塞13a的往复移动，在含粒子的液体在抽吸管嘴21和容器23之间往复而进行搅拌。即使搅拌(搅拌)前粒子在容器23内沉淀，仍由柱塞13a的往复所致的搅拌动作而粒子和液体成为混合悬浮液。在图2(b)中将搅拌动作的期间以Δta表示。将在搅拌动作中的内压的极大值Pbdc的平均以Pa表示。在搅拌动作的结束时，控制部15使柱塞13a位于上死点，悬浮液被抽吸到抽吸管嘴21(图2(c)参照)。
在此实施方式中，控制部15用预先确定的周期、预先确定的速度往复移动柱塞13a而进行搅拌动作。将往复移动之中向上死点时的柱塞13a的移动速度，即，抽吸时的速度设为Rsuction。柱塞13a的移动速度对应于注射器的容积的变化的速度。即使在作为抽吸部使用柱塞型以外的泵的实施方式中，也能作为与抽吸管嘴21的内部连通的室的容积的变化捕捉而进行同样的动作。再者，在此实施例中，在搅拌中的柱塞13a的前进和后退(抽吸)移动的方向相反，但速度相等。将该速度设为Ragit。柱塞13a在搅拌工序的最后的阶段在上死点停止，进行抽吸。从而，Rsuction＝Ragit。
<静止>
搅拌动作之后，控制部15使处于上死点的柱塞13a静止(参照在图2(a)的期间Δts的图)。静止进行指定的期间(图2(b)中所示的Δts)。再者，搅拌结束后，也可使抽吸管嘴21的尖端升高，或使容器23降低而向收容在容器23的悬浮液的液面的上方移动。但是，其中，即使不使抽吸管嘴21升高到液面的上方，固液分离也是可能的。根据优选的构成，升降机构29可基于控制部15的控制而将抽吸管嘴21的尖端升高到容器23的液面之上。在固液分离装置11不具备升降机构29的构成中，使用者也可使抽吸管嘴21或容器23的位置手动移动。
即使抽吸管嘴21的尖端位于高于容器23的液面，注射器内压P与大气压比也成为负压，另外还有表面张力的作用，抽吸管嘴21内的悬浮液的大半不从下端的开口滴下。
一方面，即使在抽吸管嘴21的尖端位于低于容器23的液面时，注射器内压P与大气压比成为负压，抽吸管嘴21内的悬浮液无向容器23流出的情况。
在图2(b)中，以Δts表示的静止期间，悬浮液停留在抽吸管嘴21内，悬浮液中的粒子开始向下端部沉降。进而，依次在悬浮液的下端部和上端部发生粒子浓度的差异、即浊度的差异。
静止期间Δts被确定为至在抽吸管嘴21内大致均一地分散的悬浮液的粒子沉降而在至少悬浮液的下端部和上端部发生粒子浓度的差异的期间。静止期间Δts例如，基于实验预先确定。该实验是向与在固液分离中使用的同型的抽吸管嘴21抽吸与在固液分离中使用的相同的粒子和溶液，其后，使柱塞13a静止，悬浮液的粒子沉降到抽吸管嘴21内的下端部，对在下端部和上端部发生粒子浓度的差异进行目测观察，或使用摄像机或光传感器等的传感器检测。
如后所述，由此实施方式的固液分离的现象的再现性良好。从而，确定抽吸管嘴21和粒子及液体，由预先实验确定适宜的静止期间Δts，则可实现稳定的固液分离。
作为不同的实施方式，固液分离装置11具备摄像机或光传感器等的传感器，控制部15也可基于它们的传感器的检测而适应性地确定静止期间Δts。即，也可以使柱塞13a在上死点静止至在抽吸管嘴21内的下端部和上端部检测到粒子浓度的差异的方式控制。
<排出(射出)>
在经过静止期间Δts后，控制部15使柱塞13a在预先确定的Δt1的期间向下死点移动(图2(a)的“I”参照)。此时，将柱塞13a的移动的速度设为Reject。控制部15优选用比抽吸时缓慢的速度移动柱塞13a。即，以Reject＜Rsuction的关系成立的方式控制柱塞13a的移动。
伴随柱塞13a的移动而注射器内压P升高。为缓和注射器内压P的升高，从抽吸管嘴21的内部经尖端开口排出液体(图2(c)参照)。注射器13b的悬浮液的上方填满空气。柱塞13a向下死点移动，则压缩该空气而注射器内压P升高。由注射器内压P的升高抽吸管嘴21内部的液体从抽吸管嘴21的尖端开口向下方的容器23排出。由于抽吸管嘴21随着向尖端而内径变得向尖部越来越细，沿向尖端开口的流，沉降的粒子及尚未沉降的粒子在尖端开口的近前集中。进而，在抽吸管嘴内发生粒子的结块(以下，也称为栓)，粒子阻塞。但是，液体穿过粒子和粒子之间、或者管壁和粒子之间而从尖端开口向容器23内排出。由于仅由栓发生向液体的流的抵抗，随着柱塞13a向下死点移动，注射器内压P比搅拌动作时更升高(参照图2(b)的Δt1的期间)。柱塞13a达下死点时的注射器内压P的极大值在图2(b)中以Pe表示。
在期间Δt1之后，控制部15使柱塞13a在下死点停止(在图2(a)中以II表示)。在图2(b)中将停止期间以Δt2表示。期间Δt2被确定为，从抽吸管嘴21充分地排出液体至固液分离完成的期间。
期间Δt1、速度Reject、期间Δt2例如，基于实验预先确定。实验向与在固液分离中使用的同型的抽吸管嘴21抽吸与在固液分离中使用的相同的粒子和溶液，使柱塞13a静止仅上述的期间Δt1而使粒子沉降，将用开口尖端的工而形成粒子的栓而粒子阻塞的适宜的条件由目测观察或使用摄像机的图像解析等使用传感器的检测发现。这样确定期间Δt1、速度Reject即可。对于期间Δt2，以确定的期间Δt1、速度Reject向下死点移动柱塞13a之后，将至液体从抽吸管嘴21充分地排出的期间由目测观察或使用压力传感器31等的传感器的检测确定即可。
在本发明的范围中，也包含在本实施方式的固液分离方法中使用的抽吸管嘴、优选为移液器吸头。抽吸管嘴优选在尖端开口附近无滤器。抽吸管嘴的最小的开口直径优选比粒子的最大直径大，并且，比粒子的最大直径的6倍小。
在本发明的范围中，也包含在本实施方式的固液分离方法中使用的粒子。
在本发明的范围中，也包含在本实施方式的固液分离方法中使用的抽吸管嘴、优选为移液器吸头和在本实施方式的固液分离方法中使用的含粒子的固液分离用试剂盒。
在本实施方式中，也可在箱中捆包收容上述的各种试剂的容器而提供于使用者。在此箱中，也可同装试剂盒的附带文书。在此附带文书中记载了，例如，试剂盒的构成、优选Presepsin的测定流程等。图3显示本实施方式的试剂盒的外观的一例。图中，40表示试剂盒，41表示收容能取下的抽吸管嘴、优选为移液器吸头的第1容器，42表示收容粒子的第2容器，43表示附带文书，44表示捆包箱。
以上、对于固液分离方法、固液分离装置及固液分离用试剂盒，含优选的实施方式而描述实施方式。优选的实施方式是能适宜组合的。
【实施例】
【实施例1：Pt曲线和粒子的阻塞】
Pt曲线明确地显示在抽吸管嘴21粒子阻塞而固液分离成功与否的状态。
图4A～图4C是显示使用图1中所示的构成的固液分离装置11测定的Pt曲线的实测例的坐标图。固液分离装置11具备压力传感器31，将压力传感器31检测的注射器内压P值用一定时间间隔标绘。
抽吸管嘴21(以下，也简称为管)使用在后述的图5C中记载的管的名称是“B”的(以下，管B或B型管)。
在此实施例中使用的粒子推定从对全血、血清或血浆进行加热而得到的上清进行脱盐处理的液体吸附期望的肽或核酸作为目标物质的吸附剂(载体)，使用多孔质氧化硅。
具体而言，秤量下列物质：(a)100mg后述的图5A记载的载体的名称是“1”(以下，第1载体或1型载体)的日本化成公司制介孔质氧化硅载体(商品名Mesopure：尚，图5A中所示的第2～第10载体是第1载体分级品)、(b)100mg的在图5A中记载的第10载体、(c)10mg的在图5A中记载的第5载体，而移向容器23(epppendorf公司制Safe-Lock Tubes 2.0mL)(图1)。
再者，对于第1载体，将网目尺寸75μm的筛和900μm的筛重叠，使作为原末的上述介孔质氧化硅载体过筛，通过回收残留在筛间的粒子而得到。将图5A指定的网目尺寸的筛重叠，使作为原末的第1载体过筛，通过回收残留在筛间的粒子而得到第2～10载体。使用微轨道FRA 9220装置(Leeds&Northrup公司制)而由激光衍射－散射法测定的第1～第10载体的粒度分布示于图5B。
向其中作为溶剂(液体)添加1.5mL的PBS(Bio-Rad公司制、商品编码：1610780)。进而，从初期的位置向上死点移动柱塞13a而抽吸收容在容器23的粒子和液体。
在柱塞13a从上死点向下死点或从下死点向上死点移动时注射器的容积改变1000μL的搅拌动作中的柱塞13a的移动速度Rsuction是2800μL/s。
柱塞13a在与图2同样地进行往复5次的搅拌动作之后，使在上死点静止，其后，缓慢地向下死点移动(前进)，在下死点停止指定的期间。在继搅拌及抽吸的工序(以下，也简称为搅拌工序)后的射出工序中，使柱塞13a从上死点向下死点前进。在搅拌工序及射出工序中因1次的前进而改变的注射器的体积是1000μL(后退同样)。前进时的移动速度R是800μL/s。
通过搅拌及抽吸的工序以及排出工序，PBS溶剂和载体被悬浮，目测观察在管内由载体的栓形成完成(固液分离成功)、或者栓形成不成功而终止(固液分离不成功)，还进行动画摄像而事后确认而判断。
再者，固液分离成功表示，在搅拌工序和射出工序之后，判断为可分开上述第1载体和上述PBS溶剂。
图4A～图4C各自显示使用上述(a)～(c)的各种载体时的Pt曲线。在图4A～图4C中，在坐标图的右侧，以图解表示固液分离成功时的图案及固液分离不成功时的代表性的管内的样式。
在判断为固液分离不成功的管和载体的组合中，与固液分离成功时比，关于Pt曲线而可举出以下的特征。(1)与在搅拌工序中测量的Pagit的值比，射出工序的时间的前半部分的Δt1期间测量的Peject的值不显示显著的差异，(2)射出工序的后半部分的Δt2期间确认不到在柱塞13a的前进移动结束往后溶剂继续向管外排出(以下“缓和”)。
一方面，在判别为固液分离成功的组合中，在Pt曲线之中，含由使用判别式Pe＝a×(t+b)2+c(其中，系数a≠0)的曲线拟合得到的曲线、即与抛物线拟合的曲线。
再者，在曲线拟合中，使用Synergy Software公司制的Kaleida Graph。
以上，确认到Pt曲线发挥判断固液分离的成功和不成功的工具的作用。
【实施例2：由管和载体的组合的固液分离】
利用使用图4A～图4C而进行说明的固液分离成功与否的判断方法，判断可否对于更多种管和载体而进行固液分离。
在此实施方式中，载体的种类用固有的尺寸(粒度分布)及在混合液或悬浮液中的体积分率(载体浓度)规定。
图5A是显示其中在实验中使用的各载体的制作中使用的筛的网目尺寸的说明图。在图5A的右上以图解表示，将载体的粒径作为S4。
图5B是显示通过对于使用有图5A指定的网目尺寸的筛而制作的第1～第10载体由激光衍射－散射法对粒径进行测定而得到的第1～第10载体的粒度分布的表。
图5C是显示在实验中使用的管的种类的说明图。管的种类特别用固有的尖端开口的尺寸(液体通过截面积)规定。在图5C的右上以图解表示，将管的尖端的开口直径表示为S0。
图5D是显示用图5A中所示的载体和图5C中所示的管的组合进行固液分离的实验的结果的表。在表及以下的记载中，“◎”表示判断为固液分离良好的，“〇”表示判断为能固液分离的。
实验选择从图5A所示的载体组(第1～第9载体)和图5C所示的管组(N、A、B、O、B1及B2型)之中各自任意地选的载体及管的组合，将选择的管安装到固液分离装置11的连接器上。进而，向容器23放入选择的载体和PBS溶剂而静置。
接下来，如图2所示，实施搅拌工序和射出工序而得到Pt曲线。基于目测观察及得到的Pt曲线而判断固液分离的成功与否，得到图5D的表。
从实验的结果，导出以下。(1)使固液分离成为可能的组合不是一个或限定的多个，而是达到多个，(2)如上述，相比管的形状(照片等)或载体的形状(第1载体～第9载体为了第二次凝集体而形状不定形)，管的尖端开口和载体的粒径的相对的尺寸的方对于固液分离的成功与否的影响更大。
更具体性地说明，则在使用第7载体和管B1的组合时显示良好的固液分离，另一方面，在使用第8载体和管B1的组合时固液分离的成功率变低(图5D)。根据图5C，相对于第7载体极大直径是0.25mm而第8载体极大直径是0.18。进而，根据图5C，管B1的最小的开口直径是0.8mm。基于这些数值而计算，得知在管的最小的开口直径比粒子的极大直径大，并且，比粒子的极大直径的6倍小的情况中，显示良好的固液分离。再者，在本实施例中，粒子的极大直径是指在载体制作时使用的2个筛之中，大的方的筛目尺寸。
再者，成功率是指对于某管和某载体的组合重复进行n回上述的合否判断时，固液分离成功时的数m的比例(m÷n)。将上述合否判断各自重复10次(n＝10)、研究固液分离的成功率。成功率在m÷n的比例显示50％以上100％以下时表示为“◎”、在显示10％以上不足50％时表示为“〇”、在显示0％时表示为“×”而表示于图5D。再者，对于在本实施例中使用的管和载体的组合而未显示成功率0％(图5D)。
另外，在实验中使用的管组如下所述。N型管；Precision Science公司制、F4100、A型管；epppendorf公司制、ep T.I.PS Standard50-1000μL、B型管；Corning公司制、100-1000μL Universal Fit Pipet Tips、O型管；GILSON公司制、CP-1000的毛细管部、B1型管；将B型管的尖端使用精密艺术刀157B型(Olfa公司制)轮切加工为与开口面平行。尖端的开口直径S0在加工后用游标卡尺CD-15PSX(三丰公司制)测量，确认为在0.8mm～1.6mm的范围。B2型管；将B型管的尖端使用精密艺术刀157B型(Olfa公司制)轮切加工为与开口面平行。尖端的开口直径S0在加工后用游标卡尺CD-15PSX(三丰公司制)测量，确认为在1.6mm～2.4mm的范围。
作为载体，秤量100mg日本化成公司制介孔质氧化硅载体(商品名Mesopure的介孔质氧化硅载体(第1～9载体)，各自移到容器中。
如前所述，溶液中的载体的浓度也确定载体的种类的因子，基于此因子的组合的实施例在实施例6中后述。
【实施例3：载体的分散及集合的再现性】
对于在实施例2中得到的成功率而接下来示其实际的值非常地高。与图1中记载的装置连接在图5A及图5C中记载的管而连续重复100次搅拌工序和射出工序。
结果，以任何的次数，均显示判断为合格的Pt曲线。即，成功率是100％。图6A～C是显示其的Pt曲线的例示。即，图6A显示第11～15次的Pt曲线，图6B显示第13次的Pt曲线，图6C显示第14次的Pt曲线。这些结果表示本实施方式的固液分离可再现性良好地实施。
【实施例4：柱塞的移动速度的探讨】
验证如上所述的判断为合格的例由特定的柱塞的移动速度Reject限定与否。方法与实施例1中记载的方法相同。详细的验证条件如以下。
在与实施例1同样的容器中秤量100mg图5C记载的第1载体，添加1mL的PBS而作为混合液。管使用在图5C中记载的B1型管(口径1.5mm)，经图1的装置的连接器而与泵连接。伴随搅拌工序的溶剂的抽吸和吐出在以下的柱塞的移动条件之下进行。进行交替重复5次后退和前进，再者，1次的后退。1次的前进或后退的移动体积是1000μL、移动速度Ragit是2800μL/s。在射出工序中，进行1次的前进，移动体积是1000μL。此时，以至30～1200μL/s的范围的Reject前进的方式控制柱塞的移动。在以各移动速度的射出工序中各自记录Pt曲线。与实施例1记载的方法同样地进行合否判断。
以任何高低的柱塞移动速度Reject，均观察到在管内形成栓。即，例证完成固液分离的Reject的条件广泛(图7)。
还确认到，Reject的值更大(柱塞更快地前进)时，发生更高的管内压力，或者，Reject的值更小(柱塞更慢地前进)时，发生耗费更长的时间(Δt2)的压力降低(缓和)。
【实施例5：多样的搅拌(搅拌)方法的探讨】
为了调查本实施方式的固液分离的成功与否是否受搅拌方法(搅拌工序)的多样性的影响，进行以下的实验。
在内径18mm的圆筒状的容器中作为载体秤量4.9g离子交换树脂BioRexMSZ501D(Bio-Rad公司)，作为溶剂添加由Millipore公司制水纯化装置MilliQ型供给的超纯水3.2mL。作为第1管使用图5C记载的B2型管(口径2.34mm)、作为第2管使用图5C记载的B2型管(口径1.8mm)，将其与图1的装置连接。由利用第2管的容器内的溶剂的抽吸和吐出、或者，利用第1管和第2管的两者的容器内的溶剂的抽吸和吐出制作悬浮液。将悬浮液用第1管抽吸之后，观察形成了栓。其后，由指定的命令前进柱塞，从第1管之中的悬浮液仅将溶剂向管外排出。由目测观察，另外，由使用Pt曲线的合否判断证明实施固液分离。
从以上的结果显示，可与溶剂或混合液或悬浮液连接的管数无关系地达成本实施方式的固液分离。
【实施例6：载体的浓度的影响】
为了调查载体的浓度的影响，进行以下的实验。使用的载体、溶剂、管的口径示于表1。
【表1】
在实施例5中记载的容器中秤量在表1中记载的第12载体(Bio-Rad公司制、BioRexMSZ501D)，在实施例1中使用的容器中秤量图5C和表1中记载的第1载体和表1中记载的第13载体(粒径0.5mm的氧化锆球(ASONE株式会社型号YTZ-0.5))，添加表1中记载的溶剂。
将在表1中记载的管与图1中记载的装置的连接器部连接，应用与实施例1同样的搅拌工序和射出工序。射出工序的前进在25℃(室温)、大气压下进行。
结果确认到，以任何的浓度均观察到期待的载体的分散或载体的块化，达到固液分离(图8A～图8C)。
【实施例7：载体的比重的影响】
为了调查载体的比重的影响，进行以下的实验。使用的载体和溶剂、射出时的ΔVplngr和Reject示于表2。
首先，在与在实施例1中使用的相同的容器秤量表2中记载的各种载体(9A～9D)，添加1.5mL比重1的磷酸缓冲液(PBS)而作为混合液。对于各种混合液，使用连接在图5C中记载的管B的装置(图1)而进行与实施例1同样的搅拌工序和射出工序。
由射出工序的前进的柱塞的移动体积和移动速度R如表2中记载。此前进在25℃(室温)、大气压下进行。
由图1记载的装置记录的Pt曲线示于图9A～D。从它们的结果确认到，使用任何的比重的载体均观察到期待的载体的分散或载体的块化，可达成固液分离。
【表2】
以下对于上述的表2中的表述而进行说明。第14载体；粒径0.5mm的SUS304球九州Bearing株式会社第15载体；粒径0.5mm的氧化铝球ASONE株式会社型号AL9-0.5第16载体；粒径0.5mm的聚苯乙烯球PBS；将10×PBS(Bio-Rad公司制、1610780)用超纯水稀释10倍
【实施例8：溶剂的比重的影响】
为了调查溶剂的比重的影响，进行以下的实验。使用的载体和溶剂、射出时的ΔVplngr和Reject示于表3。
首先，在与在实施例1中使用的相同的容器中秤量100g比重2的第1载体，添加1.5mL表3中记载的各种载体(10A～10C)而作为混合液。对于各种混合液，使用连接在图5C中记载的管B的装置(图1)而进行与实施例1同样的搅拌工序和射出工序。
由图1记载的装置记录的Pt曲线示于图10A～C。从它们的结果确认到，使用任何的比重的溶剂均观察到期待的载体的分散或载体的块化，可达成固液分离。
【表3】
以下对于上述的表3中的表述而进行说明。PBS：将10×PBS(Bio-Rad公司制、1610780)用超纯水稀释10倍；60％CsCl：将CsCl(和光纯药公司制、034-08161)用超纯水溶解；Hexan：n-Hexan(和光纯药公司、082-00421)。
【实施例9：溶剂的粘度的影响】
为了调查溶剂的粘度的影响，进行以下的实验。使用的载体和溶剂、射出时的ΔVplngr和Reject示于表4。
首先，在与在实施例1中使用的相同的容器中秤量在表4中记载的各种载体(11A～11D)，添加1.5mL在表4中记载的各种溶剂而作为混合液。对于各种混合液，使用连接在图5C中记载的管B的装置(图1)而进行与实施例1同样的搅拌工序和射出工序。
由图1记载的装置记录的Pt曲线示于图11A～D。从它们的结果确认到，使用任何的粘度的溶剂均观察到期待的载体的分散或载体的块化，可达成固液分离。
【表4】
以下对于上述的表4中的表述而进行说明。Tween：tween-20(NACALAI TESQUE公司制、23926-35)；80％Glycerol：将Glycerol(NACALAI TESQUE公司制、17018-25)用超纯水稀释；超纯水95℃：通过将超纯水在热浴(东京理化器械公司制、SB-450型)中静置30分钟来调制。
【实施例10：温度的影响】
在与在实施例1中使用的相同的容器中秤量100mg在图5C中记载的第6载体，对于将添加1.5mL的超纯水而得到的混合液(a)通过在冰浴(在容器中装满用自来水和Scotsman公司制AFE400型的制冰碎冰器制作的冰的)静置30分钟而于0.5℃调制的混合液、(b)在室温下静置的25℃的混合液、(c)通过在热浴(东京理化器械公司制SB-450型)中静置30分钟而于98℃调制的各种混合液，使用连接在图5C中记载的管B的装置(图1)而进行与实施例1同样的搅拌工序和射出工序。
由射出工序的前进的柱塞的移动体积是1000μL、移动速度R是800μL/s(但是，对于(a)2800μL/s)。此前进在25℃(室温)、大气压下进行。
由图1记载的装置记录的Pt曲线示于图12A～C。结果确认到，在任何的温度下均观察到期待的载体的分散或载体的块化，可达成固液分离。
【实施例11：含表面活性剂的溶剂的利用可能性】
为了调查溶剂中含表面活性剂时的影响，进行以下的实验。
在与在实施例1中使用的相同的容器中秤量100mg图5C中记载的第1载体，作为溶剂，制作添加1mL的将TritonX(NACALAI TESQUE公司制、商品编码：35501-15)用超纯水稀释至达指定的浓度((a)20％、(b)8％、(c)0％)的而得到的混合液。对于这些混合液，使用连接在图5C中记载的管B1(S0＝1.32)的装置(图1)而应用与实施例1同样的搅拌工序和射出工序。
射出工序的前进在25℃(室温)、大气压下进行。
由图1中记载的装置记录的Pt曲线示于图13A～C。结果确认到，使用任何的溶剂均观察到期待的载体的分散或载体的块化，可达成固液分离。
【实施例12：能在固液分离中使用的载体的种类的范围的扩大化】
在与某管的组合中判别为固液分离不成功、即，不合格的载体通过与支持体联用，为了调查固液分离变得可能与否，进行以下的实验。
首先，在与在实施例1中使用的相同的容器中，对于管B，作为不合格的载体使用图5C记载的第10载体，作为合格的载体(支持体)使用与图5C记载的第2载体相同的载体。秤量100mg第10载体、秤量10mg与第2载体相同的载体，混合这些而制作载体和支持体的混合物(图14A)。向各种载体及混合物各自添加1.5mLPBS而作为混合液。对于得到的各种混合液，使用连接在图5C中记载的管B的装置(图1)而进行与实施例1同样的搅拌工序和射出工序。射出工序的前进在25℃(室温)、大气压下进行。
由图1中记载的装置记录的Pt曲线示于图14B～D。结果，如事前的判断，对于成为不合格的载体观察不到块化(图14B)、对于成为合格的载体观察到本发明的固液分离(图14C)。另外确认到，在使用上述的载体及支持体的混合物时达到固液分离(图14D)。
经证实，即使是判断为不合格的载体，仍通过以成为合格的载体作为支持体添加而变得能达成固液分离。即得知，仅通过添加支持体的简单的操作，在本发明的固液分离中，大大扩展处理的载体的范围。
【实施例13：肾上腺皮质刺激激素(ACTH)肽的纯化】
通过利用本实施方式的固液分离，从含ACTH肽的液体试样除去盐，调查是否能以ACTH肽作为纯化级分回收。
(1)含TMR-ACTH肽的液体试样的调制
作为目标分子使用将由肾上腺皮质刺激激素(ACTH)的1位～24位的氨基酸构成的ACTH部分肽用四甲基若丹明(TMR)标记的TMR-ACTH肽(株式会社Scrum制)。再者，ACTH是碱性肽(等电点pI＝10.64)，以SEQ ID NO:1表示。以TMR-ACTH肽的最终浓度成为50nM的方式溶解于PBS(Bio-Rad公司制、1610780)，调制含TMR-ACTH肽的液体试样。
(2)含TMR-ACTH肽的液体试样的脱盐处理(连续稀释式)
将含TMR-ACTH肽的液体试样由使用本实施方式的固液分离的图15中记载的工序(以下，称为连续稀释式的BF分离操作)进行脱盐处理。一系列的工序使用在图1中记载的装置进行。作为载体使用细孔径4nm的日本化成公司制的介孔质氧化硅载体的表面有氨基甲硅烷基修饰的载体(以下，称为氨基甲硅烷基修饰氧化硅载体)。使用图5C记载的B型管的管和与实施例1中使用的相同的容器。
以下对于图15中记载的连续稀释式的BF分离操作的各工序(i)～(iii)而进行说明。
(i)吸附工序
将含TMR-ACTH肽的液体试样(F0)1.5mL添加到收容载体100mg的容器中。由搅拌工序向载体吸附TMR-ACTH肽，将含载体的液体试样抽吸到管内。将管从容器提高，使载体沉降到管的口部，观察形成了栓。其后，由射出工序吐出仅液体。以吐出的液体作为流通级分(F1)回收。
(ii)水洗工序
将吐出后的管浸到与放入离子交换水1mL的实施例1同样的容器中，通过重复吸吐操作而搅拌，将盐类冲洗。将载体和离子交换水的悬浮液抽吸到管内，将管从容器提高，使载体沉降到管的口部，观察形成了栓。其后，由射出工序吐出仅液体。以吐出的液体作为冲洗水级分(F2-1)回收。将同样的水洗工序再重复进行2次。在图15中，将在第2次及第3次的水洗工序中得到的冲洗水级分各自表述为F2-2及F2-3。
(iii)溶出工序
将吐出后的管浸到与放入1mL肽溶出用的脱离液(溶出液){含50％乙腈(和光纯药公司制、019-21691)和0.1％三氟醋酸(和光纯药公司制、206-10731)的水溶液}的实施例1同样的容器中，由搅拌搅拌，使吸附在载体的肽溶出。将载体和脱离液的悬浮液抽吸到管内，将管从容器提高，使载体沉降到管的口部，观察形成了栓。其后，由射出工序吐出仅液体。以吐出的液体作为纯化级分(F3)回收。
(3)导电率的测定
对于脱盐处理前的液体试样(F0)及脱盐处理后的纯化级分(F3)而测定导电率。导电率计使用Twin Cond B-173(株式会社堀场制作所)。其中，脱盐处理前的溶剂是水，与此相对，脱盐处理后的溶剂是50％乙腈/0.1％TFA溶液。从而，脱盐处理后的导电率值表示从测定值减去50％乙腈/0.1％TFA溶液的导电率值(2.0mS/cm)的值。
从得到的导电率，根据下述的式1而算出由本脱盐处理的脱盐效率。
脱盐效率(％)＝(脱盐处理前的导电率-脱盐处理后的导电率)/(脱盐处理前的导电率)×100…式1
导电率和脱盐效率示于下述的表5。再者，F3的导电率由于减去乙腈本身的导电率(2.0mS/cm)而成为负的值。减法前的值是1.72mS/cm。
【表5】
级分 导电率(mS/cm) 脱盐效率(％)
脱盐处理前(F0) 10.1 -
脱盐处理后(F3) -0.28 100
(4)荧光强度的测定
对于脱盐处理前的液体试样(F0)及脱盐处理后的纯化级分(F3)而测定荧光强度。分光荧光光度计使用F-7000(株式会社日立HighTechnologies)而测定激发波长480nm及荧光波长580nm处的荧光强度。
从得到的荧光强度，根据下述的式2而算出由本脱盐处理的肽回收率。肽回收率(％)＝(在脱盐处理后的荧光强度)/(在脱盐处理前的荧光强度)×100…式2
荧光光谱示于图16，荧光强度和肽回收率示于下述的表6。
【表6】
级分 荧光强度(ex 480nm/em 580nm) 肽回收率(％)
脱盐处理前(F0) 0.747 100
脱盐处理后(F3) 0.259 35
如表5所示，由BF分离操作纯化级分F3充分地脱盐。另外，如表6所示，从脱盐处理后的纯化级分F3观测到起因于TMR的荧光，在纯化级分F3中含TMR-ACTH肽。从这些结果得知，由利用本实施方式的固液分离的连续稀释式的BF分离操作去除液体试样中的盐，可以ACTH肽作为纯化级分回收。
【实施例14：癌胎儿性抗原(CEA)肽的纯化】
通过利用本实施方式的固液分离，从含CEA肽的液体试样除去盐，调查是否能以CEA肽作为纯化级分回收。(1)含TMR-CEA肽的液体试样的调制
作为目标分子使用将由癌胎儿性抗原(CEA)的132位～171位的氨基酸构成的CEA部分肽用TMR标记的TMR-CEA肽(株式会社Scrum制)。再者，CEA是酸性肽(等电点pI＝4.38)，以SEQ ID NO:2表示。以TMR-CEA肽的最终浓度成为2.5μM的方式溶解于PBS，调制含TMR-CEA肽的液体试样。
(2)含TMR-CEA肽的液体试样的脱盐处理
除了代替含TMR-ACTH肽的液体试样而使用在上述(1)中调制的含TMR-CEA肽的液体试样，作为载体使用细孔径4nm的日本化成公司制介孔质氧化硅载体(商品名Mesopure：图5A记载的载体的名称是“1”的)的表面有十八烷基甲硅烷基(ODS)修饰的(ODS修饰氧化硅载体)之外，与实施例13同样地，用图15中记载的连续稀释式的BF分离操作实施脱盐处理。
(3)导电率的测定
对于脱盐处理前的液体试样F0及脱盐处理后的纯化级分F3而用与实施例13同样的方法测定导电率。从得到的导电率，根据实施例13中记载的式1而算出由本脱盐处理的脱盐效率。导电率和脱盐效率示于下述的表7。再者，F3的导电率由于减去乙腈本身的导电率(2.0mS/cm)而成为0。减法前的值是2mS/cm。
【表7】
级分 导电率(mS/cm) 脱盐效率(％)
脱盐处理前(F0) 8.9 -
脱盐处理后(F3) 0.0 100
(4)荧光强度的测定
对于脱盐处理前的液体试样F0及脱盐处理后的纯化级分F3而用与实施例13同样的方法测定激发波长480nm及荧光波长580nm处的荧光强度。从得到的荧光强度，根据实施例13中记载的式2而算出由本脱盐处理的肽回收率。
荧光光谱示于图17，荧光强度和肽回收率示于下述的表8。
【表8】
级分 荧光强度(ex 480nm/em 580nm) 肽回收率(％)
脱盐处理前(F0) 28.92 100
脱盐处理后(F3) 2.007 6.9
结果，如表7所示，由BF分离操作纯化级分F3充分地脱盐。另外，如表8所示，从脱盐处理后的纯化级分F3观测到起因于TMR的荧光，在纯化级分F3中含TMR-CEA肽。从这些结果得知，由利用本实施方式的固液分离的连续稀释式的BF分离操作去除液体试样中的盐，可以CEA肽作为纯化级分回收。
【实施例15：肽的选择性纯化】
使用与BNP比较而对于ACTH具有高的亲和性的载体，从含ACTH和BNP肽的液体试样，调查在由利用本实施方式的固液分离的BF分离操作的纯化级分中的BNP和ACTH的回收率的差异。
(1)含肽混合物的液体试样的调制
作为目标分子使用TMR-ACTH肽和脑性钠利尿肽(BNP)(株式会社Scrum制)。再者，BNP是碱性肽(等电点pI＝10.95)，以SEQ ID NO:3表示。以TMR-ACTH肽的最终浓度成为5μM、BNP肽的最终浓度成为100μM的方式溶解于PBS，调制含肽混合物的液体试样。
(2)来自含肽混合物的液体试样的对象肽的BF分离处理
将含肽混合物的液体试样用与实施例13同样的方法BF分离处理。使用的载体是ODS修饰氧化硅载体。
(3)肽的检测
对于BF分离处理前后的各级分[BF分离处理前(F0)、BF分离处理工序中的流通级分(F1)和冲洗水级分{F2；将3个冲洗水级分(F2-1、F2-2及F2-3)各等量混合的}、及BF分离处理后的纯化级分(F3)]进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。具体而言，将作为10x加样缓冲液(宝生物株式会社)及60％(w/w)甘油溶液的1:1混合物的样品缓冲液(还原剂非添加)和上述的各级分混合，使用NuPAGE4-12％Bis-Tris凝胶及NuPAGEMES SDS电泳缓冲液(一同Life Technologies日本株式会社)，以200V(定电压)进行电泳30分钟。电泳槽使用EXEL SURE-LOCK MINICELL(Life Technologies日本株式会社)、电源装置使用PowerStation1000×P(ATTO株式会社)。对于电泳后的凝胶，将TMR-ACTH肽使用荧光成像仪Pharos FX系统(Bio-Rad Laboratories株式会社)检测。
另外，将BNP肽由银染色进行检测。在银染色中使用银染色试剂盒“EzStainSilver”(ATTO株式会社)。染色的各工序如下。固定；在固定液100mL{超纯水40mL+甲醇(和光纯药工业株式会社)50mL+醋酸(和光纯药工业株式会社)10mL+试剂盒瓶S-1 1mL}中振荡10分钟，清洗；在超纯水100mL中振荡10分钟×3次、染色；在染色液(超纯水100mL+试剂盒瓶S-2 1mL)中振荡10分钟，清洗；在超纯水100mL中振荡30秒钟，在显色液100mL(超纯水200mL+试剂盒瓶S-3 1mL+试剂盒瓶S-4 1mL)中振荡30秒钟，显色；在显色液100mL中振荡5～10分钟，停止；在停止液100mL(超纯水100mL+醋酸1mL)中振荡10分钟，清洗；在超纯水100mL中振荡5分钟×2次。振荡机使用体外摇床Wave-SI(TAITEC株式会社)。
对于凝胶的荧光成像像及银染色像，使用图像处理软件ImageJ1.46r(NIH)而求出TMR-ACTH肽或BNP肽的条带的光密度测定法值，根据下述的式3而算出回收率。
回收率(％)＝(各级分中的光密度测定法值)/(BF分离处理前的光密度测定法值)×100…式3
凝胶的荧光成像像和银染色像示于图18及图19，TMR-ACTH肽或BNP肽的回收率示于下述的表9。
【表9】
结果表明，由利用本实施方式的固液分离的连续稀释式的BF分离操作，从含ACTH和BNP肽的液体试样，根据对于载体的ACTH和BNP的亲和性的差异，作为纯化级分，相比BNP更选择性地回收ACTH。
【实施例16：肽的选择性纯化】
使用对于ACTH具有高的亲和性、对于λDNA具有低的亲和性的载体，由利用本发明的固液分离的BF分离操作，调查是否能从含ACTH和λDNA的液体试样将ACTH选择性地作为纯化级分回收。
(1)含肽和核酸的液体试样的调制
作为目标分子使用TMR-ACTH肽。作为混杂物使用噬菌体λ来源的直链状核酸，且由48,502个碱基长构成的λDNA(宝生物株式会社制、型号：3010)。以TMR-ACTH肽的最终浓度成为5μM、λDNA的最终浓度成为50μg/mL的方式溶解于PBS，调制含肽和核酸的液体试样。
(2)来自含肽和核酸的液体试样的肽的BF分离处理
将含肽和核酸的液体试样用与实施例13同样的方法BF分离处理。作为载体使用细孔径4nm的，无化学修饰的介孔质氧化硅载体、即部件表面有硅烷醇基的无修饰氧化硅载体(日本化成公司制)。
(3)肽及核酸的检测
对于BF分离处理前后的各级分[BF分离处理前(F0)、BF分离处理工序中的流通级分(F1)和冲洗水级分{F2；将3个冲洗水级分(F2-1、F2-2及F2-3)各等量混合的}及BF分离处理后的纯化级分(F3)]进行SDS-PAGE或琼脂糖凝胶电泳。SDS-PAGE用与实施例15同样的方法进行。琼脂糖凝胶电泳具体而言，将琼脂糖(宝生物株式会社)和三醋酸EDTA(TAE)缓冲液(和光纯药工业株式会社)混合，在加热溶解后在凝胶托盘(株式会社Mupid)中固定而制成1％琼脂糖凝胶。将6x加样缓冲液(宝生物株式会社)和上述的各级分混合，使用制作的1％琼脂糖凝胶和TAE缓冲液，以100V(定电压)进行电泳40分钟。电源装置付电泳槽使用Mupid-2plus(株式会社Mupid)。对于电泳后的凝胶，用核酸荧光染色剂SYBR Green II(LONZA日本株式会社)对λDNA进行染色，使用荧光成像仪Image Quant LAS4000(GE Healthcare·日本株式会社)进行检测。λDNA的染色在1×SYBR Green II/TAE缓冲液中将凝胶振荡60分钟而进行。振荡机使用体外摇床Wave-SI。
对于凝胶的荧光成像像而用与实施例15同样的方法算出TMR-ACTH肽或λDNA的回收率。
凝胶的荧光成像像示于图20及图21，TMR-ACTH肽或λDNA的回收率示于下述的表10。
【表10】
结果表明，由利用本实施方式的固液分离的BF分离操作，从含ACTH肽和λDNA的液体试样之中，作为纯化级分，可选择性地回收ACTH。
【实施例17：来自血液试样的肽的纯化】
根据特开2015-140320号中记载的方法，通过处理全血而去除得到的肽的液(以下，也称为肽汤)中的盐，调查作为纯化级分能取出肽与否。
(1)含肽和全血的液体试样的调制
作为目标分子使用将由ACTH的1位～24位的氨基酸构成的ACTH部分肽用作为红色荧光染料的四甲基若丹明(TMR)标记的TMR-ACTH部分肽(株式会社BIOLOGICA)。作为混杂物，从PROMEDDX公司购入并使用添加抗凝固剂EDTA盐的健康自愿者血液(全血)。根据特开2015-140320号中记载的方法，以TMR-ACTH肽的最终浓度成为5μM、全血稀释成为3倍的方式，使TMR-ACTH部分肽及全血溶解于含有氯化锌的三-磷酸混合系缓冲液(Tris·HCl[pH＝7.0](最终浓度100mM)、磷酸钠(最终浓度0.4mM)、NaCl(最终浓度6mM)、进而ZnCl2(最终浓度100mM))，调制含肽和全血的液体试样。
(2)含肽和全血的液体试样的加热处理
向10mL容积的玻璃试管移含肽和全血的液体试样1.4mL，接下来用特氟隆(注册商标)制的试管用耐压密封座(Milestone General株式会社)封上之后，使用微波照射装置MultiSYNTH(Milestone General株式会社)，从室温(25℃)升温至100℃30秒钟，其后，通过以100℃～160℃1分钟升温而进行加热处理。加热处理后的冷却通过从与上述的微波照射装置连接的空气压缩机YC-3R(株式会社八重崎空压)将压缩空气吹到上述的耐压密封座来进行。冷却速度设为每分20℃。回收加热处理后的作为上清级分的肽汤。
(3)含肽和全血的液体试样的加热处理上清的脱盐处理
将含肽和全血的液体试样的加热处理上清(肽汤)用与实施例13同样的BF分离操作进行脱盐处理。使用的载体是ODS修饰氧化硅载体。
(4)导电率的测定
对于脱盐处理前后的各级分{脱盐处理前(F0)、脱盐处理工序中的流通级分(F1)和冲洗水级分(F2-1,F2-2,F2-3)及脱盐处理后的纯化级分(F3)}，用与实施例13同样的方法测定导电率，算出由本脱盐处理的脱盐效率。
导电率和脱盐效率示于下述的表11。
【表11】
级分 导电率(mS/cm) 脱盐效率(％)
脱盐处理前(F0) 214 -
流通级分(F1) 50 -
冲洗水级分(F2-1) 12.3 -
冲洗水级分(F2-2) 1.1 -
冲洗水级分(F2-3) 0.1 -
纯化级分(F3) 2.4 98.9
(5)荧光强度的测定
对于脱盐处理前后的各级分{脱盐处理前(F0)、脱盐处理工序中的流通级分(F1)和冲洗水级分(F2-1,F2-2,F2-3)及脱盐处理后的纯化级分(F3)}，用与实施例13同样的方法测定荧光强度，算出由本脱盐处理的肽回收率。在荧光强度测定中，在TMR-ACTH肽的检测中设为激发波长540nm及荧光波长580nm、另外，在全血来源肽的检测中设为激发波长287nm及荧光波长350nm。
荧光光谱示于图22及图23，荧光强度和肽回收率示于下述的表12。
【表12】
结果显示，由利用本发明的固液分离的连续稀释式的BF分离操作，根据特开2015-140320号中记载的方法而进行由全血调制的液中的盐的除去，可以ACTH或全血来源的肽作为纯化级分回收。
【实施例18：使用多样的载体的TMR-ACTH肽的纯化】
使用确认到对于ACTH具有高的亲和性的3种载体而调查将特开2015-137978号中记载的试剂中进行加热处理而得到的液中的盐能由利用本发明的固液分离的BF分离操作除去与否。再者，调查由3种载体的回收率的差异。
(1)含肽和全血的液体试样的调制
作为目标分子使用TMR-ACTH肽。作为混杂物使用与实施例17同样的全血。将两者一同溶解于含有甘氨酸的0.5×磷酸缓冲性生理盐水(0.5×PBS[pH＝7.4]、氯化钠(最终浓度68.5mM)、磷酸氢二钠(最终浓度4mM)、氯化钾(最终浓度1.3mM)、磷酸二氢钾(最终浓度0.7mM、进而甘氨酸(最终浓度500mM))，调制含肽和全血的液体试样。
(2)含肽和全血的液体试样的加热处理
通过将含肽和全血的液体试样用与实施例17同样的方法进行加热处理，再直接于160℃保持60秒钟，回收加热处理后的上清级分。
(3)含肽和全血的液体试样的加热处理上清的脱盐处理(保留回(RetentionBack)式)
将含肽和全血的液体试样的加热处理上清由使用本实施方式的固液分离的在图24中记载的工序(以下，保留回(Retention Back)式的BF分离操作)进行脱盐处理。一系列的工序使用图1记载的装置进行。作为载体使用无修饰氧化硅载体、ODS修饰氧化硅载体、或者，氨基甲硅烷基修饰氧化硅载体。作为管使用图5C记载的B1型管(口径1.34mm)，作为容器使用与实施例1同样的容器。一系列的工序的概略图和在工序中出现的各级分的名称示于图24。
以下对于图24中记载的保留回(Retention Back)式的BF分离操作的各工序(i)～(iii)而进行说明。
(i)吸附工序
将含TMR-ACTH肽和全血的液体试样(F0)1.5mL添加到与秤量载体100mg的实施例1同样的容器中。搅拌混合液，使TMR-ACTH肽吸附在载体上，将含载体的液体试样抽吸到管内。以略微残留在抽吸含载体的液体试样之后的容器内的含载体的液体试样作为残渣(R0)。将管从容器提高，静置，使载体沉降到管的口部，观察形成了栓。其后，吐出溶剂。以吐出的溶剂作为流通级分(F1)回收。
(ii)水洗工序
将水洗用的离子交换水1mL添加到前述的残渣(R0)中之后，将在管内栓形成的载体在离子交换水中搅拌，冲洗盐类。将搅拌的液抽吸到管内，将管从容器提高，静置，使载体沉降到管的口部，观察形成了栓。其后，吐出溶剂。以吐出的溶剂作为冲洗水级分(F2)回收。以略微残留在抽吸含载体的离子交换水之后的1.5mL容器内的含载体的离子交换水作为残渣(R0)。将同样的水洗工序再重复2次。
(iii)溶出工序
将肽溶出用的脱离液1mL由上述的水洗工序添加到最终得到的残渣(R0)之后，将载体在脱离液中搅拌，使吸附在载体的肽溶出。将载体和脱离液的混液抽吸到管内，将管从容器提高，静置，使载体沉降到管的口部，观察形成了栓。其后，吐出溶剂。以吐出的液体作为纯化级分(F3)回收。
(4)导电率的测定
对于使用无修饰氧化硅载体、ODS修饰氧化硅载体、或者，氨基甲硅烷基修饰氧化硅载体的脱盐处理前后的各级分{脱盐处理前(F0)及脱盐处理后的纯化级分(F3)}而用与实施例13同样的方法测定导电率。导电率示于下述的表13。再者，F3的导电率由于减去乙腈本身的导电率(2.0mS/cm)而成为负的值。减法前的值是1.18mS/cm。
【表13】
(5)荧光强度的测定
对于使用无修饰氧化硅载体、ODS修饰氧化硅载体、或者，氨基甲硅烷基修饰氧化硅载体的脱盐处理前后的各级分{脱盐处理前(F0)及脱盐处理后的纯化级分(F3)}而用与实施例13同样的方法测定荧光强度，算出肽回收率。
在荧光强度测定中，在TMR-ACTH肽的检测中设为激发波长540nm及荧光波长580nm、另外，在全血来源肽的检测中设为激发波长287nm及荧光波长350nm。
另外，从算出的肽回收率，根据下述的式4而算出本脱盐处理后的TMR-ACTH肽和全血来源肽的比率的差异。TMR-ACTH肽/全血来源肽回收率比＝(TMR-ACTH肽的回收率)/(全血来源肽的回收率)…式4
使用无修饰氧化硅载体的本脱盐处理前后的荧光光谱示于图25及图26，使用ODS修饰氧化硅载体的本脱盐处理前后的荧光光谱示于图27及图28，使用氨基甲硅烷基修饰氧化硅载体的本脱盐处理前后的荧光光谱示于图29及图30。另外，荧光强度和肽回收率示于下述的表14～16，TMR-ACTH肽/全血来源肽回收率比示于下述的表17。
【表14】
【表15】
【表16】
【表17】
氧化硅载体的种类 TMR-ACTH肽/全血来源肽回收率比
无修饰氧化硅载体 2.1
ODS修饰氧化硅载体 2.2
氨基甲硅烷基修饰氧化硅载体 3.5
结果，由利用本实施方式的固液分离的保留回(Retention Back)式的BF分离操作，根据特开2015-137978号中记载的方法而可能从全血得到的液中除去盐。再者，在3种载体之间，ACTH的回收率无大的差异，但在任何的载体上均对于大量的全血来源肽而选择性地回收ACTH，结果显示，在纯化级分中的肽中的ACTH的浓缩是可能的。
在本发明的优选的实施方式中，也含将上述的多个实施方式之中的任何组合。
除了前述的实施方式之外，对于本发明而也可有各种变形例。它们的变形例不应解释为不属于本发明的范围。在本发明中应包括与权利要求等同的含意及在上述范围内的全部的变形。
【符号的说明】
11：固液分离装置、
13：抽吸部、
13a：柱塞、
13b：注射器、
13c：柱塞驱动电机、
15：控制部、
17：容器支持体
21：抽吸管嘴、
23：容器、
25a：管嘴支架、
25b：工作台驱动电机、
27：容器支持体、
29：升降机构、
29a：螺旋轴、
29b：螺母、
29c：轴承、
29d：轴驱动电机、
31：压力传感器、
40：试剂盒、
41：第1容器、
42：第2容器、
43：附带文书、
44：捆包箱
序列表
<110> SYSMEX CORPORATION
MITSUBISHI CHEMICAL CORPORATION
<120> 固液分离方法和装置及在其中使用的移液器吸头、粒子及试剂盒
<130> 16-044JP
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ACTH (1-24)的序列
<400> 1
Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys
1 5 10 15
Arg Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro
20
<210> 2
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (132-171)的序列
<400> 2
Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys Pro
1 5 10 15
Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala Val
20 25 30
Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr
35 40
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BNP的序列
<400> 3
Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp
1 5 10 15
Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His
20 25 30

Claims (28)

1.固液分离方法，其中
从上述开口向在尖端形成开口的抽吸管嘴的内部抽吸含粒子的悬浮液，
使抽吸的悬浮液中所含的粒子的至少一部分沉降而在上述抽吸管嘴内阻塞，
经使上述粒子阻塞的抽吸管嘴的开口而排出内部的液体。
2.权利要求1所述的固液分离方法，其中上述液体的排出是在抽吸的粒子大致均一地分散的悬浮液的尖端开口附近和离尖端开口最远部发生由沉降导致的粒子浓度的差异之后退行，伴随排出，排出可通过使粒子阻塞的抽吸管嘴的液体的工序。
3.权利要求2所述的固液分离方法，其中
在上述悬浮液中，含目标物质的试样液和吸附目标物质的粒子混合在一起，
上述液体的排出是使吸附目标物质的粒子留在开口近前侧的工序。
4.权利要求3所述的固液分离方法，其中
上述目标物质是期望的肽或核酸，
上述液体含上述期望的肽或核酸以外的肽及/或核酸、盐。
5.权利要求3所述的固液分离方法，其中上述试样液是全血、血清或血浆。
6.权利要求3所述的固液分离方法，其中上述试样液是通过将全血、血清或血浆用微波炉加热而得到的上清。
7.权利要求3所述的固液分离方法，其中上述试样液是通过将全血、血清或血浆用微波炉加热而得到的上清的脱盐处理液。
8.权利要求3～7之任一项所述的固液分离方法，其中上述粒子是使上述目标物质吸附的多孔性材料的粒子。
9.权利要求3～8之任一项所述的固液分离方法，其中上述粒子以氧化硅、氧化铝、氧化锆或聚苯乙烯作为材料。
10.权利要求1～9之任一项所述的固液分离方法，其中上述粒子对于粒径及粒径分布而有120μm以上的D90-D10，并且D50是170μm以上。
11.权利要求1～10之任一项所述的固液分离方法，其中上述抽吸管嘴的最小的开口直径
比上述粒子的最大直径大，并且
比上述粒子的最大直径的6倍小。
12.权利要求3所述的固液分离方法，其中
在排出上述液体之后，将从吸附目标物质的粒子溶出目标物质的溶出液抽吸到抽吸管嘴内，
使由抽吸的溶出液混合的粒子的至少一部分沉降到开口近前侧，
使溶出液和溶出的目标物质经尖端开口排出。
13.权利要求1～12之任一项所述的固液分离方法，其中
上述悬浮液的抽吸是将抽吸管嘴的尖端浸到悬浮液，使抽吸管嘴内的气压成为相对于外部的气压成为负压的工序，
上述粒子的沉降是使抽吸管嘴内的气压保持一定的工序，
上述液体的排出是使抽吸管嘴内的气压成为相对于外部的气压成为正压的工序。
14.权利要求13所述的固液分离方法，其中
抽吸管嘴内的气压的控制是在抽吸管嘴的后端连接含柱塞的注射器的状态下控制柱塞的位置的工序，
上述悬浮液的抽吸是使柱塞移动而使含抽吸管嘴的注射器内部的容积增大的工序，
上述粒子的沉降是使柱塞静止而保持相同的位置的工序，
上述液体的排出是使柱塞移动而使含抽吸管嘴的注射器内部的容积减少之后，使柱塞静止而保持相同的位置的工序。
15.权利要求1～14之任一项所述的固液分离方法，其用于BF分离。
16.权利要求1～15之任一项所述的固液分离方法，其中上述悬浮液中的上述粒子的浓度是10～100mg/mL。
17.权利要求1～16之任一项所述的固液分离方法，其中上述抽吸部的尖端的内径变得向尖部越来越细。
18.目标物质的测定方法，其中
从上述开口向在尖端形成开口的抽吸部的内部抽吸含有包含目标物质的试样液和吸附目标物质的粒子的悬浮液，
使抽吸的悬浮液中所含的粒子的至少一部分沉降而在上述抽吸管嘴内阻塞，
经使上述粒子阻塞的抽吸部的开口而排出内部的液体，
将从吸附目标物质的粒子溶出目标物质的溶出液抽吸到抽吸部内，
使由抽吸的溶出液混合的粒子的至少一部分沉降而阻塞，
经使上述粒子阻塞的抽吸部的开口而排出溶出了目标物质的溶出液，
对上述溶出液中所含的目标物质进行测定。
19.固液分离装置，其具备：
安装在尖端形成开口的抽吸管嘴的抽吸部，
控制上述抽吸部的动作的控制部，及
支持收容有含粒子的液体的容器的容器支持体，
上述控制部如下控制上述抽吸部：将上述悬浮液的至少一部分从上述开口抽吸到抽吸管嘴的内部，使抽吸的悬浮液中所含的粒子的至少一部分沉降而在上述抽吸管嘴内阻塞，经使上述粒子在内部阻塞的抽吸管嘴的开口而排出内部的液体。
20.权利要求19所述的固液分离装置，其中上述控制部如下控制上述抽吸部：在基于上述悬浮液的抽吸后，至抽吸管嘴内粒子大致均一地分散的悬浮液的尖端开口附近和离尖端开口最远部发生由沉降导致的粒子浓度的差异的期间而预先确定的静止期间，停止上述悬浮液的抽吸而使上述粒子的至少一部分沉降，在经过上述静止期间后，经使上述粒子在内部阻塞的抽吸管嘴的开口而排出内部的液体。
21.权利要求19或20所述的固液分离装置，其中
上述容器收容含目标物质的试样液和吸附该目标物质的粒子，
上述控制部通过排出内部的液体而使吸附目标物质的粒子留在抽吸管嘴的内部。
22.权利要求19～21之任一项所述的固液分离装置，其中
上述抽吸部包括含柱塞的注射器和使该柱塞移动的运作器，
上述控制部以控制运作器而使含抽吸管嘴的注射器内部的容积增大的方式移动柱塞而进行上述悬浮液的抽吸之后，在上述静止期间以保持相同的位置的方式使柱塞静止，在经过上述静止期间后，以使含抽吸管嘴的注射器内部的容积减少的方式移动柱塞之后使柱塞静止。
23.权利要求21所述的固液分离装置，其中上述控制部使上述柱塞比抽吸上述悬浮液的柱塞的移动速度缓慢地移动而排出内部的液体。
24.权利要求19～22之任一项所述的固液分离装置，其中上述抽吸管嘴能与抽吸部连离。
25.权利要求19所述的固液分离装置，其还具备：
将抽吸管嘴搬送到在上述抽吸部安装的位置的管嘴搬送机构，及
使安装到上述抽吸部上的抽吸管嘴的尖端向支持在上述容器支持体的容器内的悬浮液下降的升降机构。
26.作为抽吸管嘴的移液器吸头，
其在权利要求1～17之任一项所述的方法中使用，
其在尖端开口附近无滤器。
27.在权利要求1～17之任一项所述的方法中使用的粒子。
28.在权利要求1～17之任一项所述的方法中使用的固液分离用试剂盒，其含：
在尖端开口附近无滤器的作为抽吸管嘴的移液器吸头，及
在上述方法中使用的粒子，
上述移液器吸头的最小的开口直径比上述粒子的最大直径大，并且比上述粒子的最大直径的6倍小。
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