CN108957001B - 核酸适体酶联检测试剂盒和制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸适体酶联检测试剂盒和制备方法及其用途，该核酸适体酶联检测试剂盒，包括核酸适体板、阴性对照、阳性对照、样品稀释液、酶标抗体、洗涤液、显色液A&B、终止液和封口膜；其中，核酸适体板为VEGF核酸适体修饰的酶联板；酶标抗体为辣根过氧化物酶标记血管内皮细胞生长因子单克隆抗体。本发明的核酸适体酶联检测试剂盒具有结果稳定准确、特异性强、灵敏度高、使用方便、价格低廉、便于推广的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于核酸适体的人血管内皮生长因子(VEGF)的酶联检测试剂盒及其制备。
背景技术
1990年，美国哈佛大学Folkman博士提出著名的Folkman理论，肿瘤组织生长，必须依靠新生血管生成提供足够的氧气和营养物质来维持。2000年Hanahan和Weinberg在Cell综述了肿瘤细胞具有六种获得性能力，并列举了各自的可能机制，其中也提到了“持续血管生成是肿瘤的重要标志之一”。而血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是最有效的血管形成因子之一，对内皮细胞具有特异性分裂能力。VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白。两条分子量各为24kDa的单链以二硫键组成二聚体。其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。
一般肿瘤患者确诊时都到了中晚期，早期筛查并对可疑患者或无症状患者及时诊断，可以提高肿瘤患者的生存率，延长生存时间。早发现和早治疗是肿瘤筛查的重要意义。肿瘤分子诊断试剂多作为基因突变位点的检测，变异的肿瘤细胞产生即可测出。但部分正常人群中存在处于休眠状态的肿瘤细胞，有些休眠期可长达10年，此时测出无法确诊，只能做为肿瘤风险性评估，不具筛查意义，并且会对筛查对象产生极大忧患。目前在应用的肿瘤标志物绝大多数对应1-3种肿瘤，特异性大多在75％左右，敏感性在30％-90％，筛查时多选择几种常见的肿瘤标志物组成体检套餐，筛查广谱性不够且检验费用较高。VEGF被认为是最有意义的血液肿瘤筛查的标记物。VEGF可筛查几乎所有实体肿瘤，它的广谱性是其他检测指标不可替代的。此外，VEGF参与许多血管生成依赖性疾病的发病及其进展，除了癌症外，还包括某些炎性疾病(如类风湿性关节炎)以及糖尿病视网膜病变等。
目前血清VEGF的检测主要有基于抗原抗体识别的酶联免疫法(ELISA)、免疫放射法(IRMA)。由于受抗体的限制，ELISA的灵敏度不高，检测范围有限，IRMA试剂盒受同位素半衰期的影响，有效期短，临床上只能手工操作，工作量大而且还易产生人为误差，此外还有一定的放射性污染。为了提高血清VEGF的检测灵敏度，国内有公司采用了VEGF受体和单克隆抗体同时固定到酶标板上，以此增加VEGF的捕获效率提高灵敏度达到pg/ml(北京健平九星生物医药科技有限公司)，然而昂贵的VEGF受体使得试剂盒价格大幅提高。此外，也有文献报道采用多步信号放大方法提高灵敏度(Biosensors and Bioelectronics,2016,86,990–995；Biosensors and Bioelectronics,2017,89,964–969)，但因为操作过程复杂，无法实现临床上的试剂盒制作。因此，开发出一种简单快速、灵敏度高、价格便宜、易于制作成临床检测试剂盒的VEGF方法在临床诊断中具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为解决以上问题的至少一个，本发明提供一种基于核酸适体的人血管内皮生长因子(VEGF)的ELISA检测试剂盒。该试剂盒具有结果稳定准确、特异性强、灵敏度高、使用方便、价格低廉、便于推广的优点。
根据本发明的一个方面，提供一种核酸适体酶联检测试剂盒，包括核酸适体板、阴性对照、阳性对照、样品稀释液、酶标抗体、洗涤液、显色液A&B、终止液和封口膜。
其中，核酸适体板为VEGF核酸适体修饰的酶联板；酶标抗体为辣根过氧化物酶标记血管内皮细胞生长因子单克隆抗体。
其中，阳性对照为人血管内皮细胞生长因子蛋白冻干粉；阴性对照为动物血清冻干粉。
其中，样品稀释液包括20mM Tris-HCl，0.1％Tween，200mM NaCl，10mM KCl，0.2％BSA和0.05％硫柳汞，pH7.4；浓缩洗涤液包括200mM Tris-HCl，1％Tween，2M NaCl和100mMKCl，pH 7.4。
其中，显色液A&B中，显色液A包括H2O2，显色液B包括3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)；终止液包括2M硫酸。
根据本发明的第二方面，提供该核酸适体酶联检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
a.制备金纳米颗粒；
b.以金纳米颗粒为载体，先将核酸适体修饰到金纳米颗粒表面；
c.将修饰有VEGF核酸适体的金纳米颗粒固定到固体支持物酶联板上，用封
闭液封闭形成该核酸适体板；
d.配制阴性对照、阳性对照、样品稀释液、酶标抗体、洗涤液、显色液A&B、终止液。
其中，步骤c中，金纳米颗粒通过生物素和亲和素相互作用的方式固定，或者是通过双链DNA杂交的方式固定或者是直接包被到酶联板上。
根据本发明的第三方面提供该核酸适体酶联检测试剂盒在血清检测方面的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本试剂盒采用VEGF的核酸适体代替了抗体。与抗体相比，核酸适体通过体外筛选，不依靠动物、细胞及内环境，容易获得，制备、修饰方便快速，无批间差异，适用于大规模生产，节约成本，化学稳定性好，便于长期保存。
2、利用金纳米颗粒的超大比表面积负载更多的VEGF核酸适体。采用金纳米颗粒作为VEGF核酸适体载体再包被到酶标板上，比直接将VEGF核酸适体包被到酶标板上能够更大的提高单位面积上核酸适体的固定密度，以及在空间上保证核酸适体的立体构象，从而提高靶蛋白的捕获效率。
3、本试剂盒检测生物学标本中的VEGF，优选来自癌症、眼内新血管综合征(如增殖性视网膜病或老年黄斑变性)、类风湿性关节炎或其他疾病病人的样本。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1示出了根据本发明实施方式的核酸适体的酶联检测试剂盒的检测原理示意图；
图2示出了根据本发明实施方式的核酸适体的酶联检测试剂盒的检测灵敏度试验的结果对比图；
图3示出了根据本发明实施方式的核酸适体的酶联检测试剂盒的检测灵敏度试验的结果对比图；
图4示出了根据本发明实施方式的核酸适体的酶联检测试剂盒的检测灵敏度试验的结果对比图；
图5示出了根据本发明实施方式的核酸适体的酶联检测试剂盒的检测灵敏度试验的结果对比图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
使用的VEGF核酸适体序列为V1，V2，3R02，3R02-3R02，这些序列均来源于文献报道并进行一些改动，主要是引入重复碱基作为连接器。其中序列V1(Molecules，2010，15,215-225)是与VEGF的receptor-binding domain(RBD)结合，与VEGF165结合的Kd为20nM；V2(PlosOne,2012,7,e31196)是与VEGF的heparin-binding domain(HBD)结合，与VEGF165结合的Kd为0.5nM；序列3R02与序列3R02-3R02(Anal.Chem.2013,85,1132-1137)均是与是与VEGF的receptor-binding domain(RBD)结合，与VEGF165结合的Kd分别为300pM和30pM。以上序列的选择是为了更好地说明本发明的试剂盒在核酸适体选择上具有普遍意义，适体的选择可以是与VEGF结合的任一结合位点，适体与VEGF的亲和力可以是在nM～pM范围内，均适用于本试剂盒。但并不局限于所描述的四种序列。
实施例1核酸适体酶联检测试剂盒
包括以下组成：
VEGF核酸适体板；
阳性对照：人VEGF蛋白冻干粉；
阴性对照：动物血清冻干粉；
样品稀释液：20mM Tris-HCl+0.1％Tween+200mM NaCl+10mM KCl+0.2％BSA，pH7.4，1瓶
酶标抗体：辣根过氧化物酶标记的抗VEGF单抗，1瓶
浓缩洗涤液：200mM Tris-HCl+1％Tween+2M NaCl+100mM KCl，pH 7.4，1瓶
显色液A&B：A液为H2O2，B液为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，A&B液各1瓶
终止液：2M硫酸，1瓶
封口膜2张。
本例所述的各种物质量均以酶联板为96孔(12条8孔或8条12孔)的例子计算，如果酶联板的孔数多于或少于96孔，则各物质量也相应或多或少。
实施例2核酸适体酶联检测试剂盒VEGF核酸适体板制备方法
2.1金纳米颗粒的制备
(1)在双颈烧瓶中加入100mL 1mM HAuCl4溶液，将烧瓶放在电热板上搅拌直至回流；
(2)当溶液开始回流后，打开塞子，快速加入10mL 38.8mM柠檬酸钠，盖上塞子，溶液的颜色在1min内从浅黄色变为深红色，继续回流20min；
(3)停止加热，使体系在搅拌下冷却至室温；
(4)将合成好的金纳米颗粒于4℃冰箱密封保存。
2.2VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒的合成
标记的VEGF核酸适体序列为：T8-3R02SH-TTTTTTTTTGTGGGGGTGGACTGGGTGGGTACC
一端巯基标记的短链单链DNA间隔体SH-T12序列为：SH-TTT TTT TTT TTT。
一端巯基标记的短链单链DNA间隔体SH-p1序列为：SH-AAAAAAAAAACAAAGTAGTCGAGGCCCCGGCGTG；与SH-p1互补的生物素标记的序列为biotin-2具体序列为：biotin-AAAAACACGCCGGGGCCTCGACTACTTTG。
一端巯基标记一端生物素标记的短链单链DNA间隔体SH-T12-biotin，具体序列为：SH-TTT TTT TTT TTT-biotin。
2.2.1VEGF核酸适体与一端巯基标记的短链单链DNA间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记的短链单链DNA(如SH-T12或SH-p1)混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2.2.2VEGF核酸适体与一端巯基标记的PEG间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记的PEG混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2.2.3VEGF核酸适体与一端巯基标记一端生物素标记的短链单链DNA间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记一端生物素标记的短链单链DNA(如SH-T12)混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2.2.4VEGF核酸适体与一端巯基标记一端生物素标记的PEG间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记一端生物素标记的PEG混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2.3VEGF核酸适体板的制备
a.本发明的VEGF核酸适体板举例可以是通过包被方式固定到酶标板上。当间隔体采用无关短链单链DNA，或者聚乙二醇(PEG)时，可采用通过包被方式将VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒固定到酶标板上。
具体方法为：将制备得到的VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒用包被缓冲液稀释一定的倍数，每孔加入100ul，4度包被过夜或至48h；每孔加入PBST洗涤一次，再加入封闭液，室温放置10分钟。封闭液主要含有BSA和一些缓冲液；弃去封闭液，拍干；用真空包装机进行包装。其中PEG可用长链(如PEG1000，可购买自芜湖芃圣生物科技有限公司)或短链(如PEG4，可购买自芜湖芃圣生物科技有限公司)。
b.本发明的VEGF核酸适体板举例可以是通过生物素和亲和素相互作用的方式固定到亲和素或链霉亲和素包被的酶标板上。当间隔体采用一端巯基修饰，另一端生物素修饰的短链单链DNA(如SH-T12-biotin)，或者PEG(如
SH-PEG1000-biotin)时，可采用该方式将VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒固定到酶标板上。
具体方法为：将制备得到的VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒用包被缓冲液稀释一定的倍数，每孔100ul加入到链霉亲和素包被的酶标板上(可购买自pierce公司)4度反应24h-48h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干。用真空包装机进行包装。
c.本发明的VEGF核酸适体板举例可以是通过双链DNA杂交的方式固定到固定有单链互补DNA的酶标板上。当间隔体采用短链单链DNA时，可采用该方式将VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒固定到酶标板上。具体方法为：先制备VEGF核酸适体与间隔体短链DNA(如SH-p1)共同修饰的金纳米颗粒；然后将与SH-p1互补的生物素修饰的DNA(如biotin-p2)加入到链霉亲和素板上，37度反应0.2h-2h，优选1h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干，得到固定有互补DNA的酶标板；将制备得到的VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒用杂交缓冲液稀释一定的倍数，每孔100ul加入到固定有互补DNA的酶标板上。37度反应0.5h-2.5h，优选2h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干。用真空包装机进行包装。固定有互补DNA的酶标板，则通过将带有生物素修饰的互补DNA与亲和素或链霉亲和素包被的酶标板上(可购买自pierce公司)，37度反应0.5-2.5h，优选1h得到。
互补DNA(如biotin-p2)与间隔体短链单链DNA(如SH-p1)互补，在序列选择上可以用其他互补的两条DNA链进行替换，只需要保存所选序列在常温下可以形成稳定的双链DNA(如Tm值大于40℃)，且与VEGF的核酸适体无明显结合即可。
实施例2-1核酸适体酶联检测试剂盒VEGF核酸适体板制备方法
2-1.1金纳米颗粒的制备
(1)在双颈烧瓶中加入100mL 1mM HAuCl4溶液，将烧瓶放在电热板上搅拌直至回流；
(2)当溶液开始回流后，打开塞子，快速加入10mL 38.8mM柠檬酸钠，盖上塞子，溶液的颜色在1min内从浅黄色变为深红色，继续回流20min；
(3)停止加热，使体系在搅拌下冷却至室温；
(4)将合成好的金纳米颗粒于4℃冰箱密封保存。
2-1.2VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒的合成
标记的VEGF核酸适体序列为：T8-3R02-3R02SH-TTTTTTTTTGTGGGGGTGGACTGGGTGGGTACCTTTTTTTTTTTGTGGGGGTGGACTGGGTGGGTACC
一端巯基标记的短链单链DNA间隔体SH-T12序列为：SH-TTT TTT TTT TTT。
一端巯基标记的短链单链DNA间隔体SH-p1序列为：SH-AAAAAAAAAACAAAGTAGTCGAGGCCCCGGCGTG；与SH-p1互补的生物素标记的序列为biotin-2具体序列为：biotin-AAAAACACGCCGGGGCCTCGACTACTTTG。
一端巯基标记一端生物素标记的短链单链DNA间隔体SH-T12-biotin，具体序列为：SH-TTT TTT TTT TTT-biotin。
2-1.2.1VEGF核酸适体与一端巯基标记的短链单链DNA间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记的短链单链DNA(如SH-T12或SH-p1)混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2-1.2.2VEGF核酸适体与一端巯基标记的PEG间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记的PEG混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2-1.2.3VEGF核酸适体与一端巯基标记一端生物素标记的短链单链DNA间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记一端生物素标记的短链单链DNA(如SH-T12)混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2-1.2.4VEGF核酸适体与一端巯基标记一端生物素标记的PEG间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记一端生物素标记的PEG混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2-1.3VEGF核酸适体板的制备
a.本发明的VEGF核酸适体板举例可以是通过包被方式固定到酶标板上。当间隔体采用无关短链单链DNA，或者聚乙二醇(PEG)时，可采用通过包被方式将VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒固定到酶标板上。
具体方法为：将制备得到的VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒用包被缓冲液稀释一定的倍数，每孔加入100ul，4度包被过夜或至48h；每孔加入PBST洗涤一次，再加入封闭液，室温放置10分钟。封闭液主要含有BSA和一些缓冲液；弃去封闭液，拍干；用真空包装机进行包装。其中PEG可用长链(如PEG1000，可购买自芜湖芃圣生物科技有限公司)或短链(如PEG4，可购买自芜湖芃圣生物科技有限公司)。(请在此处巯基标记的两种间隔体即无关短链单链DNA和PEG1000的结构或制备方法，以便与图2的IA和IB对应)
b.本发明的VEGF核酸适体板举例可以是通过生物素和亲和素相互作用的方式固定到亲和素或链霉亲和素包被的酶标板上。当间隔体采用一端巯基修饰，另一端生物素修饰的短链单链DNA(如SH-T12-biotin)，或者PEG(如SH-PEG1000-biotin)时，可采用该方式将VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒固定到酶标板上。
具体方法为：将制备得到的VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒用包被缓冲液稀释一定的倍数，每孔100ul加入到链霉亲和素包被的酶标板上(购买自pierce公司)。4度反应24h-48h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干。用真空包装机进行包装。
c.本发明的VEGF核酸适体板举例可以是通过双链DNA杂交的方式固定到固定有单链互补DNA的酶标板上。当间隔体采用短链单链DNA时，可采用该方式将VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒固定到酶标板上。具体方法为：先制备VEGF核酸适体与间隔体短链DNA(如SH-p1)共同修饰的金纳米颗粒；然后将与SH-p1互补的生物素修饰的DNA(如biotin-p2)加入到链霉亲和素板上，37度反应0.2h-2h，优选1h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干，得到固定有互补DNA的酶标板；将制备得到的VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒用杂交缓冲液稀释一定的倍数，每孔100ul加入到固定有互补DNA的酶标板上。互补DNA(如biotin-p2)与间隔体短链单链DNA(如SH-p1)互补，在序列选择上可以用其他互补的两条DNA链进行替换，只需要保存所选序列在常温下可以形成稳定的双链DNA(如Tm值大于40℃)，且与VEGF的核酸适体无明显结合即可。37度反应0.5h-2.5h，优选2h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干。用真空包装机进行包装。固定有互补DNA的酶标板，则通过将带有生物素修饰的互补DNA与亲和素或链霉亲和素包被的酶标板上(可购买自pierce公司)，37度反应0.5-2.5h，优选1h得到。
实施例2-2核酸适体酶联检测试剂盒VEGF核酸适体板制备方法
2-2.1金纳米颗粒的制备
(1)在双颈烧瓶中加入100mL 1mM HAuCl4溶液，将烧瓶放在电热板上搅拌直至回流；
(2)当溶液开始回流后，打开塞子，快速加入10mL 38.8mM柠檬酸钠，盖上塞子，溶液的颜色在1min内从浅黄色变为深红色，继续回流20min；
(3)停止加热，使体系在搅拌下冷却至室温；
(4)将合成好的金纳米颗粒于4℃冰箱密封保存。
2-2.2VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒的合成
标记的VEGF核酸适体序列为：T8-V1
SH-TTTTTTTT TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA
一端巯基标记的短链单链DNA间隔体SH-T12序列为：SH-TTT TTT TTT TTT。
一端巯基标记的短链单链DNA间隔体SH-p1序列为：SH-AAAAAAAAAACAAAGTAGTCGAGGCCCCGGCGTG；与SH-p1互补的生物素标记的序列为biotin-2具体序列为：biotin-AAAAACACGCCGGGGCCTCGACTACTTTG。
一端巯基标记一端生物素标记的短链单链DNA间隔体SH-T12-biotin，具体序列为：SH-TTT TTT TTT TTT-biotin。
2-2.2.1VEGF核酸适体与一端巯基标记的短链单链DNA间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记的短链单链DNA(如SH-T12或SH-p1)混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2-2.2.2VEGF核酸适体与一端巯基标记的PEG间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记的PEG混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2-2.2.3VEGF核酸适体与一端巯基标记一端生物素标记的短链单链DNA间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记一端生物素标记的短链单链DNA(如SH-T12)混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2-2.2.4VEGF核酸适体与一端巯基标记一端生物素标记的PEG间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记一端生物素标记的PEG混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2-2.3VEGF核酸适体板的制备
a.本发明的VEGF核酸适体板举例可以是通过包被方式固定到酶标板上。当间隔体采用无关短链单链DNA，或者聚乙二醇(PEG)时，可采用通过包被方式将VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒固定到酶标板上。
具体方法为：将制备得到的VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒用包被缓冲液稀释一定的倍数，每孔加入100ul，4度包被过夜或至48h；每孔加入PBST洗涤一次，再加入封闭液，室温放置10分钟。封闭液主要含有BSA和一些缓冲液；弃去封闭液，拍干；用真空包装机进行包装。其中PEG可用长链(如PEG1000，可购买自芜湖芃圣生物科技有限公司)或短链(如PEG4，可购买自芜湖芃圣生物科技有限公司)。(请在此处巯基标记的两种间隔体即无关短链单链DNA和PEG1000的结构或制备方法，以便与图2的IA和IB对应)
b.本发明的VEGF核酸适体板举例可以是通过生物素和亲和素相互作用的方式固定到亲和素或链霉亲和素包被的酶标板上。当间隔体采用一端巯基修饰，另一端生物素修饰的短链单链DNA(如SH-T12-biotin)，或者PEG(如SH-PEG1000-biotin)时，可采用该方式将VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒固定到酶标板上。
具体方法为：将制备得到的VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒用包被缓冲液稀释一定的倍数，每孔100ul加入到链霉亲和素包被的酶标板上(购买自pierce公司)。4度反应24h-48h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干。用真空包装机进行包装。
c.本发明的VEGF核酸适体板举例可以是通过双链DNA杂交的方式固定到固定有单链互补DNA的酶标板上。当间隔体采用短链单链DNA时，可采用该方式将VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒固定到酶标板上。具体方法为：先制备VEGF核酸适体与间隔体短链DNA(如SH-p1)共同修饰的金纳米颗粒；然后将与SH-p1互补的生物素修饰的DNA(如biotin-p2)加入到链霉亲和素板上，37度反应0.2h-2h，优选1h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干，得到固定有互补DNA的酶标板；将制备得到的VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒用杂交缓冲液稀释一定的倍数，每孔100ul加入到固定有互补DNA的酶标板上。互补DNA(如biotin-p2)与间隔体短链单链DNA(如SH-p1)互补，在序列选择上可以用其他互补的两条DNA链进行替换，只需要保存所选序列在常温下可以形成稳定的双链DNA(如Tm值大于40℃)，且与VEGF的核酸适体无明显结合即可。37度反应0.5h-2.5h，优选2h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干。用真空包装机进行包装。固定有互补DNA的酶标板，则通过将带有生物素修饰的互补DNA与亲和素或链霉亲和素包被的酶标板上(可购买自pierce公司)，37度反应0.5-2.5h，优选1h得到。
实施例2-3核酸适体酶联检测试剂盒VEGF核酸适体板制备方法
2-3.1金纳米颗粒的制备
(1)在双颈烧瓶中加入100mL 1mM HAuCl4溶液，将烧瓶放在电热板上搅拌直至回流；
(2)当溶液开始回流后，打开塞子，快速加入10mL 38.8mM柠檬酸钠，盖上塞子，溶液的颜色在1min内从浅黄色变为深红色，继续回流20min；
(3)停止加热，使体系在搅拌下冷却至室温；
(4)将合成好的金纳米颗粒于4℃冰箱密封保存。
2-2.2VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒的合成
标记的VEGF核酸适体序列为：T8-V2
SH-TTTTTTTT CAATTGGGCCCGTCCGTATGGTGGGT
一端巯基标记的短链单链DNA间隔体SH-T12序列为：SH-TTT TTT TTT TTT。
一端巯基标记的短链单链DNA间隔体SH-p1序列为：SH-AAAAAAAAAACAAAGTAGTCGAGGCCCCGGCGTG；与SH-p1互补的生物素标记的序列为biotin-2具体序列为：biotin-AAAAACACGCCGGGGCCTCGACTACTTTG。
一端巯基标记一端生物素标记的短链单链DNA间隔体SH-T12-biotin，具体序列为：SH-TTT TTT TTT TTT-biotin。
2-3.2.1VEGF核酸适体与一端巯基标记的短链单链DNA间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记的短链单链DNA(如SH-T12或SH-p1)混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2-3.2.2VEGF核酸适体与一端巯基标记的PEG间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记的PEG混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2-3.2.3VEGF核酸适体与一端巯基标记一端生物素标记的短链单链DNA间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记一端生物素标记的短链单链DNA(如SH-T12)混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2-3.2.4VEGF核酸适体与一端巯基标记一端生物素标记的PEG间隔体共同修饰的金纳米颗粒的合成
将10-5M巯基标记的VEGF核酸适体和一端巯基标记一端生物素标记的PEG混合(摩尔比为50：1～1:50，优选3:1)后加入金纳米颗粒中，通过加盐陈化得到VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒，离心分离，弃去上清，加入PBS溶解沉淀，4度避光保存。
2-3.3VEGF核酸适体板的制备
a.本发明的VEGF核酸适体板举例可以是通过包被方式固定到酶标板上。当间隔体采用无关短链单链DNA，或者聚乙二醇(PEG)时，可采用通过包被方式将VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒固定到酶标板上。
具体方法为：将制备得到的VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒用包被缓冲液稀释一定的倍数，每孔加入100ul，4度包被过夜或至48h；每孔加入PBST洗涤一次，再加入封闭液，室温放置10分钟。封闭液主要含有BSA和一些缓冲液；弃去封闭液，拍干；用真空包装机进行包装。其中PEG可用长链(如PEG1000，可购买自芜湖芃圣生物科技有限公司)或短链(如PEG4，可购买自芜湖芃圣生物科技有限公司)。(请在此处巯基标记的两种间隔体即无关短链单链DNA和PEG1000的结构或制备方法，以便与图2的IA和IB对应)
b.本发明的VEGF核酸适体板举例可以是通过生物素和亲和素相互作用的方式固定到亲和素或链霉亲和素包被的酶标板上。当间隔体采用一端巯基修饰，另一端生物素修饰的短链单链DNA(如SH-T12-biotin)，或者PEG(如SH-PEG1000-biotin)时，可采用该方式将VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒固定到酶标板上。
具体方法为：将制备得到的VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒用包被缓冲液稀释一定的倍数，每孔100ul加入到链霉亲和素包被的酶标板上(购买自pierce公司)。4度反应24h-48h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干。用真空包装机进行包装。
c.本发明的VEGF核酸适体板举例可以是通过双链DNA杂交的方式固定到固定有单链互补DNA的酶标板上。当间隔体采用短链单链DNA时，可采用该方式将VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒固定到酶标板上。具体方法为：先制备VEGF核酸适体与间隔体短链DNA(如SH-p1)共同修饰的金纳米颗粒；然后将与SH-p1互补的生物素修饰的DNA(如biotin-p2)加入到链霉亲和素板上，37度反应0.2h-2h，优选1h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干，得到固定有互补DNA的酶标板；将制备得到的VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒用杂交缓冲液稀释一定的倍数，每孔100ul加入到固定有互补DNA的酶标板上。互补DNA(如biotin-p2)与间隔体短链单链DNA(如SH-p1)互补，在序列选择上可以用其他互补的两条DNA链进行替换，只需要保存所选序列在常温下可以形成稳定的双链DNA(如Tm值大于40℃)，且与VEGF的核酸适体无明显结合即可。37度反应0.5h-2.5h，优选2h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干。用真空包装机进行包装。固定有互补DNA的酶标板，则通过将带有生物素修饰的互补DNA与亲和素或链霉亲和素包被的酶标板上(可购买自pierce公司)，37度反应0.5-2.5h，优选1h得到。
实施例3核酸适体酶联检测试剂盒的使用方法
(1)平衡：从冷藏环境中取出试剂盒及样品，室温平衡30分钟。从以平衡至室温的密封袋中取出所需板条，其他未用板条密封放回4度。
(2)配液：所有试剂使用前应摇匀，洗涤浓缩液用蒸馏水或去离子水稀释10倍，如产生结晶，应待其于室温溶解后再稀释。
(3)加样：每次检测均需设置空白、阴性和阳性对照各2孔。空白对照每孔加入200uL样品稀释液，其它各孔先加入100uL样品稀释液，然后，阴性对照每孔加入100uL阴性对照，阳性对照每孔加入100uL阳性对照，其余各孔加入100uL待测样品，混匀后用封口膜封盖反应板，37℃振荡孵育60分钟。
(4)洗板：弃去孔内液体，在滤纸上拍干，用稀释洗涤液洗板3次，每次5min，拍干。
(5)加酶标抗体：每孔加入200uL酶标抗体，用封口膜封盖反应板，37℃振荡反应60分钟。
(6)洗板：弃去孔内液体，在滤纸上拍干，用稀释洗涤液1洗板3次，每次5min，拍干。
(7)显色：每孔加入显色剂A&B各100uL，混匀后37℃用封口膜封盖反应板，避光振荡反应10分钟。
(8)测定：每孔加入50uL终止液，混匀，反应终止10分钟内用酶标仪450nm和630nm(参比波长)双波长测定各孔OD值。图1为该酶联检测试剂盒的检测原理示意图。
实施例4核酸适体酶联检测试剂盒的灵敏度检测
不同核酸适体板制备方法对血清体系(胎牛血清FBS)中不同VEGF浓度的检测灵敏度。
其中I组为通过实施例2.3中的方法a的包被方式固定到酶标板：IA为间隔体采用无关短链单链DNA；IB为间隔体采用PEG1000。
II组为实施例2.3中的方法b的通过生物素和亲和素相互作用的方式固定到链霉亲和素包被的酶标板上；IIA为间隔体采用一端巯基修饰一端生物素修饰的短链单链DNA；IIB为间隔体采用一端巯基修饰一端生物素修饰的PEG(如PEG1000)。
III组为实施例2.3中的方法c的通过双链DNA杂交的方式固定到固定有单链互补DNA的酶标板上。
IV组为直接将一端生物素修饰的核酸适体修饰到链霉亲和素包被的酶标板上。直接用生物素修饰核酸适体的具体方法为：将100μl 10-7M生物素修饰的VEGF核酸适体biotin-3R02加入到链霉亲和素板上，37度反应0.2h-2h，优选1h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干，得到固定有VEGF核酸适体的酶标板。
V组为购买的VEGF商品化试剂盒，检测原理是抗体作为捕获分子进行ELISA检测。
对不同浓度的VEGF蛋白进行检测，所有结果见图2。计算VEGF蛋白标准品与空白对照的OD值以及空白对照的标准差，当VEGF蛋白标准品的OD值大于空白均值加两倍标准偏差时，说明试剂盒可以检测该浓度的VEGF蛋白标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度。
从图2可以看出，对照组(IV组)的灵敏度为100pg/ml，对照组(V组)的灵敏度为6.5pg/ml，而本发明制得的基于VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒修饰的核酸适体板(I组、II组和III组)的检测灵敏度能达到3pg/ml，具有更高的灵敏度。
对应实施例2-1中序列T8-3R02-3R02制备的核酸适体板的实验结果：
其中I组为通过实施例2-1.3中的方法a的包被方式固定到酶标板：IA为间隔体采用无关短链单链DNA；IB为间隔体采用PEG1000。
II组为实施例2-1.3中的方法b的通过生物素和亲和素相互作用的方式固定到链霉亲和素包被的酶标板上；IIA为间隔体采用一端巯基修饰一端生物素修饰的短链单链DNA；IIB为间隔体采用一端巯基修饰一端生物素修饰的PEG(如PEG1000)。
III组为实施例2-1.3中的方法c的通过双链DNA杂交的方式固定到固定有单链互补DNA的酶标板上。
IV组为直接将一端生物素修饰的核酸适体修饰到链霉亲和素包被的酶标板上。直接用生物素修饰核酸适体的具体方法为：将100μl 10-7M生物素修饰的VEGF核酸适体biotin-3R02加入到链霉亲和素板上，37度反应0.2h-2h，优选1h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干，得到固定有VEGF核酸适体的酶标板；
对不同浓度的VEGF蛋白进行检测，所有结果见图3。计算VEGF蛋白标准品与空白对照的OD值以及空白对照的标准差，当VEGF蛋白标准品的OD值大于空白均值加两倍标准偏差时，说明试剂盒可以检测该浓度的VEGF蛋白标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度。
从图3可以看出，对照组(IV组)的灵敏度为100pg/ml，而本发明制得的基于VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒修饰的核酸适体板(I组、II组和III组)的检测灵敏度能达到3pg/ml，具有极高的灵敏度。
对应实施例2-2中序列T8-V1制备的核酸适体板的实验结果：
其中I组为通过实施例2-2.3中的方法a的包被方式固定到酶标板：IA为间隔体采用无关短链单链DNA；IB为间隔体采用PEG1000。
II组为实施例2-2.3中的方法b的通过生物素和亲和素相互作用的方式固定到链霉亲和素包被的酶标板上；IIA为间隔体采用一端巯基修饰一端生物素修饰的短链单链DNA；IIB为间隔体采用一端巯基修饰一端生物素修饰的PEG(如PEG1000)。
III组为实施例2-2.3中的方法c的通过双链DNA杂交的方式固定到固定有单链互补DNA的酶标板上。
IV组为直接将一端生物素修饰的核酸适体修饰到链霉亲和素包被的酶标板上。直接用生物素修饰核酸适体的具体方法为：将100μl 10-7M生物素修饰的VEGF核酸适体biotin-3R02加入到链霉亲和素板上，37度反应0.2h-2h，优选1h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干，得到固定有VEGF核酸适体的酶标板；
对不同浓度的VEGF蛋白进行检测，所有结果见图4。计算VEGF蛋白标准品与空白对照的OD值以及空白对照的标准差，当VEGF蛋白标准品的OD值大于空白均值加两倍标准偏差时，说明试剂盒可以检测该浓度的VEGF蛋白标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度。
从图4可以看出，对照组(IV组)的灵敏度为100pg/ml，而本发明制得的基于VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒修饰的核酸适体板(I组、II组和III组)的检测灵敏度能达到3pg/ml，具有极高的灵敏度。
对应实施例2-3中序列T8-V2制备的核酸适体板的实验结果：
其中I组为通过实施例2-3.3中的方法a的包被方式固定到酶标板：IA为间隔体采用无关短链单链DNA；IB为间隔体采用PEG1000。
II组为实施例2-3.3中的方法b的通过生物素和亲和素相互作用的方式固定到链霉亲和素包被的酶标板上；IIA为间隔体采用一端巯基修饰一端生物素修饰的短链单链DNA；IIB为间隔体采用一端巯基修饰一端生物素修饰的PEG(如PEG1000)。
III组为实施例2-3.3中的方法c的通过双链DNA杂交的方式固定到固定有单链互补DNA的酶标板上。
IV组为直接将一端生物素修饰的核酸适体修饰到链霉亲和素包被的酶标板上。直接用生物素修饰核酸适体的具体方法为：将100μl 10-7M生物素修饰的VEGF核酸适体biotin-3R02加入到链霉亲和素板上，37度反应0.2h-2h，优选1h。每孔加入PBST洗涤一次，拍干，得到固定有VEGF核酸适体的酶标板；
对不同浓度的VEGF蛋白进行检测，所有结果见图5。计算VEGF蛋白标准品与空白对照的OD值以及空白对照的标准差，当VEGF蛋白标准品的OD值大于空白均值加两倍标准偏差时，说明试剂盒可以检测该浓度的VEGF蛋白标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度。
从图5可以看出，对照组(IV组)的灵敏度为100pg/ml，而本发明制得的基于VEGF核酸适体修饰的金纳米颗粒修饰的核酸适体板(I组、II组和III组)的检测灵敏度能达到3pg/ml，具有极高的灵敏度。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种核酸适体酶联检测试剂盒，其特征在于，包括核酸适体板、阴性对照、阳性对照、样品稀释液、酶标抗体、洗涤液、显色液A&B、终止液和封口膜；
其中，核酸适体板为VEGF核酸适体修饰的酶联板；核酸适体板具体为将修饰有VEGF核酸适体的金纳米颗粒固定到固体支持物酶联板上；
酶标抗体为辣根过氧化物酶标记VEGF单克隆抗体；
VEGF核酸适体的序列为：
TTTTTTTTTGTGGGGGTGGACTGGGTGGGTACCTTTTTTTTTTTGTGGGGGTGGACTGGGTGGGTACC或
TTTTTTTTTGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA或
TTTTTTTTCAATTGGGCCCGTCCGTATGGTGGGT或
TTTTTTTT TGTGGGGGTGGACTGGGTGGGTACC。
2.如权利要求1所述的核酸适体酶联检测试剂盒，其特征在于，
样品稀释液包括20mM Tris-HCl，0.1％Tween，200mM NaCl，10mM KCl，0.2％BSA和0.05％硫柳汞，pH7.4；
浓缩洗涤液包括200mM Tris-HCl，1％Tween，2M NaCl和100mM KCl，pH 7.4。
3.如权利要求1所述的核酸适体酶联检测试剂盒，其特征在于，
阳性对照为人血管内皮细胞生长因子蛋白冻干粉；阴性对照为动物血清冻干粉。
4.如权利要求1所述的核酸适体酶联检测试剂盒，其特征在于，显色液A&B中，显色液A包括H2O2，显色液B包括3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)；终止液包括2M硫酸。
5.权利要求1～4任一所述的核酸适体酶联检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.制备金纳米颗粒；
b.以金纳米颗粒为载体，先将核酸适体修饰到金纳米颗粒表面；
c.将修饰有VEGF核酸适体的金纳米颗粒固定到固体支持物酶联板上，用封闭液封闭形成所述核酸适体板；
d.配制阴性对照、阳性对照、样品稀释液、酶标抗体、洗涤液、显色液A&B、终止液。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
步骤c中，金纳米颗粒通过生物素和亲和素相互作用的方式固定，或者是通过双链DNA杂交的方式固定，或者是直接包被到酶联板上。
7.如权利要求1～4任一所述的核酸适体酶联检测试剂盒在血清检测方面的应用。
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