CN102854322A

CN102854322A - 一种vefg受体酶联诊断试剂盒及其制备方法

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Publication number: CN102854322A
Application number: CN2012102713485A
Authority: CN
Inventors: 吴克
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-07-31
Filing date: 2012-07-31
Publication date: 2013-01-02

Abstract

本发明公开了一种检测人血管内皮生长因子(VEGF)的酶联检测试剂盒。试剂盒盒体内包括：VEGF受体包被的酶联反应板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体加保护剂配置的酶结合物、作为阳性对照的VEGF蛋白的冻干粉、作为阴性对照的蛋白冻干粉、样品稀释液、PBST浓缩洗液、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺配置的显色底物、作为终止液的2MH2S04、封板胶纸。本发明提供的试剂盒可用于癌症、血管病、糖尿病视网膜病及类风湿关节炎等有关与VEGF受体有关的疾病的诊断和预后，具有准确、特异、灵敏、稳定、方便等优点，因此具有十分广阔的应用前景。

Description

一种VEFG受体酶联诊断试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的酶联检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

肿瘤的发展和转移是多阶段的、复杂的、具有高度选择性的过程，涉及肿瘤细胞与宿主之间错综复杂的关系，其机理尚不甚清楚。近年来关于新的血管生成与肿瘤发展、转移和预后关系的研究进展迅速，证明新的血管生成是肿瘤生成、转移和转移灶生长的必要条件，血管内皮细胞生长因子(VEGF)是调节新血管生成的最重要的细胞因子。研究表明血管内皮细胞生长因子(VEGF)在血管系统的发育分化中具有不可替代的作用。

VEGF是一个分子量为45KD的高度糖基化的碱性蛋白，有两个相同亚单位通过二硫键结合形成，等电点为8.5，有很强的耐热和耐酸能力。人VEGF基因有5种不同的异构体，分别为VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145、VEGF121。VEGF高亲和力结合位点仅位于血管内皮细胞上昀3种VEGF受体，即VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，这3种受体主要分布于血管内皮细胞表面，均是跨膜受体。研究表明，VEGF受体在体外与VEGF有高度的亲和力(Kendall etal．PNAS USA，1993，90:10705-9)。VEGF是癌症生长、转移所必需的一种因子。目前研究表明，在人类各种恶性肿瘤(即癌症)疾病中，VEGF的分泌增加有着普遍性和广泛性。有大量文献报道，VEGF在正常人和癌症患者中的浓度明显不同，正常人中的VEGF浓度很低或检测不到，而在癌症患者中VEGF浓度很高。因此，检测人血液中的VEGF浓度，能够用于癌症的早期普查诊断。另一方面，VEGF在人体血液中的浓度随肿瘤的消长情况而变化。肿块大、生长快时，VEGF的血液浓度就高；而当肿瘤因化疗或手术“临床治愈”时，VEGF的血液浓度降低。故VEGF得检测可作为疗效观察和预后的指标。VEGF是恶性肿瘤诊断中的一个重要组成部分。另外，血液VEGF水平增高亦见于糖尿病、血管炎症性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等。

现有技术中关于VEGF的生物检测方法，存在灵敏度较低、稳定性不佳等问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种酶联免疫检测人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的检测试剂盒。本发明提供的试剂盒结果准确稳定、特异性强、灵敏度高、使用方便、便于推广。

本发明的另一目的是提供上述酶联检测试剂盒的生产制备及使用方法。

为实现上述目的，本发明提供一种VEGF受体酶联诊断试剂盒，包括：酶联板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、酶联物、浓缩洗涤液、显色剂A＆B、终止液和封板胶纸；

其中：酶联板为血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体包被的酶联反应板；

酶联物为辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子单克隆抗体。

作为进一步优选方案，所述阳性对照为血管内皮细胞生长因子蛋白冻干粉；

所述阴性对照为动物血清冻干粉；

所述样品稀释液为0.05%吐温-20～80，l%牛血清白蛋白，l0mM乙二胺四乙酸二钠，0.05%硫柳汞，0.4M NaCl，pH6.5；

所述浓缩洗涤液为137mM NaCl，2.7mM KC1，10mMNa2HP04，2mMKH₂P0₄，0.05%吐温20，Ph7.4：

所述显色剂A液为H₂O₂溶液，所述显色剂B液为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液；

所述终止液为2MH₂S0₄溶液。

作为进一步优选方案，上述各物质的量以酶联板的孔数为标准。

作为进一步优选方案，所述酶联板为96孔。

一种上述VEGF受体酶联检测试剂盒的制备和操作方法，主要步骤为：

(a)将血管内皮细胞生长因子受体包被于固体支持物酶联反应板上；

(b)用封闭液封闭；

(c)特生物标本加入到预包被的酶联反应板反应孔中，生物标本中的血管内皮细胞生长因子特异地与血管内皮细胞生长因子受体结合；

(d)用血管内皮细胞生长因子单克隆抗体检测血管内皮细胞生长因子；

(e)显色底物为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液。

作为进一步优选方案，步骤a所述的血管内皮细胞生长因子受体用昆虫细胞表达。

作为进一步优选方案，步骤c所述的生物标本为癌症、血管病、糖尿病视网膜病及类风湿关节炎生物个体的血清、血浆、脑脊液、唾液、组织提取液或尿液。

作为进一步优选方案，步骤d所述的血管内皮细胞生长因子单克隆抗体是用血管内皮细胞生长因子免疫小鼠所得。

作为进一步优选方案，步骤d所述的单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记。

本发明试剂盒的独特性在于，它使用VEGF受体包被酶联板，能够确保VEGF能被本试剂盒所检测，能对标本有准确的测定。本试剂盒检测生物标本中的VEGF，优选来自癌症、血管病病人或其他疾病病人的标本。本发明所述方法的成功开发对于VEGF受体相同的疾病的检测和预后有着重要的意义，同时该方法也为VEGF受体疾病的防治、早期筛查、诊断工作提供了准确、简便、有效的监测手段，具有广泛的应用范围和社会需求。总之，本发明积极适应了现代生物、预防保健、临床诊断等领域的工作需要和人性化服务的需要，因此其应用前景十分广阔。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。

实施例1VEGF受体酶联诊断试剂盒的制备

本发明的试剂盒举例可以是下列物质：

(1)VEGF受体包被酶联板；

(2)阳性对照(VEGF蛋白冻干粉)1支；

(3)阴性对照(动物血清冻干粉)1支；

(4)样品稀释液：0.050r6吐温20，lor6牛血清白蛋白，10mM乙二胺四乙酸二钠，0.050r6硫柳汞，0.4M NaCl，pH6.5，1瓶，

(5)酶联物：辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子单克隆抗体，1瓶；

(6)浓缩洗涤液为：137mM NaCl，2.7mM KC1，10mM Na2HP04，2rrrMKH2P04，0.050r6吐温20，Ph7.4，1瓶；

(7)显色剂A液位H。O。溶液，显色剂B液为3，37，5，5四甲基联苯胺溶液，各1瓶；

(8)终止液为2MH，s04，1瓶；

(9)封板胶纸2张。

上述各种物质量均以酶联板为96孔(12条8孔或8条12孔)为例计算的，若酶联板的孔数多于或少于96孔，则各物质量也应相应或多或少。

上述VEGF受体酶联诊断试剂盒的制备方法：

(1)VEGF基因和VEGF受体基因的克隆

以人胎盘cDNA文库为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。依据VEGF基因的报道序列设计引物，PCR反应祭件：95℃变性40秒，52℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，30个循环后72℃保温10分钟。

反应体系：

凝胶电泳回收PCR扩增的片段，克隆到载体pMT18-T中，转化大肠杆菌DH5a，提取重组质粒进行酶切鉴定。VEGF基因的重组质粒命名为bVT18-1，VEGF受体基因的重组质粒命名为pMT18-2。DNA序列分析由上海博沃生物工程有限公司完成。

(2)Vero细胞表达载体的构建

用Sal I、BamH 1分别酶切质粒pMT18-1和pMT18-2，分别回收VEGF基因片段和VEGF受体基因片段。同时用Sal I、BamHI酶切质粒pFastBac-HT，回收6.7kb片段。将VEGF基因片段和VEGF受体基因片段分别与6.7kb片段进行连接，构建载体pFastBac-1和pFastBac-2。用不同的限制性内切酶进行酶切鉴定，表明所构建载体正确。

分别将载体pFastBac-1和pFastBac-2转化DHlOBac感受态细胞。采用蓝白斑筛选，24小时后将白斑划到新平板上，确认其是否白斑。将菌落挑到2mLLB培养基中，37℃，250rpm振荡培养12小时。

提取培养的菌液中的质粒方法如下：

(a)将1.5mL菌液转入离心管中，10000rpm离心30s，弃上清，将离心管倒立于纸巾上，使细菌沉淀尽可能干燥；

(b)加300uL溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8．O)，在震荡器上振荡混匀；

(c)加300uL现配的溶液II(0.2N NaOH，lor6SDS)，混匀，室温放置5分钟；

(d)加300uL预冷的溶液III(5M KAc，pH5.5)，冰浴5分钟；

(e)12000rpm离心15分钟；

(f)转移上清至一新离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀；

(g)10000-12000rpm离心10分钟；

(h)用70%和无水乙醇洗涤沉淀；

(i)吹干，溶于50uL加RNase的TE (lOmM Tris-HCl，ImM EDTA，pH8.0)中，于37℃放置一小时，置于20℃备用。

对提取的质粒迸行PCR鉴定，PCR反应依据前述的方法。

(3)转染Vero细胞

Vero细胞培养于Grace培养液中，添加150r6胎牛血清、青霉素50U/mL、链霉素50ug/mL，转染方法如下：

(a)转染前一天将细胞分到24孔板；

(b)转染前2小时，更换新鲜无血清、无双抗培养液，洗一次，然后加入500uL培养液：

(c)在50uL无血清、无双抗培养液中分别加入2uL脂质体、5uL前述的重组质粒，室温放置5分钟，将质粒加入到脂质体中，室温放置20分钟；

(e)将上一步骤的混合物加到细胞中，27℃培养；

(f)转染4小时后，吸掉培养液，加入1mL新鲜牛血清、有双抗Grace培养液，27℃培养72小时；

(g)转染72小时后，观察是否有出毒迹象；

(h)将有杆状病毒上清感染新Vero细胞。

(4)Vero表达蛋白的纯化(Ni柱吸附法)

(a)Ni柱的制备

(I)取ImLNi-NTA到一离心管中，1500g离心5分钟；

(II)去掉上清，将Ni-NTA用1倍体积的洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，500mMKC1，20mM咪唑，2mM巯基乙醇，10%甘油，pH8.5)重悬；

(III)将重悬液到入柱中，用5～10倍体积的wash buffer平衡。

(b)细胞抽提物的准备

(1)500g离心5分钟收集50mL细胞；

(II)用裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，l00mM KC1，20mM咪唑，5mM巯基乙醇，1mM苯甲基磺酰氟，pH8.5)重悬细胞；

(III)10000g离心10分钟，将上清液转移到一新管中。

(c)蛋白纯化

(I)将上一步骤的上清液加到平衡好的Ni柱中；

(II)用10倍体积的bufferA(20mM Tris-HCl，500mM KC1，20mM咪唑，5mM巯基乙醇，100r6甘油，pH8.5)洗柱；

(III)用2倍体积的buffer B(20mM Tris-HCl，1MKC1，20mM咪唑，5mM巯基乙醇，10%甘油，pH8.5)洗柱；

(IV)用2倍体积的bufferA洗柱；

(V)用5～10倍buffer C(20mM Tris-HCl，lOOmM KC1，lOOmM咪唑，5mM巯基乙醇，10%甘油，pH8.5)洗脱，收集洗脱液；

(VI)用SDS-PAGE胶检测所纯化蛋白的浓度与纯度。

(5)VEGF单克隆抗体的制备、纯化及标记

以小鼠为免疫动物，重组VEGF为抗原进行免疫。

根据小鼠免疫效价，挑选免疫效价最高的动物，取脾脏进行细胞融合，采用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。挑选有一个细胞团的阳性孔进行有限稀释，一个孔中只有此～个克隆细胞团，中央密集成圆形向四周铺开。待有限稀释的所有的孔皆如此且全部检测为阳性，可认为克隆完成。由其中单一细胞来源的杂交瘤分泌所得到的抗体为单克隆抗体。正辛酸硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，纯度在95%以上。

采用戊二醛法将辣根过氧化物酶(HRP)标记到VEGF单克隆抗体上。

(6)试剂盒的制备

酶联板的包被采用以下步骤：抗体用包被缓冲液稀释一定的倍数，每孔加100uL。

37℃水浴或温箱中包被2小时，然后放在室温过夜。每孔加满PBST洗涤液，放置30秒左右，甩干。每孔加120u1封闭液，室温放置2小时。封闭液配方主要含有BSA、一些盐类等。

甩掉封闭液，拍打除去残余封闭液。超净台上吹干。或超净台上吹数小时，然后室温放置过夜。用真空包装机进行包装。

实施例2VEFG酶联诊断试剂盒的使用方法

1．从以平衡至室温的密封袋中取出所需板条，其它板条请密封放回4℃。

2．留一孔为空白孔，其他各孔加入样品稀释液100uL(或2滴)。

3．除空白孔外，加入阴性对照1孔、阳性对照2孔、血清标本各100uL至相应孔中，轻弹混匀。用封板胶纸封住反应孔，37℃60分钟。

4．洗板3次：(1)自动洗板机：甩尽孔内液体，要求注入的洗涤液为350uL，注入与吸出间隔1530秒，洗板3次。(2)手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350uL，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗3次。

5．除空白孔外，每孔加酶联物200uL(或4滴)，封住板孔，37℃60分钟。

6，洗板3次。

7.显色反应：将显色剂A、B液各100ul(或2滴)加到反应孔(包括空白孔)内，避光室温显色25分钟。

8.终止反应：每孔(包括空白孔)各加终止液50uL(或1滴)，混匀，测量450nmOD值。

实施例3试剂盒线性范围、线性、特异性、灵敏性、准确性、精密性、重复性的检测

1.特异性

特异性评价：组装的VEGF受体检测试剂盒用于检测VEFG受体，结果表明该试剂盒的特异性很高，具体如表1所示。

表1检测VEGF受体抗原含量方法特异性试验450nm吸光度结果

结果表明：该检测试剂盒的特异性高，与TNF-α、IL 22等多种受体没有交叉。

2.灵敏度

检测如下表2所示：

表2VEGF受体抗原检测方法灵敏度

结果表明：含量在1000-5ng/mL时，OD值≥阴性对照*2.1，该方法的检测灵敏度为5ng/mL检测范围及线性：

表3VEGF受体检测方法线性试验吸光度值结果

结果表明：含量在5-1000ng/mL时，连续9点线性≥0.97,检测的受体范围5ng～1000ng/mL。

3.准确性

稀释VEGF受体使其理论含量依次为200ng/mL、400ng/mL、600ng/mL、800ng/mL、1000ng/mL，检测上述稀释的抗原含量。

表4VEGF受体检测方法准确性试验

结果表明：200ng/mL准确性为：91%～108%；400ng/mL准确性为：96%～108%；600ng/mL准确性为：92%～111%；800ng/mL准确性为：92%～110%；1000ng/mL准确性为：92%～109%。准确性在90%～120%之间，准确值较高。

4.精密性

根据受体含量检查结果，判定变异系数。

表5VEGF受体检测方法精密性试验

结果表明：变异系数均小于10%，变异系数较小，精密性高。

5.重复性

表11VEGF受体检测方法重复性试验

结果表明：双人重复试验显示：cv值<10%，具有较好的重复性。

综上述试验结果表明，本发明提供的VEGF受体诊断试剂盒特异性强、灵敏度高。检测灵敏度能达到ng/L水平，稳定、本发明于4℃保存，有效期长达9～12个月，使用方便，所需检测仪器(酶标仪)在各大医院和检测中心普遍使用。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种VEGF受体酶联检测试剂盒，其特征在于，所述VEGF受体酶联诊断试剂盒包括：酶联板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、酶联物、浓缩洗涤液、显色剂A＆B、终止液和封板胶纸；

2.根据权利要求1所述的VEGF受体酶联检测试剂盒，其特征在于：

所述阳性对照为血管内皮细胞生长因子蛋白冻干粉；

所述阴性对照为动物血清冻干粉；

所述浓缩洗涤液为137mM NaCl，2.7mM KC1，l0mM Na2HP04，2mMKH₂P0₄，0.05%吐温20，Ph7.4：

所述终止液为2MH₂S0₄溶液。

3.根据权利要求1所述的VEGF受体酶联检测试剂盒，其特征在于：各物质的量以酶联板的孔数为标准。

4.根据权利要求1所述的VEGF受体酶联检测试剂盒，其特征在于：所述酶联板为96孔。

5.一种权利要求1所述的VEGF受体酶联检测试剂盒的制备和操作方法，其特征在于，主要步骤为：

(b)用封闭液封闭；

(e)显色底物为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液。

6.根据权利要求5所述的VEGF受体酶联检测试剂盒的制备和操作方法，其特征在于：步骤a所述的血管内皮细胞生长因子受体用昆虫细胞表达。

7.根据权利要求5所述的VEGF受体酶联检测试剂盒的制备和操作方法，其特征在于：步骤c所述的生物标本为癌症、血管病、糖尿病视网膜病及类风湿关节炎生物个体的血清、血浆、脑脊液、唾液、组织提取液或尿液。

8.根据权利要求5所述的VEGF受体酶联检测试剂盒的制备和操作方法，其特征在于：步骤d所述的血管内皮细胞生长因子单克隆抗体是用血管内皮细胞生长因子免疫小鼠所得。

9.根据权利要求5所述的VEGF受体酶联检测试剂盒的制备和操作方法，其特征在于：步骤d所述的单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记。