CN108865885B - 一种用于细胞培养截留装置及其截留方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于细胞培养截留装置，包括反应器、声学截留器、中空纤维柱和收获罐，所述反应器通过管道依次与外循环泵、声学截留器的入端口相连接；所述声学截留器的沉降口与反应器相连接，声学截留器的出端口通过管道与中空纤维柱相连接，并在出端口与中空纤维柱之间的管道处安装有出液泵；所述中空纤维柱的出液口通过管道依次与收获泵、收获罐相连接，中空纤维柱将截留后的细胞收集到与中空纤维柱相连接的反应器中。本发明可极大提高截留效率，可满足90％以上的截留效率。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种用于细胞培养截留装置及其截留方法。
背景技术
用动物细胞生产基因工程药物的品种越来越多，特别是工程抗体的出现，产量已成为生产的瓶颈。用灌流培养系统替代传统的批次的生产工艺已越来越引人们关注。采用灌流培养系统可大大提高细胞密度和产量，大大减少设备和产房的投资。为了进行有效的灌流培养，其核心是要有一套、低成本、并可长期使用的将细胞截留在反应罐内的灌流系统。至今的截留装置有声波截留、ATF截留等，但是各种方法之间均存在着各自的缺点，如声波截留利用超声波对细胞进行汇聚沉淀，但是并未能完全截留细胞，当灌流较大的时候，仍有部分细胞损失并进入上清液中，上清液中如果细胞含量较大，下游需要增加过滤工序，同时较多上清细胞有可能增加了宿主蛋白含量，加大了下游纯化层析的难度；而ATF截留方法虽然对大量细胞进行有效截留，随着使用时间延长，培养液中细胞及产物会贴附滤膜，堵塞滤膜，导致收获液产物浓度下降，影响收率。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的旨在提供一种既降低了单一使用声学截流系统导致收获上清中残留细胞增加的下游纯化工艺难度，又解决了单一使用ATF截留细胞易堵塞的问题的截留装置及其截留方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于细胞培养截留装置，包括反应器、声学截留器、中空纤维柱和收获罐，所述反应器通过管道依次与外循环泵、声学截留器的入端口相连接；所述声学截留器的沉降口与反应器相连接，声学截留器的出端口通过管道与中空纤维柱相连接，并在出端口与中空纤维柱之间的管道处安装有出液泵；所述中空纤维柱的出液口通过管道依次与收获泵、收获罐相连接，中空纤维柱将截留后的细胞收集到与中空纤维柱相连接的反应器中。
进一步的，所述收获泵的收获体积设置为0.1-3倍培养体积，根据密度和营养需求、目标蛋白浓度调整收获灌流量。既要保持足够营养供应，又要保证适合的目标蛋白浓度。
进一步的，所述外循环泵速率设置为1-3倍出液泵流速；可保证足够培养液进入超声截留装置内被截留，一部分被截留并回流反应器内部，另一部分培养液及未截留细胞被出液泵泵入中空纤维柱内进行再次截留。
进一步的，所述出液泵的灌注速率设置为1-3倍收获泵灌注速率。
进一步的，所述声学截留器连接有超声控制器，通过超声控制器控制声学截留器的超声波功率为5～100w，声学截留器的超声频率为2.09-2.17MHz，声学截留器的超声波脉冲间隔不限于0min、3min、5min、10min、15min、999min，声学截留器的反冲时间不限于0min、3sec、5sec、1min。
进一步的，所述中空纤维柱的膜孔径大小为0.2um～1.0um，中空纤维柱长度为20、41.5或65cm，中空纤维柱内的隔膜面积为13cm2～11.3m2；中空纤维柱收获泵的收获体积设置为0.1-3倍培养体积，中空纤维柱内细胞液的流速为1～2倍收获流速。收获泵灌注速率通常取决于目标收获值，在0.1-3倍培养体积范围内均可获得较好的截留效果，中空纤维柱内细胞液的流速为1～2倍收获流速，可保证不被抽空，同时将被吸附的细胞和目标产物回流罐内。
一种用于细胞培养截留装置的细胞截留方法，包括步骤：
1)通过外循环泵将含有细胞的培养液从声学截留器的入端口进入，培养液中大量细胞聚集在声学截留器的腔体内，聚集的细胞通过腔体的沉降口回到生物反应器中，部分细胞随着培养液从腔体的出端口流出；
2)从声学截留器出端口流出的培养液在出液泵的作用下，流入中空纤维柱做进一步的截留，培养液中的部分细胞经中空纤维柱截留后培养液中剩余的细胞聚集到生物反应器，并通过收获泵将剩余的培养液收集到收获罐中。
进一步的，所述声学截留器的出液泵灌注速率范围为1～3倍收获泵灌注速率。
进一步的，所述外循环泵的灌注速率为1～3倍出液泵灌注速率，经超声截留部分细胞可被捕获并回流反应器内，超声截留率一般都能到60％以上。Biosep出液泵灌注速率通常取决于目标收获值，收获大则相应超声截留会相对变差，外循环灌注速率在1-3倍收获灌注速率范围均有理想的截留效果。
本发明的有益效果在于：
本发明所述细胞培养截留装置首先通过超声截留装置biosep进行第一道截留，可截留大部分细胞，损失的另一部分再通过中空纤维柱截留，相对单纯使用中空纤维柱截留，由于进行了第一道截留，细胞相对较少，此截留压力相对低，即使超声截留装置biosep不稳定或者超载量，仍能较好的进行截留，大大提高截留效率，从而保证高密度细胞长时间培养。上所述各蠕动泵控制比例会对截留有很大影响，在所述范围内均可以满足最低要求，在满足以上所述各蠕动泵控制比例基础上，结合超声截留装置biosep功率控制，根据不同密度选择大小不同的功率，可输出5～100W不等，可极大提高截留效率，可满足90％以上的截留效率。对于生长慢的细胞可以在较短时间内扩增至高密度。
附图说明
图1为本发明的细胞培养截留装置的结构示意图。
附图标记：1、反应器；2、声学截留器；201、外循环泵；202、出液泵；3、中空纤维柱；301、收获泵；4、收获罐。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
如图1所示，一种用于细胞培养截留装置，包括反应器、声学截留器、中空纤维柱和收获罐，所述反应器通过管道依次与外循环泵、声学截留器的入端口相连接；所述声学截留器的沉降口与反应器相连接，声学截留器的出端口通过管道与中空纤维柱相连接，并在出端口与中空纤维柱之间的管道处安装有出液泵；所述中空纤维柱的出液口通过管道依次与收获泵、收获罐相连接，中空纤维柱将截留后的细胞收集到与中空纤维柱相连接的反应器中。
所述收获泵的收获体积设置为3倍培养体积；所述外循环泵速率设置为3倍出液泵流速；所述出液泵的灌注速率设置为3倍收获泵灌注速率。所述声学截留器的通过超声控制器控制，超声波功率5～100w，超声频率设置为2.09～2.17MHz，超声波脉冲间隔可设置为0min、3min、5min、10min、15min、999min不等，反冲时间可设置0min、3sec、5sec、1min等，该参数下的超声波不影响细胞的生长，适合的脉冲间隔(3min～10min为宜)能促进细胞在超声腔体聚集成团，利于沉降，有利超声截留。
上述各蠕动泵控制比例会对截留有很大影响，在所述范围内均可以满足最低要求，在满足以上所述各蠕动泵控制比例基础上，结合超声截留装置biosep功率控制，根据不同密度选择大小不同的功率，可输出5～100W不等，可极大提高截留效率，可满足90％以上的截留效率。对于生长慢的细胞可以在较短时间内进行扩增。而上述各蠕动泵的控制由中控设备统一控制，提高自动化程度。
一种用于细胞培养截留装置的细胞截留方法，包括步骤：
1)通过外循环泵将含有细胞的培养液从声学截留器的入端口进入，培养液中大量细胞聚集在声学截留器的腔体内，聚集的细胞通过腔体的沉降口回到生物反应器中，部分细胞随着培养液从腔体的出端口流出；
2)从声学截留器出端口流出的培养液在出液泵的作用下，流入中空纤维柱做进一步的截留，培养液中的部分细胞经中空纤维柱截留后培养液中剩余的细胞聚集到生物反应器，并通过收获泵将剩余的培养液收集到收获罐中。
所述声学截留器的出液泵灌注速率范围为1～3倍收获泵灌注速率。
所述外循环泵的灌注速率为1～3倍出液泵灌注速率。
所述中空纤维柱的膜孔径大小可根据产品需求选择不同厂家不同孔径的规格，宜选择高亲水性，高通量，低蛋白结合率，孔径可选范围3kD(千道尔顿)-02um不等，基本可覆盖不同大小的抗体及重组蛋白需求，可选纤维内径0.5mm～1.0mm，中空纤维柱长度设置为20、41.5或65cm，中空纤维柱内的隔膜面积设置为13cm2～11.3m2；中空纤维柱收获泵的收获体积设置为0.1-3倍培养体积，中空纤维柱内细胞液的流速为1～2倍收获流速，可保证不被抽空，同时将被吸附的细胞和目标产物回流罐内。
具体运行实例：在容量为40L培养体积的反应器进行CHO细胞灌流培养过程中，采用本发明截留装置对细胞进行截留。其中中控纤维柱的所述中空纤维柱的膜孔径大小为0.8mm，中空纤维柱长度为65cm，中空纤维柱内的隔膜面积设置为13cm2；外循环泵速率均控制在80L/d，出液泵流速均控制在60L/d，中空纤维柱的收获泵的灌注速率为80L/d，实际收获量约80L。其中40L培养液中的细胞浓度为1000万cell/ml，经过截留装置截留后收获罐细胞浓度小于50万cell/ml，截留效率可达95％，相对比单独使用超声波截留和ATF截留的方法，本实施例的截留效率大幅度提高，保证高密度细胞培养。
本实施例所述细胞培养截留装置首先通过超声截留装置biosep进行第一道截留，可截留大部分细胞，损失的另一部分再通过中空纤维柱截留，相对单纯使用中空纤维柱截留，由于进行了第一道截留，细胞相对较少，此截留压力相对低，即使超声截留装置biosep不稳定或者超载量，仍能较好的进行截留，从而保证高密度细胞培养，中空纤维截留压力小，不易堵塞，使用过程无需频繁更换，降低更换操作风险，同时延长中空纤维使用寿命，降低生产成本。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于细胞培养截留装置，其特征在于，包括反应器、声学截留器、中空纤维柱和收获罐，所述反应器通过管道依次与外循环泵、声学截留器的入端口相连接；所述声学截留器的沉降口与反应器相连接，声学截留器的出端口通过管道与中空纤维柱相连接，并在出端口与中空纤维柱之间的管道处安装有出液泵；所述中空纤维柱的出液口通过管道依次与收获泵、收获罐相连接，中空纤维柱将截留后的细胞收集到与中空纤维柱相连接的反应器中。
2.根据权利要求1所述的一种用于细胞培养截留装置，其特征在于，所述收获泵的收获体积设置为0.1-3倍培养体积。
3.根据权利要求1所述的一种用于细胞培养截留装置，其特征在于，所述外循环泵速率设置为1-3倍出液泵流速。
4.根据权利要求1所述的一种用于细胞培养截留装置，其特征在于，所述出液泵的灌注速率设置为1-3倍收获泵灌注速率。
5.根据权利要求1所述的一种用于细胞培养截留装置，其特征在于，所述声学截留器连接有超声控制器，通过超声控制器控制所述声学截留器的超声波功率为5～100w，所述声学截留器的超声频率为2.09-2.17MHz，所述声学截留器的超声波脉冲间隔不限于0min、3min、5min、10min、15min、999min，所述声学截留器的反冲时间不限于0min、3sec、5sec、1min。
6.根据权利要求1所述的一种用于细胞培养截留装置，其特征在于，所述中空纤维柱的膜孔径大小为0.2um～1.0um，中空纤维柱长度设置为20、41.5或65cm，中空纤维柱内的隔膜面积为13cm2～11.3m2；中空纤维柱收获泵的收获体积设置为0.1-3倍培养体积，中空纤维柱内细胞液的流速为1～2倍收获流速。
7.一种基于权利要求1所述的一种用于细胞培养截留装置的细胞截留方法，其特征在于，包括步骤：
1)通过外循环泵将含有细胞的培养液从声学截留器的入端口进入，培养液中大量细胞聚集在声学截留器的腔体内，聚集的细胞通过腔体的沉降口回到生物反应器中，部分细胞随着培养液从腔体的出端口流出；
2)从声学截留器出端口流出的培养液在出液泵的作用下，流入中空纤维柱做进一步的截留，培养液中的部分细胞经中空纤维柱截留后培养液中剩余的细胞聚集到生物反应器，并通过收获泵将剩余的培养液收集到收获罐中。
8.根据权利要求7所述的一种用于细胞培养截留装置的细胞截留方法，其特征在于，所述声学截留器的出液泵灌注速率范围为1～3倍收获泵灌注速率。
9.根据权利要求7所述的一种用于细胞培养截留装置的细胞截留方法，其特征在于，所述外循环泵的灌注速率为1～3倍出液泵灌注速率。
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