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CN108823231B - 一种猪圆环病毒3型基因工程亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种猪圆环病毒3型基因工程亚单位疫苗及其制备方法 Download PDF

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CN108823231B CN201810743651.8A CN201810743651A CN108823231B CN 108823231 B CN108823231 B CN 108823231B CN 201810743651 A CN201810743651 A CN 201810743651A CN 108823231 B CN108823231 B CN 108823231B
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Abstract

一种猪圆环病毒3型(PCV3)基因工程亚单位疫苗及其制备方法，所述方法包括：S1构建PCV3cap蛋白基因克隆载体；S2对步骤S1克隆的PCV3cap蛋白基因进行剪接及表达筛选，并确定剪接方式；S3对步骤S2筛选的表达PCV3cap蛋白基因的密码子进行优化；S4在步骤S3优化的PCV3cap蛋白N端基因上游融合连接特定基因片段；S5用步骤S4重组的基因构建表达工程菌，采用所述表达工程菌表达可溶性PCV3cap蛋白，亚基分子量约为25kDa，并对其进行纯化；S6纯化后的蛋白在电子显微镜下呈现直径为17.74nm至18.20nm圆球状病毒样颗粒，利用纯化后的表达蛋白添加免疫增强剂配制疫苗。用该疫苗免疫实验猪后，能检测出抗PCV3Cap蛋白的抗体，在攻毒保护实验中能显著降低实验猪血清中的PCV3病毒载量，表明对实验猪有显著的保护作用。

Description

一种猪圆环病毒3型基因工程亚单位疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程、生物制药领域，具有涉及一种猪圆环病毒3型基因 工程亚单位疫苗及其制备方法，尤其涉及一种重组猪圆环病毒3型基因工程亚 单位疫苗及其制备方法。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，病 毒无囊膜、是单链负股环状DNA病毒，是最小的动物病毒之一。传统的观点认 为猪圆环病毒存在两个基因型：猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型 (PCV2)，其中PCV2具有致病性。2015年6月，美国北卡罗来纳州某猪场暴 发猪皮炎肾病综合征(PDNS)疫情，与历史平均值相比，母猪死亡率升高10.2％、 受孕率下降0.6％。患病母猪出现厌食症状，皮肤呈现多灶性丘疹、斑点和浅表 性皮炎，所产胎儿(包括弱胎、死胎、木乃伊胎)具有类似临床症状。美国堪 萨斯州立大学兽医诊断实验室的科学家Rachel Palinski[1]，从患有皮炎肾病 综合征与繁殖障碍的猪只中检测出一种新型猪圆环病毒，并通过宏基因组测序 及遗传进化分析，将该病毒命名为猪圆环病毒3型(PCV3)。与猪圆环病毒1、2 型相似，PCV3病毒粒子呈二十面体结构，无囊膜，直径为17-20nm。基因组为 单股DNA，全长2 000bp，包含3个主要开放阅读框(ORF)。其中，ORF1编 码由297个氨基酸(aa)组成的复制酶蛋白Rep，Rep蛋白编码基因序列中无 标准起始密码子ATG，rep基因5’端的起始密码子是GTC。ORF3编码一个由231 个aa组成的蛋白质，编码方向与ORF1基因相同，其功能未知。ORF2编码由214 个aa组成的衣壳蛋白Cap，与ORF1和ORF3的复制方向相反。PCV3 Cap蛋白N 端富含精氨酸，为病毒核定位信号区域，与病毒在细胞核内定位有关。PCV3 Cap 蛋白为PCV主要结构蛋白，能够诱导动物机体产生特异性免疫应答。PCV2与 PCV3 Cap蛋白aa同源性仅为30％，两者间存在交叉免疫保护可能性较低。
我国湖北、广东某些发生繁殖障碍母猪以及急性死亡仔猪体内也检测出 PCV3。PCV3感染可导致母猪出现厌食症状，皮肤出现多灶性丘疹、斑点和浅表 性皮炎，生产性能下降；妊娠母猪发生繁殖障碍，产弱胎、死胎、木乃伊胎和 弱仔猪，病情严重甚至造成急性死亡；不同胎龄胎儿均可发生流产。截至目前， 我国已有13个省的猪场存在PCV3感染与流行。鉴于PCV2与PCV3交叉免疫 保护可能性较低，因此，现有的疫苗对该病毒没有保护作用。急需开发新的疫 苗防控这种新型病毒引起的疾病。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种用于预防猪 圆环病毒3型的生物疫苗及其制备方法，尤其是一种重组猪圆环病毒3型基因 工程亚单位疫苗及其制备方法；更具体地为：一种用大肠杆菌表达的重组猪圆 环病毒3型基因工程亚单位疫苗及其制备方法；
另外，提供一种或多种在制备所述疫苗的过程中的中间产物以及所述中间 产物的制备方法亦是本发明的发明目的之一，例如：PCV3 cap蛋白基因克隆载 体的构建、PCV3cap蛋白基因的剪接及表达筛选、PCV3 cap蛋白基因密码子的 优化、PCV3 cap基因融合方法比较表达实验、重组PCV3 cap基因表达和表达蛋 白的纯化及检测、重组猪圆环病毒PCV-3型基因工程亚单位疫苗的配制、重组 猪圆环病毒3型基因工程亚单位疫苗的本体动物免疫及抗体检测等均是本发明 的发明目的之一。
此外，在后面的描述中会提及本申请发明人所作出的很多小的、较为琐碎 的发明创造，其均属于本发明的发明目的，均是申请人希望得到专利保护的发 明创造。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种猪圆环病毒3型(PCV3)基因工程亚单位疫苗的制备方法：
S1：构建PCV3 cap蛋白基因克隆载体；
S2：对步骤S1克隆的PCV3 cap蛋白基因进行剪接及表达筛选，并确定剪 接方式；
S3：对步骤S2筛选的能表达PCV3 cap蛋白基因的密码子进行优化；
S4：在步骤S3优化的PCV3 cap蛋白N-端序列的基因上游连接一段特定的 基因片段；
S5：用步骤S4重组的基因构建表达工程菌，采用所述表达工程菌制备表达 可溶性PCV3 cap蛋白，并对其进行纯化；
S6：利用纯化后的表达蛋白添加免疫增强剂配制疫苗。
一种用于制备PCV3疫苗的可溶性融合蛋白的制造方法：
S1：构建PCV3 cap蛋白基因克隆载体；
S2：对步骤S1克隆的PCV3 cap蛋白基因进行剪接及表达筛选；
作为优选实施例，S2：对步骤S1克隆的PCV3 cap蛋白基因进行剪接及表 达筛选的步骤包括：设计引物对PCV3 cap蛋白的N端序列的基因进行剪接。
作为优选实施例，N端剪接引物包括下列物质中的至少一个上游引物：N端 未剪接引物：5′-CCC GGA TCC ATG AGA CAC AGA GCT ATA TTC AGA AGA AGA CCC-3’； N端剪接引物1：5′-CCC GGA TCC ATG AGA AGA AGG CTA TTC ATT AGG AGG-3 ′；N端剪接引物2：5′-CCC GGA TCC ATG CCC ACA GCT GGC ACA TAC TAC ACA AAG-3′；N端剪接引物3：5′-CCCGGA TCC ATG AAG AAA TAC TCC ACC ATG AAC GTC-3′；N端剪接引物4：5′-CCC GGA TCCATG AAG CCC TGG CAC GCC AAC CAC TTC-3′。
作为优选实施例，步骤S2中确定的剪接方式为：设计引物对PCV3 cap蛋 白的N端序列的基因进行剪接，N端剪接引物2为：5′-CCC GGA TCC ATG CCC ACA GCT GGC ACA TACTAC ACA AAG-3′。
S3：对步骤S2筛选的能表达PCV3 cap蛋白基因的密码子进行优化。
作为优选实施例，S3：对步骤S2筛选的能表达PCV3 cap蛋白基因的密码 子进行优化的步骤包括：1)将原基因序列的第69位亮氨酸的密码子编码由CTA 变为能被大肠杆菌tRNA正常识别的密码子CTG，将原基因序列的第83位异亮氨 酸的密码子编码由ATA变为能被大肠杆菌tRNA正常识别的密码子ATT；2)在1) 操作的基础上，进一步将原基因序列的第109位异亮氨酸的密码子编码由ATA 变为能被大肠杆菌tRNA正常识别的密码子ATT，将原基因序列的第111位亮氨 酸的密码子编码由CTA变为能被大肠杆菌tRNA正常识别的密码子CTG。
S4：在步骤S3优化的PCV3 cap蛋白N-端序列的基因上游连接一段特定的 基因片段；
作为优选实施例，S4：在去掉PCV3 Cap蛋白的N端精氨酸丰富的核定位肽 后，用PCV3 rep蛋白的N端32个氨基酸序列替代核定位肽系列。该设计方案 通过合成一段PCR长引物，然后通过PCR的方法实现。引物序列如下：
正向上游引物：5’-ACC ATG GGC CGG AGG GAA AGC CCG AAA CAC AGG TGG TGTTTT ACG ATA AAC AAC TGG ACC CCG ACC GAG TGG GAA TCT ATT GTG GAG TGT GGA GGCAGT CCC ACA GCT GGC ACA TAC TAC ACA AAG-3’
反向下游引物：5’-AAG CTT TTA GAG AAC GGA CTT GTA ACG AAT CC-3’
用该套引物的扩增产物构建成表达工程菌，并命名为：Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a-PCV3 Nd32M3 Cap，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCC NO：M2018156。采用该表达工程菌表达制备可溶性PCV3 cap 蛋白，并对其进行纯化；
作为优选实施例，纯化后的表达蛋白的亚基分子量约为25kDa，蛋白的电泳 纯度达到95％以上，在透射电镜下呈现出直径为17.74nm至18.20nm圆球状病毒 样颗粒。与技术背景中阐述的PCV3直径为17-20nm的病毒颗粒大小相吻合，表 明该蛋白合成过程中能自我装配成病毒样颗粒。
一种采用本发明所述的方法制备的猪圆环病毒3型(PCV3)基因工程亚单 位疫苗，优选地，所述疫苗中的免疫增强剂包括氢氧化铝胶。
一种采用本发明所述的方法制备的用于制备PCV3疫苗的可溶性融合蛋白。
一种重组PCV3 cap蛋白，其基因序列如下：
Figure BSA0000166775070000051
一种用于制备猪圆环病毒3型疫苗的可溶性融合蛋白，其主要成份是大肠 杆菌表达的经过改造后的PCV3 cap蛋白
作为优选实施例，所述的PCV3 cap蛋白是PCV3 cap蛋白全基因删除不同 长度核苷酸序列后剩余的基因片段，它们分别为：PCV3 cap gene，PCV3 Nd24 cap gene，PCV3Nd32 cap gene，PCV3 Nd40 cap gene，PCV3 Nd57 cap gene，优 选PCV3 Nd32 cap gene。
作为优选实施例，所述的经过N端剪裁后的猪圆环病毒3型cap蛋白基因， 进行基因编码密码子的优化。其特征是：1)将原基因序列的第69位亮氨酸的 密码子编码由CTA变为能被大肠杆菌tRNA正常识别的密码子CTG，将原基因序 列的第83位异亮氨酸的密码子编码由ATA变为能被大肠杆菌tRNA正常识别的 密码子ATT；2)在1)操作的基础上，进一步将原基因序列的第109位异亮氨 酸的密码子编码由ATA变为能被大肠杆菌tRNA正常识别的密码子ATT，将原基 因序列的第111位亮氨酸的密码子编码由CTA变为能被大肠杆菌tRNA正常识别 的密码子CTG。
作为优选实施例，所述的PCV3 cap蛋白基因进行N端剪裁序列替换的融合 表达，在去掉PCV3 Cap蛋白的N端精氨酸丰富的核定位肽后，用PCV3 rep蛋 白的N端32个氨基酸序列进行替换，同时将PCV3 rep蛋白序列的起始密码子 由GTC改为ATG，并在起始密码子后增加1个甘氨酸的编码序列。
作为优选实施例，质粒载体，含有所述的核苷酸序列。
作为优选实施例，宿主细胞，含有所述的质粒载体，为大肠杆菌BL21(DE3)， 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018156。该宿主细 胞经过生物工程方法的诱导能表达出可溶性重组PCV3 cap蛋白。
作为优选实施例，所述的细胞，经过诱导表达生产的可溶性PCV3 cap蛋白 的纯化方法，其主要步骤是：破菌离心，10％-30％饱和度硫酸铵分级沉淀浓缩， SepharoseTM 4Fast Flow凝胶过滤层析，和Marcro Cap Q离子交换层析方法， 可使表达蛋白的电泳纯度达到95％以上，亚基分子量约为25kDa，在电子显微镜 下呈现出17.74nm-18.20nm的病毒样颗粒。表明该蛋白合成过程中能自我装配 成病毒样颗粒。
作为优选实施例，所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白纯化后加上免疫增强剂， 制成重组PCV3基因工程亚单位疫苗。该免疫增强剂主要是氢氧化铝胶。
附图说明
图1是PCV3 Cap蛋白表达及纯化结果电泳图；
图2重组PCV3 Cap电子显微镜照片；
图1中：泳道1：Blue Plus Protein Marker(14-100kDa)，从下向上分别 为：14，25，30，40，50，70，100kDa；泳道2：E.coli BL21/pET28a表达蛋 白全菌；泳道3：E.coli BL21pET28a-PCV3 Nd32M3 cap表达蛋白全菌；泳道4：E.coli BL21 pET28a-PCV3 Nd32M3 cap表达蛋白上清液；泳道5：E.coli BL21 pET28a-PCV3 Nd32M3 cap表达蛋白经SepharoseTM 4Fast Flow柱层析洗脱液； 泳道5：E.coli BL21 pET28a-PCV3 Nd32M3 cap表达蛋白经Marcro Cap Q离子 交换层析洗脱液。
下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子， 并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限 制性的实施例如下：
一、PCV3 cap蛋白基因克隆载体的构建
1、材料与方法
1.1、病料DNA的提取
取猪圆环病毒3型感染后病死猪的腹股沟淋巴结样品0.5g，加无菌生理盐 水4.5mL，充分匀浆后取472μL淋巴结匀浆液，加入25μL 10％SDS(十二烷 基硫酸钠)和2.5μL蛋白酶K(25mg/ml)，置于50℃水浴作用2小时，加入500 μL的Tris饱和酚，涡旋30秒，置12000rpm离心10分钟。将上清移入另外一 支离心管中，加500μL的体积比为25∶24∶1的苯酚、氯仿、异戊醇，混合后 置12000rpm离心10分钟。取上清，按1/10体积加入3mol/L醋酸钠(pH值5.3)， 加入2.5倍体积的无水乙醇，置-20℃冰箱中30分钟，以15000rpm离心10分 钟，弃上清后加入70％乙醇1ml洗涤沉淀，以15000rpm离心10分钟，弃上清。 带有核酸沉淀的EP管开盖放置到65℃的金属浴中干燥10min左右，使残余的乙 醇完全挥发，干燥总DNA沉淀。使用前加入50μL双蒸水溶解，置-20℃冰箱中 保存备用。
1.2、PCR扩增PCV3 Cap蛋白基因
1.2.1、外套引物扩增
PCV3 Cap外套引物PF
5’GTA TTT ATT GGG TGG GTG GGT GGG CAG 3’
PCV3 Cap外套引物PR
5’GGA TCC ACG GAG GTC TGT AGG GAG AAA 3’
扩增体系(见表1)：
表1
Figure BSA0000166775070000081
优选按照上述增扩体系中试剂的序号顺序先后依次添加上述试剂，其中病 料总DNA为病料DNA提取步骤中提取得到的产物。
温度循环参数：94℃，5min→(94℃，30S，→62℃，45S，→72℃，60S) ×30→72℃，10min。其中62℃为退火温度，45S是退火时间。这里需要特别 说明的是：上述温度循环参数是经过本申请发明人结合理论在大量创造性实验 的基础上获得的，温度过高或过低、循环时间过长或过短均会影响所述外套引 物扩增的效率。
在上述外套扩增的基础上利用其产物进一步进行后续内套引物扩增，具体 如下：
1.2.2、内套引物扩增
PCV3 Cap内套引物PF
5’ATG AGA CAC AGA GCT ATA TTC AGA AGA AGA CCC 3’
PCV3 Cap内套引物PR
5’AAG CTT TTA GAG AAC GGA CTT GTA ACG AAT CC 3’
扩增体系(见表2)：
表2
Figure BSA0000166775070000091
温度循环参数：94℃，5min→(94℃，30S，→62℃，45S，→72℃，60S) ×35→72℃，10min。
其中62℃为退火温度，45S是退火时间。这里需要特别说明的是：上述温 度循环参数是经过本申请发明人结合理论在大量创造性实验的基础上获得的， 温度过高或过低、循环时间过长或过短均会影响所述内套引物扩增的效率。
利用琼脂糖凝胶电泳回收扩增带，连接到pTOPO-TA质粒载体上，转化大肠 杆菌DH5α，转化菌命名为：E.coli DH5α/pTOPO-PCV3 cap，经PCR鉴定后送 上海生物工程有限公司进行序列测定。
2 pTOPO-PCV3 Cap质粒的目的基因测序结果及推测的氨基酸排列次序如 下：
Figure BSA0000166775070000101
二、PCV3 cap蛋白基因的剪接及表达筛选
材料与方法
PCV3全基因保存载体：pTOPO-PCV3 cap
限制性核酸内切酶：BamH I；Hind III
设计引物对PCV3 cap蛋白N端序列的基因进行剪接。引物见下表3：
表3
引物名称 引物序列
N端未剪接引物 5′-CCC GGA TCC ATG AGA CAC AGA GCT ATA TTC AGA AGA AGA CCC-3’
N端剪接引物1 5′-CCC GGA TCC ATG AGA AGA AGG CTA TTC ATT AGG AGG-3′(Nd24)
N端剪接引物2 5′-CCC GGA TCC ATG CCC ACA GCT GGC ACA TAC TAC ACA AAG-3′(Nd32)
N端剪接引物3 5′-CCC GGA TCC ATG AAG AAA TAC TCC ACC ATG AAC GTC-3′(Nd40)
N端剪接引物4 5′-CCC GGA TCC ATG AAG CCC TGG CAC GCC AAC CAC TTC-3′(Nd57)
下游引物 5’CCC AAG CTT TTA GAG AAC GGA CTT GTA ACG AAT CC 3’
PCR反应体系(表4)：
表4
Figure BSA0000166775070000111
温度循环参数：94℃，5min→(94℃，30S，→62℃，45S，→72℃，60S) ×35→72℃，10min。
其中62℃为退火温度，45S是退火时间。这里需要特别说明的是：上述温 度循环参数是经过本申请发明人结合理论在大量创造性实验的基础上获得的， 温度过高或过低、循环时间过长或过短均会影响产物效率。
电泳回收扩增带，并连接到pTOPO-TA质粒载体上。转化大肠杆菌DH5α， 提取质粒DNA后用PCR方法检测鉴定重组质粒。分别命名为：pTOPO PCV3 cap，pTOPO PCV3 Nd 24cap，pTOPO PCV3 Nd 32 cap，pTOPO PCV3 Nd 40 cap，pTOPO PCV3 Nd 57 cap。
其中PCV3 cap gene，PCV3 Nd24 cap gene，PCV3 Nd32 cap gene，PCV3 Nd40 capgene，PCV3 Nd57 cap gene。优选PCV3 Nd32 cap gene是猪圆环病毒3型 cap蛋白全基因删除不同长度核苷酸序列后剩余的基因片段。
将上述5种不同剪切方式构建的质粒DNA分别用限制性核酸内切酶(BamH I /HindIII)进行消化，并与同样限制性核酸内切酶消化的表达质粒pET28a进 行连接。
连接产物分别命名为：pET28a PCV3 cap，pET28a PCV3 Nd24 cap，pET28a PCV3Nd32 cap，pET28a PCV3 Nd40 cap，pET28a PCV3 Nd57 cap。
用连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选转化子。构建成5种PCV3抗原 蛋白表达工程菌。分别命名为：E.coli BL21/pET28a PCV3 cap，E.coli BL21/pET28a PCV3 Nd24cap，E.coli BL21/pET28a PCV3 Nd32 cap，E.coli BL21/pET28a PCV3 Nd40 cap，E.coliBL21/pET28a PCV3 Nd57 cap。
进行诱导表达实验，诱导剂为α-乳糖，工作浓度为：0.03mol/L。诱导产 物用SDS-PAGE电泳进行检测。结果显示
E.coli BL21 pET28a PCV3 cap不表达，
E.coli BL21 pET28a PCV3 Nd24 cap不表达，
E.coli BL21 pET28a PCV3 Nd32 cap微量表达，表达量约为总蛋白量的10％， 部分可溶。
E.coli BL21 pET28a PCV3 Nd40 cap高效表达，表达量约为总蛋白量的30％， 不可溶。
E.coli BL21 pET28a PCV3 Nd57 cap高效表达，表达量约为总蛋白量的35％， 不可溶。
三、PCV3 cap蛋白基因密码子的优化
由于E.coli BL21 pET28a-PCV3 Nd32 cap表达蛋白部分可溶，但是表达量 偏低，因此，选择了该工程菌进行密码子优化。共设计了两种方案优化PCV3 cap 蛋白基因密码子。
第一方案：
通过Overlapping PCR的方式完成。
A片段扩增
引物序列：
AP1：5′-CCC GGA TCC ATG CCC ACA GCT GGC ACA TAC TAC ACA AAG-3′
AP2：5′-CAT CTT TAG AAT CTT ATA ATA TTC AAA GCT AAT TGC AGT TTC CCACTC GTT CAG GCG GGT AAT GAA-3′
PCR扩增体系(见表5)：
表5
Figure BSA0000166775070000131
温度循环参数：
94℃，5min→(94℃，30S，→62℃，45S，→72℃，60S)×20→72℃，10min。
保留扩增产物备用。
其中62℃为退火温度，45S是退火时间。这里需要特别说明的是：上述温 度循环参数是经过本申请发明人结合理论在大量创造性实验的基础上获得的， 温度过高或过低、循环时间过长或过短均会影响产物效率。
B片段扩增
引物：
BP1：5′-TTC ATT ACC CGC CTG AAC GAG TGG GAA ACT GCA ATT AGC TTT GAATAT TAT AAG ATT CTA AAG ATG-3′
BP2：5’CCC AAG CTT TTA GAG AAC GGA CTT GTA ACG AAT CC 3’
PCR扩增体系(见表6)：
表6
Figure BSA0000166775070000141
温度循环参数：
94℃，5min→(94℃，30S，→62℃，45S，→72℃，60S)×20→72℃， 10min。
保留扩增产物备用。
其中62℃为退火温度，45S是退火时间。这里需要特别说明的是：上述温 度循环参数是经过本申请发明人结合理论在大量创造性实验的基础上获得的， 温度过高或过低、循环时间过长或过短均会影响产物效率。
AB片段的扩增
引物序列：
AP1：5′-CCC GGA TCC ATG CCC ACA GCT GGC ACA TAC TAC ACA AAG-3′
BP2：5’CCC AAG CTT TTA GAG AAC GGA CTT GTA ACG AAT CC 3’
PCR扩增体系(见表7)：
表7
Figure BSA0000166775070000151
温度循环参数：
94℃，5min→(94℃，30S，→62℃，45S，→72℃，60S)×35→72℃， 10min。
扩增产物回收后用BamH I/HindIII双酶切后插入pET 28a质粒中构建表达 质粒载体。
将原基因序列的第69位亮氨酸的密码子编码由CTA变为能被大肠杆菌tRNA 正常识别的密码子CTG。将原基因序列的第83位异亮氨酸的密码子编码由ATA 变为能被大肠杆菌tRNA正常识别的密码子ATT。
由该序列构建的大肠杆菌表达工程菌命名为：E.coli BL21/pET28a PCV3 Nd32M1cap。
第二方案：
在方案一的基础上，通过Overlapping PCR的方法完成。
C片段扩增
引物序列：
CP1：5′-CCC GGA TCC ATG CCC ACA GCT GGC ACA TAC TAC ACA AAG-3′
CP2：5′-CCA AGT GTT TGT GGT CCA GGC GCC GTC CAG ATC AAT GGC TGT GTGCCC GAA CAT AGT TTT TGT TTG CTG-3′
PCR扩增体系(见表8)：
表8
Figure BSA0000166775070000161
温度循环参数：
94℃，5min→(94℃，30S，→62℃，45S，→72℃，60S)×20→72℃， 10min。
保留扩增产物备用。
D片段扩增
引物序列：
DP1：5’CAG CAA ACA AAA ACT ATG TTC GGG CAC ACA GCC ATT GAT CTG GAC GGCGCC TGG ACC ACA AAC ACT TGG
DP2：5’CCC AAG CTT TTA GAG AAC GGA CTT GTA ACG AAT CC 3’
PCR扩增体系(见表9)：
表9
Figure BSA0000166775070000171
温度循环参数：
94℃，5min→(94℃，30S，→62℃，45S，→72℃，60S)×20→72℃， 10min。
保留扩增产物备用。
CD片段的扩增
引物序列：
AP1：5′-CCC GGA TCC ATG CCC ACA GCT GGC ACA TAC TAC ACA AAG-3′
BP2：5’CCC AAG CTT TTA GAG AAC GGA CTT GTA ACG AAT CC 3’
PCR扩增体系(见表10)：
表10
Figure BSA0000166775070000181
温度循环参数：
94℃，5min→(94℃，30S，→62℃，45S，→72℃，60S)×35→72℃， 10min。
扩增产物回收后用BamH I/HindIII双酶切后插入pET 28a质粒中构建表达 质粒载体。在第一方案的基础上进一步将原基因序列的第109位异亮氨酸的密 码子由ATA变为能被大肠杆菌tRNA正常识别的密码子ATT。将原基因序列的第 111位亮氨酸的密码子由CTA变为能被大肠杆菌tRNA正常识别的密码子CTG。
将本实例构建的2种PCV3 Cap蛋白表达工程菌进行诱导表达。诱导剂为α -乳糖，工作浓度为：0.03mol/L。然后，用超声波破菌离心后，通过SDS-PAGE 电泳检测蛋白的表达量和溶解性状。结果显示，第二方案的目的蛋白表达和溶 解性状更佳。表达量约为总蛋白的15％-20％，置于12000RPM下离心10min后约 有30-40％目的蛋白存在于上清中。由该序列构建的大肠杆菌表达工程菌命名为： E.coli BL21/pET28a PCV3 Nd32M2 cap。
四、PCV3 cap基因融合比较表达实验
第一方案
在去掉PCV3 Cap蛋白的N端精氨酸丰富的核定位肽后，用表达质粒pET28a 的5’-端序列替代核定位肽。该方案等同于工程菌E.coli BL21/pET28a PCV3 Nd32M2 cap。
第二方案
在去掉PCV3 Cap蛋白的N端精氨酸丰富的核定位肽后，用PCV3 rep蛋白的 N端32个氨基酸基因序列替代核定位肽系列，并将PCV3 rep蛋白原序列的起始 密码子GTC改为ATG，为了去掉表达质粒pET28a的5’-端的原融合序列，将原有的 限制性内切酶位点GGATCC(Bam H I)改为CCATGG(Nco I)为满足Nco I酶切位 点的要求，在原序列的起始密码后添加了一组编码甘氨酸的密码子GGC。全序列 的长度为33个氨基酸。该设计方案通过合成一段长引物，然后通过PCR的方法实 现。
引物序列如下：
正向上游引物：
5’-ACC ATG GGC CGG AGG GAA AGC CCG AAA CAC AGG TGG TGT TTT ACG ATAAAC AAC TGG ACC CCG ACC GAG TGG GAA TCT ATT GTG GAG TGT GGA GGC AGT CCC ACAGCT GGC ACA TAC TAC ACA AAG-3’
反向下游引物：
5’-AAG CTT TTA GAG AAC GGA CTT GTA ACG AAT CC-3’
扩增完成后，连接到pTOPO-TA质粒载体上，回收质粒，用Nco I/HindIII， 进行双酶切后连接到Nco I/HindIII双酶切线性化的pET 28a质粒上。转化大肠杆 菌BL21(DE3)细胞构建表达工程菌。经PCR鉴定后送上海生物工程有限公司进 行序列测定。测序结果如下：
Figure BSA0000166775070000191
Figure BSA0000166775070000201
将本实例构建的2种PCV3 Cap蛋白表达工程菌进行诱导表达。诱导剂为α -乳糖，工作浓度为：0.03mol/L。然后，用超声波破菌离心后，通过SDS-PAGE 电泳检测蛋白的表达量和溶解性状。结果显示，方案二的目的蛋白表达和溶解 性状较好。表达量约为总蛋白的20％-25％，置于12000RPM下离心10min后主要 的表达蛋白存于上清中，表明是可溶性蛋白(见图1)。工程菌命名为： Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a-PCV3 Nd32M3 Cap，该菌保藏于中国典型 培养物保藏中心(保藏单位代码CCTCC)，保藏日期2018年3月26日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2018156，分类命名 Escherichia coliBL21(DE3)/pET28a-PCV3 Nd32M3 Cap。
五、重组PCV3 cap基因表达和表达蛋白的纯化及检测
1、发酵培养及诱导表达：
用发酵培养的方法生产Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a-PCV3 Nd32M3Cap。待OD600值(在600nm处的吸光值)达1.0左右时加入诱导剂α-乳糖至工 作浓度为0.03mol/L。诱导培养5小时。
2、菌体裂解
用PBS缓冲液将表达菌体重悬(湿菌体∶PBS＝1∶10)，使用超声波裂解仪(型 号：宁波新芝生物科技股份有限公司，JY98-III超声波细胞粉碎机)裂解300次， 功率65％，裂解5S，间隔20S，裂解完毕后，进行显微镜检查，确定裂解完全。 裂解液置12000rpm离心10min。去沉淀。上清液继续纯化。
3、硫酸铵沉淀
将表达蛋白上清液用硫酸铵进行分级沉淀，收集10％-30％饱和度的硫酸铵沉淀，用PBS液复溶后继续下续纯化过程。
4、凝胶柱层析
将PCV3蛋白液上样于SepharoseTM 4 Fast Flow层析柱，收集目的蛋白峰。
5、离子交换层析分离
将凝胶柱层析收集的蛋白液用Marcro Cap Q离子交换柱进行纯化。洗脱液 A：0.02M PBS缓冲液；洗脱液B：0.02M PBS缓冲液，pH7.4，含有1mol氯化钠。 进行线性梯度洗脱，收集抗原蛋白的洗脱峰。
通过SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化结果见附图1。
其中，图1中泳道1：Blue Plus Protein Marker(14-100kDa)，从下向上 分别为：14，25，30，40，50，70，100kDa；泳道2：E.coli BL21/pET28a表 达蛋白全菌；泳道3：E.coliBL21 pET28a-PCV3 Nd32M3 cap表达蛋白全菌； 泳道4：E.coli BL21 pET28a-PCV3 Nd32M3cap表达蛋白上清液；泳道5：E.coli BL21 pET28a-PCV3 Nd32M3 cap表达蛋白经SepharoseTM 4 Fast Flow柱层析洗 脱液；泳道5：E.coli BL21 pET28a-PCV3 Nd32M3 cap表达蛋白经Marcro Cap Q 离子交换层析洗脱液。
电泳结果显示，表达蛋白为可溶性蛋白，蛋白的电泳纯度达到95％以上，亚 基分子量约为25kDa。
6、透射电子显微镜观察PCV3 Cap蛋白表达纯化产物
将200目碳涂层铜网浸于50微升纯化样品液中，室温条件下作用10分钟， 用滤纸吸去多余的液体，用3％磷钨酸负染10分钟，用滤纸吸去多余液体。制备 好的样品在透射电子显微镜(JEM-1200EX)下观察PCV3 Cap蛋白形成的类病毒 颗粒结构。见附图2，由电子显微镜照片可见，在40万倍放大的条件下纯化蛋 白呈现规整的圆状颗粒，颗粒直径17.74nm-18.20nm，表明该蛋白合成过程中能 自我装配成病毒样颗粒。
六、重组猪圆环病毒-3型基因工程亚单位疫苗的配制。
将纯化抗原蛋白稀释至25mg/100ml，以配制PCV-3基因工程亚单位疫苗 1000毫升(注：1000头份疫苗)为例。
1、PCV3 Nd32M3 cap蛋白液(25mg/100ml) 800ml
2、铝胶佐剂(2mg/ml，Al3+) 200ml
充分混合，即为重组猪圆环病毒PCV3基因工程亚蛋白疫苗。
七、重组猪圆环病毒-3型基因工程亚单位疫苗的本体动物免疫及抗体检测
取21-27日龄实验猪，采集血清用ELISA试剂盒测定抗PCV3 Cap抗体，均为 阴性。将15头抗体阴性猪，随机分为3组。
空白对照组5头，颈部肌肉注射灭菌生理盐水2毫升；
实验1组5头，颈部肌肉注射重组猪圆环病毒-3型基因工程亚单位疫苗1毫 升；
实验2组5头，颈部肌肉注射重组猪圆环病毒-3型基因工程亚单位疫苗2毫 升。
注射免疫21天时，用相同的疫苗相同的剂量进行2次免疫，2次免疫后14天， (一免后35天)采集实验猪血清标本，用ELISA试剂盒检测抗体。结果见表11：
表11
Figure BSA0000166775070000231
注：阴性样本OD450平均值＝0.11
按照经典间接ELISA的结果判断标准，S/N＜1.6为抗体阴性；2.1＞S/N≥1.6 为抗体可疑；S/N≥2.1为抗体阳性。根据以上判断标准，实验1组在免疫2次后 都可达到抗体阳性的标准，抗体阳性率为100％。实验2组在免疫2次后抗体阳性 率也为100％，而且血清抗体滴度高于实验1组。
八、猪圆环病毒3型基因工程亚蛋白疫苗的本体动物攻毒保护实验及结果
根据Palinski R，Pineyro P，Shang P，Yuan F，Guo R，Fang Y，Byers E， HauseBM(2017)A novel porcine circovirus distantly related to known circoviruses isassociated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductivefailure.J Virol 91：e01879-16报道的PCV3荧光 定量PCR引物序列合成引物。
PCV3realtime FP：Agt gct ccc cat tga acg
PCV3realtime RP：Aca cag ccg tta ctt cac
不按原文献合成荧光探针，而用TB GreenTM Premix Ex TaqTM(RR420A)试 剂盒(TaKaRa产品)中的TB Green荧光物质。
从血样中提取总DNA：
1、取50μL血清，加入450μL灭菌的PBS进行稀释。
2、加入500μL等体积的Tris-饱和酚，剧烈震荡，4℃，12000rpm离心10min。 3、将上清小心转移至灭菌的1.5mL的Ep管中，加入等体积的(约400μL) 的25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇，震荡混匀；4℃，12000rpm离心10min。
4、取上清(约250μL)转移至灭菌的1.5mL的Ep管中，加入2.5倍体积的预 冷无水乙醇，混匀后，放置于-20℃沉淀1h；4℃，12000rpm离心10min。
5、弃上清，沉淀用1mL的70％乙醇进行清洗，4℃，12000rpm离心10min。
6、弃上清，带有核酸沉淀的Ep管开启管盖，放置到65℃的金属浴中干燥 10min左右，使残余的乙醇完全挥发。
7、加入25μL的5mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，溶解DNA，并用Quawell 5000 超微量分光光度计进行DNA含量的测定和纯度的分析。
标准品的制备：
1、质粒为pTOPO PCV3 Nd24Cap
2、分子量为(1865+594)bp×660Da/bp＝1622940Da
3、测定的质粒浓度为300ng/μL＝0.3g/L
4、摩尔浓度为0.3/1622940＝1.8×10-6mol/L
5、拷贝数为1.8×10-6×6.02×1023＝1.0836×1018copy/L＝1×1012copy/μL
6、用Tris缓冲液将模板稀释成1×1010copy/μL、1×108copy/μL、 1×107copy/μL、1×106copy/μL、1×105copy/μL、1×104copy/μL、 1×103copy/μL、1×102copy/μL、1×101copy/μL
荧光定量：
荧光定量PCR仪为BIO RAD的CFX Connect；试剂盒为TAKARA的SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)，code：RR420A
表12
SYBR Premix Ex Taq 10μL
10μM PCV3 real time FP 0.4μL
10μM PCV3 real time RP 0.4μL
Template 1μL
dd H<sub>2</sub>O 8.2μL
TOTAL 20μL
两步法扩增：
扩增温度参数：94℃，3min；40cycles×(94℃，10s；55℃，35s读板)；
融解曲线测定参数：94℃，10s；65℃----95℃，5s读板(0.5℃递增)。
表13
Fluor Efficiency％ Slope Y-Intercept R^2
SYBR 104.25 -3.224 42.213 0.999
攻毒保护实验：
取猪圆环病毒3型感染病猪的腹股沟淋巴结样品5.0g，加无菌生理盐水 45.0ml，充分匀浆置10000转/min离心5分钟。取50μL匀浆液提取DNA后，进行 Realtime PCR。测得PCV3拷贝数为3.85×108。剩余匀浆上清液用0.22μm的除菌 滤器过滤2次。取滤液对实例7的猪进行攻毒实验。每头猪静脉注射1ml。攻毒后 48小时采静脉血，分离血清用realtimePCR测定病毒拷贝数。
表14
Figure BSA0000166775070000251
注：不同组Log Starting Quantity平均值具有不同字母肩号的数据间有显 著差异。
用SPSS统计分析软件进行单因素方差分析，多重比较 Student-Newman-Keuls检验设定显著性水平α为0.05。多重比较检验的相似性 子集结果显示，实验1组显著高于实验2组和空白对照组攻毒前，显著低于空白 对照组攻毒后。实验2组显著低于实验1组和空白对照组攻毒后，与空白对照组 攻毒前无显著性差异。空白对照组攻毒后显著高于实验1组、实验2组和空白对 照组攻毒前。空白对照组攻毒前显著低于实验1组和空白对照组攻毒后，与实验 2组无显著性差异。
重组猪圆环病毒PCV3型基因工程亚蛋白疫苗的本体动物攻毒保护实验结果 表明，猪圆环病毒3型基因工程亚单位疫苗免疫后的实验1组和实验2组猪只的血 清病毒载量显著降低，而且，病毒载量降低的程度与疫苗的免疫剂量有关。表 明猪圆环病毒PCV-3基因工程亚蛋白疫苗对实验猪有显著的保护作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本 发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构 特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对 本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落 在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施 方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进 行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征， 在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重 复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不 违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Figure ISA0000166775090000011
Figure ISA0000166775090000021
Figure ISA0000166775090000031
Figure ISA0000166775090000041

Claims (13)

1.一种猪圆环病毒3型PCV3基因工程亚单位疫苗的制备方法：
S1：构建PCV3 cap蛋白基因克隆载体；
S2：对步骤S1克隆的PCV3 cap蛋白基因进行剪接及表达筛选，并确定剪接方式；
S3：对步骤S2筛选的能表达PCV3 cap蛋白基因的密码子进行优化；
S4：在步骤S3优化的PCV3 cap蛋白N-端序列的基因上游在去掉PCV3 Cap蛋白的N端精氨酸丰富的核定位肽后，用PCV3 rep蛋白的N端32个氨基酸序列替代核定位肽序列，设计方案通过合成一段PCR长引物，然后通过PCR的方法实现,所述引物的序列如下：
正向上游引物：5'-ACC ATG GGC CGG AGG GAA AGC CCG AAA CAC AGG TGG TGT TTTACG ATA AAC AAC TGG ACC CCG ACC GAG TGG GAA TCT ATT GTG GAG TGT GGA GGC AGTCCC ACA GCT GGC ACA TAC TAC ACA AAG-3'；
反向下游引物：5'-AAG CTT TTA GAG AAC GGA CTT GTA ACG AAT CC-3'；
S5：用步骤S4重组的基因构建表达工程菌，采用所述表达工程菌表达制备可溶性PCV3cap蛋白，亚基分子量约为25kDa,并对其进行纯化；
S6：利用纯化后的PCV3 Cap蛋白添加免疫增强剂配制疫苗。
2.一种用于制备PCV3疫苗的可溶性融合蛋白的制造方法，包括：
S1：构建PCV3 cap蛋白基因克隆载体；
S2：对步骤S1克隆的PCV3 cap蛋白基因进行剪接及表达筛选；
S3：对步骤S2筛选的能表达PCV3 cap蛋白基因的密码子进行优化；
S4：在步骤S3优化的PCV3 cap蛋白N-端序列基因的上游在去掉PCV3 Cap蛋白的N端精氨酸丰富的核定位肽后，用PCV3 rep蛋白的N端32个氨基酸序列替代核定位肽序列，设计方案通过合成一段PCR长引物，然后通过PCR的方法实现,所述引物的序列如下：
正向上游引物：5'-ACC ATG GGC CGG AGG GAA AGC CCG AAA CAC AGG TGG TGT TTTACG ATA AAC AAC TGG ACC CCG ACC GAG TGG GAA TCT ATT GTG GAG TGT GGA GGC AGTCCC ACA GCT GGC ACA TAC TAC ACA AAG-3'；
反向下游引物：5'-AAG CTT TTA GAG AAC GGA CTT GTA ACG AAT CC-3'；
S5：用步骤S4重组的基因构建表达工程菌，采用所述表达工程菌表达制备可溶性PCV3cap蛋白，亚基分子量约为25kDa,并对其进行纯化。
3.如权利要求1或2所述的方法，S2：对步骤S1克隆的PCV3 cap蛋白基因进行剪接及表达筛选的步骤包括：设计引物对PCV3 cap蛋白的N端序列的基因进行剪接。
4.如权利要求3所述的方法，N端剪接引物包括下列物质中的至少一个上游引物：N端未剪接引物：5ˊ-CCC GGA TCC ATG AGA CAC AGA GCT ATA TTC AGA AGA AGA CCC-3’；N端剪接引物1：5ˊ-CCC GGA TCC ATG AGA AGA AGG CTA TTC ATT AGG AGG-3ˊ；N端剪接引物2：5ˊ-CCC GGA TCC ATG CCC ACA GCT GGC ACA TAC TAC ACA AAG-3ˊ；N端剪接引物3：5ˊ-CCCGGA TCC ATG AAG AAA TAC TCC ACC ATG AAC GTC-3ˊ；N端剪接引物4：5ˊ-CCC GGA TCCATG AAG CCC TGG CAC GCC AAC CAC TTC-3ˊ。
5.如权利要求3所述的方法,N端剪接引物是N端剪接引物2：5ˊ-CCC GGA TCC ATG CCCACA GCT GGC ACA TAC TAC ACA AAG-3ˊ。
6.如权利要求1或2所述的方法，S3：对步骤S2表达筛选的表达部分可溶的PCV3 cap蛋白基因的密码子进行优化的步骤包括：1)将原基因序列的第69位亮氨酸的密码子编码由CTA变为能被大肠杆菌tRNA正常识别的密码子CTG，将原基因序列的第83位异亮氨酸的密码子编码由ATA变为能被大肠杆菌tRNA正常识别的密码子ATT；2)在1)操作的基础上，进一步将原基因序列的第109位异亮氨酸的密码子编码由ATA变为能被大肠杆菌tRNA正常识别的密码子ATT，将原基因序列的第111位亮氨酸的密码子编码由CTA变为能被大肠杆菌tRNA正常识别的密码子CTG。
7.如权利要求1或2所述的方法，所述引物的扩增产物构建成表达工程菌，并命名为：Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a-PCV3 Nd32M3 Cap，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018156。
8.一种采用任一项权利要求1,3-7所述的方法制备的猪圆环病毒3型(PCV3)亚单位疫苗。
9.如权利要求8所述的疫苗，所述疫苗中的免疫增强剂包括氢氧化铝胶。
10.一种采用任一项权利要求2-7所述的方法制备的用于制备PCV3疫苗的可溶性融合蛋白。
11.一种采用任一项权利要求2-7所述的方法制备的用于制备PCV3疫苗的可溶性融合蛋白,电泳纯度达到95％以上，亚基分子量约为25kDa。
12.如权利要求11所述的可溶性融合蛋白，纯化后在透射电镜下呈现出直径为17.74nm至18.20nm圆球状病毒样颗粒。
13.一种重组PCV3 cap蛋白，其基因序列如下：
ATGGGCCGGAGGGAAAGCCCGAAACACAGGTGGTGTTTTACGATAAACAACTGGACCCCGACCGAGTGGGAATCTATTGTGGAGTGTGGAGGCAGTCCCACAGCTGGCACATACTACACAAAGAAATACTCCACCATGAACGTCATTTCCGTTGGAACTCCTCAGAATAATAAGCCCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGCCTGAACGAGTGGGAAACTGCAATTAGCTTTGAATATTATAAGATTCTAAAGATGAAAGTTACACTCAGCCCTGTAATTTCTCCAGCTCAGCAAACAAAAACTATGTTCGGGCACACAGCCATTGATCTGGACGGCGCCTGGACCACAAACACTTGGCTCCAAGACGACCCTTATGCGGAAAGTTCCACTCGTAAAGTTATGACCTCTAAAAAAAAACACAGCCGTTACTTCACCCCCAAACCAATTCTGGCGGGAACTACCAGCGCTCACCCAGGACAAAGCCTCTTCTTTTTCTCCAGACCCACCCCGTGGCTCAACACATATGACCCCACCGTTCAATGGGGAGCACTGCTTTGGAGCATTTATGTCCCGGAAAAAACTGGAATGACAGACTTCTACGGCACGAAAGAAGTTTGGATTCGTTACAAGTCCGTTCTCTAA。
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