CN113549634B

CN113549634B - 编码可溶性hpv58 l1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用

Info

Publication number: CN113549634B
Application number: CN202110632917.3A
Authority: CN
Inventors: 王爱萍; 张改平; 陈玉梅; 薛明岩; 周景明; 刘燕凯; 祁艳华; 刘红亮; 梁超; 丁培阳; 朱习芳; 马红芳
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2021-06-07
Filing date: 2021-06-07
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2041-06-07
Also published as: CN113549634A

Abstract

本发明公开了一种编码可溶性HPV58L1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用。本发明在综合多重复杂因素的基础上优化设计得到基因HPV58L1，并构建了重组质粒pUC‑58L1和pESUMO‑58L。本发明HPV58L1基因能显著提高目的蛋白可溶性表达的效率，且产物性质均一、性能稳定，其目的蛋白表达量可满足工业化生产的要求；本发明提供了一种低成本的原核表达可溶性HPV58L1蛋白的方法，该方法将HPV58L1蛋白与SUMO蛋白融合表达，可以获得可溶性好、具有明显血凝活性的重组表达蛋白。

Description

编码可溶性HPV58 L1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉一种编码可溶性HPV58 L1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用。

背景技术

据统计，2018年全球宫颈癌新发病例57万例，死亡病例有31.1万例，是第四大最常的女性癌症，而高危型人乳头瘤病毒（High Risk Human papillomavirus, HR-HPV）的长期持续性感染是导致发生宫颈癌变的重要原因。人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）是一类双链小分子DNA病毒，具有严格的种属特异性，主要感染人的皮肤和粘膜组织，具有高度的多样性和种属特异性，在地理和种族的分布方面呈现出明显的差异。HPV 58是最常见的致癌亚型之一；在全球范围内，HPV 58在宫颈癌病因中排到第六位，但是在东亚地区却流行更广，其检出率仅排在HPV 16与HPV 18之后排到第三位，占所有病例的10%～18%。除宫颈癌外，HPV感染还与肛门生殖器癌、头颈鳞状细胞癌和皮肤疣等疾病密切相关。

HPV是一类小型dsDNA病毒，其基因组大小为8000 bp左右，分子量约为5×10⁶道尔顿，直径为50～60nm，正二十面体结构。含有8个开放阅读框（Open reading frame，ORF），分别编码不同的蛋白质，根据其表达时间的不同，将其分为：早期区、晚期区和长控制区。早期区位于基因组的下游，编码参与病毒的复制与转录的非结构蛋白E1、E2、E4、E5、E6和E7。晚期区大小为2500 bp左右，编码L1和L2结构蛋白，二者共同组成了病毒的衣壳。L1蛋白是HPV的主要衣壳蛋白，由L1 ORF编码，由于L1 ORF的保守性非常高，因此作为HPV分型的依据。L1蛋白大小约为55～60 kDa。一般情况下，5个L1蛋白聚合形成5聚体，72个5聚体和一定数量的L2蛋白一同构成T=7的20面体结构的病毒衣壳。

有研究表明，L1蛋白在合适的条件下可以自组装形成病毒样颗粒（Virus likeparticles，VLP），目前所有获批上市的HPV预防性疫苗均是基于VLP研制的，但是由于相关疫苗选用杆状病毒表达系统研制，生产成本较高，价格昂贵而且保护亚型有限，在发展中国家和低收入地区的普及率较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种编码可溶性HPV58 L1蛋白的基因及其重组质粒、重组工程菌，并构建了HPV58 L1蛋白表达方法，旨在提高HPV 58 L1蛋白的可溶性、活性及表达量，并降低其制备成本。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

基于野生型HPV58L1基因进行改造，对其所对应的氨基酸全部采用大肠杆菌中使用频率最高的核苷酸密码子；而且为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构对翻译效率造成影响，并避开一些常用的酶切位点，对最优的密码子频率进行修正；最终，在综合考虑多重复杂因素的基础上，研究设计出全新的HPV58 L1 DNA序列，如SEQ IDNO.1所示。

合成优化获得的HPV58L1 DNA基因装入pUC57质粒中，构成重组质粒pUC-58L1；并构建了重组质粒pESUMO-58L。

构建表达可溶性HPV58 L1蛋白的重组质粒的方法，包括如下步骤：

（1）设计基因HPV23L1的扩增引物，且其正向引物包含Bsa I限制性内切酶位点、反向引物包括位于终止密码子侧翼的Xho I限制性内切酶位点；

（2）以所述扩增引物PCR扩增基因HPV58L1；

（3）取pESUMO质粒与所得PCR扩增产物分别进行限制性内切核酸酶Bsa I与Xho I双酶切消化，回收空载体质粒pE-SUMO和HPV58L1基因的双酶切产物，用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，得到重组质粒；

（4）将上步所得重组质粒 pESUMO-58L1转化大肠杆菌感受态细胞BL21，涂布在Amp⁺/LB固体培养基上培养，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒，测序结果正确的即为表达可溶性HPV58 L1蛋白的重组质粒。

所述扩增引物的序列如下：

引物名称	酶切位点	序列5’-3’
			F-58	<i>Bas I</i>	TT<u><i>GGTCTC</i></u>TAGGTATGTCCGTGTGGCGTC
R-58	<i>Xho I</i>	CCG<u><i>CTCGAG</i></u> TTATTTTTTAACCTTTTTGCGT

可溶性人乳头瘤病毒58亚型L1蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）取所述重组质粒pESUMO-58L1接种于Amp⁺/LB液体培养基中培养至OD₄₅₀值至0.75～0.85时，在诱导剂IPTG浓度为0.3 mmol/L、18℃条件下诱导表达；

（2）诱导表达结束后，离心收集菌体，清洗后破碎，并离心分离，收集上清液；

（3）将所述上清液通过Ni亲和层析柱进行洗脱纯化得SUMO-58 L1蛋白。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

（1）本发明优化设了HPV58L1基因，使其能在大肠杆菌宿主中高效率表达目标蛋白HPV58L1，并且基于SUMO标签表达系统在大肠杆菌中融合表达，增大了目的蛋白的可溶性，也使表达的目的蛋白具有更高的生物活性。

（2）本发明基因及其表达系统能显著提高目的蛋白可溶性表达的效率，且制得的纯化产物性质均一、稳定性好；其蛋白表达量高达100μg/ml，能够满足工业化生产的要求。

（3）本发明提供了一种低成本的原核表达可溶性HPV58L1蛋白的方法，该方法将HPV58L1蛋白与SUMO蛋白融合表达，可以获得可溶性好、具有明显血凝活性的重组表达蛋白。

附图说明

图1为重组质粒的菌液PCR及双酶切鉴定图谱；其中，

图A为pESUMO-58L1的菌液PCR鉴定；M. Marker；泳道1- 8. pESUMO-58L1扩增产物；

图B为重组表达载体的双酶切鉴定：M. Marker；泳道1为pESUMO-58L1双酶切产物。

图2为重组SUMO-L1蛋白的初步表达及鉴定图谱；其中，

A图为12% SDS-PAGE鉴定；M：蛋白Marker；1：未诱导pE-SUMO-L1空菌；2：pE-SUMO-L1表达菌诱导10 h；3：BL21（DE3）空载菌对照组（NC）；

B图为Western Blot鉴定；M：蛋白Marker；1：NC对照；2：SUMO-L1重组蛋白；

C图为可溶性分析。M：蛋白Marker；1：超声沉淀；2：超声上清。

图3为HPV58L1的大肠杆菌表达重组蛋白的纯化鉴定图；其中，

A图为12% SDS-PAGE鉴定结果；M.蛋白Marker；1.纯化前的SUMO-58L1蛋白；2.纯化后的SUMO-58L1蛋白；

B图为Western Blot鉴定。图中M.蛋白Marker；1.纯化后的SUMO-58L1蛋白。

图4为SUMO 蛋白酶的纯化及重组蛋白SUMO-58L1蛋白的SUMO-tag切除结果；其中，

A图为纯化的SUMO 蛋白酶（Ulp1）的SDS-PAGE鉴定；其中M.蛋白Marker；1.纯化后的Ulp1；

B图为UMO-tag切除的SDS-PAGE鉴定；M.蛋白Marker；1.SUMO-58L1蛋白；2.酶切反应后产物；3.纯化浓缩的HPV58L1蛋白。

图5为重组蛋白的血凝活性鉴定，其中，1:2～1:1024为纯化的SUMO-58L1蛋白2倍倍比稀释的结果；NC为PBS阴性对照。

图6为免疫小鼠血清抗体消长规律及效价测定结果；其中，

A图为免疫后0、7、14、21、28及36d的血清ELISA检测结果；

B图为免疫后的36d的小鼠血清效价检测结果。

图7为间接免疫荧光（IFA）鉴定结果；其中，

A图为pcDNA3.1-GFP转染293T细胞；

B图为pcDNA3.1-HPV58 L1转染293T细胞后与免疫血清的反应情况；

C图为用PBS代替小鼠血清作为空白对照（BC）；

D图为用PBS免疫小鼠血清作为阴性对照（NC）。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如（《分子克隆：实验室手册》原书第四版 2012）中所述的条件进行。

以下实施例中DNA延伸和PCR扩增试剂以及限制性内切酶BsaI、EcoRI和Xho I购自NEB（New England Biolabs, Inc.）；使用的抗HRP标记的羊抗鼠IgG购自Abcam公司。

以下实施例中，纯化步骤中使用的破菌缓冲液配方为：PBS（3-吗啉丙磺酸），pH7.4。

实施例一、重组表达质粒的构建

1. HPV58 L1蛋白编码区基因的克隆

1.1 HPV58L1基因序列的设计合成

本发明HPV58L1基因序列是经过大肠杆菌偏爱密码子优化的DNA序列，具体如下：

首先，对野生型HPV 58L1基因进行改造，对其所有的氨基酸全部采用大肠杆菌中使用频率最高的核苷酸密码子；同时，为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构对翻译效率造成影响，并避开一些常用的酶切位点，对最优的密码子频率进行修正，并综合考虑了其它影响因素，最终研究设计出一个全新的HPV58 L1 DNA序列，如SEQ ID NO.1所示。

经优化获得的HPV58L1 DNA送生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后的基因直接装入pUC57质粒中，命名为重组质粒pUC-58L1。

2. HPV58 L1基因的PCR扩增及双酶切回收

2.1 引物序列的设计和合成

根据HPV58 L1基因序列设计合成正向引物，具体见表1；其中，正向引物F-58包括一个Bsa I限制性内切酶位点；反向引物R-58包括位于终止密码子侧翼的XhoI限制性内切酶位点，所述酶切位点见引物序列中的下划线所示。

表1 引物列表

引物名称	酶切位点	序列(5’-3’)
			F-58	<i>Bas I</i>	TT<u><i>GGTCTC</i></u>TAGGTATGTCCGTGTGGCGTC（SEQ ID NO.2）
R-58	<i>Xho I</i>	CCG<u><i>CTCGAG</i></u> TTATTTTTTAACCTTTTTGCGT（SEQ ID NO.3）

2.2 HPV58L1 基因的PCR扩增和回收

将生物公司合成的含有HPV58L1 基因的pUC57-HPV58 L1质粒作为模板，F-58与R-58引物扩增目的基因，其扩增体系如下：

组分体积（50 μL）

Primer STAR Max 25 μL

F-58 1 μL

R-58 1 μL

pUC57-HPV58 L1质粒 1 μL（10ng）

无菌DDW 22 μL。

总反应体系50μL ，PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90 s；共30个循环；72℃延伸10 min。PCR 结束以后，将得到的产物做电泳鉴定，经过鉴定之后，将成功扩增的L1 基因使用DNA 回收试剂盒回收。

2.3 PCR扩增产物及空载体质粒的双酶切回收

将pESUMO质粒和PCR扩增产物（HPV58 L1基因）分别进行限制性内切核酸酶Bsa I和Xho I双酶切消化具体反应条件如下：

酶切消化体系为：

HPV58L1基因或pESUMO质粒 20μL

10×Buffer 5 µL

Bsa I 1μL

Xho I 1μL

双蒸水 23μL。

总体系为50μL，反应条件为37℃，4h。随后分别回收空载体质粒pE-SUMO和HPV58L1基因的双酶切产物，用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，连接反应体系（20 μL）如下：

HPV58L1基因 3 μL

pE-SUMO 9 μL

10×T4 Buffer 2μL

T4 DNA Ligase 1 μL

无菌DDW 5 μL。

连接产物pE-SUMO-L1 的转化E.coli感受态细胞DH5α，经菌液PCR和双酶切鉴定挑选阳性克隆，提质粒送阳测序，测序正确即得到重组质粒pESUMO-58L1。

3. HPV58 L1蛋白的重组表达菌的构建

分别将重组质粒pESUMO-58L1转化大肠杆菌感受态细胞BL21，涂布在Amp⁺/LB固体培养基上培养，挑取单菌落进行菌液PCR鉴和双酶切定（见图1），筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒进行测序，测序结果正确的，命名为重组质粒pSUMO-HPV58L1，即为表达可溶性人乳头瘤病毒58亚型L1蛋白的重组质粒。

实施例二、HPV58亚型L1蛋白的初步诱导表达及鉴定

1. HPV58L1的大肠杆菌表达菌株的表达和鉴定

将大肠杆菌表达菌株pESUMO-58L1接种于Amp⁺/LB液体培养基中培养至OD₄₅₀值约为0.8时，加入IPTG，使其终浓度为0.3 mmol/L，然后于18℃诱导表达12h；诱导表达结束后，离心收集菌体，取一小部分菌体用SDS-PAGE及West-Blotting鉴定，同时设立空载大肠杆菌作为对照，结果如图2所示，从图中可以看出pESUMO-58L1的表达产物在在大约80kDa处有目的条带，HPV58L1蛋白约58kDa；SUMO 标签约12kDa，加上HIS-tag，融合蛋白SUMO-58L1蛋白分子量约72kDa，因HIS-tag带正电荷，在SDS-PAGE电泳中泳动速率滞后，故目的条带在80kDa处预测位置基本一致，说明pESUMO-58L1表达菌株中有SUMO-58L1重组蛋白表达。

2. 重组蛋白HPV58-L1的可溶性分析

在诱导剂IPTG浓度为0.3 mmol/L，16℃条件下诱导表达18 h后收集pESUMO-58L1表达菌体，PBS重悬后经超声破碎处理，上清和沉淀分别用12%SDS-PAGE进行鉴定。结果显示，pESUMO-58L1的超声上清和沉淀的大约80kDa的位置均存在蛋白条带，而重组SUMO-58L1蛋白上清中的表达量整体高于沉淀（图2C）。

实施例三、HPV58 L1重组蛋白的纯化及活性鉴定

1. HPV58 L1重组蛋白的纯化

将剩余的菌体与清洗缓冲液按照重量比1:5的比例混合，摇匀，12000r/min离心5min，收集菌体沉淀。将菌体沉淀和破菌缓冲液按照重量比1:10的比例混合，摇匀，高压破碎，将高压破碎的破菌液12000r/min、4℃离心30min，收集上清液。

将上清液通过Ni亲和层析柱进行纯化，洗脱方式为：Wash Buffer，pH8.0 的含有250mmol/LNaCl 的50 mmol/LTris-HCl缓冲液+20 mmol / L咪唑；Elution Buffer pH8.0的含有250mmol/LNaCl 的50 mmol/LTris-HCl缓冲液+200 mmol / L咪唑）进行洗脱，收集洗脱组分，并采用SDS-PAGE，Western-blot检测，结果如图3所示，纯化获得的SUMO-23 L1蛋白分子量大小在80kDa处与预期结果相符合，证明成功获得SUMO-23 L1蛋白。

2. SUMO-58 L1重组蛋白SUMO标签的切除

Ulp1 蛋白酶使用Ni-NTA 纯化之后构建酶切反应体系，对SUMO-L1 蛋白进行酶切，以去除SUMO-tag。酶切体系为：Ulp1 蛋白酶与SUMO-L1 蛋白的比例为1:50，酶切体系中包含50 mmol/L 的Tris-HCL、200 mmol/L NaCl 和1 mmol/L的DTT，pH 条件为8.0，酶切体系在30℃下反应3 h 后，对酶切反应体系取样做12% SDS-PAGE 分析。重组SUMO-L1 蛋白与Ulp1 蛋白酶反应后，将酶切反应液通过Ni-NTA 层析柱，将酶切体系中的SUMO-tag、Ulp1蛋白酶与L1 蛋白等各组分相分离，收集到的L1 蛋白通过Amicon® Ultra 离心过滤器进行浓缩以提高蛋白浓度。

结果如图4所示， Ulp1 用Ni 柱纯化后在48 KDa 处有单一条带，纯度约90%（图4A）；Ulp1 将重组SUMO-L1 蛋白酶切后，SDS-PAGE结果显示Ulp1 可将含有SUMO 标签的重组HPV58 L1 蛋白进行特异性切割，经酶切后，HPV58 L1 目的蛋白大小约为58kDa，SUMO 标签大小约为12.4 kDa（图4B）；将酶切体系通过Ni-NTA 层析柱，体系中的SUMO-tag、Ulp1 蛋白酶与L1 蛋白等各组分相分离，收集到的L1 蛋白通过Amicon® Ultra 离心过滤器进行浓缩，蛋白纯度约95%。

3. 血凝试验（Hemagglutination, HA）鉴定重组HPV58 L1蛋白活性

3.1 红细胞制备方法

用灭菌注射器吸取1ml新鲜小鼠血于含有1,000U的肝素（抗凝）的灭菌离心管内中；向上述离心管中加入9ml PBS中以1500r/min离心5min，弃上清液；用10ml PBS重悬血球，2000r/min离心10min，弃上清，如此将红细胞洗涤三次；最后根据所需用量，用PBS配成体积分数1%的小鼠红细胞悬液。

3.2 HA

血凝实验：取96孔微型血凝反应板，用微量移液器吸取PBS 25 μl，从第1孔加到第8孔，每孔25 μl。吸取25 μl纯化的HPV58 L1重组蛋白加入第1孔，充分混匀后从第1孔吸出25 μl，加入第2孔再次充分混匀后，从第2孔吸出25 μl加入第3孔混匀，以此类推，一直倍比稀释至第5孔，第6、7、8孔每孔加入25 μl PBS设置为阴性对照。25 μl 1%小鼠红细胞悬液从第8孔倒加至第1孔且要悬加，震荡混匀；室温下静置40min，拍照并记录实验结果。血凝实验显示纯化的HPV58 L1蛋白有凝集小鼠红细胞的血凝活性，血凝价为1:16（图5）。

实施例四、HPV58 L1重组蛋白的动物实验

1.免疫程序

动物分组：将待免疫的小鼠（6～8 周龄雌性Balb/c 小鼠）分为三组，每组4 只，三组免疫剂量分别为20 μg/只、5 μg/只和NC 组（PBS）。免疫方式：实验中采取皮下多点注射的方法对实验小鼠进行免疫，一共免疫3 次，每次间隔时间为两周。血清样本采集：分别在第0 d、7 d、14 d、21 d、28 d 和36 d 对小鼠进行断尾采血：对小鼠进行断尾后，使用微量移液器吸取小鼠尾端血液10 μL 稀释于990 μL 的PBS 缓冲液中（1:100 稀释），之后对采集到的血液样本进行离心，3000 r/min、10 min，吸取上清即经过1:100 稀释的血清样本，将得到的血清样本做好标记存放于-80℃超低温冰箱。

2. 初步免疫评价

（1）ELISA测定血清效价

用CBS溶液将L1蛋白稀释至浓度为4 μg/mL，每孔100 μL添加到96微孔板中，37℃包被2h。用PBST洗5次，用每孔300 μL添加5%的脱脂奶溶液4℃条件下封闭过夜。将小鼠免疫血清进行2倍梯度稀释作为一抗37℃孵育1 h，稀释度为1:3200～1:204800，用PBS作为阴性对照（NC）。PBST洗5次，每孔100 μL加入HRP-羊抗鼠IgG（1：5000稀释），37℃孵育1 h。PBST洗5次，每孔50 μL加入TMB底物显色液反应5 min，每孔50 μL加入2mol/LH₂SO₄终止反应，读取450 nm下的吸光值。当检测孔的OD₄₅₀值≥阴性NC孔OD₄₅₀值的2.1倍（P/N≥2.1）时，判为阳性孔，该孔所对应的抗体稀释倍数即为抗体的效价。

ELISA结果显示，与PBS组相比，不管是20 μg组还是5 μg组都产生了特异性抗体，并且随着免疫次数的增多和免疫时间推移，特异性抗体水平也都随之升高（图6A）；免疫后的第36天的小鼠血清效价可达1:1.024×10⁵（图6B）。

（2）间接免疫荧光实验（IFA）

将293T细胞以2×10⁴个/孔接种于96孔细胞板。待长至汇合度60%左右，将提前备好的质粒pcDNA3.1-GFP、pcDNA3.1-HPV58 L1分别与Lipofectamine 2000混合，加入无血清DMEM，混匀后静置20 min，吸除细胞培养上清将混合液加入细胞培养板中，6 h后补加完全DMEM培养基。转染48 h后通过观察GFP表达情况判断转染情况，同时转染pcDNA3.1空载作为阴性对照。转染后的细胞用预冷的甲醇固定20 min，用5%脱脂奶37℃封闭1 h，一抗选用用PBS进行1:200稀释后的免疫血清，37℃孵育1h。用PBS免疫小鼠血清作为阴性对照（NC），用PBS代替小鼠血清作为空白对照（BC），二抗用1:100稀释的FITC-羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h，PBS洗3次用倒置荧光显微镜观察细胞形态及荧光强度。

IFA结果显示，对照组GFP蛋白成功表达，说明转染成功（图7A）；而将pcDNA3.1-HPV58 L1转染293T细胞进行瞬时表达后与小鼠免疫血清孵育，也可观察到明显的绿色荧光，说明真核源HPV58 L1可以与小鼠免疫血清发生特异性反应（图7B），表明小鼠经原核表达获得的HPV58 L1蛋白免疫刺激后，其体内可产生特异性抗体。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，或者是对相关步骤、方法及材料进行等同替代，从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学

<120> 编码可溶性HPV58 L1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用

<130> /

<160> 3

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1497

<212> DNA

<213> HPV58L1

<400> 1

atgtccgtgt ggcgtccgtc tgaggccact gtgtacctgc cgccggtgcc ggtgtctaag 60

gttgtaagca ctgatgaata tgtgtctcgc accagcattt attattatgc tggctcttcc 120

cgtctgctgg ctgttggcaa tccatacttc tccatcaaat ctccgaacaa caacaaaaaa 180

gtactggttc cgaaggtatc tggcctgcag tatcgtgtct ttcgtgtgcg tctgccggat 240

cccaacaagt tcggtttccc ggacaccagc ttctacaacc cggataccca acgtctggtc 300

tgggcatgtg taggcctgga aatcggtcgt ggtcagccac tgggtgttgg cgtatctggt 360

catccgtatt tcaacaaatt tgatgacact gaaacctcta accgttatcc ggcacagcca 420

ggttctgata accgtgaatg cctgtctatg gattataaac aaacccaact gtgtctgatt 480

ggctgtaaac cgccgactgg tgagcattgg ggtaaaggtg ttgcctgtaa caacaacgca 540

gctgctactg attgtccgcc actggaactg tttaactcta ttattgagga tggtgacatg 600

gtagataccg gttttggttg catggacttt ggtaccctgc aggctaacaa atctgatgtg 660

ccgattgata tttgtaactc tacctgcaaa tatccagatt atctgaaaat ggcctctgaa 720

ccgtatggtg attctctgtt cttttttctg aggcgtgagc agatgttcgt tcgtcacttc 780

ttcaaccgtg ccggtaaact gggcgaggct gtcccggatg acctgtatat taaaggttcc 840

ggtaacactg cagttatcca atcttctgca ttttttccaa ctccgtctgg ctctatggtt 900

acctctgaat ctcaactgtt taacaagccg tattggctgc agcgtgcaca aggtcataac 960

aacggcattt gttggggcaa tcagctgttc gtgaccgtag ttgataccac tcgtagcact 1020

aacatgaccc tgtgcactga agtaactaag gaaggtacct ataaaaacga taactttaag 1080

gaatatgtac gtcatgttga agaatacgac ttacagttcg tgttccagct gtgcaagatt 1140

accctgactg cagagatcat gacctatatc catactatgg attccaacat tctggaggac 1200

tggcaatttg gtctgacccc gccgccgtct gcctctctgc aggacaccta tcgttttgtt 1260

acctcccagg ctattacttg ccaaaaaacc gcaccgccga aagaaaaaga agatccactg 1320

aacaaatata ctttttggga ggttaacctg aaggaaaagt tttctgcaga tctggatcag 1380

tttccgctgg gtcgtaagtt tctgctgcaa tctggcctga aagcaaagcc gcgtctgaaa 1440

cgttctgccc cgactacccg tgcaccatcc accaaacgca aaaaggttaa aaaataa 1497

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

ttggtctcta ggtatgtccg tgtggcgtc 29

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

ccgctcgagt tattttttaa cctttttgcg t 31

Claims

1.一种编码可溶性人乳头瘤病毒58亚型L1蛋白的基因HPV58L1，其DNA序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种载体质粒pUC-58L1，包括载体质粒pUC57及装载其中的权利要求1所述基因HPV58L1。

3.一种重组质粒pESUMO-58L1，包括载体质粒pE-SUMO及装载其中的权利要求1所述基因HPV58L1。

4.一种表达可溶性HPV58 L1蛋白的重组质粒，含有权利要求1所述基因HPV58L1。

5.权利要求4所述表达可溶性HPV58L1蛋白的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：

（1）基于权利要求1所述基因HPV58L1设计其扩增引物，且其正向引物包含Bsa I限制性内切酶位点、反向引物包括位于终止密码子侧翼的Xho I限制性内切酶位点；

（2）以所述扩增引物PCR扩增基因HPV58L1；

（3）取pESUMO质粒与所得PCR扩增产物分别进行限制性内切核酸酶Bsa I与Xho I双酶切消化，回收空载体质粒pE-SUMO和HPV58L1基因的双酶切产物，用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，得到重组质粒；

（4）将上步所得重组质粒pESUMO-58L1转化大肠杆菌感受态细胞BL21，涂布在Amp⁺/LB固体培养基上培养，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒，测序结果正确的即为表达可溶性HPV58 L1蛋白的重组质粒。

6.根据权利要求5所述重组质粒的构建方法，其特征在于，所述扩增引物的序列如下：

F-58：5’- TT GGTCTC TAGGTATGTCCGTGTGGCGTC -3’，酶切位点：Bas I；

R-58：5’- CCG CTCGAG TTATTTTTTAACCTTTTTGCGT -3’，酶切位点：Xho I。

7.一种可溶性HPV58 L1蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）取权利要求3所述重组质粒pESUMO-58L1接种于Amp⁺/LB液体培养基中培养至OD₄₅₀值至0.75～0.85时，以诱导剂IPTG诱导表达；

8.权利要求1所述基因HPV58L1、权利要求2载体质粒pUC-58L1、权利要求3重组质粒pESUMO-58L1或权利要求7所述可溶性HPV58 L1蛋白在疫苗制备中的应用。