CN108778316B - 糖皮质激素联合聚乙二醇修饰的白介素2治疗呼吸道疾病 - Google Patents
糖皮质激素联合聚乙二醇修饰的白介素2治疗呼吸道疾病 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了糖皮质激素与聚乙二醇(PEG)修饰的白介素2的吸入式药物组合物，用于呼吸道疾病治疗。本发明还提供了聚乙二醇修饰的白介素2在制备增强糖皮质激素对呼吸道疾病的疗效的药物组合物中的应用，以及治疗呼吸道疾病的方法。
Description
技术领域
本发明涉及用于呼吸道疾病治疗的药物组合物，特别涉及糖皮质激素与聚乙二醇(PEG)修饰的白介素2(IL-2)的吸入式药物组合物，本发明还涉及聚乙二醇修饰的白介素2在制备增强糖皮质激素对呼吸道疾病的疗效的药物组合物中的应用，以及治疗呼吸道疾病的方法。
发明背景
随着生活环境的改变，可接触变应原的增加，使得包括哮喘在内的呼吸道过敏性疾病的发病率逐年增加，给发展中国家和发达国家均造成了很大的经济负担，且哮喘的危害涉及各年龄层及各性别，并具有一定的致死率，其预防和治疗成为了一项倍受关注的公共卫生及临床问题[1,2]。
在哮喘的病理过程中，变应原由抗原提呈细胞(APC)提呈给淋巴结中未激活的CD4+T细胞，进一步诱导这些未激活的CD4+T细胞分化为效应T细胞Th2型，其分泌的多种细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13等)可促使嗜酸性粒细胞向炎症部位富集，促使腺体分泌粘液，促使被激活的B淋巴细胞分泌IgE，IgE结合于肥大细胞表面，待过敏原再次进入机体与结合在肥大细胞表面的IgE形成交联，激发肥大细胞分泌一系列引起呼吸道高反应的内容物。长期患病的人群其组织形态改变，气道重塑，形成不可逆性的气道狭窄[3]。目前临床上多使用具有松弛气道平滑肌、扩张气管功效的药物，配合糖皮质激素对哮喘进行控制，需要每天多次长期用药，副作用较明显且易产生耐药。
调节T细胞分为来源于胸腺的天然型调节性T细胞(nTreg)以及在一定强度的抗原刺激下Th0分化而成的诱导型调节T细胞(iTreg)，这些调节T细胞通过与效应T细胞直接接触的杀伤效应，或者分泌包括IL-10、TGF-β等抑炎因子，发挥着免疫调节作用，保护机体不受到自身免疫系统的损伤[3-5]。在哮喘的发病过程中，Treg通过多种机制发挥着重要免疫调节的作用[6]。目前已有证据表明，机体Th2细胞和Treg细胞的失衡是导致哮喘发病的重要机制[1]，且在针对哮喘患者的多项研究中，均发现Th2/Treg比例与哮喘的重症与缓解密切相关[7,8]。
作为全球性的疾病控制和治疗难题，哮喘的传统治疗方法又有其局限性及副作用，迄今为止，还没有一种短期用药而达到长期控制哮喘慢性气道炎症进而抑制气道重塑的治疗方法。目前已有多项研究通过使用1,25-(OH)2VitD3[9]、IL-2/anti-IL-2[10]、甾体类药物[11]或者直接输注Treg[12]的方法，上调机体Treg从而达到对哮喘的控制治疗的目的。上调Treg治疗哮喘方法相较于传统的治疗方法，是从哮喘的发病机制上对疾病进行治疗，用药次数少、疗效时间相对维持较长，但这些方法有的只能作为预防哮喘发病使用，有的在一般的治疗中难以实现，同时这些方法对Treg的上调效应维持时间依然不够理想，且长期使用仍然具有一定的副作用。在我们的前期研究中，已经证明通过腹腔注射糖皮质激素(Dex)联合白介素2，可以长时有效地上调机体Treg比例，缓解哮喘症状，并对其上调机制进行了探究[13]。然而，这种全身治疗上调Treg缓解症状的同时，也改变了自身应有的Th2/Treg比例，打破免疫平衡，有其潜在不利的一面；且用药剂量相对较大，超出人类一般所能承受的用药剂量；如此超大剂量白介素2的体内应用，可引起发热、寒战、造血抑制和严重渗漏综合征，尤其对于哮喘患者难于耐受。
局部用药能够发挥效应的前提条件包括，富集的药物能够在局部与靶标细胞进行密切接触。已有研究结果表明，抗原的提呈、T细胞在炎症部位的富集和持续激活均在气道内完成[14]。因此，呼吸道雾化吸入的药物能够在呼吸道内与免疫调节的对象结合并发挥作用。
发明内容
本发明提供了经呼吸道雾化局部给药的方法，并证明了通过该方便、无创的方法，可以以较小的药物剂量局部上调Treg，以达到长时有效地缓解哮喘的目的。
第一方面，本发明提供了一种吸入式药物组合物，其包含聚乙二醇(PEG)修饰的白介素2和糖皮质激素，以及任选存在的药物学可接受的载体和/或赋形剂。
在一个实施方案中，所述糖皮质激素选自地塞米松(Dex)、布地奈德(Bud)、二丙酸倍氯米松(BDP)、环索奈德、氢化可的松、可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、曲安西龙、倍他米松、丁酸氯倍他松、曲安奈德、氟氢松、糠酸莫米松、氯氟舒松、丙酸氯倍他松、氯氟舒松、卤美他松、双醋二氟松中的一或多种，优选所述糖皮质激素选自地塞米松、布地奈德和二丙酸倍氯米松中的一或多种，优选所述糖皮质激素包含地塞米松、布地奈德和二丙酸倍氯米松，优选所述糖皮质激素是地塞米松、布地奈德和二丙酸倍氯米松的组合。
在另一个实施方案中，所述白介素2(IL-2)是人源IL-2，例如SEQ ID NO.1所示。
在另一个实施方案中，所述PEG修饰为非支链PEG修饰或支链PEG修饰，例如分子量2-60KD的非支链PEG修饰或支链PEG修饰，优选分子量2、4、6、8、10、20、30、40、50或60KD的非支链PEG修饰或支链PEG修饰，优选分子量10或20KD的非支链PEG修饰或分子量20KD的支链PEG修饰。本发明所述PEG修饰可以位于IL-2中任何适合进行PEG修饰的位点，例如在IL-2的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基或N末端α-氨基。在一个实施方案中，所述PEG修饰在IL-2的N端氨基酸残基，例如IL-2的N端的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基。在一个实施方案中，所述PEG修饰在IL-2的N末端α-氨基。所述PEG修饰可以是例如单点修饰或多点修饰。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物配制为干粉组合物的形式，并且任选包括一种或多种适合的稀释剂或载体，例如乳糖、右旋糖酐、甘露醇或葡萄糖，并且优选α-乳糖一水合物。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物配制为加压式计量吸入剂的形式，并且PEG修饰的IL-2(IL-2(PEG))和糖皮质激素都悬浮于或完全地溶解于液体推进剂混合物中。
在另一个实施方案中，PEG修饰的IL-2与糖皮质激素的比例介于1,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素至10,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素之间，例如IL-2(PEG)与糖皮质激素的比例为1,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、2,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、3,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素或4,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、5,000IUIL-2(PEG):1μg糖皮质激素、6,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、7,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、8,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、9,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素或10,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素，优选IL-2(PEG)与糖皮质激素的比例为3,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、4,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、5,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素或6,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素。
在另一个实施方案中，PEG修饰的IL-2的剂量介于3,000IU至100,000IU之间，优选5,000IU至50,000IU之间。例如PEG修饰的IL-2的剂量可以是3,000IU、4,000IU、5,000IU、6,000IU、7,000IU、8,000IU、9,000IU、10,000IU、11,000IU、12,000IU、13,000IU、14,000IU、15,000IU、16,000IU、17,000IU、18,000IU、19,000IU、20,000IU、25,000IU、30,000IU、35,000IU、40,000IU、45,000IU、50,000IU、60,000IU、70,000IU、80,000IU、90,000IU或100,000IU。
在另一个实施方案中，糖皮质激素是Dex，优选PEG修饰的IL-2与Dex的比例为4,000IU IL-2(PEG):1μg Dex，优选PEG修饰的IL-2的剂量介于7,500IU至80,000IU之间，更优选PEG修饰的IL-2的剂量介于12,500IU至50,000IU之间。例如PEG修饰的IL-2的剂量可以是7,500IU、8,000IU、8,500IU、9,000IU、9,500IU、10,000IU、10,500IU、11,000IU、11,500IU、12,000IU、12,500IU、13,000IU、13,500IU、14,000IU、14,500IU、15,000IU、16,000IU、17,000IU、18,000IU、19,000IU、20,000IU、25,000IU、30,000IU、35,000IU、40,000IU、45,000IU或50,000IU。
在另一个实施方案中，糖皮质激素是Bud，优选PEG修饰的IL-2与Bud的比例为5,000IU IL-2(PEG):1μg Bud，优选PEG修饰的IL-2的剂量介于3,500IU至80,000IU之间，更优选PEG修饰的IL-2的剂量介于5,000IU至50,000IU之间。例如PEG修饰的IL-2的剂量可以是3,500IU、4,000IU、4,500IU、5,000IU、5,500IU、6,000IU、6,500IU、7,000IU、7,500IU、8,000IU、8,500IU、9,000IU、9,500IU、10,000IU、10,500IU、11,000IU、11,500IU、12,000IU、12,500IU、13,000IU、13,500IU、14,000IU、14,500IU、15,000IU、16,000IU、17,000IU、18,000IU、19,000IU、20,000IU、25,000IU、30,000IU、35,000IU、40,000IU、45,000IU或50,000IU。
在另一个实施方案中，糖皮质激素是BDP，优选PEG修饰的IL-2与BDP的比例为5,000IU IL-2(PEG):1μg BDP，优选PEG修饰的IL-2的剂量介于3,500IU至80,000IU之间，更优选PEG修饰的IL-2的剂量介于5,000IU至50,000IU之间。例如PEG修饰的IL-2的剂量可以是3,500IU、4,000IU、4,500IU、5,000IU、5,500IU、6,000IU、6,500IU、7,000IU、7,500IU、8,000IU、8,500IU、9,000IU、9,500IU、10,000IU、10,500IU、11,000IU、11,500IU、12,000IU、12,500IU、13,000IU、13,500IU、14,000IU、14,500IU、15,000IU、16,000IU、17,000IU、18,000IU、19,000IU、20,000IU、25,000IU、30,000IU、35,000IU、40,000IU、45,000IU或50,000IU。
第二方面，本发明提供了上述药物组合物，其用于治疗呼吸道疾病，优选所述呼吸道疾病是慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘。
第三方面，本发明提供了聚乙二醇修饰的白介素2在制备增强糖皮质激素对呼吸道疾病的疗效的药物组合物中的应用，其中所述药物组合物任选包含药物学可接受的载体和/或赋形剂。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物为吸入式药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明的呼吸道疾病是慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘。
在另一个实施方案中，所述药物组合物包含糖皮质激素。
在另一个实施方案中，本发明的糖皮质激素选自地塞米松(Dex)、布地奈德(Bud)、二丙酸倍氯米松(BDP)、环索奈德、氢化可的松、可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、曲安西龙、倍他米松、丁酸氯倍他松、曲安奈德、氟氢松、糠酸莫米松、氯氟舒松、丙酸氯倍他松、氯氟舒松、卤美他松、双醋二氟松中的一或多种，优选所述糖皮质激素选自地塞米松、布地奈德和二丙酸倍氯米松中的一或多种，优选所述糖皮质激素包含地塞米松、布地奈德和二丙酸倍氯米松。
在另一个实施方案中，所述白介素2(IL-2)是人源IL-2，例如SEQ ID NO.1所示。
在另一个实施方案中，本发明的PEG修饰为非支链PEG修饰或支链PEG修饰，例如分子量2-60KD的非支链PEG修饰或支链PEG修饰，优选分子量2、4、6、8、10、20、30、40、50或60KD的非支链PEG修饰或支链PEG修饰，优选分子量10或20KD的非支链PEG修饰或分子量20KD的支链PEG修饰。本发明所述PEG修饰可以位于IL-2中任何适合进行PEG修饰的位点，例如在IL-2的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基或N末端α-氨基。在一个实施方案中，所述PEG修饰在IL-2的N端氨基酸残基，例如IL-2的N端的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基。在一个实施方案中，所述PEG修饰在IL-2的N末端α-氨基。所述PEG修饰可以是例如单点修饰或多点修饰。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物配制为干粉组合物的形式，并且任选包括一种或多种适合的稀释剂或载体，例如乳糖、右旋糖酐、甘露醇或葡萄糖，并且优选α-乳糖一水合物。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物配制为加压式计量吸入剂的形式，并且PEG修饰的IL-2和糖皮质激素都悬浮于或完全地溶解于液体推进剂混合物中。
在另一个实施方案中，PEG修饰的IL-2与糖皮质激素的比例介于1,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素至10,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素之间，例如IL-2(PEG)与糖皮质激素的比例为1,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、2,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、3,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素或4,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、5,000IUIL-2(PEG):1μg糖皮质激素、6,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、7,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、8,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、9,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素或10,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素，优选IL-2(PEG)与糖皮质激素的比例为3,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、4,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素、5,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素或6,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素。
在另一个实施方案中，PEG修饰的IL-2的剂量介于3,000IU至100,000IU之间，优选5,000IU至50,000IU之间。例如PEG修饰的IL-2的剂量可以是3,000IU、4,000IU、5,000IU、6,000IU、7,000IU、8,000IU、9,000IU、10,000IU、11,000IU、12,000IU、13,000IU、14,000IU、15,000IU、16,000IU、17,000IU、18,000IU、19,000IU、20,000IU、25,000IU、30,000IU、35,000IU、40,000IU、45,000IU、50,000IU、60,000IU、70,000IU、80,000IU、90,000IU或100,000IU。
在另一个实施方案中，糖皮质激素是Dex，优选PEG修饰的IL-2与Dex的比例为4,000IU IL-2(PEG):1μg Dex，优选PEG修饰的IL-2的剂量介于7,500IU至80,000IU之间，更优选PEG修饰的IL-2的剂量介于12,500IU至50,000IU之间。例如PEG修饰的IL-2的剂量可以是7,500IU、8,000IU、8,500IU、9,000IU、9,500IU、10,000IU、10,500IU、11,000IU、11,500IU、12,000IU、12,500IU、13,000IU、13,500IU、14,000IU、14,500IU、15,000IU、16,000IU、17,000IU、18,000IU、19,000IU、20,000IU、25,000IU、30,000IU、35,000IU、40,000IU、45,000IU或50,000IU。
在另一个实施方案中，糖皮质激素是Bud，优选PEG修饰的IL-2与Bud的比例为5,000IU IL-2(PEG):1μg Bud，优选PEG修饰的IL-2的剂量介于3,500IU至80,000IU之间，更优选PEG修饰的IL-2的剂量介于5,000IU至50,000IU之间。例如PEG修饰的IL-2的剂量可以是3,500IU、4,000IU、4,500IU、5,000IU、5,500IU、6,000IU、6,500IU、7,000IU、7,500IU、8,000IU、8,500IU、9,000IU、9,500IU、10,000IU、10,500IU、11,000IU、11,500IU、12,000IU、12,500IU、13,000IU、13,500IU、14,000IU、14,500IU、15,000IU、16,000IU、17,000IU、18,000IU、19,000IU、20,000IU、25,000IU、30,000IU、35,000IU、40,000IU、45,000IU或50,000IU。
在另一个实施方案中，糖皮质激素是BDP，优选PEG修饰的IL-2与BDP的比例为5,000IU IL-2(PEG):1μg BDP，优选PEG修饰的IL-2的剂量介于3,500IU至80,000IU之间，更优选PEG修饰的IL-2的剂量介于5,000IU至50,000IU之间。例如PEG修饰的IL-2的剂量可以是3,500IU、4,000IU、4,500IU、5,000IU、5,500IU、6,000IU、6,500IU、7,000IU、7,500IU、8,000IU、8,500IU、9,000IU、9,500IU、10,000IU、10,500IU、11,000IU、11,500IU、12,000IU、12,500IU、13,000IU、13,500IU、14,000IU、14,500IU、15,000IU、16,000IU、17,000IU、18,000IU、19,000IU、20,000IU、25,000IU、30,000IU、35,000IU、40,000IU、45,000IU或50,000IU。
第四方面，本发明提供了一种治疗呼吸道疾病的方法，其特征在于经吸入给药给与患者治疗有效量的本发明的聚乙二醇修饰的白介素2和糖皮质激素，例如给予本发明的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明的给药是经口吸入或鼻内吸入，优选通过气溶胶或喷雾施用。
在另一个实施方案中，本发明的呼吸道疾病是慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘。
第五方面，本发明提供了一种制备本发明的药物组合物的方法。
本发明证实，相较于单用糖皮质激素，糖皮质激素与IL-2联合用药起效更快。而与全身用药相比，短期呼吸道局部联合使用糖皮质激素及IL-2能够在较小剂量且不影响机体其它免疫系统的情况下上调Treg，并成功缓解哮喘症状长达至少6周，表明定期使用该方法可望达到解决哮喘慢性气道炎症和气道重塑难题，进一步达到治愈哮喘。由于IL-2和IL-2(PEG)的剂型不同，相较于前者，后者的代谢速率显著降低，药物能够更长效地在局部发挥作用，改变剂型后，达到上调效应的所需剂量明显降低。而采用例如IL-2(PEG):Bud、IL-2(PEG):BDP等剂型能够进一步降低用药剂量至对人体较为安全合适的范围内。联合用药作用下产生的Treg主要为非特异性Treg，能够协助机体对抗由多种变应原带来的气道高敏反应。这一项无创、方便、起效快速、药效维持时间长的新型哮喘治疗方法，一定会给临床患者带来很大的福利。
附图说明
图1局部用药有效性评估。A、造模及用药时间点。B、对照组、单用Dex、单用IL-2及联合用药组肺泡灌洗液中Treg流式检测。C、肺部病理切片影像(20倍镜下)，H&E染色。数据以均数±标准差表示(n＝6～8只每组)。*组与NaCl组比，P<0.05。i.p：OVA抗原腹腔注射致敏；i.n：OVA抗原经鼻滴注激发。
图2固定比例药物最适剂型探究。A、采用IL-2：Dex恒比例不同剂量下Treg上调情况。B、20KD非支链PEG修饰前后IL-2的凝胶电泳图。C、纯化后IL-2(PEG)原液高效液相分子体积排除色谱(HP-SEC)检测。D、PEG-IL-2(即IL-2(PEG))活性检测图谱。E、采用IL-2(PEG)：Dex恒比例不同剂量下Treg上调情况。F、采用IL-2(PEG)：Bud恒比例不同剂量下Treg上调情况。G、IL-2:Dex，IL-2(PEG)：Dex及IL-2(PEG)：Bud三种剂型Treg上调情况比较。H、IL-2:Dex，IL-2(PEG)：Dex及IL-2(PEG)：Bud三种剂型治疗后肺功能测定。I、IL-2(PEG)：BDP治疗后肺功能测定。数据以均数±标准差表示(Treg测定：n＝6～8只每组；肺功能：n＝3只每组)，*组与NaCl组比P<0.05。
图3IL-2(PEG)：Bud剂型不同用药比例治疗后Treg上调水平。固定Bud为2μg搭配不同IL-2(PEG)剂量，数据以均数±标准差表示(n＝6只每组)。*组与NaCl组比P<0.05。
图4IL-2(PEG)：Bud剂型最适比例不同剂量下治疗后Treg上调水平及哮喘治疗指标检测。A、肺泡灌洗液中Treg上调水平。B、单独使用IL-2(PEG)、Bud及不同剂量联合用药治疗后肺功能测定。C、肺部病理切片影像(20倍镜下)，左侧：H&E染色；右侧：PAS染色。数据以均数±标准差表示(Treg测定：n＝6只每组；肺功能：n＝3只每组)。D、10KD非支链PEG修饰的IL-2或20KD支链PEG修饰的IL-2与Bud联合用药治疗后肺功能测定。*组与NaCl组比P<0.05。
图5IL-2(PEG)：Bud局部雾化用药和Dex腹腔注射药效比较。A、造模及用药时间点。B、地塞米松(40μg)腹腔注射3、5、7天与IL-2(PEG)：Bud局部用药三天治疗后肺功能测定。C、肺部病理切片影像(20倍镜下)，左侧：H&E染色；右侧：PAS染色。数据以均数±标准差表示(n＝3只每组)。*组与NaCl组比P<0.05。
图6局部用药IL-2(PEG)：Bud6周后治疗效果评估。A、造模及用药时间点。B、用药6周后肺功能测定。C、肺部病理切片影像(20倍镜下)，左侧：H&E染色；右侧：PAS染色。数据以均数±标准差表示(n＝4只每组)。*组与NaCl组比P<0.05。
图7局部使用IL-2(PEG)：Bud后肺泡灌洗液中Th2细胞及细胞因子测定。A、Th2细胞流式检测。B、细胞因子检测。数据以均数±标准差表示(n＝6只每组)。*组与NaCl组比P<0.05。
图8药物诱导后流式分选出的肺泡灌洗液中iTreg的特异性及非特异性抑制效应。A、iTreg及脾脏中nTreg对OVA刺激下DO10.11小鼠(OVA抗原特异TCR转基因小鼠)脾脏淋巴细胞增殖的抑制效应。B、iTreg及脾脏中nTreg对BALB/c及C57小鼠脾脏淋巴细胞混合反应体系中淋巴细胞增殖的抑制效应。数据以均数±标准差表示(n＝6只每组)。*组与对照组比P<0.05。
图9局部用药治疗后，A、脾脏细胞Th2、Treg流式检测，及B、血清中细胞因子测定。数据以均数±标准差表示(n＝6只每组)。
具体实施方式
本发明并不限于本文所述的具体方法、方案、试剂等，因为这些可以变化与调整。本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的而不是为了限制本发明的范围。除非另有定义，本文所用的所有科技术语均具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。
在详细描述本发明的示例性实施方案之前，对理解本发明非常重要的术语给出定义。
本发明的“糖皮质激素”可以是任何合成的或天然存在的糖皮质激素。可以用于本发明的糖皮质激素例如是可用于治疗呼吸道疾病的糖皮质激素，其实例包括地塞米松(Dex)、布地奈德(Bud)、二丙酸倍氯米松(BDP)、环索奈德、氢化可的松、可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、曲安西龙、倍他米松、丁酸氯倍他松、曲安奈德、氟氢松、糠酸莫米松、氯氟舒松、丙酸氯倍他松、氯氟舒松、卤美他松、双醋二氟松、莫米松、氯替泼诺(loteprednol)、依替泼诺(etiprednol)、曲安西龙(triamcinolone)、氟尼缩松(flunisolide)、氟莫奈德(flumoxonide)、罗氟奈德(rofleponide)、布替可特(butixocort)、替泼尼旦(tipredane)等等。
在本说明书的上下文中，除非另有说明，任何对于“糖皮质激素”的称谓都包括可以从所述糖皮质激素生成的所有活性盐、溶剂化物或衍生物。糖皮质激素可能的盐或衍生物的实例包括：钠盐、磺基苯甲酸盐、磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、丙酸盐、二氢磷酸盐、棕榈酸盐、特戊酸盐、富马酸盐和可药用酯(例如C1-C6烷基酯)。糖皮质激素及其活性盐或衍生物也可以为它们的溶剂化物形式，例如水合物形式。
本发明的“IL-2”是指任何来源的IL-2，包括哺乳动物来源例如人类、小鼠、大鼠、灵长动物和猪，并且可以是天然的或通过重组或合成技术获得的，包括通过微生物宿主生产的重组IL-2多肽。IL-2可以是或包含天然多肽序列，或者可以是天然IL-2多肽的活性变体。优选地，IL-2多肽或活性变体源自于人类来源，并包括重组人源IL-2，特别是由微生物宿主生产的重组人源IL-2。
在优选实施方式中，本发明使用人源IL-2或其活性变体，更优选地是通过重组生产的。人源IL-2的核苷酸和氨基酸序列分别公开在例如Genbank ref3558或P60568中，例如本发明所用人源IL-2的序列如SEQ ID NO.1(5'-APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT-3')所示。如无特别说明，本发明使用的均为人源IL-2，并且是基本上纯的形式，例如纯度为95％或以上，更优选地96、97、98或99％纯。IL-2可以以单体蛋白或多体蛋白形式使用。
本发明的“呼吸道”即气道，其连通到肺泡，构成肺。本发明的“呼吸道疾病”表示与呼吸系统相关的疾病或病症。例子包括，但不限于气道炎症、过敏、呼吸障碍、囊性纤维化(CF)、过敏性鼻炎(AR)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、癌症、肺高血压、肺部炎症、支气管炎、气道阻塞、支气管收缩、微生物和病毒感染，例如SARS。
COPD是慢性疾病，其特征在于气道阻塞和降低的来自肺的最大呼气流量，其表现为持续性每日症状，例如呼吸短促(呼吸困难)和进行日常活动或用力的能力的限制。此外，有导致逐日症状的恶化和活动限制的疾病状态的周期性加重，并且由于恶化的症状/限制的严重性还能导致患者住院治疗。此外，在几年时间存在肺功能的逐渐下降(疾病发展)。
哮喘是慢性疾病状态，其特征在于广泛、可变和可逆的气流阻塞。症状包括咳嗽、气喘、呼吸急促和/或胸部憋闷感。哮喘发作通常由暴露于引发剂如花粉、灰尘或其它过敏原而导致，其导致气道收缩(支气管收缩)。应当理解患有疾病状态如哮喘的个体可能时而不同地表现没有明显症状的疾病状态，或可能遭受周期性侵袭，在这期间表现症状或可能经历疾病状态的加重或恶化。
本发明的“预防”表示在受试对象患上疾病之前或早先诊断出的病症恶化以前进行的预防性治疗，从而使得受试对象能避免、防止或降低所患疾病的症状或相关疾病的可能性。该受试对象可是患疾病或早先诊断出的病症恶化的风险增加的对象。
本发明的“治疗”、“治疗的”或“治疗性”表示被给予这种治疗方法的受试对象表现出疾病或其它病症的症状可能降低的方法。在本申请说明书的上下文中，除非另有相反的具体说明，术语“治疗”意图包括预防现有疾病状态的这种周期性侵袭或加重。这类治疗可被称为“维持治疗”或“维持疗法”。术语“治疗的”和“治疗地”也可相应地解释。
术语“药物学可接受的载体”或“赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和作用剂的使用为本领域公知的。本发明所用活性成分，例如糖皮质激素和聚乙二醇修饰的白介素2可以与一种或多种可药用添加剂、稀释剂或载体混合使用。适合的稀释剂或载体的实例包括乳糖(例如一水合物)、葡聚糖、甘露糖醇或葡萄糖。
本发明的药物组合物适宜地以溶液剂、混悬剂、气雾剂或干粉制剂的形式吸入给药(例如局部给药至呼吸道)。给药可以是经口吸入或鼻内吸入。优选通过产生由粉末或液体的鼻部、经呼吸或可吸入颗粒组成的气溶胶或喷雾施用。含有活性成分的药物组合物经呼吸或可吸入颗粒被受试对象吸入，即经吸入或鼻部施用进入呼吸道。制剂可含有可呼吸或可吸入的药物组合物的液体或固体颗粒，本发明的所述颗粒包括体积足够小从而可在吸入后通过口和喉并继续进入支气管和肺泡的经呼吸或可吸入颗粒。颗粒的直径大体上约是0.05、0.1、0.5、1、2、4、6、8、10微米。特别是直径约0.5μm到小于5μm的可经呼吸或可吸入的颗粒。气溶胶或喷雾中不可吸入大小的颗粒易沉积在喉咙处被吞咽。因此，气溶胶中不可呼吸颗粒的数量宜最少。就鼻部施用而言，优选的颗粒大小范围约是8、10、20、25、35、50、100、150、250、500μm(直径)以保证能留在鼻腔内。液体制剂可喷进呼吸道(鼻部)，特别是施用于新生儿和婴儿。
本发明的活性成分优选地适合于从干粉吸入器、计量吸入器或雾化器中一起或分别给药。干粉吸入器、计量吸入器和雾化器是公知的，多种这类装置是可获得的。
干粉吸入器可以用于单独地给予活性成分或者给予活性成分与可药用载体的组合，在给予活性成分与可药用载体的组合情况时，以微细粉碎的粉末或者有序混合物的形式给药。干粉吸入器可以是单剂量或多剂量，并且可以采用干粉或含有粉末的胶囊。
计量吸入器可以用于给予分散在适合的推进剂中的活性成分，其中含有或没有额外的赋形剂(例如乙醇)、表面活性剂、润滑剂、抗氧化剂或稳定剂。适合的推进剂包括烃、氯氟碳和氢氟烷(例如七氟烷)推进剂，或者所述推进剂的任意混合物。优选的推进剂是P134a和P227，它们各自可以单独使用或者与其他推进剂和/或表面活性剂和/或其他赋形剂组合使用。也可以使用单位剂量或多剂量制剂形式的雾化含水混悬剂，或者优选为溶液剂，其中含有或没有适合的pH和/或张力调节剂。
当将各活性成分一起或分别经由雾化器给药时，它们可以是雾化的含水混悬剂或溶剂形式，其中含有或没有适合的pH或张力调节剂，为单剂量或多剂量装置。
本发明所用的术语“治疗有效量”指包含药物需要量的吸入制剂的量，当该药量递送至患者时能起到疗效，例如减轻、预防或抑制要治疗的特定病症。除非另有明确不同限定之外，本发明所用活性成分的量是指单位剂量。可以通过DPI装置一次或多次喷射来递送治疗有效量。因此，根据药物性质和要治疗病症的性质及严重度，每天每数小时进行一次或多次喷射是必需的，持续许多天、周、月等等。
治疗有效量很大程度上取决于药物的性质、患者的情况和要治疗病症的性质及严重度。治疗有效量的范围可以在低至1ng/kg，例如当治疗局部病症如哮喘时使用有效的活性物质，和多达10mg/kg之间，更特别是剂量范围在20ng/kg至1mg/kg之间。该治疗剂量应在随着在DPI装置上的包装或标签上指明。
本发明相应涉及包含本发明制剂的这类多剂量吸入器。多剂量吸入器可以包含干粉贮器，该贮器包含数十或甚至数百个治疗有效量。
本发明的药物组合物可以散装和单位剂量的形式以及本领域已知可打开或可穿孔的植入物、胶囊、泡罩包装或药筒的形式提供。本发明也提供了试剂盒，该试剂盒装有递送装置、在独立容器中装有本发明的药物组合物与任选的其它合适添加剂，例如其它治疗性化合物、赋形剂、表面活性物质(用作治疗性药物以及制剂成分)、抗氧化剂、调味与着色剂、填料、挥发性油、缓冲剂、分散剂、表面活性物质、抗氧化剂、调味剂、膨胀剂、推进剂和防腐剂，以及使用试剂盒成分的使用说明书。
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。应当理解实施例和图不应理解为限制性的。本领域技术人员能够清楚地设想本文列出的原理的进一步的修改。
实施例
实施例1：哮喘小鼠造模
采用6～8周龄的雌性BALB/c小鼠(购于SLAC实验动物有限责任公司)造哮喘模型，于第1天及第8天腹腔注射100μg卵清蛋白(OVA)(Sigma)及2mg注射用Al(OH)3(Sigma)致敏，于第9～14天每日经鼻滴注20μl的2％OVA进行激发(图1A)。
实施例2：地塞米松联合IL-2用药上调气道中Treg并缓解呼吸道炎症反应。
实施例1中的哮喘小鼠模型于第12～14天滴鼻激发的同时进行药物干预。具体给药方式为采用7％水合氯醛(生工生物)麻醉小鼠后采用雾化定量给药装置(
-Model IA-1B)进行肺部雾化定量给药，固定给药体积为25ul/只，通过浓度的高低来调节给药剂量。于第15天进行相关指标检测。
肺泡灌洗液收集。颈椎脱臼处死小鼠，用300ul的PBS溶液经气管切开口对小鼠进行肺泡灌洗液冲洗，反复3次，得到约900ul的肺泡灌洗液。以2,000rpm离心5分钟，收集细胞进行流式检测，用商业化ELISA试剂盒检测上清中的IFN-γ、IL-4、IL-10及IL-13(R&DCorp)。
流式细胞检测。使用流式细胞术对肺泡灌洗液中收集的细胞以及脾脏细胞中的Treg进行流式检测，其中CD4为FICT标记、FoxP3为APC标记(eBioseicnce)，其中CD4为细胞表面标志物，可直接标记，FoxP3为胞内转录因子，细胞打孔固定后标记[15]。检测脾脏中的Th2细胞时，采用Per-CP标价的Gate3抗体(eBioseicnce)，细胞打孔固定后标记。所有结果通过FlowJo软件(Treestar)进行分析。
肺部组织病理学。将鼠肺以10％福尔马林进行固定后，以石蜡进行包埋、切片，分别进行H&E(Merck&Co,Inc)及PAS(Sigma)染色后，在20倍镜下镜检。
在我们的前期研究中，400,000IU IL-2联合100μg地塞米松作为最佳剂量，可以有效地上调机体Treg，缓解哮喘小鼠肺部组织病理表现[13]。采用与之前研究相同的药物比例(4,000IU IL-2：1μg Dex)，我们尝试采用50,000IU IL-2(厦门特宝生物工程股份有限公司)联合1.25μg Dex对哮喘小鼠进行呼吸道局部雾化给药治疗，可以观察到肺泡灌洗液中Treg明显上调(p<0.05，图1B)，肺部组织病理片显示肺部炎症的病理表现得到缓解，而单独使用相同剂量的任何一种药物，均无法达到同样的效果(图1B，C)，证明了联合用药的有效且该效果不是某单一一种药物所产生的。
实施例3：联合用药具有剂量依赖性，改良后的IL-2(PEG)联合布地奈德(Bud)在较小剂量下可以发挥抗炎作用。
考虑到局部用药时药物在肺部的浓度较高，最佳剂量不同于全身用药，之前研究成果表明[13]，联合用药具有剂量依赖性。因此，我们对局部用药的剂量依赖性及最适剂量进行探究。按照实施例1方式进行造模，同时按照实施例2方式进行给药和Treg检测，在一定范围内随着药物浓度的增高，其上调Treg幅度逐渐增加，之后效用开始减弱，符合前期体内研究结果。其中50,000IUIL-2：12.5μg Dex和75,000IU IL-2：18.8μg Dex两个剂量均可有效上调气道中Treg(p<0.05，图2A)。
虽然能够有效上调Treg，但50,000IU IL-2剂量依旧较大(体重60kg成人需用药1500万IU白介素2)，在实际治疗中，可能由于高剂量IL-2引发渗漏综合征而导致肺水肿以及哮喘症状加重等风险，且其配伍的糖皮质激素剂量也相应较高，同样可能带来由糖皮质激素所导致的不良反应。
已经证明，对大分子药物进行PEG修饰，不仅可以降低药物抗原性，还能够延长药物半衰期，增加药物在体内驻留时间，从而提升药物疗效[16]。目前临床应用PEG修饰的药物一般为了达到长期药效作用。而在在本实验中，是为了降低药物剂量，以达到适合人体使用的剂量，并不用延长药物作用时间(本研究只需要3天)。为了证实能否利用PEG修饰的方法使药物驻留在气道腔内局部而减少其它组织分布，我们采用了分子量20KD非支链PEG修饰的IL-2，替换普通IL-2，进行了剂量探究，以期利用PEG驻留的特点，使其在气道短时间达到较高的局部浓度。本发明中如无特别说明，均使用分子量20KD非支链PEG修饰的IL-2。
IL-2(PEG)的制备。IL-2(序列如SEQ ID NO.1所示)替换缓冲液为醋酸醋酸钠缓冲液(pH值4～6)，与M-AlD-20kD(北京键凯科技有限公司)非支链PEG按比例混匀(质量比：1：2～1：6)，氰基硼氢化钠还原，2-10℃反应3-18小时，得IL-2(PEG)粗品。IL-2(PEG)粗品经阳离子交换层析，醋酸醋酸钠缓冲体系下初步分离，收集目的蛋白峰进行反相层析，用乙腈三氟乙酸体系梯度洗脱，收集目的蛋白峰用阳离子交换层析，醋酸醋酸钠缓冲体系下浓缩，收集目的蛋白峰，最后经超滤替换成醋酸醋酸钠缓冲液，即得IL-2(PEG)原液。
另制备10kD非支链PEG修饰的IL-2和20kD支链PEG修饰的IL-2，工艺流程与制备20kD非支链PEG修饰的IL-2(PEG)一致。
选择的PEG类型主要修饰位点为肽链的N端，经20kD非支链PEG修饰后，IL-2的分子量由15kD上升至35kD(图2B)，且纯度较高(图2C)。经CTLL-2细胞法检测活性，证实PEG修饰的IL-2与IL-2工作标准品比活性相当(图2D)。
我们意外发现，更换IL-2(PEG)后，联合用药在一个更低的IL-2活性单位(12,500IU IL-2(PEG)+3.13μg Dex)的剂量下即可发挥上调Treg的作用(图2E)。由于Dex不是常规的哮喘治疗的雾化吸入激素，其分子颗粒不利于药物在局部起效且容易入血，故将Dex更换为一种临床常见的哮喘局部治疗糖皮质激素Bud，可以观察到起效剂量进一步降低至5,000IU IL-2(PEG)+1.25μg Bud(图2F)。
在对三种不同的药物搭配方式上调Treg的综合分析中，可以看到Treg上调幅度主要与IL-2剂量相关，IL-2剂量较大时，Treg上调比例较高，而修饰的IL-2(PEG)及呼吸道局部起效快的糖皮质激素Bud，则协助降低起效浓度(图2G)。上调幅度由IL-2剂量决定，相应糖皮质激素的用量由两者的比例确定，该实验的比例是根据前期体内用药探索得出的[13]，然而只能两药协同作用下才能上调Treg。由于Treg起调节免疫作用，只要有上调，即可产生效果。
接下来，选用50,000IU IL-2+12.5μg Dex，12,500IU IL-2(PEG)+3.13μg Dex以及5,000IU IL-2(PEG)+1.25μg Bud三种剂型的起效剂量治疗哮喘小鼠，并进行肺功能测定。
肺功能测定。用2％戊巴比妥钠麻醉小鼠后，分别用3.125mg/ml、6.25mg/ml以及12.5mg/ml的PBS配制的乙酰甲胆碱(Sigma)对小鼠进行呼吸道激发试验，并对气道阻力曲线进行描记、分析(FinePoint NAM)。采用BUXCO气道阻力和肺顺应性系统(BUXCOElectronics)完成测定。
可以观察到，尽管剂量不同且Treg上调幅度不同，但均可以看到气道顺应性的改善，除了50,000IU IL-2+12.5μg Dex组小鼠，其余配伍方式均可看到显著性差异，且IL-2(PEG)+Bud剂型用药剂量更小而改善气道阻力效果更加显著(p<0.05,图2H)。
另外，当更换为另一种临床常见的哮喘局部治疗糖皮质激素BDP时，5,000IU IL-2(PEG)+1μg BDP的剂型也能显著改善气道阻力(*组与NaCl组比，p<0.05,图2I)。
实施例4：IL-2(PEG)+Bud新剂型联合用药最佳比例。
尽管IL-2(PEG)+Bud能够有效上调Treg，并缓解哮喘，然而，其作用范围较窄(图2G)。IL-2(PEG)相较于传统IL-2，具有抗原性低，药物易驻留局部的特点[16]；而Bud相较于Dex的呼吸道局部用药，具有快速达到致病部位、起效快的特点[17]。另外，由于给药方式的改变，药物浓度、代谢与之前均有差异。因此，相对于之前的全身用药探索出来的最佳比例剂型，新剂型的最适用药比例应存在差异。实施例3证明了IL-2(PEG)+Bud疗效最佳，然而其有效范围较窄，推断这可能由于药物比例不适导致。
按照实施例1方式进行造模，同时按照实施例2方式进行给药和Treg检测，固定Bud为2μg，分别与2,500、5,000、10,000或20,000IU IL-2(PEG)联合使用，我们得出10,000IUIL-2(PEG)搭配2μg Bud(5,000IU IL-2(PEG):1μg Bud)能够最大幅度地上调气道中Treg，为最佳用药比例(p<0.05，图3)。
实施例5：IL-2(PEG)+Bud新剂型最适比例上调Treg有效范围广，小剂量即可发挥治疗作用。
按照实施例1方式进行造模，按照实施例2方式进行给药、Treg检测和组织病理学分析，并同时按照实施例3方式进行肺功能测定，采用最适比例(5,000IU IL-2(PEG):1μgBud)的大剂量(50,000IU IL-2(PEG):10μg Bud)，中剂量(25,000IU IL-2(PEG):5μg Bud)和小剂量(5,000IU IL-2(PEG):1μg Bud)对哮喘模型小鼠连续用药3天后，分析肺泡灌洗液中的细胞，可以看到三种剂量均可有效上调Treg(p<0.05，图4A)，而当再减小剂量时(2,500IU IL-2(PEG):0.5μg Bud)，上调效应消失。在肺功能检测和肺部组织病理学镜检中，可以观察到能够上调Treg的三个剂量均可以改善肺部病理症状以及气道顺应性和气道阻力(p<0.05，图4B、C)。而2,500IU IL-2(PEG):0.5μg Bud不能上调Treg和不能缓解气道阻力同步，进一步证明Treg上调与缓解气道阻力的治疗效应相关。
为了确定不同分子量的PEG修饰的IL-2与糖皮质激素联合用药的效果，分别采用实施例2涉及的10KD非支链PEG修饰的IL-2和20KD支链PEG修饰的IL-2进行实验。20,000IUPEG修饰后的IL-2与4μgBud联合使用，对哮喘小鼠连续用药3天后，可以看到气道阻力降低，表明治疗有一定的效果(p<0.05，图4D)。由此说明，10kD、20kD非支链PEG修饰的IL-2及20kD支链PEG修饰的IL-2对哮喘均有治疗效果。
实施例6：IL-2(PEG)：Bud局部雾化用药和Dex腹腔注射相比，起效迅速且疗效显著。
哮喘模型小鼠的造模及用药。采用同实施例1小鼠造哮喘模型，于第1天及第8天腹腔注射100μg卵清蛋白(OVA)(Sigma)及2mg注射用Al(OH)3(Sigma)致敏，于第9～18天每日经鼻滴注20μl的2％OVA进行激发。其中依据实验目的，分别于12～18、14～18以及16～18天进行40μg Dex腹腔注射或25,000IU IL-2(PEG)+5μg Bud雾化给药。
按照实施例2方式进行给药和组织病理学分析，并同时按照实施例3方式进行肺功能测定。临床上常采用注射Dex的方法治疗包括哮喘在内的呼吸道过敏性疾病。小鼠于第二次腹腔注射的第二天起连续激发10天，分别从激发后的第4、6、8天开始用药(图5A)。按照每只小鼠40μg Dex的剂量(相当60kg体重成人12mgDex，属哮喘平喘剂量)连续腹腔注射3天或5天，均不能缓解哮喘小鼠气道阻力，至少需要连续7天的腹腔注射，才能够对哮喘发挥治疗作用。
而一个较小剂量的呼吸道局部雾化治疗(25,000IU IL-2(PEG)+5μg Bud)(用药方式同图5A)仅用药三天，即可发挥达到相同水平的治疗效应(图5B、C)。
实施例7：呼吸道局部联合用药能够维持至少6周的治疗效应。
哮喘模型小鼠的造模及用药。采用同实施例1小鼠造哮喘模型，于第1天及第8天腹腔注射100μg卵清蛋白(OVA)(Sigma)及2mg注射用Al(OH)3(Sigma)致敏，于第9～18天每日经鼻滴注20μl的2％OVA进行激发。于造模后第12～14天进行药物干预，6周后再次采用20μl的2％OVA连续激发三天。联合用药(联合药物及比例和剂量均与实施例6相同)在呼吸道局部雾化给药三天，间隔六周后再次激发三天(图6A)，在对小鼠的肺功能测定中，可以观察到，相较于仅用生理盐水进行治疗给药的小鼠(该组表现出较差的气道顺应性)，联合用药组小鼠的虽然在较低浓度乙酰甲胆碱的激发下，肺功能相对健康小鼠较差，但在12.5mg/ml乙酰甲胆碱的激发下，其肺功能基本与健康组小鼠持平。肺部组织病理表现也同样说明了药物治疗的效应至少能够维持6周(图6B、C)。并且长期效果与短期效果相似。
实施例8：联合用药的作用机制在于相对下调Th2细胞，同时上调的Treg可通过分泌抗炎因子发挥免疫调控作用。
按照实施例1方式进行造模，按照实施例2方式进行给药(联合药物及比例和剂量均与实施例6相同)、Th2检测和细胞因子检测。作为一种促使哮喘发病的关键效应T细胞，我们对联合用药后小鼠肺泡灌洗液细胞中的Th2细胞(CD4+gata3+)也进行了分析，发现联合用药后，Treg细胞升高的同时，Th2的比例出现了明显的下调(图7A)，证明联合用药在升高Treg的同时，调节了Th2/Treg比例这一导致哮喘发病的关键因素，从发病机制上对哮喘进行了治疗[1,7]。分析肺泡灌洗液中的细胞因子，诱导B细胞分泌IgE抗体的致病细胞因子IL-4在联合用药后出现下调，而调控免疫平衡的细胞因子IFN-γ及IL-10则在用药后升高。此外，促使粘液分泌的IL-13在两组中并没有明显的差异，表明其不是联合用药发挥哮喘治疗机制的关键(图7B)。
实施例9：体外Treg抑制实验表明，联合用药诱导产生的Treg为非特异性Treg。
脾脏淋巴细胞的收集。无菌条件下取小鼠脾脏组织，在PBS中进行研磨后，通过单细胞筛(BD)，收集单个细胞。离心后去除PBS，用红细胞裂解液(天根)进行裂红处理后，再次使用PBS进行洗涤。用1640培养基(Gibco)重悬后即得到脾脏细胞悬液。
体外Treg抑制实验。按照实施例1方式进行造模，按照实施例2方式进行给药(联合药物及比例和剂量均与实施例6相同)。采用CD4+CD25+流式分选试剂盒分离DO10.11小鼠(OVA特异TCR转基因小鼠)脾脏中的淋巴细胞。无菌采集哮喘小鼠用药后的肺泡灌洗液，使用流式分选的方法获得其中的Treg，每只小鼠约可获得105细胞量。在分离出的DO10.11小鼠脾脏淋巴细胞的培养体系中加入OVA，另外，分别加入健康BALB/c小鼠脾脏细胞及药物治疗后哮喘小鼠肺泡灌洗液中分选出的Treg，在含10％血清的1640培养基中培养24小时后，进行CFSE染色，测定细胞增殖。
结果表明，在DO10.11小鼠脾脏淋巴细胞的培养体系中加入OVA可以明显的促使效应T细胞增殖。而无论是加入未致敏小鼠脾脏细胞中分选出的nTreg，抑或哮喘模型小鼠联合用药后产生的Treg，均能够有效地抑制这种特异性抗原所激发的T细胞增殖(图8A)。
在96孔板上构建淋巴细胞反应体系，每孔中约105雌性BALB/c小鼠脾脏细胞，其中加入约105丝裂霉素处理后的C57BL/6小鼠脾脏细胞刺激其增殖，构成混合淋巴细胞反应体系。分别加入健康BALB/c小鼠脾脏细胞及药物治疗后哮喘小鼠肺泡灌洗液中分选出的Treg，在含10％血清的1640培养基中培养24小时后，进行CFSE染色，测定细胞增殖。
结果表明，无论是加入未致敏小鼠脾脏细胞中分选出的nTreg，抑或哮喘模型小鼠联合用药后产生的Treg，均具有类似的抑制淋巴细胞活化增殖的效果(图8B)。
实施例10：局部用药对全身无影响。
在我们的前期研究中，全身用药能够上调脾脏细胞中Treg，可能导致对自身免疫稳态的影响[13]。按照实施例1方式进行造模，按照实施例2方式进行给药(联合药物及比例和剂量均同实施例6)后收集脾脏细胞，我们分析了哮喘模型小鼠用药及不用药条件下脾脏细胞中Treg和Th2的比例，未见显著性差异(P>0.05，图9A)。此外，两组小鼠血清中几种在肺泡灌洗液中存在差异的细胞因子也同样未见显著性差异(p>0.05，图9B)。
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Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
Claims (32)
1.聚乙二醇(PEG)修饰的白介素2(IL-2)在制备增强糖皮质激素对呼吸道疾病的疗效的吸入式药物组合物中的应用，其中所述PEG修饰在IL-2的N端，其中所述药物组合物包含糖皮质激素，以及任选包含药物学可接受的载体和/或赋形剂。
2.权利要求1的应用，其中所述糖皮质激素选自地塞米松(Dex)、布地奈德(Bud)、二丙酸倍氯米松(BDP)、环索奈德、氢化可的松、可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、曲安西龙、倍他米松、丁酸氯倍他松、曲安奈德、氟氢松、糠酸莫米松、氯氟舒松、丙酸氯倍他松、氯氟舒松、卤美他松、双醋二氟松中的一或多种。
3.权利要求1的应用，其中所述糖皮质激素选自地塞米松、布地奈德和二丙酸倍氯米松中的一或多种。
4.权利要求1的应用，其中所述糖皮质激素为地塞米松、布地奈德和二丙酸倍氯米松。
5.权利要求1的应用，其中所述白介素2(IL-2)是人源IL-2。
6.权利要求5的应用，其中所述白介素2(IL-2)如SEQ ID NO.1所示。
7.权利要求1-6任一项的应用，其中所述PEG修饰为非支链PEG修饰或支链PEG修饰。
8.权利要求1-6任一项的应用，其中所述PEG修饰为分子量2-60KD的非支链PEG修饰或支链PEG修饰。
9.权利要求1-6任一项的应用，其中所述PEG修饰为分子量2、4、6、8、10、20、30、40、50或60KD的非支链PEG修饰或支链PEG修饰。
10.权利要求1-6任一项的应用，其中所述PEG修饰为分子量10或20KD的非支链PEG修饰或分子量20KD的支链PEG修饰。
11.权利要求1-6任一项的应用，其中所述药物组合物配制为：
(1)干粉组合物的形式，任选包括一种或多种适合的稀释剂或载体；或者
(2)加压式计量吸入剂的形式，并且PEG修饰的IL-2和糖皮质激素都悬浮于或完全地溶解于液体推进剂混合物中。
12.权利要求11的应用，其中所述稀释剂或载体为乳糖、右旋糖酐、甘露醇或葡萄糖。
13.权利要求11的应用，其中所述稀释剂或载体为α-乳糖一水合物。
14.权利要求1-6任一项的应用，其中PEG修饰的IL-2与糖皮质激素的比例介于1,000IU
IL-2(PEG):1μg糖皮质激素至10,000IU IL-2(PEG):1μg糖皮质激素之间。
15.权利要求14的应用，其中PEG修饰的IL-2与糖皮质激素的比例介于3,000IUIL-2(PEG):1μg糖皮质激素之间。
16.权利要求14的应用，其中PEG修饰的IL-2与糖皮质激素的比例介于4,000IUIL-2(PEG):1μg糖皮质激素之间。
17.权利要求14的应用，其中PEG修饰的IL-2与糖皮质激素的比例介于5,000IUIL-2(PEG):1μg糖皮质激素之间。
18.权利要求14的应用，其中PEG修饰的IL-2与糖皮质激素的比例介于6,000IUIL-2(PEG):1μg糖皮质激素之间。
19.权利要求1-6任一项的应用，其中PEG修饰的IL-2的剂量介于3,000IU至100,000IU之间。
20.权利要求19的应用，其中PEG修饰的IL-2的剂量介于5,000IU至50,000IU之间。
21.权利要求1-6任一项的应用，其中
(1)所述糖皮质激素是Dex；或者
(2)所述糖皮质激素是Bud；或者
(3)所述糖皮质激素是BDP。
22.权利要求21的应用，其中PEG修饰的IL-2与Dex的比例为4,000IU IL-2(PEG):1μgDex。
23.权利要求21的应用，其中(1)中PEG修饰的IL-2的剂量介于7,500IU至80,000IU之间。
24.权利要求23的应用，其中PEG修饰的IL-2的剂量介于12,500IU至50,000IU之间。
25.权利要求21的应用，其中PEG修饰的IL-2与Bud的比例为5,000IUIL-2(PEG):1μgBud。
26.权利要求21的应用，其中(2)中PEG修饰的IL-2的剂量介于3,500IU至80,000IU之间。
27.权利要求26的应用，其中PEG修饰的IL-2的剂量介于5,000IU至50,000IU之间。
28.权利要求21的应用，其中PEG修饰的IL-2与BDP的比例为5,000IUIL-2(PEG):1μgBDP。
29.权利要求21的应用，其中(3)中PEG修饰的IL-2的剂量介于3,500IU至80,000IU之间。
30.权利要求29的应用，其中PEG修饰的IL-2的剂量介于5,000IU至50,000IU之间。
31.权利要求1-6任一项的应用，其中所述呼吸道疾病是慢性阻塞性肺病(COPD、哮喘和过敏性鼻炎。
32.权利要求1-6任一项的应用，其中所述药物组合物是通过气溶胶或喷雾施用的吸入式药物。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1262473 Country of ref document: HK |
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| GR01 | Patent grant | ||
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