CN108707641A - 从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法：首先将洗净的鱼鳞放入盐酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液浸泡，浸泡结束后烘干待用，然后将经过预处理的鱼鳞使用酸性浸泡剂溶胀，水洗至中性，沥干后粉碎，之后加入蒸馏水进行热水抽提，抽提结束后真空抽滤除杂，冷冻干燥得到鱼鳞胶原蛋白粉，最后将活化培养后的乳酸菌接种到含有鱼鳞胶原蛋白粉的发酵液中进行培养发酵，结束后过滤、离心，取上清液蒸发浓缩，即制得鱼鳞胶原蛋白多肽。本发明制备方法简单易行、反应条件温和、提取效率高、成本低、便于商业化，所制备的鱼鳞胶原蛋白多肽得率和纯度高，分子量小，生物活性好，亲水性强，可被广泛应用于化妆品、保健食品和医药制品等领域。

Description

从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法。

背景技术

胶原蛋白是动物细胞合成的一种天然生物高分子，作为细胞外基质中的重要成分几乎存在于所有组织内，约占动物总蛋白的30%，胶原蛋白具有高度抗延伸能力，使得皮肤等结缔组织得以维持一定的结构并具有特殊的机械力学性质以实现支撑和保护细胞、组织和机体功能，对细胞和组织的结构与性能等方面十分关键。

鱼胶原蛋白多肽是一种功能食品或保健品原料，许多研究表明鱼胶原蛋白多肽中存在大量的生物活性组分，包括具有抗氧化、抑制ACE活性、抗溃疡、抑制关节炎、提高免疫力、增强骨密度以及预防骨质疏松等生物活性的多肽。

近几年来，随着人们生活水平的提高，人们对水产资源需求的多样性及实用性逐渐提高，从而促进我国水产加工业的飞速发展。但是，在水产加工业高速发展的同时会产生大量的鱼下脚料，例如鱼皮、鱼鳞、内脏、鱼头等，这些下脚料约占原料鱼的40-50%，其中约5%是鱼鳞，鱼鳞中含有人体所需的多种营养物质，除含有大量钙质，还含有大脑生长活动不可缺少的磷脂质、磷蛋白以及其它生命活动所需物质，如鱼鳞中含有丰富的胶原蛋白，占20-40%，将其作为新型的胶原蛋白资源，具有很高的开发和利用价值。

现有技术如授权公告号为CN 103045706 B的中国发明专利，公开了一种连续生产鱼鳞胶原肽螯合钙盐和鱼鳞胶原肽的方法，包括如下步骤：预处理鱼鳞、酶法提取鱼鳞胶原多肽和钙溶液、纯化鱼鳞胶原多肽和钙溶液、肽钙螯合技术制备鱼鳞胶原肽螯合钙盐溶液、分离鱼鳞胶原肽螯合钙盐溶液得到沉淀物和上清液、沉淀物水溶解干燥得鱼鳞胶原肽螯合钙盐粉成品、上清液浓缩去除乙醇再分离纯化得鱼鳞胶原肽溶液、鱼鳞胶原肽溶液干燥得到鱼鳞胶原肽粉成品。该方法生产的鱼鳞胶原肽螯合钙盐产品生物利用度高、安全性高，且肽钙双补，所生产的鱼鳞胶原肽产品平均相对分子量低、纯度高。但是，该方法的不足之处是制备过程复杂，且得率较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单易行、反应条件温和、提取效率高、成本低、便于商业化生产的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，所制备的鱼鳞胶原蛋白多肽得率和纯度高，分子量小，生物活性好，亲水性强。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，包括鱼鳞预处理、鱼鳞胶原蛋白的提取、发酵液制备、鱼鳞胶原蛋白多肽的制备，具体步骤如下：

鱼鳞预处理：将鱼鳞表面的粘稠物及其他杂质洗净，干燥，然后将鱼鳞放入浓度为3-5%的盐酸溶液中浸泡20-24h，脱去鱼鳞上的钙，再将脱钙后的鱼鳞放入饱和碳酸氢钠溶液中浸泡12-16h，除去鱼鳞中的脂肪及杂蛋白，最后将处理好的鱼鳞在35-40℃下烘干备用，对鱼鳞进行预处理可以将包裹在胶原蛋白纤维周围的脂肪及球蛋白、角蛋白等非胶原性蛋白质还有鱼鳞中的钙质去除，便于后续胶原蛋白多肽的提取分离工作，有利于提高鱼磷胶原蛋白多肽的纯度；

鱼鳞胶原蛋白的提取：将经过预处理的鱼鳞与酸性浸泡剂按照重量配比为1:4-6溶胀30-50min，用水反复清洗至中性，沥干水分后粉碎处理，之后在鱼鳞粉中添加鱼鳞粉重量8-10倍的蒸馏水，在45-50℃水浴摇床中抽提6-8h，抽提结束后真空抽滤除杂，冷冻干燥得到鱼鳞胶原蛋白粉，通过酸性浸泡与热水抽提相结合的方法可有效提取鱼鳞中的胶原蛋白，提取过程中胶原纤维被充分溶胀，有利于胶原纤维的溶解，使得胶原蛋白的提取率大大提高；

发酵液的制备：将鱼鳞胶原蛋白粉、酵母膏、磷酸氢二铵、柠檬酸、琼脂、葡萄糖、腺苷二磷酸酯、硫酸镁、硫酸锰和蒸馏水按照配比混合均匀，并在120-125℃高压灭菌20-30min，发酵液的组成搭配合理，营养充足，适合菌种的生长代谢；

鱼鳞胶原蛋白多肽的制备：将乳酸菌在脱脂乳培养基中进行活化培养，活化培养后接种到发酵液中，同时加入5-10%的蔗糖在40-50℃下培养发酵18-24h，并控制发酵液的pH为6.0-6.5，发酵结束后进行过滤，并将滤液在3500-4000rpm离心20-30min，取上清液置于旋转蒸发仪中浓缩，温度控制在50-60℃，浓缩至液体粘稠挂壁，即制得鱼鳞胶原蛋白多肽，通过乳酸菌发酵所制备的鱼鳞胶原蛋白多肽得率和纯度高，分子量小，生物活性好，亲水性强，应用范围广，且在发酵过程中产生的乙醛和双乙酰等风味物质可达到除臭除腥的目的，使得胶原蛋白多肽无需后续进行脱腥处理，大大节省了资源，减少了能耗，降低了成本。

作为优选，鱼鳞胶原蛋白的提取过程中使用的酸性浸泡剂为重量配比为1:0.3-0.6的柠檬酸和尿苷三磷酸的混合物，尿苷三磷酸在柠檬酸的配合下，首先破坏鱼鳞中的羟基磷灰石，然后迅速向鱼鳞中渗透，充分溶胀胶原纤维，并破换纤维分子之间的席夫碱和盐键，使得胶原纤维中的胶原蛋白被快速分离出来，进而提高了胶原蛋白的提取效率，缩短了提取周期，降低了成本。

作为优选，发酵液的原料成分及其重量份为：鱼鳞胶原蛋白粉45-60份、酵母膏5-8份、磷酸氢二铵2-4份、柠檬酸2-4份、琼脂5-8份、葡萄糖15-20份、腺苷二磷酸酯0.8-1.0份、硫酸镁0.2-0.5份、硫酸锰0.05-0.1份、蒸馏水80-100份，其中腺苷二磷酸酯与发酵培养液中其他组分发挥协同作用，一方面可促进乳酸菌的生长代谢过程中蛋白酶的合成与激活，增加乳酸菌细胞壁上蛋白酶的数量，有利于促进酶解效率，进而提高鱼鳞胶原蛋白多肽的得率，另一方面通过影响羟脯氨酸上的活性基团可使胶原蛋白三螺旋空间结构发生解旋，分子结构变得松散，多肽链上的酶结合位点增多，增加了酶与底物的结合几率，不仅大大提高了水解度，而且得到的多肽分子量小，生物活性高。

作为优选，乳酸菌为保加利亚乳杆菌、布氏乳杆菌、嗜热链球菌的混合物，其重量配比为1:1:0.5-0.8，添加量为每升发酵液中接种0.8-1.0%活化培养后的乳酸菌。

进一步优选，乳酸菌活化培养的具体方法为：将新鲜牛乳煮沸后静置30-40min，自然冷却，待出现脂肪层后，取下层乳液，在100-105℃灭菌30-50min，冷却即得脱脂乳培养基，然后将保加利亚乳杆菌、布氏乳杆菌、嗜热链球菌分别接入脱脂乳培养基中，40-45℃温箱内培养6-10h，连续活化3-4次，经过活化的乳酸菌代谢能力强、数量充足，可有效发酵水解鱼鳞胶原蛋白的三股螺旋多肽链，使得肽链变短，分子量降低，产生更多具有生物活性的胶原蛋白多肽。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1）本发明从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法简单易行、反应条件温和、提取效率高、成本低，综合利用废弃鱼鳞资源，不仅能够减少环境污染，还可以明显提高鱼类加工的附加值，创造良好的经济与社会效益；

2）本发明乳酸菌发酵过程中产生的乙醛和双乙酰等风味物质可达到除臭除腥的目的，无需后续进行脱腥操作，大大节省了资源，减少了能耗；

3）本发明从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽得率和纯高，分子量小，生物活性好，亲水性强，可被广泛应用于化妆品、保健食品和医药制品等领域中。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，包括鱼鳞预处理、鱼鳞胶原蛋白的提取、发酵液的制备、鱼鳞胶原蛋白多肽的制备，具体步骤如下：

1）鱼鳞预处理：将鱼鳞表面的粘稠物及其他杂质洗净，干燥，然后将鱼鳞放入浓度为3%的盐酸溶液中浸泡20h，脱去鱼鳞上的钙，再将脱钙后的鱼鳞放入饱和碳酸氢钠溶液中浸泡12h，除去鱼鳞中的脂肪及杂蛋白，最后将处理好的鱼鳞在40℃下烘干备用，对鱼鳞进行预处理可以将包裹在胶原蛋白纤维周围的脂肪及球蛋白、角蛋白等非胶原性蛋白质还有鱼鳞中的钙质去除，便于后续胶原蛋白多肽的提取分离工作，有利于提高鱼磷胶原蛋白多肽的纯度；

2）鱼鳞胶原蛋白的提取：将经过预处理的鱼鳞与酸性浸泡剂按照重量配比为1:4溶胀50min，用水反复清洗至中性，沥干水分后粉碎处理，然后在鱼鳞粉中添加鱼鳞粉重量10倍的蒸馏水，在45℃水浴摇床中抽提6h，抽提结束后真空抽滤除杂，冷冻干燥得到鱼鳞胶原蛋白粉，通过酸性浸泡与热水抽提相结合的方法可有效提取鱼鳞中的胶原蛋白，提取过程中胶原纤维被充分溶胀，有利于胶原纤维的溶解，使得胶原蛋白的提取率大大提高；

3）发酵液的制备：将鱼鳞胶原蛋白粉、酵母膏、磷酸氢二铵、柠檬酸、琼脂、葡萄糖、腺苷二磷酸酯、硫酸镁、硫酸锰和蒸馏水按照配比混合均匀，并在120℃高压灭菌20min，发酵液的组成搭配合理，营养充足，适合菌种的生长代谢；

4）鱼鳞胶原蛋白多肽的制备：将乳酸菌在脱脂乳培养基中进行活化培养，活化培养后接种到发酵液中，同时加入5%的蔗糖在40℃下培养发酵18h，并控制发酵液的pH为6.0-6.5，发酵结束后进行过滤，并将滤液在4000rpm离心20min，取上清液置于旋转蒸发仪中浓缩，温度控制在60℃，浓缩至液体粘稠挂壁，即制得鱼鳞胶原蛋白多肽，通过乳酸菌发酵所制备的鱼鳞胶原蛋白多肽得率和纯度高，分子量小，生物活性好，亲水性强，应用范围广，且在发酵过程中产生的乙醛和双乙酰等风味物质可达到除臭除腥的目的，使得胶原蛋白多肽无需后续进行脱腥处理，大大节省了资源，减少了能耗，降低了成本。

上述鱼鳞胶原蛋白的提取过程中使用的酸性浸泡剂为重量配比为1:0.3的柠檬酸和尿苷三磷酸的混合物，尿苷三磷酸在柠檬酸的配合下，首先破坏鱼鳞中的羟基磷灰石，然后迅速向鱼鳞中渗透，充分溶胀胶原纤维，并破换纤维分子之间的席夫碱和盐键，使得胶原纤维中的胶原蛋白被快速分离出来，提高了胶原蛋白的提取效率，大大缩短了提取周期，降低了成本。

上述发酵液的原料成分及其重量份为：鱼鳞胶原蛋白粉45份、酵母膏6份、磷酸氢二铵4份、柠檬酸2份、琼脂5份、葡萄糖15份、腺苷二磷酸酯1.0份、硫酸镁0.2份、硫酸锰0.05份、蒸馏水90份，一方面可促进乳酸菌的生长代谢过程中蛋白酶的合成与激活，增加乳酸菌细胞壁上蛋白酶的数量，有利于促进酶解效率，提高鱼鳞胶原蛋白多肽的得率，另一方面通过影响羟脯氨酸上的活性基团可使胶原蛋白三螺旋空间结构发生解旋，分子结构变得松散，多肽链上的酶结合位点增多，增加了酶与底物的结合几率，不仅大大提高了水解度，而且得到的多肽分子量小，生物活性高。

上述乳酸菌为保加利亚乳杆菌、布氏乳杆菌、嗜热链球菌的混合物，其重量配比为1:1:0.5，添加量为每升发酵液中接种0.8%活化培养后的乳酸菌。

上述乳酸菌活化培养的具体方法为：将新鲜牛乳煮沸后静置30min，自然冷却，待出现脂肪层后，取下层乳液，在102℃灭菌30min，冷却即得脱脂乳培养基，然后将保加利亚乳杆菌、布氏乳杆菌、嗜热链球菌分别接入脱脂乳培养基中，40℃温箱内培养6h，连续活化3次，经过活化的乳酸菌代谢能力强、数量充足，可有效发酵水解鱼鳞胶原蛋白的三股螺旋多肽链，使得肽链变短，分子量降低，产生更多具有生物活性的胶原蛋白多肽。

实施例2：

从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，包括鱼鳞预处理、鱼鳞胶原蛋白的提取、发酵液的制备、鱼鳞胶原蛋白多肽的制备，具体步骤如下：

1）鱼鳞预处理：将鱼鳞表面的粘稠物及其他杂质洗净，干燥，然后将鱼鳞放入浓度为5%的盐酸溶液中浸泡24h，脱去鱼鳞上的钙，再将脱钙后的鱼鳞放入饱和碳酸氢钠溶液中浸泡16h，除去鱼鳞中的脂肪及杂蛋白，最后将处理好的鱼鳞在40℃下烘干备用；

2）鱼鳞胶原蛋白的提取：将经过预处理的鱼鳞与酸性浸泡剂按照重量配比为1: 6溶胀50min，用水反复清洗至中性，沥干水分后粉碎处理，然后在鱼鳞粉中添加鱼鳞粉重量8倍的蒸馏水，在50℃水浴摇床中抽提8h，抽提结束后真空抽滤除杂，冷冻干燥得到鱼鳞胶原蛋白粉；

3）发酵液的制备：将鱼鳞胶原蛋白粉60份、酵母膏8份、磷酸氢二铵4份、柠檬酸3份、琼脂8份、葡萄糖20份、腺苷二磷酸酯1.0份、硫酸镁0.5份、硫酸锰0.06份、蒸馏水80份混合均匀，并在125℃高压灭菌30min；

4）鱼鳞胶原蛋白多肽的制备：将乳酸菌在脱脂乳培养基中进行活化培养，活化培养后接种到发酵液中，同时加入10%的蔗糖在45℃下培养发酵24h，并控制发酵液的pH为6.0-6.5，发酵结束后进行过滤，并将滤液在3500rpm离心30min，取上清液置于旋转蒸发仪中浓缩，温度控制在60℃，浓缩至液体粘稠挂壁，即制得鱼鳞胶原蛋白多肽。

上述鱼鳞胶原蛋白的提取过程中使用的酸性浸泡剂为重量配比为1:0.6的柠檬酸和尿苷三磷酸的混合物。

上述乳酸菌为保加利亚乳杆菌、布氏乳杆菌、嗜热链球菌的混合物，其重量配比为1:1:0.8，添加量为每升发酵液中接种1.0%活化培养后的乳酸菌。

上述乳酸菌活化培养的具体方法为：将新鲜牛乳煮沸后静置30min，自然冷却，待出现脂肪层后，取下层乳液，在105℃灭菌30min，冷却即得脱脂乳培养基，然后将保加利亚乳杆菌、布氏乳杆菌、嗜热链球菌分别接入脱脂乳培养基中，42℃温箱内培养8h，连续活化4次。

实施例3：

从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，包括鱼鳞预处理、鱼鳞胶原蛋白的提取、发酵液的制备、鱼鳞胶原蛋白多肽的制备，具体步骤如下：

1）鱼鳞预处理：将鱼鳞表面的粘稠物及其他杂质洗净，干燥，然后将鱼鳞放入浓度为4%的盐酸溶液中浸泡20h，再将脱钙后的鱼鳞放入饱和碳酸氢钠溶液中浸泡16h，最后将处理好的鱼鳞在40℃下烘干备用；

2）鱼鳞胶原蛋白的提取：将经过预处理的鱼鳞与酸性浸泡剂按照重量配比为1:5溶胀50min，用水反复清洗至中性，沥干水分后粉碎处理，然后在鱼鳞粉中添加鱼鳞粉重量10倍的蒸馏水，在45℃水浴摇床中抽提7h，抽提结束后真空抽滤除杂，冷冻干燥得到鱼鳞胶原蛋白粉；

3）发酵液的制备：将鱼鳞胶原蛋白粉50份、酵母膏6份、磷酸氢二铵3份、柠檬酸3份、琼脂8份、葡萄糖15份、腺苷二磷酸酯0.9份、硫酸镁0.5份、硫酸锰0.05份、蒸馏水100份混合均匀，并在120℃高压灭菌30min；

4）鱼鳞胶原蛋白多肽的制备：将乳酸菌在脱脂乳培养基中进行活化培养，活化培养后接种到发酵液中，同时加入8%的蔗糖在50℃下培养发酵24h，并控制发酵液的pH为6.0-6.5，发酵结束后进行过滤，并将滤液在4000rpm离心20min，取上清液置于旋转蒸发仪中浓缩，温度控制在60℃，浓缩至液体粘稠挂壁，即制得鱼鳞胶原蛋白多肽。

上述鱼鳞胶原蛋白的提取过程中使用的酸性浸泡剂为重量配比为1:0.5的柠檬酸和尿苷三磷酸的混合物。

上述乳酸菌为保加利亚乳杆菌、布氏乳杆菌、嗜热链球菌的混合物，其重量配比为1:1:0.6，添加量为每升发酵液中接种1.0%活化培养后的乳酸菌。

上述乳酸菌活化培养的具体方法为：将新鲜牛乳煮沸后静置40min，自然冷却，待出现脂肪层后，取下层乳液，在105℃灭菌30min，冷却即得脱脂乳培养基，然后将保加利亚乳杆菌、布氏乳杆菌、嗜热链球菌分别接入脱脂乳培养基中，45℃温箱内培养7h，连续活化4次。

对比实施例1：

对比实施例1与实施例1相比，步骤3中发酵液的原料成分及其重量份为：鱼鳞胶原蛋白粉45份、酵母膏6份、磷酸氢二铵4份、柠檬酸2份、琼脂5份、葡萄糖15份、硫酸镁0.2份、硫酸锰0.05份、水90份，除此外的方法步骤均相同。

为了对比本发明效果，分别测试实施例1、实施例2、实施例3和对比实施例1所制备的鱼鳞胶原蛋白多肽中相对分子质量在500-1000的胶原蛋白肽的含量，具体结果如表1。

表1鱼鳞胶原蛋白多肽的相对分子质量在500-1000的含量表

	相对分子质量在500-1000的含量/%
		实施例1	85
实施例2	92
		实施例3	89
对比实施例1	70

从表1可以看出，与对比实施例1相比，实施例1、实施例2和实施例3所制备的相对分子质量在500-1000的胶原蛋白多肽的含量较高，可见，本发明从鱼鳞中提取的胶原蛋白多肽分子量小，生物活性好，可被广泛应用于化妆品、保健食品和医药制品等领域中。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，包括鱼鳞预处理、鱼鳞胶原蛋白的提取、鱼鳞胶原蛋白多肽的制备，其特征在于：所述具体步骤如下：

1）鱼鳞预处理：将洗净的鱼鳞先后放入盐酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液中浸泡，浸泡结束后烘干待用；

2）鱼鳞胶原蛋白的提取：将经过预处理的鱼鳞使用酸性浸泡剂溶胀，水洗至中性，沥干后粉碎，然后加入蒸馏水进行热水抽提，抽提结束后真空抽滤除杂，冷冻干燥得到鱼鳞胶原蛋白粉，所述酸性浸泡剂为柠檬酸和尿苷三磷酸的混合物；

3）发酵液制备；

4）鱼鳞胶原蛋白多肽的制备：将活化培养后的乳酸菌接种到发酵液中，加入蔗糖进行培养，并控制发酵液的温度、pH以及培养时间，结束后过滤、离心，取上清液蒸发浓缩，即制得鱼鳞胶原蛋白多肽。

2.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤1盐酸溶液的浓度为3-5%。

3.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤2酸性浸泡剂中柠檬酸和尿苷三磷酸的重量配比为1:0.3-0.6。

4.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤2经过预处理的鱼鳞和酸性浸泡剂的重量比为1:4-6。

5.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤3发酵液的原料成分及其重量份为：鱼鳞胶原蛋白粉45-60份、酵母粉5-8份、磷酸氢二铵2-4份、柠檬酸2-4份、醋酸钾5-8份、葡萄糖15-20份、腺苷二磷酸酯0.8-1.0份、硫酸镁0.2-0.5份、硫酸锰0.05-0.1份、水80-100份。

6.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤4乳酸菌为保加利亚乳杆菌、布氏乳杆菌、嗜热链球菌的混合物，其重量配比为1:1:0.5-0.8，添加量为每升发酵液中接种0.8-1.0%活化培养后的乳酸菌。

7.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤4乳酸菌活化培养的具体方法为：将新鲜牛乳煮沸后静置30-40min，自然冷却，待出现脂肪层后，取下层乳液，在100-105℃灭菌30-50min，冷却即得脱脂乳培养基，然后将保加利亚乳杆菌、布氏乳杆菌、嗜热链球菌分别接入脱脂乳培养基中，40-45℃温箱内培养6-10h，连续活化3-4次。

8.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤4控制发酵液温度为40-50℃、pH为6.0-6.5以及培养时间18-24h。