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CN108700578A - 与用于连接分子的基板有关的改进 - Google Patents

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CN108700578A CN201680070014.8A CN201680070014A CN108700578A CN 108700578 A CN108700578 A CN 108700578A CN 201680070014 A CN201680070014 A CN 201680070014A CN 108700578 A CN108700578 A CN 108700578A
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Abstract

一种基板，其包含掩蔽材料涂层和多个旨在将一种或多种结合剂连接到其上的离散反应区，其中所述区为基板上的未涂覆区域。

Description

与用于连接分子的基板有关的改进
技术领域
本发明涉及对用于连接结合剂的基板的改进。特别地，本发明涉及一种改进的微阵列基板。另一方面，提供一种改进的组合物，其用于涂覆用于连接结合剂的基板，并且特别用于涂覆用于微阵列的基板。在本发明的另一方面，提供一种用于分析微阵列的改进方法。
背景技术
在分析物的检测和表征中使用分子的构成阵列是众所周知的。例如，多核苷酸的构成阵列广泛用于DNA测序过程和杂交研究中，以检测患者的遗传变异。免疫测定也是众所周知的，其用于通过分析物作为抗原或抗体的特性来检测分析物，如特异性蛋白质或其他结合剂。
微阵列基板通常包括支撑材料，该支撑材料包括多个位于基板上的空间不同区域中的反应区。提供多个反应区使得可以同时测试样品中的多种分析物或生物标记物。微阵列是重要的实验室工具，不仅可以更全面地分析患者状况，而且还节省与实验室试验相关的时间和成本。通常，微阵列通过将分子或分子片段沉积或“点样(spotting)”到基板上以形成反应区阵列来制备。为了获得可接受的数据质量，点样应均匀，使得点具有相同的尺寸和形状。然而，由当前可用的微阵列获得的数据仍然有改善准确度和精度的余地，以在研究和临床环境中更有效。对于解决这个问题，人们做了相对较少的工作。
因此，有益的是提供一种提供高质量的数据的基板。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供一种基板，其包含掩蔽材料涂层和多个旨在将一种或多种结合剂共价连接到其上的离散反应区，其中所述区为基板上的未涂覆区域。
出人意料地发现，本发明的经涂覆的基板提供了改善的检测灵敏度和图像质量，尤其是当使用数字传感器时。基板的涂覆区域减少了非特异性结合和点的交联，并因此降低了背景噪声，从而产生增强的信噪比。这意味着获得的信号与样品和基板上的靶标之间发生的“真实”结合的程度成比例。还获得了提高的空间分辨率。
此外，使用本发明的经涂覆的基板可以提高结合剂沉积的准确度。可以在基板上制备内部校准标记，以能够准确识别离散反应区，用于在所述区内准确地进行生物分子沉积。
附图说明
图1示出了在9mm×9mm区域上的具有低至高密度阵列格式的微阵列的示意图。图1中的每个微阵列包括基板1、掩蔽材料涂层2和未涂覆的离散反应区3a、3b、3c。
图2示出了7×7阵列格式的参考点的图像。图2a示出了没有预定的离散反应区的基板1的图像。图2b示出了包括掩蔽材料涂层2的基板1的图像，所述基板具有预定的非硅离散反应区。
图3示出了含有参考点、FT4(游离甲状腺素)、FT3(三碘甲状腺原氨酸)和TSH(促甲状腺激素)捕获抗体的游离甲状腺阵列的图像。其中FT4和FT3是竞争测定法，而TSH是夹心测定。图3a示出了没有预定的离散反应区的基板1的图像。图3b示出了使用包括掩蔽材料涂层2和预定的离散反应区的基板1的图像。
图2和3示出了本发明的微阵列，其具有低的背景噪声信号和抗模糊(anti-blooming)特性。
图4示出了与对照相比，本发明的微阵列的检测灵敏度的改善。该图像示出了用于测定较低水平的灵敏度的TSH(促甲状腺激素)测定法。第一列示出了预期的灵敏度，第二列和第五列分别示出了在未经涂覆和经涂覆的基板上测量的灵敏度。第三列和第六列示出了通过数字传感器采集的典型3D像素图。第四列和第七列示出了信噪比的改善。
具体实施方式
本发明提供一种基板，其包含掩蔽材料涂层，和多个旨在将一种或多种结合剂连接到其上的离散反应区，其中所述区为基板上的未涂覆区域。
基板优选为5×5、7×7、10×10、20×20或30×30微阵列基板。术语微阵列并非旨在局限于检测任何特定分子，而是包括所有类型的阵列，包括RNA、DNA、蛋白质阵列，以及用于检测生物分子或生物分子片段的任何其他阵列。优选地，待连接到微阵列上的结合剂是蛋白质。更优选地，待连接到微阵列上的结合剂是抗体。最优选地，基板是蛋白质微阵列基板。
基板本身可以包含技术人员已知的任何合适的材料。优选基板包含硅、金属氧化物、陶瓷、玻璃或塑料。更优选地，基板为陶瓷基板。更优选，陶瓷是基于氧化铝。最优选，基板为白色陶瓷基板。这在基板和施加到基板上的掩蔽材料涂层之间提供了最大的对比度。
可制备陶瓷基板以提供一系列粒度(1至30μm)。用于本发明中的陶瓷基板的优选粒度小于20μm，优选小于10μm。减小的粒度赋予大大改善的表面均匀性，进而提供增强的生物测定性能。
优选的陶瓷材料包含约96％的粒度为4-8μm的氧化铝(Al2O3)。该材料是真空密封的，研磨时表面形貌为0.6至0.8μm。通过抛光工艺可以改善表面均匀性，以产生变化性为0.4-0.5μm的表面。通过精研和抛光实现进一步的改善，以产生变化性为0.05-0.1μm的表面。
优选涂层是不含硅的涂层并且优选没有元素硅或掺入硅的化合物。含硅涂层在现有技术中是已知的，例如硅酮。然而，发明人已经发现，当使用这种涂层时，硅可能污染离散反应区，这对结合剂的连接具有不利影响。
可以使用任何合适的非硅掩蔽材料或涂层。优选涂层包含一种或多种选自以下的树脂：丙烯酸树脂、醇酸树脂、环氧树脂、烃类树脂、酚醛树脂或含氟聚合物如聚四氟乙烯(PTFE)。涂层还可以含有任何合适的油墨溶剂和/或油墨添加剂。特别优选的油墨溶剂包括环己酮、丁氧基乙醇和芳族馏分。特别优选的油墨添加剂包括炭黑(黑色颜料)，矿物油(润湿剂)，石油馏分，邻苯二甲酸二丁酯(增塑剂)，钴盐、锰盐或锆盐(干燥剂)，铝和钛螯合剂(螯合剂)，抗氧化剂，表面活性剂和消泡剂。
优选地，涂层(掩蔽材料)包含环氧树脂和丙烯酸树脂、颜料以及结构化试剂。可以存在一种颜料或者可以使用多种颜料。环氧树脂和丙烯酸树脂用于增加油墨粘度、流变特性和对基板的粘合。颜料赋予深色，优选黑色，并因此赋予油墨不透光性。结构化试剂为基板表面提供亲水性/疏水性并且还有助于对基板的粘合。
优选颜料的存在量为掩蔽组合物(掩蔽材料)的1至15重量％；环氧树脂的存在量为10至60重量％，丙烯酸树脂的存在量为1至20重量％，结构化试剂的存在量为10至60重量％。
更优选地，颜料——优选黑色颜料——的存在量为掩蔽组合物的1至8重量％；环氧树脂的存在量为掩蔽组合物的15至50重量％，丙烯酸树脂的存在量为掩蔽组合物的2至15重量％，结构化试剂的存在量为掩蔽组合物的15-50重量％。
最优选地，颜料——优选黑色颜料——的存在量为掩蔽组合物的5重量％；环氧树脂的存在量为掩蔽组合物的30重量％，丙烯酸树脂的存在量为掩蔽组合物的10重量％，结构化试剂的存在量为掩蔽组合物的20重量％。
在一个优选的实施方案中，在掩蔽材料中使用炭黑颜料，优选Elftex 285。优选地，丙烯酸树脂为B-67。优选地，结构化试剂为PTFE蜡，如 965。优选地，掩蔽材料包含环氧树脂，优选Epikote1004。
最优选地，颜料为Elftex285，丙烯酸树脂为B-67，环氧树脂为Epikote 1004，结构化试剂为 965。
涂层(掩蔽材料)还可以包含一种或多种选自以下的试剂：溶剂，例如乙醇、丙醇、二甲苯、二甘醇、丁基醚；分散剂；颜料润湿剂；流平剂；颜料润湿剂和/或交联剂。
优选地，涂层的接触角为20-175°，更优选20-170°，更优选90-120°，甚至更优选约110°。使用以下方案进行测量：使用KSV CAM200接触角测量仪测量接触角，所述接触角测量仪配备有使用步进电机控制的自动分配器、LED源和CCD照相机。所述接触角测量仪与用于分配控制器、图像抓取和图像分析的软件工具连接。将3.5μl去离子水的液滴分配在基板上的预定位置处，使用CCD照相机获取图像。使用软件进行图像分析以估计水滴的接触角。
优选地，施加到基板上的涂层的厚度为1-100μm厚，优选2-50μm厚。这产生了离散反应区，其为深度分别为1-100μm、优选2-50μm的孔。最优选地，涂层的厚度为3至20μm厚，所得到的孔的深度为3至20μm深。
离散反应区或孔的壁由周围涂层形成。当将含有抗体或其他生物分子的缓冲溶液点样到离散反应区上时，抗体或生物分子被固化在活化表面上。每个离散反应区的壁吸收散射光，从而产生改善的数据读数。
优选地，基板包括疏水性掩蔽涂层，和多个旨在将一种或多种结合剂连接到其上的离散反应区，其中所述区是基板上的未涂覆区域。
优选地，涂层比基板更暗。这将在离散反应区和周围的涂覆区域之间形成对比。更优选地，基板为白色，且涂层是从灰白色到黑色范围内的任何颜色。除白色之外的任何颜色都会在离散反应区和周围的涂覆区域之间形成对比。经涂覆的基板的离散反应区与周围区域之间的对比提供了更好的空间分辨率，并且即使对于高密度的离散反应区也可以获得准确的数据。本文中的术语“掩蔽”材料意指用于涂覆基板的任何材料，其优选具有比基板更暗的颜色。优选掩蔽材料具有从灰白色到黑色范围内的颜色。更优选地，掩蔽材料具有哑光面。
涂层(掩蔽材料)可以使用本领域技术人员已知的技术制备。图5中提供了该方法的概述。
本发明利用常规设备来准确地对阵列化的分子成像。优选地，使用本领域技术人员已知的丝网印刷技术施用涂层。丝网印刷基板以提供离散反应区，其为基板上的未涂覆区域。
优选仅未经涂覆的基板区域为离散反应区。这使得机器人软件可以物理定位圆形特征并将结合剂准确沉积到特定位置中。这对于增加的离散反应区密度而言特别重要，增加的离散反应区密度可增加基于反应区的x和y坐标的生物芯片的排斥总风险。
如本文所使用的术语微阵列指具有高密度离散反应区的基板。使用每9mm×9mm基板面积最多达约1000个离散反应区可获得准确的数据。即使在这种高密度的离散反应区下，也会产生具有非常明确的边界的高质量点。诸如改善的数据准确度的优点也可以在较低密度下看到，例如每81mm2基板面积具有4个离散反应区的基板上。
基板可以是大型微阵列基板，例如尺寸约为100mm×99mm，其中基板包括例如尺寸约为9mm×9mm的正方形子部分，并且其中每个正方形子部分包括离散反应区网格。每个正方形子部分中的离散反应区的数量在2×2至30×30的范围内，优选其中每个正方形部分包括5×5、10×10、20×20或30×30的离散反应区网格。优选地，每个离散反应区的直径约为0.1至1mm。
在一个优选的实施方案中，将掩蔽材料涂层从100mm×99mm基板的边缘省略以产生非涂覆的边界。优选在该未涂覆的边缘区域制备独立的标记，例如正方形或椭圆形图案。这可以对纳米分配器进行校准以能够准确识别离散反应区，用于在反应区内准确地沉积结合剂。
优选地，微阵列的离散反应区密度为0.08至15个区/mm2，更优选0.2至13个区/mm2，甚至更优选0.25至13个区/mm2。即使在这些高密度下也可以获得高质量的数据。
优选基板的厚度为0.5至5mm，更优选0.5至3mm，最优选0.5至1.5mm，甚至更优选基板的厚度为约0.5mm。
本发明的特别优选的微阵列具有以下尺寸：
优选地，正方形子部分可彼此断开。当制备本发明的基板时，对例如由玻璃、陶瓷、塑料或硅制成的起始基板进行激光刻制，优选达到基板厚度的一半以使其容易断开。
在一个优选的实施方案中，基板包含一种或多种结合剂，所述结合剂固定在表面上，优选固定在离散反应区上。
固定到基板上的分子可以是任何适用于分析物测定的分子。例如，阵列形式的分子可以是多核苷酸，例如DNA、RNA或其功能类似物。或者，可以使用蛋白质和肽，例如酶、抗体、受体或激素。分子也可以是病毒或有机化合物。固定在基板表面上的结合剂可以是任何可以与目的分析物结合的试剂，例如生物分子，特别是抗体、适体、噬菌体和寡核苷酸，以及非生物分子如分子印记聚合物。优选地，固定在基板表面上的结合剂是蛋白质。更优选地，结合剂是抗体。术语“抗体”是指特异性识别靶标上的表位的免疫球蛋白，所述靶标通过重链和轻链的免疫球蛋白可变结构域(VHS和VLS)、更具体而言互补决定区(CDR)的结合特征确定。本领域中已知许多潜在的抗体形式，其可包括但不限于多种完整的单克隆抗体或包含完整单克隆抗体的多克隆混合物，抗体片段(例如Fab、Fab’和Fv片段，包含抗体片段的线性抗体、单链抗体和多特异性抗体)，单链可变片段(scFv)，多特异性抗体，嵌合抗体，人源化抗体和包含识别靶标上给定表位所必需的结构域的融合蛋白。
本领域技术人员将知晓可用于制备本发明的经涂覆的基板的常规制备步骤。例如，可对离散反应区进行化学活化以使得可固定结合剂。优选将具有反应性官能团的化学品添加到离散反应区的表面。结合剂可以通过接头结合到基板上。特别地，优选在与结合剂反应之前使用有机硅烷或聚合物涂层活化表面。本发明的基板可以根据例如GB-A-2324866(EP0874242)中公开的方法制备，其内容整体纳入本说明书中。当然希望分子在固定化步骤后保持最大活性。分子的共价固定可以使用常规技术，通常使用化学反应性接头分子进行，所述化学反应性接头分子可以在限定的条件下活化。优选地，本发明使用基于等离子体聚合、旋涂、CVD、湿涂和其他涂覆方法的表面改性技术。更优选地，该制备方法使用硅烷化用于结合剂的固定。化学改变可以在制备预定的离散反应区之前或之后进行。优选地，在对基板进行活化或功能化之前对基板进行表面去污。
本发明的基板在下面的实施例中证明。这些实施例但提供作为说明，而不应被理解为限制本发明。
实施例1
基于以下组分的油墨：
25重量％的环氧树脂，例如Epon8111、Epon8021、Epikote 1004；
5重量％的炭黑颜料，例如Elftex 285、Elftex 415、Elftex 435、Elftex 460；
0.05重量％的分散剂，例如Disperbyk 190、Disperbyk 192、Disperbyk 168；
5重量％的丙烯酸树脂，例如B-67、B-99N、DM-55；
0.2重量％的润湿剂，例如 104BC、 104、 104DPM；
25重量％的结构化试剂，例如POLYWAXTM 3000；POLYWAXTM 400； 965；
1重量％的消泡剂，例如BYK051、BYK055、BYK053；
3.75重量％的流平剂，例如BYK-358N；BYK-355；BYK-356；
5重量％的交联剂，例如Silquest A-2120；Silquest A-1110；
30重量％的溶剂介质，例如乙醇、丙醇、二甲苯、二甘醇、丁基醚。
实施例2
基于以下组分的油墨：
22重量％的环氧树脂，例如Epon8021；
4重量％的炭黑颜料，例如Elftex 460；
0.05重量％的分散剂，例如Disperbyk 168；
8重量％的丙烯酸树脂，例如DM-55；
0.2重量％的润湿剂，例如 104BC；
20重量％的结构化试剂，例如POLYWAXTM 3000；
0.85重量％的消泡剂，例如BYK051；
3.9重量％的流平剂，例如BYK-358N；
6重量％的交联剂，例如Silquest A-1110；
35重量％的溶剂介质，例如二甘醇。
实施例3
基于以下组分的油墨：
30重量％的环氧树脂，例如Epikote 1004；
5重量％的炭黑颜料，例如Elftex 285；
0.05重量％的分散剂，例如Disperbyk 190；
10重量％的丙烯酸树脂，例如B-67；
0.2重量％的润湿剂，例如 104BC；
20重量％的结构化试剂，例如 965；
1重量％的消泡剂，例如BYK055；
1重量％的流平剂，例如BYK-355；
2.75重量％的交联剂，例如Silquest A-1110；
30重量％的溶剂介质，例如丁基醚。
实施例4
在含有抛光的顶面和未抛光的底面的基于氧化铝的原陶瓷片的底面上进行激光刻制直至达到陶瓷片厚度的一半，以在生物芯片组装期间容易断开。将陶瓷片使用表面活性剂水混合物进行表面去污，并使用Ar和O2的1∶1混合物进行微波等离子体处理10分钟。通过湿式硅烷化涂覆技术对表面进行化学活化，然后在140℃下热固化2小时。
将化学功能化的表面装载到丝网印刷机上。将含有所需微阵列图案的乳剂丝网装载到具有选自上述实施例1至3的油墨的印刷机上。使用刮板将设计图案转移到所述片上。
基板的连续丝网印刷通过挤压和拂刀(flood blade)的重复作用实现，所述拂刀将油墨再次涂布到丝网上。将刚印刷的片在140℃下热固化20分钟，获得10-20μm的干印刷厚度。
然后将丝网印刷的陶瓷片装载到用于生物分子沉积的纳米分配器上。通过陶瓷片上存在的内部校准标记实现化学活化的离散反应区的准确识别。基于选定的印刷设计，使用纳米分配器产生5×5直至30×30的阵列。
制备以下圆直径范围和设计：
将微阵列在室温下干燥2小时，然后封闭并进行稳定化处理。将微阵列切割并组装在载体孔中，用于在Randox分析仪上进行诊断测试。通过数字传感器使用化学发光技术使改善的数据可视化。图2、3和4示出了由这些实施例采集的图像和数据。图2示出了本发明的参考点的7×7阵列，图3示出了本发明的5×5阵列(游离甲状腺)，图4示出了本发明的5×5阵列(游离甲状腺)。

Claims (31)

1.一种基板，其包含掩蔽材料涂层和多个旨在将一种或多种结合剂连接到其上的离散反应区，其中所述区为基板上的未涂覆区域。
2.根据权利要求1所述的基板，其中所述基板的尺寸约为100mm×99mm，并且其中所述基板包括尺寸约为9mm×9mm的正方形子部分，并且其中每个正方形子部分包括离散反应区网格。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的基板，其中每个正方形子部分中的离散反应区的数量在2×2至30×30的范围内，优选其中每个正方形部分包括5×5、10×10、20×20或30×30离散反应区网格。
4.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其具有高密度的离散反应区。
5.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中离散反应区的密度为0.08至15个区/mm2，优选0.2至13个区/mm2。
6.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中每个离散反应区的直径为0.1mm至1mm。
7.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其包含一种或多种固定在离散反应区上的结合剂。
8.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中所述结合剂为蛋白质。
9.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中所述结合剂为抗体。
10.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其为微阵列平台。
11.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中所述基板包含硅、金属氧化物、陶瓷、玻璃或塑料，优选其中所述基板为陶瓷、玻璃或塑料。
12.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中所述基板为陶瓷基板，优选白色陶瓷基板。
13.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中所述掩蔽材料的接触角为20-175°，优选20-170°，优选60-120°，更优选90-120°。
14.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中所述掩蔽材料为疏水性的。
15.根据前述权利要求14所述的基板，其中所述掩蔽材料不含硅。
16.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中施加到基板上的涂层的厚度为1-100μm(微米)厚。
17.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中所述掩蔽材料涂层是从灰白色到黑色范围内的颜色。
18.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中所述掩蔽材料涂层通过丝网印刷施用。
19.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中将所述掩蔽材料涂层从基板的边缘省略以产生非涂覆的边界。
20.根据权利要求3和4所述的基板，其中所述正方形子部分彼此易断开。
21.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中制备一个或多个独立的标记，用于纳米分配器的校准。
22.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中对所述离散反应区进行化学活化，以使得可以固定结合剂。
23.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中所述掩蔽材料包含颜料，优选炭黑颜料，更优选Elftex 285。
24.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中所述掩蔽材料包含丙烯酸树脂，优选B-67。
25.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中所述掩蔽材料包含结构化试剂如PTFE蜡，优选965。
26.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中所述掩蔽材料包含环氧树脂，优选Epikote 1004。
27.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其包含颜料、丙烯酸树脂、环氧树脂和结构化试剂。
28.根据权利要求27所述的基板，其中
颜料——优选黑色颜料——的存在量为掩蔽组合物的1至8重量％；
环氧树脂的存在量为掩蔽组合物的15至50重量％；
丙烯酸树脂的存在量为掩蔽组合物的2至10重量％；以及
结构化试剂的存在量为掩蔽组合物的15-50重量％。
29.根据权利要求27或28所述的基板，其中
颜料——优选黑色颜料——的存在量为掩蔽组合物的约5重量％；
环氧树脂的存在量为掩蔽组合物的约30重量％；
丙烯酸树脂的存在量为掩蔽组合物的约10重量％；以及
结构化试剂的存在量为掩蔽组合物的约20重量％。
30.根据权利要求27-29所述的基板，其中所述颜料为Elftex 285，所述丙烯酸树脂为B-67，所述环氧树脂为Epikote 1004，所述结构化试剂为965。
31.根据前述权利要求中任一项所述的基板，其中所述掩蔽材料还包含一种或多种选自以下的试剂：溶剂、分散剂、颜料润湿剂、流平剂、颜料润湿剂和/或交联剂。
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