CN108660107B

CN108660107B - 一种骨骼肌类器官构建方法

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Publication number: CN108660107B
Application number: CN201810491120.4A
Authority: CN
Inventors: 邹晓晖; 欧阳宏伟; 刘怡孝; 吴兵兵; 安晟锐
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-05-21
Filing date: 2018-05-21
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2038-05-21
Also published as: CN108660107A

Abstract

本发明涉及一种骨骼肌类器官构建方法，该方法包括：从小鼠骨骼肌中分离的成肌祖细胞(MPCs)与其骨骼肌中的快速贴壁细胞(RACs)在martrigel中3D共培养并经分化诱导后得到可以抽动的类肌肉组织块的步骤。本发明方法简易，可操作性强，得到的骨骼肌类器官可以收缩，结合moveheat方法定量分析骨骼肌类器官的生理功能，适用于高通量药筛研究。

Description

一种骨骼肌类器官构建方法

技术领域

本发明涉及一种类器官的构建方法，具体地，本发明涉及一种骨骼肌类器官构建方法。

背景技术

在骨骼肌再生研究中，2D培养体系最经常用来扩增MPCs和诱导MPCs分化成肌管，但是这种培养方法不能长时间维系，与天然肌肉解剖结构相差较大需要用复杂的培养体系来引发肌肉收缩。大量研究发现，在肌肉干细胞微环境信号调控中，细胞-细胞和细胞-胞外基质间的相互作用起到重要作用，然而2D培养体系由于受到维度的限制已不适宜用来做细胞-细胞和细胞-胞外基质相互作用对细胞调控的研究。即使最近报道的3D培养组织工程肌肉，其中所用种子细胞要么是成肌细胞系与MPCs差异较大，要么是从新生大鼠或成体骨骼肌分离出的不纯的MPCs细胞组成成分复杂不易控制。所以考虑到骨骼肌细胞组成成分的复杂性，一种新的模拟天然肌肉微环境的3D组织工程肌肉培养方法亟待开发。

类器官技术是一种利用哺乳动物多能干细胞或成体组织来源的干细胞自我组织的特性在体外构建3D类似体内的微环境的具有多细胞类型的细胞团块。近年来已有多种组织器官的类器官研究报道，这些具有多细胞类型复杂程度的类器官已经与对应体内组织器官高度类似。这种技术为研究组织器官的发育，再生及病理提供了理想的平台。

发明内容

本发明的目的是提供一种骨骼肌类器官构建方法及应用。为研究骨骼肌再生体外研究提供了新的与体内肌肉再生高度类似的研究平台。

本发明采用的技术方案为：

一种骨骼肌类器官构建方法，该方法包括：从小鼠骨骼肌中分离的成肌祖细胞(myogenic progenitorcells,MPCs)与其骨骼肌中的快速贴壁细胞(rapidly adheringcells,RACs)在martrigel中3D共培养并经分化诱导后得到可以抽动的类肌肉组织块的步骤。

具体地，该方法包括：

1)将RACs和MPCs体外扩增到3～4代；

2)用胰酶分别将RACs和MPCs消化成细胞悬液并分别计数；

3)取所需细胞悬液，将RACs和MPCs按1:1的个数比混合，离心去上清；

4)用稀释后matrigel重悬细胞混匀，之后放冰上；

5)吸取matrigel细胞重悬液，滴到培养皿中，之后将培养皿倒置放到CO₂培养箱中15min使matrigel凝固；

6)将凝固后的matrigel细胞混合物从培养皿里脱离，放到生长培养基(GrowthMedium,GM)里悬浮培养24h；

7)将matrigel细胞混合物从生长培养基转移到分化培养基(DifferentiationMedium,DM)培养14天，即得。

所述的MPCs、RACs由包括如下步骤的方法制备得到：

1)取已断椎处死且灭菌处理的C57BL/6雄性小鼠的后肢腓肠肌和胫前肌；用HBSS清洗3遍并剃除肌腱，脂肪和筋膜；

2)用眼科剪将肌肉剪成肉浆；离心，去上清；用HBSS洗涤并再次离心；

3)去上清，加37℃预热后的0.2％胶原酶Ⅺ重悬肌肉开始消化，37℃水浴锅中孵1小时，其中每10min颠倒混匀一次；

4)肉浆-酶混合物离心去上清后，用diapase溶液重悬，37℃水浴锅中孵1小时；

5)肉浆-酶混合物离心，去上清后用0.1％胰酶重悬，37℃水浴锅中孵45min；

6)离心，去上清后用GM重悬；

7)用70μm孔径细胞筛过滤重悬物；

8)用注射器抽吸重悬液；

9)将重悬液转移到胶原Ⅰ包被后的培养皿中，命名为PP1；

10)37℃细胞培养箱中放置2h后将上清转移至新的胶原Ⅰ包被60mm培养皿中并命名为PP2，在PP1中加入新鲜生长培养基(Growth Medium,GM)；

11)24h后将PP2中的上清转移至新的胶原Ⅰ包被培养皿中并命名为PP3，在PP2中加入新鲜培养基；

12)重复步骤(11)直到获得PP6，上清在PP6培养皿中72h后再吸弃换新的培养基；

PP1,PP2中的细胞为快速贴壁细胞(Rapidly adhering cells,RACs)；PP3,PP4中的细胞，体外纯化扩增后为成肌祖细胞，即MPCs。

本发明还提供了一种Moveheat检测骨骼肌类器官方法，该方法包括如下步骤：

1)、将培养成熟的骨骼肌类器官从培养箱拿出，在40X镜下拍下其收缩的视频(约1min)；

2)、获得视频后，利用15*15的平均算子处理视频中的每一帧图像，对图像进行模糊化；

3)、计算n+3帧与第n帧对应像素的灰度差；

4)、最后求所有帧每个像素灰度变化的平均值，作为对应区域图像变化的热度。

本发明所具有的有益效果：

本发明方法简易，可操作性强，得到的骨骼肌类器官可以收缩，结合moveheat方法定量分析骨骼肌类器官的生理功能，适用于高通量药筛研究。

附图说明

图1为肌肉祖细胞的分离和鉴定的结果。

其中A，白光视野下的MPCs。B，MYOD1和PAX7免疫荧光共染。C，肌肉祖细胞占总细胞数目比例。

通过对图1中免疫荧光结果中PAX7⁺MYOD1⁺,PAX7^-MYOD1⁺,PAX7⁺MYOD1^-细胞数目占总细胞数的比例计算可知分离得到纯度较高的成肌祖细胞。

图2为骨骼肌类器官培养过程中RACs能够促进MPCs成肌

图2中R：RACs单独3D培养；MR：RACs和MPCs 3D共培养；M：MPCs单独3D培养。A：体式镜下骨骼肌类器官。B：40X镜下骨骼肌类器官。C：MHC(myosin heavy chain)免疫荧光。

将从小鼠骨骼肌中分离得到的RACs及MPCs共培养，在生长培养基中培养1天，成肌诱导培养基中培养2周后得到可以抽动的骨骼肌(图2，MR组)，然而在相同的培养条件下RACs和MPCs各自单独培养则不会形成能够抽动的骨骼肌类器官(图2，R组和M组)，这表明RACs在骨骼中类器官培养过程中促进MPCs成肌分化起到关键作用。图3为从小鼠骨骼肌中分离快速贴壁细胞(RACs)及成肌祖细胞(MPCs)流程图。

如图所示，我们将肌肉消化后的悬液中24小时内贴壁的细胞称为快速贴壁细胞(rapidly adhering cells,RACs)，将贴壁时间长于24小时的细胞称为慢贴壁细胞(slowlyadhering cells,SACs)

图4为骨骼肌类器官培养流程示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

1.MPCs及快速贴壁细胞的分离及鉴定。

1.1骨骼肌快速贴壁细胞及MPCs分离

1)37℃预热胶原酶Ⅺ(C7657,Sigma-Aldrich)，dispaseⅡ((D4693-1G,Sigma)和胰酶；

2)将两只6～8w大C57BL/6雄性小鼠断椎处死后放入75％酒精中灭菌10min；

3)取后肢腓肠肌和胫前肌，用HBSS清洗3遍并剃除肌腱，脂肪和筋膜；

4)用眼科剪将肌肉剪成肉浆(约1mm³)；

5)将肉浆转移至15ml离心管中；离心；

6)去上清，用HBSS(24020-117,Invitrogen)洗涤并再次离心；

7)去上清，加37℃预热后的0.2％胶原酶Ⅺ10ml重悬肌肉开始消化，37℃水浴锅中孵1小时，其中每10min颠倒混匀一次；

8)肉浆-酶混合物4℃930g离心5min，去上清后用10ml diapase溶液重悬，37℃水浴锅中孵1小时，其中每10min颠倒混匀一次；

9)肉浆-酶混合物4℃930g离心5min，去上清后用10ml 0.1％胰酶重悬，37℃水浴锅中孵45min，每10min混匀一次(轻柔)；

10)4℃930g离心5min，去上清后用10ml GM重悬；

11)用70μm孔径细胞筛过滤重悬物；

12)依次分别用带有18G，23G和27G10ml注射器抽吸重悬液(各2次)；

13)将重悬液转移到胶原Ⅰ包被后的60mm培养皿中,命名为PP1；

14)37℃细胞培养箱中放置2h后将上清转移至新的胶原Ⅰ包被60mm培养皿中并命名为PP2，在PP1中加入3ml新鲜生长培养基(Growth Medium,GM)；

生长培养基(Growth Medium,GM)：H-DMEM，10％FBS，10％HS，0.5％CEE，青霉素(100U/ml)，链霉素(100U/ml)。

15)24h后将PP2中的上清转移至新的胶原Ⅰ包被60mm培养皿中并命名为PP3，在PP2中加入3ml新鲜培养基；

16)重复步骤(15)直到获得PP6，上清在PP6培养皿中72h后再吸弃换新的培养基。

PP1,PP2中的细胞为快速贴壁细胞(Rapidly adhering cells,RACs)，细胞形态与成纤维细胞极为相似；PP3,PP4中的细胞约大部分为肌肉干细胞，体外纯化扩增后为成肌祖细胞，即MPCs。

MPCs体外纯化步骤：

1.吸弃培养基，用2ml1X PBS洗涤；

2.用0.5ml 0.05％胰酶37℃消化30s,之后加0.5mlGM终止消化；

3.将消化下的细胞转移至15ml离心管中930g离心5min；

4.吸弃上清，加入3mlGM重悬细胞并将细胞悬液转移至新的60mm胶原Ⅰ包被的培养皿中，然后将培养皿放到培养箱中贴壁30min；

5. 30min贴壁处理后，将上清中未贴壁细胞转移至新的60mm胶原Ⅰ包被的培养皿中。

至此完成一次纯化，纯化重复的次数视成纤维样细胞混杂程度而定。

1.2 MPCs鉴定

PAX7是肌肉干细胞经典marker,MYOD1是肌肉干细胞激活后表达的成肌转录因子，即成肌祖细胞的经典marker，因此我们用这两种marker来鉴定分离到的肌肉干/祖细胞。如图1所示分离得到的肌肉干/祖细胞的中肌肉干/祖细胞所占比例约为83％。

2.骨骼肌类器官的培养

1)生长培养基和matrigel提前30min在冰上预冷；

2)根据使用需求量将matrigel用生长培养基稀释1倍后继续冰上预冷；

3)将RACs和MPCs体外扩增到3～4代，使RACs和MPCs能够各自达到至少达到7*10⁵；

4)用胰酶分别将RACs和MPCs消化成细胞悬液并分别计数；

5)根据制作organoid的个数(R,RM,M每组三个)来确定RACs和MPCs的用量(RACs:MPCs＝1:1)，然后取所需细胞悬液(R组2.8*10⁵个RACs,RM组RACs和MPCs各1.4*10⁵个，M组MPCs 2.8*10⁵个)，将RACs和MPCs按1:1的个数比混合，200g离心5min后去上清。

6)每组用35μl体积的GM重悬细胞混匀，之后放冰上预冷5min，然后每组加入35μl体积预冷的matrigel。

7)用预冷后的200μl枪头吸取matrigel细胞重悬液，小心滴到(20μl/滴)60mm培养皿中，之后将培养皿倒置放到CO₂培养箱中15min使matrigel凝固。

8)用1ml大枪头将凝固后的matrigel细胞混合物从培养皿里脱离，放到生长培养基里悬浮培养24h。

9)将matrigel细胞混合物从生长培养基转移到分化培养基(DifferentiationMedium,DM)培养14天。

分化诱导培养基(differentiation medium,DM)；H-DMEM，2％HS，青霉素(100U/ml)，链霉素(100U/ml)。

骨骼肌类器官生理功能检测

培养得到的骨骼肌类器官直径约为2.5mm，不易用现有的肌肉生理功能检测手段检测，为了检测骨骼肌类器官生理功能我们发明了Moveheat检测方法。

Moveheat检测骨骼肌类器官原理：

1)将培养成熟的骨骼肌类器官从培养箱拿出，在40X镜下拍下其收缩的视频(约1min)；

2)获得视频后，利用15*15的平均算子处理视频中的每一帧图像，对图像进行模糊化；

3)计算n+3帧与第n帧对应像素的灰度差；

4)最后求所有帧每个像素灰度变化的平均值，作为对应区域图像变化的热度。

Claims

1.一种骨骼肌类器官构建方法，其特征在于：该方法包括：

1)将RACs和MPCs体外扩增到3～4代；

2)用胰酶分别将RACs和MPCs消化成细胞悬液并分别计数；

4)用稀释后matrigel重悬细胞混匀，之后放冰上；

6)将凝固后的matrigel细胞混合物从培养皿里脱离，放到生长培养基里悬浮培养24h；

7)将matrigel细胞混合物从生长培养基转移到分化培养基培养14天，即得；

所述的MPCs、RACs由包括如下步骤的方法制备得到：

6)离心，去上清后用新鲜生长培养基重悬；

7)用70μm孔径细胞筛过滤重悬物；

8)用注射器抽吸重悬液；

9)将重悬液转移到胶原Ⅰ包被后的培养皿中，命名为PP1；

10)37℃细胞培养箱中放置2h后将上清转移至新的胶原Ⅰ包被60mm培养皿中并命名为PP2，在PP1中加入新鲜生长培养基；

12)重复步骤(11)直到获得PP6，上清在PP6培养皿中72h后再吸弃换新的培养基；PP1,PP2中的细胞为快速贴壁细胞(RACs)；PP3,PP4中的细胞，体外纯化扩增后为成肌祖细胞，即MPCs；

生长培养基：H-DMEM，10％FBS，10％HS，0.5％CEE，青霉素：100U/ml，链霉素：100U/ml；

分化培养基；H-DMEM，2％HS，青霉素：100U/ml，链霉素：100U/ml。