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CN108650886B - 多价和多特异性gitr-结合融合蛋白 - Google Patents

多价和多特异性gitr-结合融合蛋白 Download PDF

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CN108650886B CN201680055497.4A CN201680055497A CN108650886B CN 108650886 B CN108650886 B CN 108650886B CN 201680055497 A CN201680055497 A CN 201680055497A CN 108650886 B CN108650886 B CN 108650886B
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Abstract

本公开内容总体上提供特异性接合糖皮质激素‑诱导的TNFR‑相关蛋白(GITR)(TNF受体超家族(TNFRSF)的成员)的分子。更特别地，本公开内容涉及至少结合GITR的多价和/或多特异性分子。

Description

多价和多特异性GITR-结合融合蛋白
相关申请
本申请要求2015年7月23日提交的美国临时申请号62/195,822的权益，其内容通过引用以其整体结合到本文中。
序列表的并入
创建于2016年7月22日，大小为209 KB，名称为“INHI022001WO_ST25.txt”的文本文件的内容通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本公开内容总体上提供特异性接合糖皮质激素-诱导的TNFR-相关蛋白(GITR)(TNF受体超家族(TNFRSF)的成员)的分子。更特别地，本公开内容涉及至少结合GITR的多价和/或多特异性分子。
发明背景
肿瘤坏死因子受体超家族由数个结构相关的细胞表面受体组成。被多聚体配体激活是许多这些受体的共同特征。如果被适当激活，TNFRSF的许多成员在许多病理中具有治疗功用。重要的是，适当地激动该受体家族通常需要高级簇集，和常规的二价抗体对此是不理想的。因此，对于TNFRSF的更有效的激动剂分子，存在治疗需要。
发明简述
本公开内容提供了多价TNF受体超家族(TNFRSF)结合融合多肽，其至少结合糖皮质激素-诱导的TNFR-相关蛋白(GITR，亦称为肿瘤坏死因子受体超家族成员18 (TNFRSF18)和/或激活-诱导型TNFR家族受体(AITR))。这些至少结合GITR的分子在本文被称为“GITR-靶向分子”或“GITR-靶向融合物”或“GITR-靶向蛋白”或“GITR-靶向融合多肽”或“GITR-靶向融合蛋白”。在一些实施方案中，GITR-靶向分子是多价分子，例如，多价GITR-靶向融合蛋白。在一些实施方案中，GITR-靶向分子是多特异性分子，例如，多特异性GITR-靶向融合蛋白。在一些实施方案中，GITR-靶向分子是多价和多特异性分子，例如，多价和多特异性GITR-靶向融合蛋白。如本文所用的，术语“融合蛋白”或“融合多肽”或“GITR-靶向融合蛋白”或“GITR-靶向融合多肽”，除非另外明确指示，是指本公开内容的任何融合蛋白实施方案，包括但不限于，多价融合蛋白、多特异性融合蛋白或多价和多特异性融合蛋白。
这些GITR-靶向分子包括至少一个结合GITR的结构域，在本文称为“GITR-结合结构域” (GITR-BD)。这些GITR-BD包括特异性结合GITR的多肽序列。在一些实施方案中，GITR-BD包括作为或衍生自抗体或抗体片段的多肽序列，所述抗体或抗体片段包括例如，scFv、Fab、单结构域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。在一些实施方案中，GITR-BD包括人或人源化sdAb。
本公开内容的GITR-靶向分子克服了来自靶向TNF受体超家族(TNFRSF)的成员，包括GITR的常规抗体的问题和限制。靶向TNFRSF的成员的常规抗体已表明需要外源交联以实现足够的激动剂活性，如通过DR4、DR5、GITR和OX40的活性抗体对Fc-γ受体(FcγR)的必需性证明的(Ichikawa et al 2001 al Nat. Med. 7, 954–960, Li et al 2008 Drug Dev.Res. 69, 69–82; Pukac et al 2005 Br. J. Cancer 92, 1430–1441; Yanda et al2008 Ann. Oncol. 19, 1060–1067; Yang et al 2007 Cancer Lett. 251:146–157;Bulliard et al 2013 JEM 210(9): 1685; Bulliard et al 2014 Immunol and CellBiol 92: 475-480)。除了通过FcγR交联之外，其它外源试剂，包括加入寡聚配体或抗体结合实体(例如，蛋白A和第二抗体)，已证实增强抗-TNFRSF抗体簇集和下游信号传导。例如，加入DR5配体TRAIL增强抗-DR5抗体的细胞凋亡诱导能力(Graves et al 2014 CancerCell 26: 177-189)。这些发现表明对超过二聚体的TNFRSF簇集的需要。
本公开内容提供了特异性结合GITR的分离的多肽。在一些实施方案中，分离的多肽衍生自抗体或抗体片段，包括scFv、Fab、单结构域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。在一些实施方案中，分离的多肽是人或人源化sdAb。sdAb片段可衍生自VHH、VNAR、工程改造的VH或VK结构域。VHH可从骆驼仅重链抗体产生。VNAR可从软骨鱼仅重链抗体产生。已执行各种方法以从常规异二聚体VH和VK结构域产生单体sdAb，包括界面工程改造和选择特定种系家族。在其它实施方案中，分离的多肽衍生自非-抗体支架蛋白，例如但不限于，经设计的锚蛋白重复蛋白(darpins)、avimers、anticalin/lipocalins、centyrins和fynomers。
在一些实施方案中，分离的多肽包括选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包括选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包括选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽包括与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包括与选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包括与选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽包含互补决定区1 (CDR1)，其包含选自SEQ IDNO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；互补决定区2(CDR2)，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和互补决定区3 (CDR3)，其包含选自SEQ ID NO:108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列。
本公开内容还提供了多价TNFRSF结合融合蛋白，其包含两个或更多个TNFRSF结合结构域(TBD)，其中至少一个TBD结合GITR，在本文称为GITR-结合结构域(GITR-BD)。在一些实施方案中，本公开内容的融合蛋白具有治疗肿瘤的功用。在一些实施方案中，本公开内容的融合蛋白结合在肿瘤细胞上表达的TNFRSF成员，例如至少GITR。
在一些实施方案中，本公开内容的GITR-BD衍生自抗体或抗体片段，包括scFv、Fab、单结构域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。在一些实施方案中，GITR-BD是人或人源化sdAb。sdAb片段可衍生自VHH、VNAR、工程改造的VH或VK结构域。VHH可从骆驼仅重链抗体产生。VNAR可从软骨鱼仅重链抗体产生。已执行各种方法以从常规异二聚体VH和VK结构域产生单体sdAb，包括界面工程改造和选择特定种系家族。在其它实施方案中，GITR-BD衍生自非-抗体支架蛋白，例如但不限于经设计的锚蛋白重复蛋白(darpins)、avimers、anticalin/lipocalins、centyrins和fynomers。
通常，本公开内容的多价融合蛋白包括至少两个或更多个通过接头多肽可操作连接的GITR-BD。利用sdAb片段作为本公开内容的多价融合蛋白内的特定GITR-BD序列具有避免许多双/多特异性抗体方法共有的重链:轻链错配问题的益处。此外，本公开内容的多价融合蛋白避免使用许多双特异性抗体必需的长接头。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个不同的GITR-BD。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个不同的GITR-BD。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个不同的GITR-BD。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个不同的GITR-BD。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个不同的GITR-BD。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含多个拷贝的GITR-BD。例如，在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少两个拷贝的GITR-BD。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少三个拷贝的GITR-BD。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少四个拷贝的GITR-BD。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少五个拷贝的GITR-BD。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少六个拷贝的GITR-BD。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的GITR-BD。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO:19-80的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个GITR-BD，其包含与选自SEQ IDNO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO:42-62的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个GITR-BD，其包含与选自SEQ IDNO: 42-62的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO:63-80的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个GITR-BD，其包含与选自SEQ IDNO: 63-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含与选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个GITR-BD，其包含互补决定区1(CDR1)，其包含选自SEQ ID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；互补决定区2 (CDR2)，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和互补决定区3 (CDR3)，其包含选自SEQ ID NO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含CDR1，其包含选自SEQ ID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；CDR2，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和CDR3，其包含选自SEQ IDNO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含CDR1，其包含选自SEQ ID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；CDR2，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和CDR3，其包含选自SEQ ID NO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含CDR1，其包含选自SEQID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；CDR2，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和CDR3，其包含选自SEQ ID NO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含CDR1，其包含选自SEQ ID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；CDR2，其包含选自SEQ ID NO:107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和CDR3，其包含选自SEQ ID NO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的GITR-BD，其包含CDR1，其包含选自SEQ ID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；CDR2，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和CDR3，其包含选自SEQ ID NO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:19-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 19-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ IDNOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含与选自SEQID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ IDNOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ IDNOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ IDNO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ IDNO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ IDNO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ IDNO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ IDNO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ IDNO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ IDNOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ IDNO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ IDNO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ IDNO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ IDNO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ IDNO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的包含选自SEQ ID NO:63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的包含选自SEQ IDNO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的包含选自SEQID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含至少一个GITR-BD，所述GITR-BD包含互补决定区1 (CDR1)，其包含选自SEQ ID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；互补决定区2 (CDR2)，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和互补决定区3(CDR3)，其包含选自SEQ ID NO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列，和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含两个或更多个拷贝的GITR-BD，所述GITR-BD包含CDR1，其包含选自SEQ ID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；CDR2，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和CDR3，其包含选自SEQ ID NO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列，和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含三个或更多个拷贝的GITR-BD，所述GITR-BD包含CDR1，其包含选自SEQ ID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；CDR2，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和CDR3，其包含选自SEQ ID NO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列，和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含四个或更多个拷贝的GITR-BD，所述GITR-BD包含CDR1，其包含选自SEQ ID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；CDR2，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和CDR3，其包含选自SEQ ID NO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列，和至少一个包含选自SEQ IDNOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含五个或更多个拷贝的GITR-BD，所述GITR-BD包含CDR1，其包含选自SEQ ID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；CDR2，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和CDR3，其包含选自SEQ ID NO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列，和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含六个或更多个拷贝的GITR-BD，所述GITR-BD包含CDR1，其包含选自SEQ ID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；CDR2，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和CDR3，其包含选自SEQ ID NO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列，和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含选自SEQ ID NO: 81-105的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含选自SEQ ID NO: 81-93的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含选自SEQ ID NO: 94-105的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含与选自SEQ ID NO: 81-105的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含与选自SEQ ID NO: 81-93的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含与选自SEQ IDNO: 94-105的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 81的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 82的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 83的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 86的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQID NO: 88的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 89的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 90的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 91的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 92的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 93的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 94的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 95的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 96的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ IDNO: 97的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 98的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 99的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 100的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 101的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 102的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 103的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 104的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价融合蛋白包含SEQ ID NO: 105的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多价GITR-靶向融合蛋白是四价的。如本文所用的，四价GITR-靶向分子是指两个拷贝的包括两个GITR-BD的GITR-靶向融合蛋白。例如，在一些实施方案中，本公开内容的四价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-靶向融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc。在一些实施方案中，本公开内容的四价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-结合融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc，其中GITR-BD是结合GITR的分离的多肽序列。在一些实施方案中，本公开内容的四价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-结合融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc，其中GITR-BD是结合GITR的sdAb序列。在一些实施方案中，本公开内容的四价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-结合融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc，其中GITR-BD是结合GITR的人源化或全人sdAb序列。在一些实施方案中，GITR-BD包含互补决定区1 (CDR1)，其包含选自SEQID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；互补决定区2(CDR2)，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和互补决定区3 (CDR3)，其包含选自SEQ ID NO:108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含至少一个包含与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含两个拷贝的选自SEQ ID NO: 81-93的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多价GITR-靶向融合蛋白是六价的。如本文所用的，六价GITR-靶向分子是指两个拷贝的包括三个GITR-BD的GITR-靶向融合蛋白。例如，在一些实施方案中，本公开内容的六价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-靶向融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc。在一些实施方案中，本公开内容的六价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-靶向融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc，其中GITR-BD是结合GITR的分离的多肽序列。在一些实施方案中，本公开内容的六价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-靶向融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc，其中GITR-BD是结合GITR的sdAb序列。在一些实施方案中，本公开内容的六价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-靶向融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc，其中GITR-BD是人源化或全人sdAb序列。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含至少一个包含与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含选自SEQ ID NO: 94-105的氨基酸序列。
与非交联的二价抗体相比，本公开内容的多价融合蛋白能够增强TNFRSF成员的簇集。与非交联的二价抗体相比，由本公开内容的多价融合蛋白介导的TNFRSF成员的簇集增强诱导TNFRSF-依赖性信号传导增强。在大部分实施方案中，多价融合蛋白将掺有超过两个GITR-BD，例如三个、四个、五个或六个。在这些实施方案中，非-TNFRSF抗原的相互作用能够提供另外的交联功能，和TNFRSF激活仅用一个或两个TBD实现。
在一些实施方案中，多价融合蛋白还包括一个或多个GITR-BD和一个或多个结合并非GITR的靶标的另外的结合结构域。在一些实施方案中，多价、多特异性融合蛋白还包括一个或多个GITR-BD和一个或多个针对非-TNFRSF成员抗原的另外的结合结构域。在任何这些实施方案中，多价、多特异性融合蛋白还可包括一个或多个针对TNFRSF成员的另外的结合结构域，在本文称为TNFRSF-结合结构域(TBD)。在任何这些实施方案中，非-TNFRSF抗原的相互作用能够提供另外的交联功能，和TNFRSF激活仅用一个或两个GITR-BD或仅用一个或两个GITR-BD和TBD实现。
在一些实施方案中，多价、多特异性融合蛋白还包括一个或多个针对TNFRSF成员的另外的结合结构域，在本文称为TNFRSF-结合结构域(TBD)。在这些实施方案中，多价、多特异性融合蛋白结合至少两个不同的抗原。在一些实施方案中，多价、多特异性融合蛋白的所有TBD识别给定TNFRSF成员上的相同表位。例如，本公开内容的多价、多特异性融合蛋白可掺有2、3、4、5或6个TBD，其对给定的TNFRSF成员具有相同特异性。在其它实施方案中，多价、多特异性融合蛋白掺有识别给定TNFRSF成员上的不同表位的TBD。例如，本公开内容的多价、多特异性融合蛋白可掺有2、3、4、5或6个TBD，其具有对GITR、CD40或CD137上的各种表位的不同识别特异性。在这些实施方案中，本公开内容的多价、多特异性融合蛋白包含靶向特定TNFRSF成员的不同区域的多个TBD。在一些实施方案中，TBD可识别相同TNFRSF成员上的不同的表位，或识别不同TNFRSF成员上的表位。例如，本公开内容提供了多价、多特异性融合蛋白，其掺有结合GITR和OX40的TBD。
在其它实施方案中，本公开内容的融合蛋白是多特异性融合蛋白，其结合GITR和非-肿瘤细胞上表达的第二TNFRSF成员，例如通过非限制性实例，OX40、CD27、HVEM、CD40、淋巴毒素β受体(LTBR)、外胚层发育异常蛋白(ectodysplasin) A2受体(ED2R)、外胚层发育异常蛋白A受体(EDAR)、TweakR、BCMA、BAFFR、DR3、DR6或CD137。在一些实施方案中，多特异性融合蛋白还是多价的。在一些实施方案中，多特异性融合蛋白是双特异性的。在这些实施方案中，本公开内容的多特异性融合蛋白调节免疫细胞，导致肿瘤破坏增强。在其它实施方案中，本公开内容的多特异性融合蛋白具有治疗炎性病况的功用。在这些实施方案中，本公开内容的多特异性融合蛋白调节免疫细胞，导致炎性损伤减弱。例如，特异性激动TNFR2可增强Treg增殖，导致免疫抑制。
在一些实施方案中，多特异性融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，多特异性融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，多特异性融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD。
在一些实施方案中，多特异性融合蛋白包含至少一个包含与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，多特异性融合蛋白包含至少一个包含与选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，多特异性融合蛋白包含至少一个包含与选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的GITR-BD。
在一些实施方案中，多特异性融合蛋白包含至少一个GITR-BD，所述GITR-BD包含互补决定区1 (CDR1)，其包含选自SEQ ID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；互补决定区2 (CDR2)，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和互补决定区3 (CDR3)，其包含选自SEQ ID NO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多特异性融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多特异性融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ ID NO:42-62的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多特异性融合蛋白包含至少一个包含选自SEQ IDNO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多特异性融合蛋白包含至少一个包含与选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多特异性融合蛋白包含至少一个包含与选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。在一些实施方案中，多特异性融合蛋白包含至少一个包含与选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的GITR-BD和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
在一些实施方案中，多特异性融合蛋白包含至少一个GITR-BD，所述GITR-BD包含互补决定区1 (CDR1)，其包含选自SEQ ID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；互补决定区2 (CDR2)，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和互补决定区3 (CDR3)，其包含选自SEQ ID NO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列，和至少一个包含选自SEQ ID NOs: 1-6的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc区多肽。
与非交联的二价抗体相比，本公开内容的多特异性融合蛋白能够增强TNFRSF成员的簇集。与非交联的二价抗体相比，由本公开内容的多特异性融合蛋白介导的TNFRSF成员的簇集增强诱导TNFRSF-依赖性信号传导增强。在大部分实施方案中，多特异性融合蛋白将掺有超过两个TBD，例如三个、四个、五个或六个。在一些实施方案中，多特异性融合蛋白将掺有TBD和针对非-TNFRSF成员抗原的结合结构域。在这些实施方案中，非-TNFRSF抗原的相互作用能够提供另外的交联功能，和TNFRSF激活仅用一个或两个TBD实现。在这些实施方案中，多特异性融合蛋白是多特异性的，结合两个不同的抗原。
在一些实施方案中，本公开内容的TBD衍生自抗体或抗体片段，包括scFv、Fab、单结构域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。在一些实施方案中，TBD是人或人源化sdAb。sdAb片段可衍生自VHH、VNAR、工程改造的VH或VK结构域。VHH可自骆驼仅重链抗体产生。VNAR可自软骨鱼仅重链抗体产生。已执行各种方法从常规异二聚体VH和VK结构域产生单体sdAb，包括界面工程改造和选择特定种系家族。在其它实施方案中，TDB衍生自非-抗体支架蛋白，例如但不限于经设计的锚蛋白重复蛋白(darpins)、avimers、anticalin/lipocalins、centyrins和fynomers。
通常，本公开内容的多特异性融合蛋白由通过接头多肽可操作连接的至少两个或更多个TBD组成。利用sdAb片段作为本公开内容的多特异性融合物内的特定TBD具有避免许多双/多特异性抗体方法共有的重链:轻链错配问题的益处。此外，本公开内容的多特异性融合蛋白避免使用许多双特异性抗体必需的长接头。
在一些实施方案中，多特异性融合蛋白的所有TBD识别给定TNFRSF成员上的相同表位。例如，本公开内容的多特异性融合蛋白可掺有2、3、4、5或6个TBD，其对GITR具有相同特异性。在其它实施方案中，多特异性融合蛋白掺有识别给定TNFRSF成员上的不同表位的TBD。例如，本公开内容的多特异性融合蛋白可掺有2、3、4、5或6个TBD，其具有对GITR、CD40或CD137上的各种表位的不同识别特异性。在这些实施方案中，本公开内容的多特异性融合蛋白包含靶向特定TNFRSF成员的不同区域的多个TBD。在一些实施方案中，TBD可识别相同TNFRSF成员上的不同的表位，或识别不同TNFRSF成员上的表位。例如，本公开内容提供了掺有结合GITR和OX40的TBD的多特异性融合蛋白。
在一些实施方案中，本公开内容的融合蛋白，例如多价和/或多特异性融合蛋白，由单一多肽构成。在其它实施方案中，本公开内容的融合蛋白由超过一种多肽构成。例如，异二聚化结构域掺入融合蛋白，使得构建体是不对称的融合蛋白。例如，如果免疫球蛋白Fc区掺入融合蛋白，CH3结构域可用作同二聚化结构域，或CH3二聚体界面区可经突变，以能够异二聚化。
在一些实施方案中，融合蛋白在融合蛋白的相对末端上包含TBD和/或GITR-BD。例如，在一些实施方案中，TBD和/或GITR-BD位于融合蛋白的氨基末端(N-末端)部分和融合蛋白的羧基-末端(C-末端)部分二者上。在其它实施方案中，所有TBD和/或GITR-BD位于融合蛋白的相同末端上。例如，TBD和/或GITR-BD位于融合蛋白的氨基或羧基末端部分的任一部分上。
在一些实施方案中，融合蛋白包含免疫球蛋白Fc区。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc区是IgG同种型，其选自IgG1同种型、IgG2同种型、IgG3同种型和IgG4亚类。
在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc区或其免疫活性片段是IgG同种型。例如，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区具有人IgG1同种型，具有以下氨基酸序列：
PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 1)
在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc区或其免疫活性片段包含人IgG1多肽序列，其与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
在一些实施方案中，人IgG1 Fc区在氨基酸Asn297 (用框标记，Kabat编号)被修饰，以阻止融合蛋白的糖基化，例如，Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。在一些实施方案中，融合蛋白的Fc区在氨基酸Leu235 (用框标记，Kabat编号)被修饰，以改变Fc受体相互作用，例如，Leu235Glu (L235E)或Leu235Ala (L235A)。在一些实施方案中，融合蛋白的Fc区在氨基酸Leu234 (用框标记，Kabat编号)被修饰，以改变Fc受体相互作用，例如，Leu234Ala (L234A)。在一些实施方案中，融合蛋白的Fc区在氨基酸Leu234 (用框标记，Kabat编号)被修饰，以改变Fc受体相互作用，例如，Leu235Glu (L235E)。在一些实施方案中，融合蛋白的Fc区在氨基酸234和235二者上被改变，例如，Leu234Ala和Leu235Ala(L234A/L235A)或Leu234Val和Leu235Ala (L234V/L235A)。在一些实施方案中，融合蛋白的Fc区在Gly235被改变以减少Fc受体结合。例如，其中Gly235从融合蛋白缺失。在一些实施方案中，人IgG1 Fc区在氨基酸Gly236被修饰以增强与CD32A相互作用，例如，Gly236Ala(G236A)。在一些实施方案中，人IgG1 Fc区缺少Lys447 (Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest的EU索引)。
在一些实施方案中，融合蛋白的Fc区在以下位置的一个或多个上被改变以减少Fc受体结合：Leu 234 (L234)、Leu235 (L235)、Asp265 (D265)、Asp270 (D270)、Ser298(S298)、Asn297 (N297)、Asn325 (N325)或Ala327 (A327)。例如，Leu 234Ala (L234A)、Leu235Ala (L235A)、Asp265Asn (D265N)、Asp270Asn (D270N)、Ser298Asn (S298N)、Asn297Ala (N297A)、Asn325Glu (N325E)或Ala327Ser (A327S)。在优选的实施方案中，Fc区内的修饰减少与Fc-受体-γ受体的结合，同时对新生儿Fc受体(FcRn)的结合具有最小影响。
在一些实施方案中，融合蛋白的Fc区缺少在以下位置的一个或多个上的氨基酸，以减少Fc受体结合：Glu233 (E233)、Leu234 (L234)或Leu235 (L235)。在这些实施方案中，这三个氨基酸的Fc缺失减少补体蛋白C1q结合。这些修饰的Fc区多肽在本文称为“Fc缺失”多肽。
PAPGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 2)
在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc区或其免疫活性片段包含人IgG1多肽序列，其与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
在一些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫活性片段具有人IgG2同种型，具有以下氨基酸序列：
PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDISVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ ID NO: 3)
在一些实施方案中，融合物或其免疫活性片段包含人IgG2多肽序列，其与SEQ IDNO: 3的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
在一些实施方案中，人IgG2 Fc区在氨基酸Asn297 (用框标记)被修饰，以阻止抗体的糖基化，例如，Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。在一些实施方案中，人IgG2Fc区缺少Lys447 (Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest的EU索引)。
在一些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫活性片段具有人IgG3同种型，具有以下氨基酸序列：
PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFKWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNST FRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESSGQPEN NYNTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNIFSCSVMHEALHNRFTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 4)
在一些实施方案中，抗体或其免疫活性片段包含人IgG3多肽序列，其与SEQ IDNO: 4的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
在一些实施方案中，人IgG3 Fc区在氨基酸Asn297 (用框标记，Kabat编号)被修饰以阻止抗体的糖基化，例如，Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。在一些实施方案中，人IgG3 Fc区在氨基酸435被修饰以延长半寿期，例如，Arg435His (R435H)。在一些实施方案中，人IgG3 Fc区缺少Lys447 (Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest的EU索引)。
在一些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫活性片段具有人IgG4同种型，具有以下氨基酸序列：
PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSLGK (SEQ ID NO: 5)
在一些实施方案中，抗体或其免疫活性片段包含人IgG4多肽序列，其与SEQ IDNO: 5的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
在一些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫活性片段具有人IgG4同种型，具有以下氨基酸序列：
PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSLGK (SEQ ID NO: 6)
在一些实施方案中，抗体或其免疫活性片段包含人IgG4多肽序列，其与SEQ IDNO: 6的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
在其它实施方案中，人IgG4 Fc区在氨基酸235被修饰以改变Fc受体相互作用，例如，Leu235Glu (L235E)。在一些实施方案中，人IgG4 Fc区在氨基酸Asn297 (Kabat编号)被修饰以阻止抗体的糖基化，例如，Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。在一些实施方案中，人IgG4 Fc区缺少Lys447 (Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest的EU索引)。
在一些实施方案中，人IgG Fc区被修饰以增强FcRn结合。增强与FcRn结合的Fc突变的实例是Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu (分别为M252Y、S254T、T256E) (Kabat编号，Dall’Acqua et al 2006, J. Biol Chem Vol. 281(33) 23514–23524)、Met428Leu和Asn434Ser (M428L、N434S) (Zalevsky et al 2010 Nature Biotech, Vol. 28(2) 157-159)或Met252Ile、Thr256Asp、Met428Leu (分别为M252I、T256D、M428L) (Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest的EU索引)。
在其中本公开内容的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，Fc多肽被突变或修饰。在这些实施方案中，突变或修饰的Fc多肽包括以下突变：Met252Tyr和Met428Leu(M252Y、M428L)，使用Kabat编号系统。
在一些实施方案中，人IgG Fc区被修饰以改变抗体-依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，描述于Natsume et al., 2008 CancerRes, 68(10): 3863-72; Idusogie et al., 2001 J Immunol, 166(4): 2571-5; Mooreet al., 2010 mAbs, 2(2): 181-189; Lazar et al., 2006 PNAS, 103(11): 4005–4010, Shields et al., 2001 JBC, 276(9): 6591–6604; Stavenhagen et al., 2007Cancer Res, 67(18): 8882-8890; Stavenhagen et al., 2008 Advan. Enzyme Regul.,48: 152-164; Alegre et al, 1992 J Immunol, 148: 3461-3468; 综述于Kaneko和Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1):1-11中的氨基酸修饰。增强ADCC的突变的实例包括在Ser239和Ile332的修饰，例如Ser239Asp和Ile332Glu (S239D, I332E)。增强CDC的突变的实例包括在Lys326和Glu333的修饰。在一些实施方案中，Fc区在这些位置的一个或两个上被修饰，例如Lys326Ala和/或Glu333Ala (K326A和E333A)，使用Kabat编号系统。
在一些实施方案中，人IgG Fc区被修饰以诱导异二聚化。例如，在CH3结构域内具有在Thr366的氨基酸修饰，其当被更大体积的氨基酸例如，Try替换时(T366W)，能够与具有在位置Thr366、Leu368和Tyr407处经氨基酸修饰为较小体积的氨基酸，例如，分别为Ser、Ala和Val (T366S/L368A/Y407V)的第二CH3结构域优先配对。通过CH3修饰的异二聚化可通过引入二硫键进一步稳定，例如在相对的CH3结构域上通过改变Ser354为Cys (S354C)和Y349为Cys (Y349C) (综述于Carter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248:7–15)。
在一些实施方案中，人IgG Fc区被修饰以阻止二聚化。在这些实施方案中，本公开内容的融合蛋白是单体的。例如在残基Thr366处修饰为荷电残基，例如Thr366Lys、Thr366Arg、Thr366Asp或Thr366Glu (分别为T366K、T366R、T366D或T366E)，阻止CH3-CH3二聚化。
在一些实施方案中，融合蛋白的Fc区在以下位置的一个或多个处被改变以减少Fc受体结合：Leu 234 (L234), Leu235 (L235), Asp265 (D265), Asp270 (D270), Ser298(S298), Asn297 (N297), Asn325 (N325)或Ala327 (A327)。例如，Leu 234Ala (L234A),Leu235Ala (L235A), Asp265Asn (D265N), Asp270Asn (D270N), Ser298Asn (S298N),Asn297Ala (N297A), Asn325Glu (N325E)或Ala327Ser (A327S)。在优选的实施方案中，在Fc区内的修饰减少与Fc-受体-γ受体的结合，同时对新生儿Fc受体(FcRn)的结合具有最小影响。
在一些实施方案中，融合蛋白包含衍生自免疫球蛋白铰链区的多肽。铰链区可选自人IgG亚类的任何一个。例如，融合蛋白可包含具有EPKSSDKTHTCPPC (SEQ ID NO: 7)的序列的修饰的IgG1铰链，其中与轻链的C-末端半胱氨酸形成二硫键的Cys220被突变为丝氨酸，例如，Cys220Ser (C220S)。在其它实施方案中，融合蛋白包含具有序列DKTHTCPPC (SEQID NO: 8)的截短的铰链。
在一些实施方案中，融合蛋白具有来自IgG4的修饰的铰链，其被修饰以阻止或减少链交换，例如，Ser228Pro (S228P)，具有序列ESKYGPPCPPC (SEQ ID NO: 9)。在一些实施方案中，融合蛋白包含接头多肽。在其它实施方案中，融合蛋白包含接头和铰链多肽。
在一些实施方案中，本公开内容的融合蛋白在N297处缺少或具有减少的连接至N-连接聚糖链的岩藻糖。有许多方法阻止岩藻糖基化，包括但不限于在FUT8缺陷的细胞系中生产；向哺乳动物细胞培养基中加入抑制剂，例如栗精胺(Castanospermine)；和生产细胞系的代谢改造。
在一些实施方案中，TBD经工程改造以消除被人中发现的预存在的抗体识别。在一些实施方案中，本公开内容的单结构域抗体通过位置Leu11的突变进行修饰，例如Leu11Glu(L11E)或Leu11Lys (L11K)。在其它实施方案中，本公开内容的单结构域抗体通过羧基-末端区的变化进行修饰，例如末端序列由GQGTLVTVKPGG (SEQ ID NO: 10)或GQGTLVTVEPGG(SEQ ID NO: 11)或其修饰组成。在一些实施方案中，本公开内容的单结构域抗体通过位置11的突变和通过羧基-末端区的变化进行修饰。
在一些实施方案中，本公开内容的融合蛋白的TBD和/或GITR-BD通过氨基酸接头可操作连接。在一些实施方案中，这些接头主要由氨基酸甘氨酸和丝氨酸构成，在文本称为GS-接头。本公开内容的融合蛋白的GS-接头可具有各种长度，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸长。
在一些实施方案中，GS-接头包含选自GGSGGS，即(GGS)2 (SEQ ID NO: 12)；GGSGGSGGS，即(GGS)3 (SEQ ID NO: 13)；GGSGGSGGSGGS，即(GGS)4 (SEQ ID NO: 14)；和GGSGGSGGSGGSGGS，即(GGS)5 (SEQ ID NO: 15)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，接头是包含甘氨酸残基的柔性接头，例如通过非限制性实例，GG、GGG、GGGG (SEQ ID NO: 16)、GGGGG (SEQ ID NO: 17)和GGGGGG (SEQ ID NO: 18)。
在一些实施方案中，GITR-靶向融合蛋白包括GS-接头和甘氨酸接头的组合。
附图简述
图1A是本公开内容的示例性多价融合蛋白的示意图。
图2A、2B和2C是一系列图，表明GITR-靶向融合蛋白与CHO细胞上表达的GITR的结合，如通过流式细胞术评价的。GITR抗体，TRX-518，用作这些研究的对照。
图3A、3B和3C是一系列图，表明GITR-靶向融合蛋白阻断GITRL和GITR之间的相互作用的能力。在本文中，使用表达GITR的CHO细胞和重组GITRL的流式细胞术测定用于评价阻断能力。GITR抗体，TRX-518，用作这些研究的对照。
图4A、4B、4C、4D和4E是一系列图，描述本公开内容的GITR-靶向分子，称为hzC06v1.1、hzC06v1.2、hzC06v1.3、hzC06v1.4、hzC06v2.1、hzC06v2.2、hzC06v2.3、hzC06v2.4、hzC06v3、hzC06v3.1、hzC06v3.2、hzC06v3.3、hzC06v3.4、hzC06v3.5、hzC06v3.6、hzC06v3.7、hzC06v3.8、hzC06v3.9、hzC06v3.10、hzC06v3.11和hzC06v3.12，与CHO细胞的表面上表达的人GITR和食蟹猴GITR (“cyno GITR”)的结合，如通过流式细胞术测量的。
图5A、5B、5C、5D和5E是一系列图，描述本公开内容的GITR-靶向分子，称为hzC04v4.1、hzC04v4.1.2、hzC04v4.2、hzC04v4.2.2、hzC04v5、hzC04v1.2.1、hzC04v5.1、hzC04v5.2、hzC04v5.3、hzC04v5.4、hzC04v5.5、hzC04v5.6、hzC04v5.7、hzC04v5.8、hzC04v5.9、hzC04v5.10、hzC04v5.11和hzC04v5.12，与CHO细胞的表面上表达的人GITR和食蟹猴GITR (“cyno GITR”)的结合，如通过流式细胞术测量的。
图6是本公开内容的四价抗-GITR分子的示意图，其用两个串联拷贝的单结构域可变区(sdAb)与人IgG1 Fc结构域融合构建。代替分子用衍生自小鼠IgG2a的Fc结构域构建。
图7是描述本公开内容的抗-GITR分子(在本文称为四价hzC06-hIgG1)与原代人T细胞结合的图。四价hzC06-hIgG1用两个拷贝的SEQ ID NO: 93的GITR-结合分子(其进而用两个串联拷贝的SEQ ID NO: 59的单结构域可变区(sdAb)构建)与SEQ ID NO: 1的人IgG1Fc结构域融合构建。
图8A和8B是一系列图，描述本公开内容的四价GITR-靶向分子激活表达GITR的报告细胞系中的NF-kB信号传导的能力。
图9A、9B和9C是一系列图，描述用本公开内容的四价GITR-靶向分子处理显著地减少CT26肿瘤生长，与给药日无关。
图10是一系列图，描述本公开内容的四价GITR-靶向分子剂量依赖性抑制CT26肿瘤生长。
图11是一系列图，描述本公开内容的四价GITR-靶向分子剂量依赖性抑制MC38肿瘤生长。
图12A、12B和12C是一系列图，描述Fc功能对CT26肿瘤生长的抑制的影响。
图13A、13B和13C是一系列图，描述用四价GITR-靶向分子处理随后抵抗用CT26肿瘤再攻击。
图14A、14B和14C是一系列图，描述用本公开内容的四价GITR-靶向分子处理在肿瘤微环境内显著地减少Treg频率和改变Treg与Teffector细胞的比率。
图15A和15B是一系列图，描述用本公开内容的四价GITR-靶向分子处理显著地诱导CD8 T细胞激活和增殖。
详细描述
本公开内容提供了特异性接合糖皮质激素-诱导的TNFR-相关蛋白(GITR) (TNF受体超家族(TNFRSF)的成员)的分子。更特别地，本公开内容涉及至少结合GITR的多价分子。这些多价TNFRSF结合融合蛋白包含两个或更多个TNFRSF结合结构域(TBD)，其中至少一个TBD结合GITR，在本文称为“GITR-结合结构域” (GITR-BD)。
GITR是TNFRSF的成员，在肿瘤中在CD4+/CD25+/Foxop3+调节T-细胞(Treg)上组成型表达，和激活后在其它T-细胞群上上调。其被假设在Treg-介导的免疫学自身耐受性中具有主导作用。GITR激动剂减弱Treg的抑制活性，和在小鼠模型中表明增强肿瘤的效应T-细胞杀伤。因此，功能性GITR激动剂极可能用于肿瘤免疫疗法。
在一些实施方案中，本公开内容的融合蛋白掺有至少一个GITR-BD。在一些实施方案中，融合蛋白是多价融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白是多特异性融合蛋白，其结合GITR和第二抗原，例如任何其它TNFRSF成员。在一些实施方案中，融合蛋白是多特异性和多价融合蛋白。
在一些实施方案中，GITR-BD结合人和食蟹猴GITR。在一些实施方案中，GITR-BD阻断、抑制或以其它方式调节GITR和其配体GITR-配体(GITR-L)的相互作用。在其它实施方案中，GITR-BD不阻断、抑制或以其它方式调节GITR和GITR-L的相互作用。在一些实施方案中，本公开内容的融合蛋白掺有多个拷贝的相同GITR-BD。在一些实施方案中，本公开内容的融合蛋白掺有多个GITR-BD，其识别GITR上的相同表位。在一些实施方案中，本公开内容的融合蛋白掺有多个GITR-BD，其识别GITR上的不同表位。在一些实施方案中，本公开内容的融合蛋白掺有多个GITR-BD，其中一些GITR-BD阻断GITR-GITR-L相互作用，而其它不阻断GITR-GITR-L相互作用。在优选的实施方案中，本公开内容的GITR-靶向融合蛋白诱导肿瘤细胞的直接细胞死亡。
在一些实施方案中，GITR-靶向分子包括至少一个拷贝的特异性结合GITR的单结构域抗体(sdAb)序列。在一些实施方案中，GITR-靶向分子包括两个或更多个拷贝的特异性结合GITR的sdAb，例如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个或更多个拷贝的特异性结合GITR的sdAb。
单结构域抗体(sdAb)是抗体片段，由能够选择性结合特定抗原的单一单体可变抗体结构域组成。具有仅12-15 kDa的分子量，单结构域抗体比由两条蛋白重链和两条轻链构成的常见抗体(150-160 kDa)小得多，甚至比Fab片段(~50 kDa，一条轻链和半条重链)和单链可变片段(~25 kDa，两个可变结构域，一个来自轻链和一个来自重链)小。
单结构域抗体是其互补决定区是单结构域多肽的一部分的抗体。实例包括但不限于，重链抗体、天然缺少轻链的抗体、衍生自常规4-链抗体的单结构域抗体、工程改造的抗体和并非衍生自抗体的那些的单结构域支架。单结构域抗体可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和/或牛。在一些实施方案中，本文使用的单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，称为缺少轻链的重链抗体。为清楚的原因，这种衍生自天然缺少轻链的重链抗体的可变结构域在本文称为VHH，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分。这样的VHH分子可衍生自在骆驼科物种(例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和原驼)中产生的抗体。骆驼科之外的其它物种可产生天然缺少轻链的重链抗体；这样的VHH在本公开内容的范围内。
GITR VHH (美洲驼-衍生的)和人源化序列在下文显示，和CDR序列在下文提供的序列中显示。在一些实施方案中，GITR-结合sdAb与IgG Fc区融合，和在这些实施方案中，融合蛋白是二价的，每分子具有两个GITR-结合结构域。在一些实施方案中，两个GITR-结合sdAb (2x)与IgG Fc区融合，和在这些实施方案中，融合蛋白是四价的，每分子具有四个GITR-结合结构域。在一些实施方案中，三个GITR-结合sdAb (3x)与IgG Fc区融合，和在这些实施方案中，融合蛋白是六价的，每分子具有六个GITR-结合结构域。
示例性GITR-结合sdAb
B09
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2x H11v420 + Fc缺失多肽
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2x H11v420.1 + Fc缺失多肽
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2x H11v420 IgG1-Fc
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2x H11v420.1 IgG1-Fc
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2x H11v401 + Fc缺失多肽
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2x H11v401.1 + Fc缺失多肽
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2x H11v401 IgG1-Fc
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2x H11v401.1 IgG1-Fc
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2x H11v421 + Fc缺失多肽
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2x H11v421.1 + Fc缺失多肽
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2x H11v421 IgG1-Fc
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2x H11v421.1 IgG1-Fc
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3x H11v420 + Fc缺失多肽
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3x H11v420.1 + Fc缺失多肽
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3x H11v420 IgG1-Fc
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3x H11v420.1 IgG1-Fc
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3x H11v401 + Fc缺失多肽
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3x H11v401.1 + Fc缺失多肽
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3x H11v401 IgG1-Fc
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3x H11v401.1 IgG1-Fc
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3x H11v421 + Fc缺失多肽
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3x H11v421.1 + Fc缺失多肽
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3x H11v421 IgG1-Fc
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3x H11v421.1 IgG1-Fc
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在一些实施方案中，本公开内容的靶向GITR的融合蛋白包括通过氨基酸接头可操作连接的两个或更多个多肽序列。在一些实施方案中，这些接头主要由氨基酸甘氨酸和丝氨酸构成，在文本称为GS-接头。本公开内容的融合蛋白的GS-接头可具有各种长度，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸长。
在一些实施方案中，GS-接头包含选自GGSGGS，即(GGS)2 (SEQ ID NO: 12)；GGSGGSGGS，即(GGS)3 (SEQ ID NO: 13)；GGSGGSGGSGGS，即(GGS)4 (SEQ ID NO: 14)；和GGSGGSGGSGGSGGS，即(GGS)5 (SEQ ID NO: 15)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，接头是包含甘氨酸残基的柔性接头，例如通过非限制性实例，GG、GGG、GGGG (SEQ ID NO: 16)、GGGGG (SEQ ID NO: 17)和GGGGGG (SEQ ID NO: 18)。
在一些实施方案中，GITR-结合融合蛋白包括GS-接头和甘氨酸接头的组合。
在一些实施方案中，多价GITR-靶向融合蛋白是四价的。在一些实施方案中，本公开内容的四价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-靶向融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc。在一些实施方案中，本公开内容的四价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-结合融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc，其中GITR-BD是结合GITR的分离的多肽序列。在一些实施方案中，本公开内容的四价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-结合融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc，其中GITR-BD是结合GITR的sdAb序列。在一些实施方案中，本公开内容的四价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-结合融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc，其中GITR-BD是结合GITR的人源化或全人sdAb序列。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含互补决定区1 (CDR1)，其包含选自SEQID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；互补决定区2(CDR2)，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和互补决定区3 (CDR3)，其包含选自SEQ ID NO:108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含至少一个包含选自SEQID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，四价GITR-靶向分子包含选自SEQ ID NO: 81-93的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多价GITR-靶向融合蛋白是六价的。在一些实施方案中，本公开内容的六价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-靶向融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc。在一些实施方案中，本公开内容的六价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-靶向融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc，其中GITR-BD是结合GITR的人源化或分离的多肽序列。在一些实施方案中，本公开内容的六价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-靶向融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc，其中GITR-BD是结合GITR的sdAb序列。在一些实施方案中，本公开内容的六价GITR-靶向分子包括两个拷贝的具有以下结构的GITR-靶向融合蛋白：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc，其中GITR-BD是结合GITR的人源化或全人sdAb序列。在一些实施方案中，六价GITR-靶向分子包含互补决定区1 (CDR1)，其包含选自SEQ ID NO: 106、109、112、117、120、125、131、138、143、148和149的氨基酸序列；互补决定区2 (CDR2)，其包含选自SEQ ID NO: 107、110、113、115、118、121、123、128、130、132、134、136、137、139、141、144和147的氨基酸序列；和互补决定区3 (CDR3)，其包含选自SEQ ID NO: 108、111、114、116、119、122、124、126、127、129、133、135、140、142、145、146和150的氨基酸序列。在一些实施方案中，六价GITR-靶向分子包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 19-80的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，六价GITR-靶向分子包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 42-62的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，六价GITR-靶向分子包含至少一个包含选自SEQ ID NO: 63-80的氨基酸序列的GITR-BD。在一些实施方案中，六价GITR-靶向分子包含选自SEQ ID NO: 94-105的氨基酸序列。
本文所述的GITR-靶向蛋白可用于各种治疗、诊断和预防性适应症。例如，GITR-靶向蛋白可用于治疗受试者的各种疾病和病症。在一些实施方案中，GITR-靶向蛋白可用于治疗患有或经鉴定为有风险患有炎性疾病或病症的受试者的疾病或病症，减轻其症状，改善和/或延迟其进展。在一些实施方案中，GITR-靶向蛋白可用于治疗癌症或其它肿瘤病况，减轻其症状，改善和/或延迟其进展。在一些实施方案中，癌症是膀胱癌、乳腺癌、子宫/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食管癌、胃肠癌、胰腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统的肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤和病毒相关癌症。在某些实施方案中，癌症是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。在一些实施方案中，GITR-靶向蛋白可用于减少或损耗有需要的受试者的肿瘤中的T调节细胞的数量。在一些实施方案中，GITR-靶向蛋白可用于刺激受试者的免疫反应。在一些实施方案中，GITR-靶向蛋白可用于治疗自身免疫疾病或病症，减轻其症状，改善和/或延迟其进展。在一些实施方案中，GITR-靶向蛋白可用于治疗病毒、细菌和寄生虫感染，减轻其症状，改善和/或延迟其进展。
本公开内容的治疗制剂，其包括本公开内容的GITR-靶向分子，用于治疗或减轻与受试者的GITR的异常活性和/或表达相关疾病或病症有关的症状。治疗方案通过使用标准方法，包括各种临床和/或实验室程序的任何一种，鉴定患有(或有风险发生)与GITR的异常活性和/或表达相关的疾病或病症的受试者，例如，人患者进行。术语患者包括人和兽医受试者。术语受试者包括人和其它哺乳动物。
结合用于诊断或治疗与GITR的异常活性和/或表达有关的特定疾病或病症的任何已知的方法确定治疗功效。与GITR的异常活性和/或表达有关的疾病或病症的一个或多个症状的减轻表明GITR-靶向分子产生临床益处。
本公开内容的GITR-靶向分子的治疗用途还可包括给予一种或多种另外的药剂。在一些实施方案中，一种或多种另外的药剂是抗-GITR抗体或融合蛋白、抗-PD1抗体或融合蛋白、LAG-3抗体或融合蛋白、CTLA-4抗体或融合蛋白和/或PD-L1抗体或融合蛋白。
本发明的GITR-靶向分子可单独或与其它治疗方式一起给予。它们可在其它治疗方式之前、基本上同时或之后提供，所述其它治疗方式例如手术、化学疗法、放射疗法或给予生物制剂例如另一种治疗性多肽/抗体。
在一些实施方案中，本发明的GITR-靶向分子可与化学治疗剂组合使用。化学治疗剂的实例包括但不限于，烷化剂，例如塞替派和Cytoxan®环磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯并多巴、卡波醌、meturedopa和uredopa；乙撑亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；多聚乙酰(特别是bullatacin和bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065 (包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；cryptophycins (特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀；duocarmycin (包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、氧氮芥盐酸盐、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯炔类抗生素(例如，卡奇霉素，特别是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1 (参见例如，Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994))；dynemicin，包括dynemicin A；二膦酸盐，例如氯膦酸盐；esperamicin；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯炔类抗生素生色团)、aclacinomysins、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、chromomycinis、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、Adriamycin®多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯并-多柔比星和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泼非霉素、 嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗-代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗-肾上腺素，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；醋酸羟哔咔唑；epothilone；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；maytansinoids，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK®多糖复合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和anguidine)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷，例如，Taxol®紫杉醇(Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton,N.J.)、Abraxane® (不含克列莫佛的白蛋白-工程改造的紫杉醇纳米颗粒制剂) (AmericanPharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)和Taxotere®多西他赛(Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France)；瘤可宁；Gemzar®吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；Navelbine®长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar, CPT-11) (包括伊立替康与5-FU和亚叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨；考布他汀；亚叶酸钙(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR (例如，erlotinib (Tarceva®))和VEGF-A的抑制剂，和上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
进一步的非限制性示例性化学治疗剂包括用于调节或抑制对癌症的激素作用的抗-激素剂，例如抗-雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如，他莫昔芬(包括Nolvadex®他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和Fareston®托瑞米芬；抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节在肾上腺中的雌激素产生，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、Megase®醋酸甲地孕酮、Aromasin®依西美坦、formestanie、法倔唑、Rivisor®伏氯唑、Femara®来曲唑和Arimidex®阿那曲唑；和抗-雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制参与异常细胞增殖的信号传导途径中的基因(例如PKC-α、Ralf和H-Ras)的表达的那些；核酶，例如VEGF表达抑制剂(例如，Angiozyme®核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，例如基因疗法疫苗，例如Allovectin®疫苗、Leuvectin®疫苗和Vaxid®疫苗；Proleukin® rIL-2；Lurtotecan®拓扑异构酶1抑制剂；Abarelix® rmRH；和上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在一些实施方案中，本发明的GITR-靶向分子可与抗-血管发生剂一起使用。血管发生剂是指小分子量物质、多核苷酸(包括，例如抑制性RNA (RNAi或siRNA))、多肽、分离的蛋白、重组蛋白、抗体或其缀合物或融合蛋白，其直接或间接抑制血管发生、血管生成或不需要的血管渗透性。应理解，抗-血管发生剂包括结合和阻断血管生成因子或其受体的血管发生活性的那些药剂。例如，抗-血管发生剂是血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如，VEGF-A的抗体(例如，贝伐单抗 (Avastin®))或VEGF-A受体(例如，KDR受体或Flt-1受体)的抗体、抗-PDGFR抑制剂例如Gleevec® (甲磺酸伊马替尼)、阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如，PTK787/ZK2284、SU6668、Sutent®/SU11248 (sunitinib malate)、AMG706或在例如，国际专利申请WO 2004/113304中描述的那些。抗-血管发生剂还包括天然的血管发生抑制剂，例如，血管他丁、内皮他丁等。参见例如，Klagsbrun和D’Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit和Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (例如表3，列举了恶性黑素瘤的抗-血管发生疗法); Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (例如，表2，列举了已知的抗-血管发生因子)；和Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206 (例如，表1，列举了临床试验中使用的抗-血管发生剂)。
在一些实施方案中，GITR-靶向分子与其它抗-肿瘤剂组合使用，例如抗-HER-2抗体、抗-CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如，erlotinib (Tarceva®)、血小板衍生的生长因子抑制剂(例如，Gleevec® (甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如，塞来考昔)、干扰素、CTLA4抑制剂(例如，抗-CTLA抗体ipilimumab (YERVOY®))、PD-1抑制剂(例如，抗-PD1抗体、BMS-936558)、PDL1抑制剂(例如，抗-PDL1抗体、MPDL3280A)、PDL2抑制剂(例如，抗-PDL2抗体)、细胞因子、结合一个或多个以下靶标ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-β, BlyS, APRIL, BCMA, PD-1, PDL1, PDL2,CTLA4或VEGF受体的拮抗剂(例如，中和抗体)、TRAIL/Apo2和其它生物活性和有机化学药剂等。
在一些实施方案中，在与一种或多种其它药剂组合治疗期间和/或之后给予GITR-靶向分子。在一些实施方案中，GITR-靶向分子和其它药剂被配制在单一治疗组合物中，同时给予GITR-靶向分子和其它药剂。或者，GITR-靶向分子和其它药剂彼此分开，例如，各自配制在单独的治疗组合物中，同时给予GITR-靶向分子和其它药剂，或在治疗方案期间在不同的时间给予GITR-靶向分子和其它药剂。例如，GITR-靶向分子在给予其它药剂之前给予，GITR-靶向分子在给予其它药剂之后给予，或GITR-靶向分子和其它药剂以交替方式给予。如本文所述的，GITR-靶向分子和其它药剂以单剂量或多个剂量给予。
在一些实施方案中，GITR-靶向分子和其它药剂同时给予。例如，GITR-靶向分子和其它药剂可配制在单一组合物中，或作为两个或更多个单独的组合物给予。在一些实施方案中，GITR-靶向分子和另外的药剂序贯给予，或GITR-靶向分子和另外的药剂在治疗方案期间在不同的时间给予。
用于筛选具有需要的特异性的GITR-靶向分子的方法包括但不限于，酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶测定法、流式细胞术和本领域已知的其它免疫学介导的技术。
本公开内容进一步提供了编码本发明的融合蛋白的核酸序列，特别是DNA序列。优选地，DNA序列被适合于染色体外复制的载体携带，例如噬菌体、病毒、质粒、噬菌粒、粘粒、YAC或附加体。特别地，编码需要的融合蛋白的DNA载体可用于促进制备本文所述的GITR-靶向分子的方法和获得大量的融合蛋白。DNA序列可插入合适的表达载体，即，包含用于转录和翻译插入的蛋白-编码序列的必要元件的载体。各种宿主-载体系统可用于表达蛋白-编码序列。这些包括被病毒(例如，牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；被病毒(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物例如含酵母载体的酵母，或被噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。根据使用的宿主-载体系统，可使用许多合适的转录和翻译元件中的任何一个。
本公开内容还提供了通过在导致表达多肽的条件下培养细胞产生GITR-靶向分子的方法,其中细胞包含编码本文所述的GITR-靶向分子的分离的核酸分子，和/或包括这些分离的核酸序列的载体。本公开内容提供了通过在导致表达GITR-靶向分子的条件下培养细胞产生GITR-靶向分子的方法，其中细胞包含编码本文所述的GITR-靶向分子的分离的核酸分子，和/或包括这些分离的核酸序列的载体。
本公开内容的融合蛋白(本文亦称为“活性化合物”)和其衍生物、片段、类似物和同源物，可掺入适合于给予的药物组合物中。这样的组合物通常包含融合蛋白和药学上可接受的载体。如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”意欲包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣料、抗微生物和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等，其与药物给予相容。合适的载体描述于本领域的标准参考书Remington’s Pharmaceutical Sciences的最新版本中，其通过引用并入本文。这样的载体或稀释剂的合适的实例包括但不限于水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。脂质体和非水性溶媒例如固定油也可使用。用于药物活性物质的这样的介质和试剂的使用是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在组合物中的用途。补充的活性化合物也可掺入组合物中。
本公开内容的药物组合物经配制以与其预期给药途径相容。给药途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、肿瘤内、口服(例如吸入)、透皮(即，局部)、透粘膜和直肠给予。用于胃肠外、皮内或皮下施用的溶液或混悬液可包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢纳；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。pH可用酸或碱调节，例如盐酸或氢氧化钠。胃肠外制剂可包装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(水溶性时)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内注射，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，和应该为流体的，至容易注射的程度。其在制备和贮存的条件下必须是稳定的，和必须针对微生物例如细菌和真菌的污染作用防腐。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物。合适的流动性可例如通过使用包衣料例如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持需要的粒径，和通过使用表面活性剂来保持。阻止微生物作用可通过各种抗细菌和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌可注射溶液可通过将需要量的活性化合物掺入合适的溶剂，按需要含上述一种成分或各成分的组合，接着过滤除菌来制备。通常，分散剂通过将活性化合物掺入包含基础分散介质和需要的上述其它成分的无菌溶媒来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其得到活性成分加来自之前其无菌过滤溶液的任何其它需要的成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可包封在明胶胶囊中或压制成片剂。为口服治疗性给予的目的，活性化合物可掺有赋形剂和以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物还可使用用作漱口剂的流体载体制备，其中流体载体中的化合物口服施用和漱口，并吐出或咽下。药学上相容的粘合剂和/或辅助材料可作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可包含任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶态二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或矫味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙矫味剂。
对于通过吸入给予，化合物以气溶胶喷雾剂的形式自包含合适的抛射剂，例如气体，例如二氧化碳的加压容器或分配器，或喷雾器中递送。
系统给予也可通过透粘膜或透皮方式。对于透粘膜或透皮给予，适合于待渗透的屏障的渗透剂用于制剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的，和对于透粘膜给予，包括例如去垢剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。透粘膜给予可通过使用鼻喷雾剂或栓剂实现。对于透皮给予，活性化合物配制为软膏剂、药膏、凝胶或霜剂，如本领域通常已知的。
化合物也可以栓剂(例如用常规栓剂基质，例如可可脂和其它甘油酯)或滞留灌肠剂的形式制备用于直肠递送。
在一个实施方案中，活性化合物用保护化合物免于自身体快速消除的载体制备，例如控制释放制剂，包括植入剂和微胶囊递送系统。可使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的方法对本领域技术人员是显而易见的。所述材料也可市售获自Alza Corporation和NovaPharmaceuticals, Inc。脂质体混悬液也可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域已知的方法制备，例如描述于美国专利号4,522,811。
特别有利的是，配制呈容易给予和剂量均匀的单位剂型的口服或胃肠外组合物。本文使用的单位剂型是指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位包含预定量的活性化合物，其经计算以与需要的药用载体结合产生需要的治疗性效果。本公开内容的单位剂型的规格由活性化合物的独特性质和实现的特定治疗效果，以及配制用于治疗个体的这样的活性化合物的领域中固有的局限性规定和直接取决于它们。
药物组合物可与给药说明书一起包括在试剂盒、容器、包装或分配器中。这些药物组合物可与使用说明书一起包括在诊断试剂盒中。
药物组合物以有效治疗或预防特定适应症的量给予。治疗有效量通常取决于治疗的受试者的重量、他或她的身体或健康状况、治疗的病况的广泛性或治疗的受试者的年龄。在一些实施方案中，药物组合物可以范围为约50 μg/kg体重至约50 mg/kg体重/剂量的量给予。在一些实施方案中，药物组合物可以范围为约100 μg/kg体重至约50 mg/kg体重/剂量的量给予。在一些实施方案中，药物组合物可以范围为约100 μg/kg体重至约20 mg/kg体重/剂量的量给予。在一些实施方案中，药物组合物可以范围为约0.5 mg/kg体重至约20mg/kg体重/剂量的量给予。
在一些实施方案中，药物组合物可以范围为约10 mg至约1,000 mg/剂量的量给予。在一些实施方案中，药物组合物可以范围为约20 mg至约500 mg/剂量的量给予。在一些实施方案中，药物组合物可以范围为约20 mg至约300 mg/剂量的量给予。在一些实施方案中，药物组合物可以范围为约20 mg至约200 mg/剂量的量给予。
药物组合物可按需要给予受试者。在一些实施方案中，有效剂量的药物组合物给予受试者一次或多次。在各种实施方案中，有效剂量的药物组合物给予受试者一月一次、一月少于一次例如每两月一次、每三个月一次或每六个月一次。在其它实施方案中，有效剂量的药物组合物给予一月超过一次，例如，每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每日一次或每日多次。有效剂量的药物组合物给予受试者至少一次。在一些实施方案中，有效剂量的药物组合物可给予多次，包括至少一个月、至少六个月或至少一年的时间。在一些实施方案中，药物组合物按需要给予受试者以减轻病况的一个或多个症状。
除非另外定义，否则结合本公开内容使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，单数术语应包括复数，和复数术语应包括单数。通常，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学和蛋白和寡或多核苷酸化学和杂交使用的命名法和其中的技术是本领域众所周知的和通常使用的。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术根据生产商的说明书，或按本领域通常进行的或如本文所述进行。前述技术和程序通常根据本领域众所周知的常规方法和按本说明书中引用和论述的各种一般性和更具体的参考文献中所述进行。参见例如，Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))。结合本文所述的分析化学、合成有机化学和医学和制药化学使用的命名法和其中的实验室程序和技术是本领域众所周知的和通常使用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送，和治疗患者。术语患者包括人和兽医受试者。
如根据本公开内容使用的，以下术语，除非另外指明，应被理解为具有以下含义：
如本文所用的，术语“靶向融合蛋白”和“抗体”可以是同义的。如本文所用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即包含特异性结合抗原(与抗原免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“与……免疫反应”或“针对……”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应，和不与其它多肽反应或以低得多的亲和力(Kd > 10-6)结合。抗体包括但不限于，多克隆、单克隆、嵌合、dAb (结构域抗体)、单链、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv、scFvs、Fab表达文库和单结构域抗体(sdAb)片段，例如VHH、VNAR、工程改造的VH或VK。
已知基础抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包含两对相同的多肽链，每对具有一个“轻链” (约25 kDa)和一个“重链” (约50-70 kDa)。每条链的氨基-末端部分包括约100-110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。每条链的羧基-末端部分定义了恒定区，其主要负责效应功能。通常，获自人的抗体分子涉及类型IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的任何一种，其彼此不同之处在于分子中存在的重链的性质。某些类型还具有亚类(亦称为同种型)，例如IgG1、IgG2等。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。
如本文所用的，术语“单克隆抗体” (mAb)或“单克隆抗体组分”是指一群抗体分子，其仅包含一个分子物类的抗体分子，由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成。特别地，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在该群体的所有分子中是相同的。Mab包含能够与特征为对其具有独特结合亲和力的抗原特定表位免疫反应的抗原结合位点。
术语“抗原-结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子的部分，其参与抗原结合。抗原结合位点由重链(“H”)和轻链(“L”)的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度不同的一段序列，称为“高变区”，插入在称为“架构区”或“FR”的较保守的侧翼段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白的高变区之间和其附近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对彼此分布，以形成抗原-结合表面。抗原-结合表面与结合的抗原的三维表面互补，和重链和轻链各自的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。各结构域的氨基酸的指定根据KabatSequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. (1987和1991))或Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)的定义。
本公开内容的融合蛋白的单结构域抗体(sdAb)片段部分在本文可互换地被称为本文的靶向多肽。
如本文所用的，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或其片段，或T-细胞受体/被免疫球蛋白或其片段，或T-细胞受体结合的任何蛋白决定簇。术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体/被免疫球蛋白或T-细胞受体结合的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子例如氨基酸或糖侧链的化学活性的表面簇集组成，和通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。当离解常数≤ 1 μM；例如，≤ 100 nM，优选≤10 nM和更优选≤ 1 nM时，抗体被认为特异性结合抗原。
如本文所用的，术语“免疫结合”和“免疫结合性质”和“特异性结合”是指在免疫球蛋白分子和免疫球蛋白对其是特异性的抗原之间发生的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可表示为相互作用的离解常数(Kd)，其中Kd越小，表示亲和力越大。选择的多肽的免疫结合性质可使用本领域众所周知的方法量化。一种这样的方法需要测量抗原-结合位点/抗原复合物形成和离解的速率，其中这些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力和在两个方向上同等影响速率的几何参数。因此，“结合速率常数”(kon)和“离解速率常数” (koff)二者可通过计算结合和离解的浓度和实际速率来计算。(参见Nature 361:186-87 (1993))。koff /kon的比率能够消除不涉及亲和力的所有参数，和等同于离解常数Kd。(一般性参见Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473)。当平衡结合常数(Kd)≤1 μM、优选≤ 100 nM、更优选≤10 nM和最优选≤ 100 pM至约1 pM时，认为本公开内容的抗体特异性结合抗原，如通过测定法例如放射配体结合测定法、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术结合测定法或本领域技术人员已知的类似测定法测量的。
优选地，不相同的残基位置不同之处在于保守氨基酸置换。
保守氨基酸置换是指具有类似侧链的残基的可互换性。例如，一组具有脂族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。合适的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所述的，本公开内容预期包括抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的较小变化，只要氨基酸序列的变化保持至少75%、更优选至少80%、90%、95%和最优选99%。特别地，预期保守氨基酸置换。保守置换是在其侧链相关的氨基酸家族内发生的那些。遗传编码的氨基酸通常分为以下家族：(1) 酸性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸；(2) 碱性氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3) 非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4) 不带电荷的极性氨基酸是甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其它氨基酸家族包括(i) 丝氨酸和苏氨酸，其是脂族-羟基家族；(ii) 天冬酰胺和谷氨酰胺，其是含酰胺家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，其是脂族家族；和(iv) 苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其是芳族家族。例如，可合理预期，亮氨酸被异亮氨酸或缬氨酸、天冬氨酸被谷氨酸、苏氨酸被丝氨酸的单独置换，或氨基酸被结构相关的氨基酸的类似置换，对得到的分子的结合或性质不具有重大影响，特别是如果置换不涉及框架位点内的氨基酸。氨基酸变化是否产生功能肽可通过测定多肽衍生物的特定活性容易地确定。本文详细描述了测定法。本领域普通技术人员可容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。片段或类似物的合适的氨基-和羧基-端出现在功能结构域的边界附近。结构和功能结构域可通过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开或专有的序列数据库鉴定。优选地，计算机化比较方法用于鉴定在已知结构和/或功能的其它蛋白中出现的序列基序或预测的蛋白构象结构域。鉴定折叠成已知的三维结构的蛋白序列的方法是已知的。Bowie et al. Science 253:164 (1991)。因此，前述实例证实了本领域技术人员可识别序列基序和结构构象，其可用于定义根据本公开内容的结构和功能结构域。
优选的氨基酸置换是如下的那些：其(1) 减少对蛋白水解的敏感性，(2) 减少对氧化的敏感性，(3) 改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4) 改变结合亲和力，和(4) 赋予或修饰这样的类似物的其它物理化学或功能性质。类似物可包括具有并非天然存在的肽序列的序列的各种突变体。例如，单个或多个氨基酸置换(优选地，保守氨基酸置换)可在天然存在的序列中进行(优选地，在形成分子间接触的结构域外的多肽部分中)。保守氨基酸置换不应显著改变亲本序列的结构特征(例如，置换氨基酸不应趋于破坏亲本序列中存在的螺旋，或破坏表征亲本序列的其它类型的二级结构)。公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H.Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C.Branden和J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991));和Thornton et al. Nature 354:105 (1991)。
本文使用的术语“多肽片段”是指具有氨基末端和/或羧基-末端缺失，但剩余氨基酸序列与例如从全长cDNA序列推导的天然存在的序列中的对应位置相同的多肽。片段通常是至少5、6、8或10个氨基酸长，优选至少14个氨基酸长，更优选至少20个氨基酸长，通常至少50个氨基酸长，和甚至更优选至少70个氨基酸长。本文使用的术语“类似物”是指包含至少25个氨基酸的区段的多肽，其与推导的氨基酸序列的一部分具有显著的同一性，并且在合适的结合条件下与GITR具有特异性结合。通常，相对于天然存在的序列，多肽类似物包含保守氨基酸置换(或添加或缺失)。类似物通常是至少20个氨基酸长，优选至少50个氨基酸长，或更长，可通常长达全长的天然存在的多肽。
肽类似物通常在医药工业中用作具有类似于模板肽的性质的非肽药物。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物”或“拟肽”。Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29(1986), Veber and Freidinger TINS p.392 (1985);和Evans et al. J. Med. Chem.30:1229 (1987)。这样的化合物通常在计算机化分子建模的帮助下开发。结构上类似于治疗有用肽的肽模拟物可用于产生同等的治疗或预防效果。通常，拟肽在结构上类似于范例多肽(即，具有生物化学性质或药理学活性的多肽)，例如人抗体，但通过本领域众所周知的方法，一个或多个肽连键任选被选自以下的连键置换：-- CH2NH--, --CH2S-, --CH2-CH2--, --CH=CH--(顺式和反式), --COCH2--, CH(OH)CH2--和-CH2SO--。共有序列的一个或多个氨基酸被相同类型的D-氨基酸系统置换(例如，D-赖氨酸替换L-赖氨酸)可用于产生更稳定的肽。此外，包含共有序列或基本上相同的共有序列变体的限制性肽可通过本领域已知的方法产生(Rizo和Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992))；例如通过添加能够形成分子内二硫桥的内部半胱氨酸残基，其将肽环化。
本文使用的术语“试剂”是指化合物、化合物的混合物、生物大分子和/或从生物材料制得的提取物。
如本文所用的，术语“标记”或“标记的”是指掺有可检测标志物，例如，通过掺入放射性标记的氨基酸或连接可被标记的亲和素(例如，包含荧光标志物或可被光学或量热方法检测的酶活性的链霉亲和素)检测的生物素部分的多肽。在某些情况下，标记或标志物还可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的，和可被使用。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H, 14C, 15N, 35S, 90Y,99Tc, 111In, 125I, 131I)、荧光标记(例如，FITC, 若丹明, 镧系元素磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基团、被第二报告子(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)识别的预定的多肽表位。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂连接，以减少潜在的空间位阻。本文使用的术语“药剂或药物”是指当适当给予患者时能够诱导需要的治疗效果的化合物或组合物。
如本文所用的，术语“治疗”、“治疗性”、“治疗法”等是指减少和/或改善病症和/或与其相关的症状。“减轻”和/或“缓解”意指减少、抑制、减弱、缩小、阻止和/或稳定疾病例如癌症的发展或进展。应理解，尽管不排除在外，但治疗病症或病况不需要病症、病况或与其相关的症状被完全消除。
在本公开内容中，“包含”、“含有”、“含”、“具有”等在美国专利法中可具有归于它们的含义，和可意指“包括”、“包含”等；术语“基本上由……组成”或“基本上由……构成”同样在美国专利法中具有归于它们的含义，和这些术语是开放式的，允许超过所述的存在，只要超过所述的存在不改变所述基本或新的特征，但不包括现有技术实施方案。
“有效量”是指相对于未治疗的患者，改善疾病的症状所需要的量。为疾病的治疗性治疗用于实施本公开内容的活性化合物的有效量根据给药方式、受试者的年龄、体重和一般健康而改变。最终，主治医生或兽医将决定合适的量和剂量方案。这样的量被称为“有效”量。
“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于，人或非人动物，例如牛、马、犬、啮齿动物、绵羊、灵长类动物、骆驼或猫。
如本文所用的术语“给予”是指传递、递送、引入或运输治疗剂至需要用这样的药剂治疗的受试者的任何方式。这样的方式包括但不限于，口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮内、鼻内和皮下给予。
“片段”是指一部分多肽或核酸分子。该部分优选包含全长参比核酸分子或多肽的至少10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%或90%。片段可包含10, 20, 30, 40, 50,60, 70, 80, 90,或100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900或1000个核苷酸或氨基酸。
本文提供的范围应理解为该范围内的所有值的速记法。例如，1-50的范围应理解为包括选自1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49或50的任何数字、数字的组合或子范围。
除非另外说明或从上下文显而易见，如本文所用的术语“一个”、“一种”和“所述”应理解为是单数或复数。除非另外说明或从上下文显而易见，如本文所用的术语“或”应理解为是包括性的。
除非另外说明或从上下文显而易见，如本文所用的术语“约”应理解为在本领域的正常容许偏差的范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可被理解为在所述值的10%,9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%或0.01%内。除非另外从上下文显而易见，本文提供的所有数值被术语“约”修饰。
本公开内容将在以下实施例中进一步描述，其不限制权利要求中描述的本公开内容的范围。
实施例
实施例1. GITR-靶向分子结合GITR
如图2A、2B和2C所示，本公开内容的各种GITR-靶向融合蛋白结合CHO细胞上表达的GITR，如通过流式细胞术评价的。GITR抗体，TRX-518，用作这些研究的对照。
在本文称为hzC06v1.1 (SEQ ID NO: 42), hzC06v1.2 (SEQ ID NO: 43),hzC06v1.3 (SEQ ID NO: 44), hzC06v1.4 (SEQ ID NO: 45), hzC06v2.1 (SEQ ID NO:46), hzC06v2.2 (SEQ ID NO: 47), hzC06v2.3 (SEQ ID NO: 48), hzC06v2.4 (SEQ IDNO: 49), hzC06v3 (SEQ ID NO: 50), hzC06v3.1 (SEQ ID NO: 51), hzC06v3.2 (SEQID NO: 52), hzC06v3.3 (SEQ ID NO: 53), hzC06v3.4 (SEQ ID NO: 54), hzC06v3.5(SEQ ID NO: 55), hzC06v3.6 (SEQ ID NO: 56), hzC06v3.7 (SEQ ID NO: 57),hzC06v3.8 (SEQ ID NO: 58), hzC06v3.9 (SEQ ID NO: 59), hzC06v3.10 (SEQ ID NO:60), hzC06v3.11 (SEQ ID NO: 61), hzC06v3.12 (SEQ ID NO: 62), hzC04v4.1 (SEQID NO: 63), hzC04v4.1.2 (SEQ ID NO: 64), hzC04v4.2 (SEQ ID NO: 65),hzC04v4.2.2 (SEQ ID NO: 66), hzC04v5 (SEQ ID NO: 67), hzC04v1.2.1 (SEQ ID NO:68), hzC04v5.1 (SEQ ID NO: 69), hzC04v5.2 (SEQ ID NO: 70), hzC04v5.3 (SEQ IDNO: 71), hzC04v5.4 (SEQ ID NO: 72), hzC04v5.5 (SEQ ID NO: 73), hzC04v5.6 (SEQID NO: 74), hzC04v5.7 (SEQ ID NO: 75), hzC04v5.8 (SEQ ID NO: 76), hzC04v5.9(SEQ ID NO: 77), hzC04v5.10 (SEQ ID NO: 78), hzC04v5.11 (SEQ ID NO: 79),和hzC04v5.12 (SEQ ID NO: 80)的GITR-靶向分子对在CHO细胞的表面上表达的人和食蟹猴GITR的结合亲和力通过流式细胞术测定。结果示于图4A-4E和5A-5E。
实施例2. GITR-靶向分子阻断GITR和GITR-L之间的相互作用
如图3A、3B和3C所示，本公开内容的各种GITR-靶向融合蛋白能够阻断GITRL和GITR之间的相互作用。简言之，在这些研究中，使用表达GITR的CHO细胞和重组GITRL的流式细胞术测定法用于实施，以评价阻断能力。GITR抗体，TRX-518，用作这些研究的对照。
实施例3. GITR-靶向分子对人和食蟹猴GITR的结合亲和力
在本文称为二价hzC06v3.9-hIgG1或2x hzC06v3.9-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 93)的GITR-靶向分子对人和食蟹猴GITR细胞外结构域人IgG1融合蛋白(GITR-Fc)的结合亲和力通过表面等离子体共振测定。简言之，生物素化的人和食蟹猴GITR-Fc被捕获到芯片表面上，然后以40ul/min注入10个浓度(0 nM – 600 nM)的二价hzC06v3.9-hIgG1，持续120秒。接着离解240秒。ka1、kd1和KD1在下表中报告。
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实施例4. GITR-靶向分子对原代人T细胞的结合
本公开内容的抗-GITR分子(在本文称为四价hzC06-hIgG1)对原代人T细胞的能力在此进行评价。四价hzC06-hIgG1用两个拷贝的SEQ ID NO: 93的GITR-结合分子构建，其进而用两个串联拷贝的与SEQ ID NO: 1的人IgG1 Fc结构域融合的SEQ ID NO: 59的单结构域可变区(sdAb)构建。
通过荧光激活细胞分选分离的全PBMC或纯化的Treg从健康人供体制备。细胞用补充有重组人IL2的抗-CD3和抗-CD28体外激活。细胞用各种浓度的四价hzC06-hIgG1和表面表型抗体混合物孵育。然后将样品洗涤和用荧光标记的抗-hIgG第二抗体染色，然后通过流式细胞术评价。活化的CD4 T细胞通过用CD3、CD4和CD25染色鉴定。对于来自三个供体的活化的CD4 T细胞(实心符号，实线)和来自两个供体的活化的Treg (空心符号，虚线)，这些研究的结果示于图7。
实施例5. GITR-靶向分子激活NF-kB信号传导
在表达GITR的报告细胞系中，四价抗-GITR-靶向分子激活NF-kB信号传导。本文所述的研究使用两个本公开内容的四价GITR-靶向分子。第一个四价GITR-靶向分子包括两个拷贝的GITR-结合融合蛋白，在本文称为2x hzC06v3.9 IgG1-Fc (SEQ ID NO: 93)，其进而包括两个拷贝的hzC06v3.9 GITR-BD (SEQ ID NO: 59)和SEQ ID NO: 1的IgG1 Fc多肽。第二个四价GITR-靶向分子包括两个拷贝的GITR-结合融合蛋白，在本文称为2x C06 IgG1-Fc，其进而包括两个拷贝的C06 GITR-BD (SEQ ID NO: 22)和SEQ ID NO: 1的IgG1 Fc多肽。
包含NF-kB-驱动分泌的碱性磷酸酶(SEAP)报告基因的HEK293细胞系用人GITR(图8A)或食蟹猴GITR (图8B)稳定转染。细胞系用滴定剂量的四价GITR抗体在37°C孵育过夜。SEAP报告基因表达通过水解底物定量，其通过650nM的光密度测量。
实施例6. 肿瘤模型中的GITR-靶向分子
如图9A-9C所示，用本公开内容的GITR-靶向分子治疗显著地减少CT26肿瘤生长，而与给药日无关。BALB/c小鼠用CT26结肠直肠癌细胞皮下接种，和在第7天(图9A)、第9天(图9B)或第11天(图9C)给予四价C06-hIgG1，其包括两个拷贝的GITR-结合融合蛋白，在本文称为2x C06-IgG1 Fc，其进而包括两个拷贝的SEQ ID NO: 22的GITR-BD和SEQ ID NO: 1的人IgG1 Fc多肽序列，或人IgG1-Fc作为对照，在各时间点上平均肿瘤体积是125、230或310 mm3。与人Fc比较，给予后6-8天开始，四价C06-IgG1 Fc治疗导致肿瘤生长显著降低，与治疗日无关(p < 0.05，通过双尾非配对t-检验确定)。
如图10所示，用本公开内容的GITR-靶向分子治疗产生CT26肿瘤生长的剂量依赖性抑制。BALB/c小鼠用CT26结肠直肠癌细胞皮下接种，和在第9天(大约肿瘤体积260 mm3)给予四价C06-mIgG2a，其包括两个拷贝的GITR-结合融合蛋白，在本文称为2x C06-mIgG12a Fc，其进而包括两个拷贝的SEQ ID NO: 22的GITR-BD和鼠IgG2a序列，或非特异性mIgG2a作为对照。与对照相比，当以2.5, 0.25, 0.08或0.025 mg/kg给予时(p < 0.05)，四价C06-mIgG2a治疗导致肿瘤体积显著降低。以0.008 mg/kg给予的四价C06-mIgG2a不显著地抑制CT26肿瘤生长。统计学显著性通过单向ANOVA确定，其中多次比较四价C06-mIgG2a组与mIgG2a。
如图11A-11B所示，用本公开内容的GITR-靶向分子治疗产生MC38肿瘤生长的剂量依赖性抑制。C57BL/6小鼠用MC38结肠直肠癌细胞皮下接种，和在第7天(平均肿瘤体积110-115 mm3)给予四价C06-mIgG2a或非特异性mIgG2a作为对照。与mIgG2a对照相比，在第14天开始，给予剂量0.08或更高的四价C06-mIgG2a导致显著肿瘤生长减少(p < 0.05) (图11A)。与mIgG2a对照相比，在第18天开始，0.025的四价C06-mIgG2a治疗显著地减少肿瘤生长(p < 0.05)。以0.008 mg/kg给予的四价C06-mIgG2a不显著地抑制MC38肿瘤生长。统计学显著性通过单向ANOVA确定，其中多次比较C06组与IgG2a。在MC38接种后第20天各个肿瘤体积显示于图11B。在该时间点在2.5, 0.25和0.08 mg/kg治疗组中存在类似的肿瘤生长减少。
实施例7. Fc功能对CT26肿瘤生长的抑制的影响
BALB/c小鼠用CT26结肠直肠癌细胞皮下接种，和在第9天(平均肿瘤体积260 mm3)给予具有野生型Fc或N297G突变以阻断与Fc受体结合(mIgG2a-沉默)的四价C06-mIgG2a。非特异性mIgG2a、抗-GITR mAb1-mIgG2a和抗-GITR对照mAb1-mIgG2a-沉默用作对照。如图12A所示，尽管具有野生型Fc的四价C06最有效，但与对照相比，野生型和沉默形式二者均显著地减少肿瘤生长(p < 0.05)。当以野生型Fc形式给予时mAb1仅抑制CT26生长。统计学显著性通过单向ANOVA确定，其中多次比较治疗组与mIgG2a。在CT26接种后第22天，各个肿瘤体积显示在图12B中。在Fc野生型和沉默形式的四价C06之间肿瘤生长的差异不显著，而形式对于mAb1抑制肿瘤生长的能力是显著的。Kaplan-Meier分析表明，用含野生型Fc的四价C06治疗能够显著地增强带CT26的小鼠的存活率(图12C)。与对于mIgG2a对照组的20天相比，在第10天单次给予四价C06-mIgG2a延长中位存活率至66天。
实施例8. 用GITR-靶向分子治疗对再次攻击产生抗性
已接受四价C06-mIgG2a-诱导的CT26消除的小鼠抵抗再次攻击。在用四价C06-mIgG2a治疗后已消除CT26肿瘤的BALB/c小鼠再次用CT26、Renca或EMT6鼠肿瘤细胞系接种。如图13A所示，之前消除CT26的小鼠在随后再次接种该模型后完全抵抗肿瘤生长。重要的是，幼稚、年龄匹配的小鼠证实CT26肿瘤生长。如图13B所示，Renca肿瘤在之前消除CT26的小鼠中生长不良好。事实上，四只小鼠中的两个完全抵抗，和一个小鼠与幼稚、年龄匹配的对照相比具有Renca生长显著降低。Renca与CT26共有T细胞表位，表明T细胞-介导的免疫被诱导。如图13C所示，EMT6肿瘤在BALB/c小鼠中生长良好，无论它们之前在C06治疗后消除了CT26还是幼稚的。EMT6与CT26不共有T细胞表位。
实施例9. 用GITR-靶向分子治疗对T细胞的影响
治疗显著地减少Treg频率和改变在肿瘤微环境内与T效应细胞的比率。BALB/c小鼠用CT26结肠直肠癌细胞皮下接种，和在第9天给予2.5 mg/kg具有野生型Fc或N297G突变以阻断与Fc受体结合(mIgG2a-沉默)的四价C06-mIgG2a。非特异性mIgG2a用作对照。治疗后3天，收集外周血和肿瘤和通过流式细胞术分析。如图14A所示，用四价C06-mIgG2a治疗显著地减少循环Treg、常规CD4 T细胞(4Tcon)和CD8 T细胞(8T)的频率(p < 0.05)。用mIgG2a-沉默形式未观察到影响。如图14B所示，用四价C06-mIgG2a治疗显著地减少肿瘤内Treg和常规CD4 T细胞的频率(p < 0.001)，但CD8 T细胞不改变。用mIgG2a-沉默形式未观察到影响。如图14C所示，作为四价C06-mIgG2a有效降低Treg的结果，效应T细胞与Treg的比率在肿瘤中显著地增加(p < 0.05)。统计学显著性通过双尾非配对t-检验确定。
实施例10. GITR-靶向分子对T细胞激活和增殖的影响
治疗显著地诱导CD8 T细胞激活和增殖。BALB/c小鼠用CT26结肠直肠癌细胞皮下接种，和在第9天给予2.5 mg/kg具有野生型Fc或N297G突变以阻断与Fc受体结合(mIgG2a-沉默)的四价C06-mIgG2a。非特异性mIgG2a用作对照。治疗后12天通过流式细胞术分析外周血。如图15A所示，用四价C06-mIgG2a治疗显著地诱导循环CD8 T细胞的频率(p < 0.005)，但Treg和常规CD4 T细胞不改变。用mIgG2a-沉默形式未观察到该影响。如图15B所示，在用四价C06-mIgG2a治疗后，CD8 T细胞还呈现活化的增殖表型(CD62L- Ki67+)。统计学显著性通过双尾非配对t-检验确定。
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Claims (26)

1.结合糖皮质激素-诱导的TNFR-相关蛋白(GITR)的分离的多肽，包含至少一个GITR-结合结构域(GITR-BD)，其中所述GITR-BD是包含选自SEQ ID NO: 50-62的氨基酸序列的单结构域抗体(sdAb)。
2.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽包含两个或更多个特异性结合GITR的GITR-结合结构域(GITR-BD)。
3.权利要求2的分离的多肽，其中所述两个或更多个GITR-结合结构域通过接头多肽可操作连接。
4.权利要求2-3中任一项的分离的多肽，其中每个GITR-BD包含选自SEQ ID NO: 50-62的氨基酸序列。
5.权利要求4的分离的多肽，其中所述多肽包含至少两个拷贝的相同GITR-BD。
6.权利要求1-3中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含免疫球蛋白Fc区多肽。
7.权利要求1-3中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽对于结合GITR是四价的，任选地其中所述多肽包含两个拷贝的融合蛋白，所述融合蛋白包含结构：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc。
8.权利要求1-3中任一项的分离的多肽，其中所述多肽对于结合GITR是六价的，任选地其中所述多肽包含两个拷贝的融合蛋白，所述融合蛋白包含结构：(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-(GITR-BD)-接头-铰链-Fc。
9.权利要求8的分离的多肽，其中每个GITR-BD包含选自SEQ ID NO: 50-59和61-62的氨基酸序列。
10.权利要求9的分离的多肽，其中每个GITR-BD包含SEQ ID NO: 59所示的氨基酸序列。
11.权利要求1-3中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列。
12.权利要求1-3中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽进一步包含一个或多个另外的结合结构域，所述另外的结合结构域结合并非GITR的靶标。
13.权利要求12的分离的多肽，其中所述一个或多个另外的结合结构域结合肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)。
14.权利要求13的分离的多肽，其中TNFRSF成员选自OX40、CD27、疱疹病毒进入介质(HVEM)、CD40、淋巴毒素β受体(LTBR)、外胚层发育异常蛋白A2受体(ED2R)、外胚层发育异常蛋白A受体(EDAR)、TweakR、B细胞成熟抗原(BCMA)、B细胞活化因子受体(BAFFR)、死亡受体3(DR3)、死亡受体6 (DR6)和CD137。
15.权利要求12的分离的多肽，其中所述一个或多个另外的结合结构域结合非TNFRSF成员。
16.权利要求12的分离的多肽，其中所述一个或多个另外的结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
17.权利要求16的分离的多肽，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv、Fab、单结构域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。
18.核酸，其编码权利要求1-17中任一项的多肽。
19.宿主细胞，其包含权利要求18的核酸。
20.药物组合物，其包含权利要求1-17中任一项的多肽。
21.权利要求20的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
22.权利要求21的用途，其中所述癌症是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。
23.权利要求21的用途，其中所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食管癌、胰腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统的肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
24.权利要求21的用途，其中所述癌症是病毒相关癌症。
25.权利要求21的用途，其中所述分离的多肽与抗-PD1或抗-PDL1抗体组合使用。
26.权利要求25的用途，其中所述抗体是抗-PD1抗体，并且所述抗-PD1抗体是BMS-936558。
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