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CN108498458B - 一种基于普鲁兰多糖的用于超声控制释放的纳米药物载体、药物载体系统及制备方法 - Google Patents

一种基于普鲁兰多糖的用于超声控制释放的纳米药物载体、药物载体系统及制备方法 Download PDF

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CN108498458B CN201810413528.XA CN201810413528A CN108498458B CN 108498458 B CN108498458 B CN 108498458B CN 201810413528 A CN201810413528 A CN 201810413528A CN 108498458 B CN108498458 B CN 108498458B
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Abstract

本发明公开了一种基于普鲁兰多糖的用于超声控制释放的纳米药物载体、药物载体系统及制备方法，属于生物材料技术领域。本发明通过酰化反应和氮氧自由基偶合反应先后在普鲁兰多糖侧链上修饰了4‑氯丁酰氯以及硬脂酸哌啶酯，制备出P‑OC。本发明还公开了超声控制释放载体系统的应用，P‑OC在水溶性环境中可以自组装形成胶束结构，内核包裹疏水抗癌药物，进而实现药物在时空的可控递送。载药纳米胶束P‑OC/DOX在外界超声条件下对癌细胞有较好的杀伤效果，而没有超声处理的对癌细胞抑制效果差，超声可控制释放药物载体系统P‑OC在药物缓释和癌症治疗领域具有潜在的应用价值。

Description

一种基于普鲁兰多糖的用于超声控制释放的纳米药物载体、 药物载体系统及制备方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种基于普鲁兰多糖的用于超声控制释放的纳米药物载体、药物载体系统及制备方法。
背景技术
目前，癌症已成为严重威胁人类健康的杀手，临床上治疗癌症常用方法有手术治疗、放射治疗、化疗药物治疗，其中化学药物治疗是重要的癌症治疗方法之一，但是由于其缺乏对肿瘤细胞的选择性，在体内代谢速度快，半衰期短，为达到治疗肿瘤效果，往往采用加大剂量给药的方式，从而造成在治疗过程中对人体正常组织产生严重毒副作用，如引起恶心、呕吐、脱发等副作用。极大的限制了这些抗癌药物在临床上的应用，因此设计出高效的药物递送载体对治疗癌症有重大意义。
这些药物递送载体在包载抗癌药物形成纳米颗粒后，能显著提高疏水抗癌药物的水溶性，增加药物在体内循环时间，并且利用肿瘤组织处的高渗透性和高滞留效应，实现药物载体的被动靶向至肿瘤组织处，有利于药物在肿瘤处聚集，提高药物的利用率。但是这些药物载体一般通过扩散或水解而缓慢释放药物，造成肿瘤细胞内达不到有效地药物浓度，降低了治疗效果并能引起癌细胞对药物的耐药性。因此设计出智能药物递送载体，在肿瘤处实现对药物释放的控制，对肿瘤的治疗有重大突破。
随着纳米科学领域的新成就和纳米医学的创新技术的快速发展，智能药物递送载体受到广泛科研工作者关注。智能药物递送载体即在某种特定环境刺激作用下，纳米药物载体发生了水解、构象、亲疏水性、质子化和溶解度等性质变化，使药物载体稳定性遭到破坏，结构发生变化，能使药物从递送载体中智能快速释放到病灶组织，形成刺激响应递送药物体系，提高药物在肿瘤组织处的药物浓度，最大程度的提高治疗效果并降低毒副作用。根据响应因素的不同，智能药物递送载体分为pH敏感型、氧化还原敏感型、酶敏感型、温度敏感型、磁场敏感型、光敏感型、超声敏感型等。其中超声敏感型是将超声用作外源刺激来设计智能纳米药物递送载体，相比较其他刺激因素，聚焦超声拥有更强的组织渗透性并且是以一种非侵入性的方式深入到身体内部，同时能实现在肿瘤组织处的时空控制药物释放，能更好的提高肿瘤治疗效果。因此设计出超声可控智能药物载体成为目前抗肿瘤治疗的一个重要方向。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于普鲁兰多糖的用于超声控制释放的纳米药物载体、药物载体系统及制备方法。
本发明的第一个目的在于提供一种基于普鲁兰多糖的用于超声控制释放的纳米药物载体，以超声敏感键将疏水分子硬脂酸与亲水分子普鲁兰多糖相连，构成一种两亲性分子，该载体具有式(Ⅰ)的结构：
进一步地，所述的普鲁兰多糖的平均分子量为30-200kDa，优选为50-150kDa，更优选为60-120kDa；所述的硬脂酸接枝率为3-10％。
本发明的第二目的在于提供所述基于普鲁兰多糖的用于超声控制释放的纳米药物载体的制备方法，首先将硬脂酰氯与4-羟基-2，2， 6，6-四甲基哌啶1-氧自由基(简称为HTEMPO)通过酰化反应形成疏水分子硬脂酸哌啶酯，然后用4-氯丁酰氯对普鲁兰多糖上羟基进行修饰，通过酰化反应生成亲水普鲁兰-4氯丁酰氯接枝聚合物，最后通过氮氧自由基偶合反应将硬脂酸哌啶酯与普鲁兰-4氯丁酰氯进行连接形成以普鲁兰多糖为主体材料的超声敏感两亲性分子。
本发明还提供本发明所述载体的优选的制备方法，包括如下步骤：
(1)氮气保护下，将4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶1-氧自由基和三乙胺溶于无水二氯甲烷中搅拌30min，随后将硬脂酰氯缓慢滴加，20-40℃搅拌反应24-48h，收集产物，通过柱层析法分离纯化，真空干燥，得到红色油状产物硬脂酸哌啶酯，将其置于4℃环境中保存；
(2)氮气保护下，将普鲁兰多糖(简称为Pullulan，P)在83℃溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，随后将4-氯丁酰氯缓慢滴加到普鲁兰多糖溶液中，之后加入吡啶，降温至20-60℃反应24-60h，收集产物，产物经透析纯化、冷冻干燥，得到普鲁兰-4氯丁酰氯接枝聚合物(简称为P-Cl)；
(3)氮气保护下，依次将(1)得到的硬脂酸哌啶酯、(2)得到普鲁兰-4氯丁酰氯接枝聚合物和2’2-联吡啶加入到无水N-甲基吡咯烷酮溶液中，25℃搅拌30min之后加入溴化亚铜，反应温度为 25-45℃，搅拌18-36h，经透析纯化、冷冻干燥，得到普鲁兰-硬脂酸哌啶酯聚合物(简称为P-OC)；
其中：
步骤(1)中所述的4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶1-氧自由基和硬脂酸摩尔比为1：(1-2)，优选为1：1.5，更优选为1：1.2；硬脂酸与三乙胺摩尔比为1：(0.5-2)，优选为1：(0.8-1.5)，更优选为1： (1-1.2)；
步骤(2)中所述的普鲁兰多糖与4-氯丁酰氯摩尔比为1：(1-5)，优选为1：(1-3)，更优选为1：2；4-氯丁酰氯和吡啶摩尔比为1：(0.5-2)，优选为1：(1-1.5)，更优选为1：1.2；
步骤(3)中所述的普鲁兰-4氯丁酰氯接枝聚合物和硬脂酸哌啶酯摩尔比为1：(0.5-2)，优选为1：(0.7-1.5)，更优选为1：(0.7-1.2)；普鲁兰-4氯丁酰氯接枝聚合物、2’2-联吡啶和溴化亚铜摩尔比为1： (2-8)：(1-4)，优选为1：(2-4)：(1-2)，更优选为1：4：2。
在上述制备方法的步骤(1)中，反应温度优选为25-30℃，更优选为30℃；反应时间优选为28-36h，更优选为30-32h。
在上述制备方法的步骤(2)中，反应温度优选为25-50℃，更优选为30-45℃；反应时间优选为30-56h，更优选为36-48h。
在上述制备方法的步骤(3)中，反应温度优选为30-40℃，更优选为35-40℃；反应时间优选为20-30h，更优选为24-28h。
在上述的制备方法中，在步骤(1)的优选技术方案为将4-羟基 -2，2，6，6-四甲基哌啶1-氧自由基和三乙胺溶于无水二氯甲烷中，冰浴搅拌30min，硬脂酰氯与适量无水二氯甲烷(V/V＝1：9)混匀，然后缓慢加入到4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶1-氧自由基溶液中，加入之后在升温至30℃反应。
在上述的制备方法中，在步骤(2)的优选技术方案为将普鲁兰在83℃溶解无水N，N-二甲基甲酰胺溶液，4h完全溶解，用无水N， N-二甲基甲酰胺将4-氯丁酰氯稀释10倍，缓慢加入到普鲁兰溶液中，降温至30-45℃反应。
在上述的制备方法中，在步骤(3)的优选技术方案为将硬脂酸哌啶酯、普鲁兰-4氯丁酰氯接枝聚合物和2’2-联吡啶加入到N-甲基吡咯烷酮中，25℃通氮气搅拌30min，排除溶液中氧气，之后加入溴化亚铜并持续通氮气，确保溶液中的无氧状态。
上述所述载体的优选的制备方法，其制备步骤如下式所示
本发明的第三目的在于提供可超声控制释放药物载体系统，包括载体和负载在所述载体上的药物，其中所述的载体为本发明所述的载体。
进一步地，所述的药物为阿霉素、紫杉醇、羟基喜树碱中的一种。
在所述可超声控制释放药物载体系统中，疏水性药物通过疏水作用被包覆于载体的疏水核心中，该聚合物能够在超声作用下快速释放疏水性药物，并保证疏水性药物在运输过程中结构的完整性。
本发明的第四目的在于提供本发明所述的可超声控制释放药物载体系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)将载体和疏水性药物搅拌混合，经透析、冷冻干燥后得载体负载药物系统；
其中，药物与载体的质量比为1：(5-30)，优选为1：(6-25)，更优选为1：(8-15)。
普鲁兰多糖是一种商业化天然多聚物，由于普鲁兰无毒、无诱变、无味、无免疫原性、无致癌以及生物可降解等独特的生物及物理化学优势，已被广泛用于食品、化妆品和医药行业。同时相比较其他多糖，普鲁兰的水溶性更好、黏度更低，吸引了许多生物医学应用领域的青睐，如药物递送、基因载体、组织工程等。普鲁兰多糖上富含羟基官能团，可通过一些化学基团修饰，连接疏水分子形成两亲性共聚物，用于抗癌药物或是基因的递送。本发明基于普鲁兰多糖为主体材料，通过氮氧自由基偶合反应将硬脂酸哌啶酯连接到经过修饰的普鲁兰 -4氯丁酰氯上，形成超声敏感键烷氧基胺(C-ON)制备得到可超声控制释药的药物载体P-OC，尚未见该类载体的报道，这种新型智能药物递送载体的研究将为纳米给药系统用于抗肿瘤治疗提供新思路。
本发明基于普鲁兰多糖的用于超声控制释放的药物载体系统 (P-OC)，在水溶性环境中可以自组装形成以硬脂酸哌啶酯为疏水核心，普鲁兰多糖为亲水外壳的纳米胶束。胶束的内核可以装载疏水性抗癌药物，进而实现药物载体递送系统。可超声控制释放的载体P-OC 独特的分子结构，使其在药物精准控制释放领域中具有潜在的应用价值。实验结果表明，负载阿霉素的本发明载体(P-OC/DOX)在外界超声(1.0MHz，9.9W)30min时，其阿霉素得到有效的释放，而没有超声处理的释放量较少，说明本发明的载体具有很好的超声控制释放行为。
在本发明中，利用本发明的载体制备以阿霉素为负载药物的药物载体超声控制递送系统的制备方法为：将P-OC溶于二甲基亚砜中，P-OC的浓度为3-5mg/mL，加入盐酸阿霉素和三乙胺溶于二甲基亚砜形成的混合液，混合液中盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1：(1-3)，阿霉素的浓度为4-6mg/mL，阿霉素与P-OC的混合质量比为1：(5-30)，搅拌0.5-2h，透析48-72h，冻干后即得到负载阿霉素的载药纳米胶束(P-OC/DOX)。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点：
(1)本发明制备的P-OC所使用的原料之一普鲁兰多糖是一种富含羟基的天然多糖，来源广泛，生物相容性良好。
(2)本发明将硬脂酸哌啶酯和4氯丁酰氯修饰的普鲁兰通过氮氧自由基偶合反应而制备得到P-OC，该制备方法高效、反应条件温和。
(3)本发明制备的P-OC在水溶性环境中可以自组装形成以硬脂酸哌啶酯为疏水核心，普鲁兰多糖为亲水外壳的纳米胶束。该胶束不仅能够包裹疏水性抗癌药物阿霉素，而且还可以通过外界超声控制药物释放，使其在药物精准控制释放领域中具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中制备基于普鲁兰多糖的用于超声控制释放的药物载体系统(P-OC)过程中，中间产物及终产物的1H NMR图谱；其中：a为溶于DMSO-d6的普鲁兰多糖(P)，b为溶于DMSO-d6的4 氯丁酰氯修饰的普鲁兰(P-Cl)，c和d分别为溶于D2O和DMSO-d6的普鲁兰-硬脂酸哌啶酯聚合物(P-OC)，e为溶于CDCl3的硬脂酸哌啶酯(OC)，f为硬脂酸哌啶酯(OC)高分辨质谱(HRMS)图谱。
图2为包载阿霉素后的P-OC超声控制释放药物载体的透射电镜图。
图3为载药纳米胶束P-OC/DOX在PBS(10mM，pH 7.4)缓冲液中的超声可控药物释放行为结果图。
图4为不同浓度纳米胶束P-OC与红细胞作用6h的溶血检测结果图。
图5为不同浓度纳米胶束P-OC与人乳腺癌细胞作用24h及48h 的毒性检测结果图。
图6为载药纳米胶束P-OC/DOX在外界超声条件下、没有超声处理以及游离阿霉素对人乳腺癌细胞作用24h的毒性检测结果图。
图7为载药纳米胶束P-OC/DOX在外界超声条件下、没有超声处理以及游离阿霉素对人乳腺癌细胞作用4h的细胞摄取定量分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以做出若干改造和变形，这些都属于本发明的保护范围。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
实施例1 P-OC的制备
(1)氮气保护下，在50mL圆底烧瓶中，将HTEMPO(1.034g， 6mmoL)和三乙胺(0.83mL)溶于15mL的无水二氯甲烷中搅拌并冰浴30min，随后将硬脂酰氯(1.81mL，6mmoL)溶于10mL无水二氯甲烷中，缓慢加入，30℃搅拌反应30h后，将反应混合物倒入分液漏斗中，用大量去离子水萃取，洗去未反应的HTEMPO，取出有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发去除二氯甲烷，剩余物用柱层析法分离杂质，用石油醚与乙酸乙酯9：1的洗脱液洗脱，得到红色油状产物硬脂酸哌啶酯(简称为OC)，将其置于4℃冰箱中保存。
(2)氮气保护下，在100mL圆底烧瓶中，将普鲁兰多糖(P， 1.62g 10mmol糖单元)置于50mL的无水N，N-二甲基甲酰胺中，在83℃溶解，随后将4-氯丁酰氯(1.72mL，15.37mmol)与10mL 的无水N，N-二甲基甲酰胺混合均匀，缓慢加入到普鲁兰溶液中，之后加入少量吡啶，降温至35℃反应36h，取出反应混合物置于过量无水乙醇中，搅拌，离心得到白色沉淀物，将沉淀物溶于少量去离子水中，置于透析袋(MWCO 3500)中，透析纯化72h，将透析液冷冻干燥，得到普鲁兰-4氯丁酰氯接枝聚合物(简称为P-Cl)，通过氢谱得出4氯丁酰氯的接枝率在7％左右；
(3)氮气保护下，依次将硬脂酸哌啶酯(0.1mmol，42.5mg)、普鲁兰-4氯丁酰氯接枝聚合物(nCl为0.07mmol，173mg)以及2’2- 联吡啶(0.2mmol，31.2mg)加入到20mL的N-甲基吡咯烷酮溶液的三颈烧瓶中，并持续通氮气，25℃搅拌30min，除去溶剂体系里的氧气，之后加入溴化亚铜(0.1mmol，14.3mg)，40℃搅拌反应 28h，之后将反应混合液倒入过量无水乙醇中，使P-OC沉淀出来，离心收集沉淀，将沉淀溶于少量去离子水中，置于透析袋(MWCO 3500)中，透析纯化72h，透析液冷冻干燥，得到普鲁兰-硬脂酸哌啶酯聚合物(简称为P-OC)，置于4℃冰箱中保存，通过氢谱得出硬脂酸哌啶酯的接枝率在7％左右。
得到的产物P-OC以硬脂酸哌啶酯为疏水核心，以普鲁兰多糖为亲水外壳，P-OC的结构式为：
实施例2 氢谱及高分辨质谱表征
将实施例1制备得到的OC溶于氘代氯仿和P-Cl、P-OC、P溶于氘代二甲基亚砜或氘代水中，通过核磁共振(1H NMR)进行结构验证，将实施例1制备得到的OC溶于二氯甲烷通过高分辨质谱进一步验证结构。
结果如图1所示，硬脂酸哌啶酯(e，CDCl3)的图谱中，在δ7.13ppm出现质子峰，是哌啶上氮氧自由基结合一个质子形成的特征峰，δ5.23ppm出现哌啶次甲基(-CH-O)质子峰，δ1.26ppm为哌啶上四个甲基(CH3)峰，而在δ0.88ppm出现硬脂酸上甲基和亚甲基质子峰，和其硬脂酸哌啶酯裂分峰一致。同时硬脂酸哌啶酯的高分辨质谱(f，CH2Cl2)中出现质荷比为411.3704的离子峰，是硬脂酸哌啶酯在正模式下形成的分子离子峰，即[M-H]+。综合上述可知，合成的硬脂酸哌啶酯结构表征准确。图1所示中，相对于普鲁兰P(a， DMSO-d6)的图谱，P-Cl(b，DMSO-d6)的图谱中出现新的质子峰，δ1.96ppm对应着4-氯丁酰氯上亚甲基峰(-CH2-)质子峰。在P-OC (c，DMSO-d6)的图谱中，在δ0.85ppm和δ1.23ppm处出现新的特征峰，分别对应着脂酸哌啶酯上硬脂酸-CH3和-CH2质子峰。而在P-OC (d，D2O)的图谱中，δ0.85ppm和δ1.23ppm的脂酸哌啶酯上硬脂酸特征峰消失，这是由于在重水环境下，P-OC两亲性分子通过自主装形成胶束结构，将脂酸哌啶酯包覆在疏水核心内部而无法检测出硬脂酸质子峰。
实施例3 P-OC/DOX载药纳米胶束的制备
将实施例1制备得到的20mg P-OC溶于4mL DMSO中，加入由2.1mg盐酸阿霉素及1.03μL三乙胺溶于400μL DMSO形成的混合液(其中，盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1：2，阿霉素的浓度为5mg/mL，阿霉素与P-OC的混合质量比为1：10)，并搅拌1h，透析72h，冻干后即得到P-OC/DOX载药纳米胶束。
实施例4 P-OC/DOX载药纳米胶束的透射电镜图
按照实施例3制备P-OC/DOX载药纳米胶束，配制成一定浓度的水溶液，使用透射电子显微镜测定P-OC包裹抗癌药物后的粒径和形态。结果如图2所示：载体在携带药物后粒径在37nm左右，结构为紧缩球型，且粒径分布较均一。
实施例5 P-OC/DOX载药纳米胶束体外药物释放实验
将实施例3制备的包载有200μg阿霉素的P-OC载药纳米胶束溶于2mL PBS(10mmol，pH7.4)缓冲液中，将溶液用超声仪器 (1.0MHz，9.9W)在37℃分别超声10min、20min、30min，之后转入透析袋(MWCO 3500)中，将透析袋浸没在装有100mL的 PBS(10mmol，pH7.4)缓冲液烧杯中，置于37℃恒温磁力搅拌器避光搅拌(搅拌转速为100rpm)。在预设的时间点，从烧杯中取出 3mL PBS，并向其加入3mL新鲜的PBS(10mmol，pH7.4)缓冲液，在λex＝505nm，λem＝561nm条件下于荧光分光光度计测得荧光强度，得到药物释放曲线。结果如图3所示：游离DOX在8h内累积释药量达到90％，并且DOX从透析袋中释放速度快，而载药纳米胶束 P-OC/DOX在没有超声处理下，其释药速度很缓慢，11h后累积释药量为37％，随后随着时间变化，释药量几乎没有变化，达到平衡状态，这有利于载药纳米胶束在血液循环过程中对阿霉素的保护，避免在非肿瘤组织处大量释放。在超声频率为1.0MHz，强度为9.9W，分别处理10、20、30分钟时，可发现随着超声时间增加，其24h后的药物累积释放量也逐渐增加，尤其是处理30分钟，DOX从载药纳米胶束的释放速率明显快于没有超声处理的载药纳米胶束P-OC/DOX，接近游离DOX释放速率，这是由于随着超声时间增加，其在PBS缓冲液(10mmol，pH7.4)中产生大量空穴效应，由此而产生的自由基、局部高温和剪切力，造成P-OC/DOX纳米胶束上不稳定机械化学键烷氧基胺(C-ON)发生裂解，胶束结构被破坏，从而释放出药物阿霉素。这体现了P-OC/DOX载药纳米胶束对DOX良好的超声控制释放，有利于实现在肿瘤组织处精准的时空释放，提高癌症治疗效果。
实施例6 纳米胶束P-OC溶血实验
取5mL抗凝后的无菌脱纤维绵羊血与5mL的PBS缓冲液混合，使用低速离心机以2000rpm，离心5min，缓慢地将上清血浆去除，留下红细胞，重复三次，直到上清液澄清，得到约为1mL的红细胞悬浮液，用PBS缓冲液稀释至50mL，缓慢混合均匀，作为2％(v/v) 的红细胞悬浮液，用于后续实验。取1mL不同浓度(1、2和4mg/mL) 实施例1制备纳米胶束P-OC，Tween 80溶液与1mL 2％(v/v)的红细胞悬浮液混合，使得P-OC胶束，Tween 80溶液得终浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，使用PBS和去离子水分别作为阴性和阳性对照。然后将混合液置于37℃，180rpm摇床中孵育6h，取出样品混合液。用低速离心机以2000rpm，离心5min，取出上清加入到96孔板，每孔加100μL，使用酶标仪检测血红蛋白在545nm处得吸光值，重复三次。从图4可以看出，作用6h后，其P-OC胶束在0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL浓度的溶血率不足3％，而Tween80 随着浓度从0.5mg/mL上升到2mg/mL，其溶血率由15.67％增加到71.88％，与空载体P-OC差异显著(p<0.05)。表明了纳米胶束P-OC 的血液相容性良好，利于载药纳米胶束在血液中循环而不会破坏血液中细胞。
实施例7 纳米胶束P-OC细胞毒性实验
对数生长期的人乳腺癌细胞(MCF-7)按照1×105/孔接种于96 孔板中，每孔100μL，在37℃、5％CO2下培养24h，将每孔的细胞培养基取出，加入100μL含有不同浓度实施例1制备纳米胶束P-OC 的培养基，于37℃，5％CO2的细胞培养箱作用24h或48h后，小心吸走培养液，向其加入100μL的MTT溶液(MTT浓度为 0.5mg/mL)，在37℃继续培养4h后，小心吸取MTT溶液，每孔加入100μL的DMSO，溶解甲瓒，使用酶标仪检测样品在630nm和 570nm处的吸光值，未经处理的细胞作为空白对照组。从图5可以看出，随着实施例1制备的P-OC胶束浓度从25μg/mL增加到 200μg/mL，P-OC胶束空载体作用到MCF-7细胞24h和48h后，其细胞存活率都处在90％以上，突出P-OC空载体拥有良好的细胞相容性，可用于后续研究载药载体对癌细胞的抑制效果。
实施例8 载药纳米胶束P-OC/DOX体外抗肿瘤效果
对数生长期的人乳腺癌细胞(MCF-7)按照1×105/孔接种于96 孔板中，每孔100μL，在37℃、5％CO2下培养24h，将每孔的细胞培养基取出，加入100μL含有包载不同阿霉素浓度实施例3制备 P-OC/DOX载药纳米胶束的培养基，继续培养4h后，将其置于超声 (1.0MHz，9.9W)条件下对其进行超声处理5min，其他处理组包括没有经过超声处理P-OC/DOX载药纳米胶束与细胞的共孵育以及游离阿霉素(Free DOX)，不同实验组作用细胞24h后，小心吸走培养液，向其加入100μL的MTT溶液(MTT浓度为0.5mg/mL)，在 37℃继续培养4h后，小心吸取MTT溶液，每孔加入100μL的DMSO，溶解甲瓒，使用酶标仪检测样品在630nm和570nm处的吸光值，未经处理的细胞作为空白对照组。从图6可以看出，实施例3制备载药纳米胶束P-OC/DOX在体外超声(1MHz，9.9W)5min时，对MCF-7 细胞有明显抑制效果，超声处理的载药纳米胶束在DOX浓度为 10μg/mL时，细胞存活率低于10％，而没有超声处理的载药纳米胶束在DOX浓度为10μg/mL时，其细胞存活率依旧在60％作用。同时通过计算半抑制浓度(IC50)值进行定量表征，从图6的数据点可计算出，载药纳米胶束P-OC/DOX在体外超声下和游离DOX对 MCF-7细胞的IC50分别为0.98μg/mL，1.12μg/mL，对细胞生长抑制没有差异，可表明实施例3制备P-OC/DOX载药纳米胶束有很好的超声控制释放性能。
实施例9 流式细胞仪检测细胞对载药纳米胶束P-OC/DOX的摄取
对数生长期的人乳腺癌细胞(MCF-7)按照1×105/孔接种于直径为35mm的细胞培养皿中，每个细胞培养皿加入2mL，在37℃、 5％CO2下培养24h，将培养皿中培养基取出，加入2mL阿霉素终浓度为10μg/mL的实施例3制备载药胶束P-OC/DOX的DMEM培养基，继续培养0.5h后，将其置于超声(1.0MHz，9.9W)条件下对其进行超声处理5min，其他处理组包括没有经过超声处理P-OC/DOX载药纳米胶束与细胞的共孵育以及相同浓度游离阿霉素(FreeDOX)，不同实验组作用细胞4h后，缓慢吸走培养皿中培养基，用PBS缓冲液洗三次，除去没有被细胞摄取的药物，每孔加入1mL的胰酶消化细胞，放在倒置显微镜下观察，当细胞逐渐分离脱落时，用吸管吸走胰酶，每孔加入1mL DMEM培养基，将贴壁细胞吹打下来并收集到1.5mL离心管中，随后将离心管置于离心机中，在2500rpm下离心 3min收集细胞，用PBS缓冲液洗三次，之后加入400μL PBS悬浮细胞，过300目尼龙网，之后使用流式细胞仪(FCM)检测MCF-7 细胞内阿霉素荧光强度，选择PE通道，设置激发波长为488nm，发射波长为580nm。从图7可以看出，实施例3制备载药纳米胶束 P-OC/DOX在体外超声(1MHz，9.9W)5min时，MCF-7细胞内的 DOX荧光强度要比没有超声处理的载药纳米胶束要高，通过显著性分析，两者存在显著差异(p<0.05)，说明实施例3制备载药纳米胶束P-OC/DOX在外界超声条件下可以实现细胞内可控释放，体现出了良好的超声在时空上的控释行为，这也显现出了载药胶束 P-OC/DOX在外界超声条件下的抗肿瘤优势。

Claims (8)

1.一种基于普鲁兰多糖的用于超声控制药物释放的纳米药物载体，其特征在于，以超声敏感键将疏水分子硬脂酸与亲水分子普鲁兰多糖相连，构成一种两亲性分子，该载体具有式(Ⅰ)的结构：
2.根据权利要求1所述的基于普鲁兰多糖的用于超声控制药物释放的纳米药物载体，其特征在于，所述的普鲁兰多糖的平均分子量为30-200kDa，所述的硬脂酸接枝率为3-10％。
3.根据权利要求1-2的任一项所述的基于普鲁兰多糖的用于超声控制药物释放的纳米药物载体的制备方法，其特征在于，首先将硬脂酰氯与4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶1-氧自由基通过酰化反应形成疏水分子硬脂酸哌啶酯，然后用4-氯丁酰氯对普鲁兰多糖上羟基进行修饰，通过酰化反应生成亲水普鲁兰-4氯丁酰氯接枝聚合物，最后通过氮氧自由基偶合反应将硬脂酸哌啶酯与普鲁兰-4氯丁酰氯进行连接形成以普鲁兰多糖为主体材料的超声敏感两亲性分子。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)氮气保护下，将4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶1-氧自由基和三乙胺溶于无水二氯甲烷中搅拌30min，随后将硬脂酰氯缓慢滴加，20-40℃搅拌反应24-48h，收集产物，通过柱层析法分离纯化，真空干燥，得到红色油状产物硬脂酸哌啶酯，将其置于4℃环境中保存；
(2)氮气保护下，将普鲁兰多糖在83℃溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，随后将4-氯丁酰氯缓慢滴加到普鲁兰多糖溶液中，之后加入吡啶，降温至20-60℃反应24-60h，收集产物，产物经透析纯化、冷冻干燥，得到普鲁兰-4氯丁酰氯接枝聚合物；
(3)氮气保护下，依次将(1)得到的硬脂酸哌啶酯、(2)得到普鲁兰-4氯丁酰氯接枝聚合物和2’2-联吡啶加入到无水N-甲基吡咯烷酮溶液中，25℃搅拌30min之后加入溴化亚铜，反应温度为25-45℃，搅拌18-36h，经透析纯化、冷冻干燥，得到普鲁兰-硬脂酸哌啶酯聚合物；
其中：步骤(1)中所述的4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶1-氧自由基和硬脂酰氯摩尔比为1:(1-2)，硬脂酰氯与三乙胺摩尔比为1:(0.5-2)；
步骤(2)中所述的普鲁兰多糖与4-氯丁酰氯摩尔比为1:(1-5)，4-氯丁酰氯和吡啶摩尔比为1:(0.5-2)；
步骤(3)中所述的普鲁兰-4氯丁酰氯接枝聚合物和硬脂酸哌啶酯摩尔比为0.7:1，普鲁兰-4氯丁酰氯接枝聚合物、2’2-联吡啶和溴化亚铜摩尔比为1:(2-8):(1-4)；
所述的普鲁兰-4氯丁酰氯接枝聚合物是以氯离子当量计算。
5.一种包含权利要求1或2所述的药物载体的给药系统，其特征在于，包括载体和负载在所述载体上的疏水性抗癌药物。
6.根据权利要求5所述的给药系统，其特征在于，所述的疏水性抗癌药物为阿霉素、紫杉醇、喜树碱中的一种。
7.一种权利要求5所述的给药系统的制备方法，包括如下步骤：将载体和疏水性药物搅拌混合，经透析、冷冻干燥后得可超声控制释放药物载体系统；
其中，疏水性药物与载体的质量比为1:(5-30)。
8.一种权利要求6所述的给药系统的制备方法，包括如下步骤：将载体和疏水性药物搅拌混合，经透析、冷冻干燥后得可超声控制释放药物载体系统；
其中，疏水性药物与载体的质量比为1:(5-30)。
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