CN108495641A

CN108495641A - 用于靶向cd38抗原和用于cd38基因失活的工程化的用于免疫疗法的细胞

Info

Publication number: CN108495641A
Application number: CN201680046216.9A
Authority: CN
Inventors: 马蒂尔德·迪索
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2015-08-11
Filing date: 2016-07-26
Publication date: 2018-09-04
Also published as: JP2018522907A; KR20180041152A; EP3334442A1; RU2018107754A3; IL257009A; US20180236053A1; US10709775B2; MX2018001776A; BR112018002600A2; RU2018107754A; CA2994746A1; WO2017025323A1; EP3334442B1; AU2016307050A1

Abstract

开发用于免疫疗法的基因工程化的免疫细胞的方法，通过以下事实，该方法可以获得靶向对于病理细胞和所述CD38免疫细胞两者是共同的抗原标志物的嵌合抗原受体：在所述免疫细胞内编码所述标志物的基因由稀切核酸内切酶如TALEN、Cas9或argonaute进行失活。

Description

用于靶向CD38抗原和用于CD38基因失活的工程化的用于免疫疗法的细胞

技术领域

本发明涉及开发用于免疫疗法的基因工程化的、优选是非同种异体反应性的免疫细胞的方法，该免疫细胞被赋予了靶向CD38抗原标志物的嵌合抗原受体，该CD38抗原标志物对病理细胞和免疫细胞来说是共同的。

方法包括表达针对所述抗原标志物的CAR；以及使免疫细胞中有助于所述抗原标志物存在于所述免疫细胞的表面上的基因失活。这种失活一般是通过使用编码RNA指导的核酸内切酶的转基因(例如:Cas9/CRISPR)、大范围核酸酶、锌指核酸酶或TAL核酸酶进行的。工程化的免疫细胞、优选是T细胞，将它们的免疫活性导向恶性细胞、被感染的细胞或有缺陷的免疫细胞，同时避免它们的相互破坏、自体刺激或聚集。本发明通过使用用于治疗癌症、感染和自身免疫疾病的免疫细胞为标准的和可负担的过继性免疫疗法策略开启新的途径。

背景技术

过继性免疫疗法(涉及离体产生的自体抗原特异性免疫细胞的转移)是治疗病毒感染和癌症的有前景的策略。例如，可以通过抗原特异性T细胞的扩增或通过基因工程使T细胞重定向而产生用于过继性免疫疗法的T细胞(Park,Rosenberg et al.2011)。

通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的基因转移已经成功地产生了T细胞中的新的特异性(Jena,Dotti et al.2010)。CAR是由与单一融合分子中的一个或多个信号转导结构域相关联的靶向部分组成的合成受体。通常，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，包括由柔性接头连接的单克隆抗体的轻片段和可变片段。也已成功地使用基于受体或配体结构域的结合部分。用于第一代CAR的信号转导结构域来源于CD3ζ或Fc受体γ链的胞质区。已经显示第一代CAR成功地重定向T细胞的细胞毒性，然而，它们不能在体内提供延长的扩增和抗肿瘤活性。单独地(第二代)或组合地(第三代)加入来自包括CD28、OX-40(CD134)和4-1BB(CD137)在内的共刺激分子的信号转导结构域以增强CAR修饰的T细胞的存活和增加其增殖。CAR成功允许T细胞重定向针对在来自各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞的表面表达的抗原(Jena,Dotti et al.2010)。

使用过继性免疫疗法用于治疗患者的当前方案是基于自体细胞转移。在该方法中，从患者回收T淋巴细胞、离体基因修饰或选择、在必要时体外培养以扩增细胞的数量并最后注入患者体内。除了淋巴细胞输注之外，也可以用其他方式操作宿主，这些其他方式支持T细胞的植入或它们参与免疫应答，例如预调节(放射或化学疗法)和给予淋巴细胞生长因子(如IL-2)。每个患者接受使用患者自身的淋巴细胞(即，自体疗法)的个别定制的治疗。自体疗法的实际应存在大量技术和后勤支持障碍，其产生需要昂贵的专用设施和专家人员，必须在患者的诊断之后的短时间内产生它们，并且在许多情况下，对患者的预处理导致降低的免疫功能，使得患者的淋巴细胞具有较差的功能性并且以极低的数量存在。由于这些障碍，每个患者的自体细胞制剂实际上是一种新的产品，具有在效力和安全性方面的显著变化。

理想地，需要使用标准化疗法，其中能够预制造同种异体治疗细胞、详细地表征并且可用于立即给予患者。同种异体是指细胞是从属于相同物种但是基因上不同的个体中获得。然而，同种异体细胞的使用目前具有许多缺点。在免疫感受性(immune-competent)宿主中，同种异体细胞被快速地排斥，这是称为宿主抗移植物排斥(HvG)的过程，并且这实质上限制了转移细胞的效力。在免疫非感受性的宿主中，能够植入同种异体细胞，但它们的内源性T细胞受体(TCR)特异性可以将宿主组织识别为外来的，导致移植物抗宿主疾病(GvHD)，其可导致严重的组织损伤和死亡。

为了提供同种异体T细胞，本发明人先前公开了基因工程化的T细胞的方法，其中通过用特异性的TAL核酸酶(以商标名TALEN^TM更为人熟知)失活不同的效应子基因，特别是编码T细胞受体的那些(Cellectis,8,rue de la Croix Jarry,75013PARIS)。已经证明该方法使用RNA转染作为平台的一部分在原代细胞中是高效的，允许大规模生产同种异体T细胞(WO 2013/176915)。

CD(分化簇38)，也称为环状ADP核糖水解酶，是在许多免疫细胞(白细胞)特别是T细胞的表面上发现的糖蛋白，免疫细胞包括CD4+、CD8+、B淋巴细胞和天然杀伤细胞。CD38还起细胞粘附、信号转导和钙信号传送的作用。关于该蛋白的结构信息可见于UniProtKB/Swiss-Prot数据库中、参考P28907。在人类中，CD38蛋白是由位于4号染色体上的CD38基因编码。CD38是催化环状ADP-核糖(cADPR)从NAD+至ADP-核糖的合成和水解的多功能胞外酶。这些反应产物被认为对于调节细胞内Ca2+是必需的。而且，CD38功能的丧失与受损的免疫应答和代谢紊乱相关(Malavasi F.,et al.(2008)."Evolution and function of theADP ribosyl cyclase/CD38gene family in physiology and pathology".Physiol.Rev.88(3):841–86)。

另一方面，CD38蛋白是HIV感染，白血病，髓瘤，实体瘤、II型糖尿病和骨代谢以及一些其他遗传确定的病症的标记。特别地，它已被用作白血病中的预后标记(Ibrahim,S.etal.(2001)CD38expression as an important prognostic factor in B-cell chroniclymphocytic leukemia.Blood 98:181-186)。

Mihara等人(2009)描述了基于TBH-7scFv的抗CD38嵌合抗原受体。这些工程化的T细胞不包含任何其他的遗传修饰。在该公开中强调活细胞的回收率非常低。

尽管表达CD38的细胞可以被认为是用于CAR的有吸引力的靶标，但事实上这样的抗原标志物也在大多数T细胞的表面表达，已经显著地妨碍了这些标志物的选择以进行免疫疗法。

本发明人在此提供了用于免疫疗法的策略，其涉及表达也存在于T细胞表面的CD38特异性抗原标志物的病理细胞。

发明内容

本发明公开了工程化旨在用于靶向病理细胞的T细胞的方法，而所述病理细胞表达也存在于T细胞表面上的CD38标志物。抗原标志物是指其免疫反应性片段的整个蛋白。

更具体地，本发明的工程化的免疫细胞涉及抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)，具有如在图8中所示的版本V1、V2和V3的特定结构；该抗CD38CAR具有作为胞质结构域的CD3ζ信号转导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，并且具有衍生自25A10、28F5、13F11、16B5、10F7、27B6或29B4单克隆抗体的VH链和VL链。

根据本发明，T细胞优选地被工程化以使编码这种CD38抗原标志物的基因的表达失活。该失活优选是通过基因组修饰进行的，更具体地，是通过在T细胞中表达能够靶向直接或间接地参与所述CD38抗原标志物在T细胞表面的产生或呈递的基因座的特异性稀切核酸内切酶进行的。可以使用不同类型的稀切核酸内切酶，如大范围核酸酶、TAL核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA/DNA指导的核酸内切酶如Cas9/CRISPR或argonaute(Ago)。在此，已经发现使用TALEN特别适合于失活CD38基因。在图1中示出了示意性表示。

根据优选的实施方式，本发明的免疫细胞被工程化以使编码CD38表面抗原的CD38基因失活，还提供了特异性抗CD38CAR，该双重基因修饰旨在特异性靶向癌性CD38表达性细胞，同时降低这些抗CD38CAR免疫细胞相互杀伤的风险。

根据另一优选的实施方式，所述双重基因工程化的抗CD38CAR细胞具有如在图8中所示出的V1、V2或V3的CAR结构，该抗CD38CAR具有作为胞质结构域的CD3ζ信号转导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，并且具有衍生自25A10、28F5、13F11、16B5、10F7、27B6或29B4单克隆抗体的VH链和VL链。

根据另一个实施方式，T细胞可以被进一步工程化以使它们是同种异体的，特别是通过删除参与自体识别的基因，例如编码T细胞受体(TCR)或HLA复合物的组分的那些。

根据另一个实施方式，T细胞可被进一步工程化以将至少一种表位或模拟表位整合在嵌合抗原受体的细胞外结合结构域中，以在需要时在体内耗尽这些工程化的T细胞。

本发明包括包含在具体实施方式、实施例和附图中陈述的遗传修饰的分离细胞或细胞系，以及有用于工程化所述T细胞的任何蛋白质、多肽或载体。

作为本发明的结果，工程化的T细胞可以用作用于治疗或预防癌症、感染或自身免疫疾病的方法中的治疗性产品，理想地是“现成的”(“off the shelf”)产品。特别地，它们最适合治疗多发性骨髓瘤(MM)或急性淋巴细胞性淋巴瘤(ALL)。

根据本发明的优选的免疫细胞是产生表型[CAR CD38]⁺[CD38]^-的那些、优选对于作为治疗性产品还是[TCR]阴性的、优选是同种异体的那些。

附图说明

图1：示意性示出根据本发明的工程化的T细胞，破坏了CD38并提供了靶向带有抗原标志物CD38的恶性细胞的嵌合抗原受体(表示为单链CAR)。

图2：A：示意性示出在T7启动子的控制下哺乳动物表达载体(pCSL10794)，该启动子用于使用限制性酶消化亚克隆每个TALE核酸酶构建体(插入物：SfaNI-BbvI和载体:BsmBI)。B：示意性示出在T7启动子的控制下哺乳动物表达载体(pCLS9632)，该启动子用于使用限制性酶消化(AscI和HindIII)亚克隆每个CAR构建体。

图3：CD38在T细胞中的表达：用抗CD3-CD28涂覆的微珠粒(Dynabeads，lifetechnologies)+20ng/ml的人IL2(Miltenyi)培养的新分离的T细胞。A：活化后第6天的T细胞的CD38表达。B：活化后超过3周的T细胞的CD38表达。

图4：本发明中进行的3次实验的时间标度：A：在T细胞中内源性CD38的Talen失活；B：在WT T细胞中转染编码CAR的mRNA；C：在纯化的CD38缺陷性T细胞中，在T细胞活化后转染编码CAR的mRNA。

图5：CD38抗原的外显子1的序列和通过TALEN测试CD38KO的3个靶标的序列；3个靶标CD38-1、CD38-2和CD38ex1-T2对应于连续的框架部分。

图6：TALEN mRNA转染7天后CD38阴性T细胞的百分比；3对TALEN CD38ex1-T2，CD38-1。

图7：A：在TALEN mRNA转染后，在用IL-2培养17天CD38阴性T细胞的百分比。B：在CD38阴性T细胞纯化后—T细胞电穿孔后第6天和T细胞活化后第10天—在IL-2存在下，培养11天T细胞生长(即增殖因子)-[图标：空心圆：无TALEN；实心圆：TALEN CD38-1和三角形：纯化的阴性CD38(TALEN CD38-1)；N表示每一种情况所执行的测试次数]。

图8：示出取决于所使用的铰链而设计和测试的抗CD38CAR的3个版本(V1、V2和V3)。

图9：用于亚克隆抗CD38CAR的构建质粒，具有各自scFv的Kd(nM)。

图10：使用Kifikit方法(Dako)针对CD38抗原的定量表达测试5个细胞系(MOLP8、Daudi、U266CD38+、U266CD38-和K562)。A：FAC分析；B：CD38表达的百分比和每个细胞CD38抗原的数量。

图11：新分离T细胞后转染编码CAR的mRNA 5天后筛选所有24种不同的CAR(8对scFv×3个版本V1、V2和V3)。使用蛋白L、抗Fab或CD38-Fc(N＝1)通过流式细胞术的CAR表达分析。

图12：激活新分离的T细胞后转染编码CAR的mRNA5天后筛选所有24个不同的CAR(8对scFv×3个版本V1、V2和V3)。用靶标细胞系(N＝1)孵育(5小时)后，在T细胞的质膜上的CD107a表达。

图13：比较wt、CD38缺陷型、纯化的CD38缺陷型抗CD38CAR T细胞。A：由LUNA细胞计数器评估的T细胞活力。B：使用CD38-Fc融合蛋白(N＝1)mRNA转染后第1天和第2天的CAR表达。

图14：比较wt、CD38缺陷型、纯化的CD38缺陷型抗CD38CAR T细胞。A：连同靶标细胞的T细胞孵育后CD107a+CD8T细胞的百分比。B：朝向无CAR T细胞和K562裂解归一化的靶标细胞裂解(N＝1)。

图15：使用CD38-Fc融合蛋白(N＝3)mRNA转染后，纯化的CD38缺陷型抗CD38CAR T细胞中，在第1天和第2天的CAR表达。

图16：连同靶标细胞的T细胞孵育后CD107a+CD8T细胞的百分比(N＝3)，除了对自体T细胞进行脱粒(N＝1或2)之外。

图17：朝向无CAR T细胞和K562裂解归一化的靶标细胞裂解(N＝3)，除了对LT自体的细胞毒性(N＝1或2)之外。

图18：FcεRI的示意性表示，由该FcεRI得到根据本发明的多链CAR结构。

图19：编码根据本发明的CD38多链CAR的多顺反子构建体的一般结构。

图20：根据本发明的CD38特异性多链CAR的不同结构。从左到右：多肽γ(融合到CD3ζ的ITAM)，多肽α(融合到ScFv)，多肽β(融合到来自CD28或41BB的共刺激结构域)。A和B：多肽β融合到来自41BB的共刺激结构域，VL和VH片段处于逆序。C和D：多肽β融合到来自CD28的共刺激结构域，VL和VH片段处于逆序。

图21A和图21B：示意性表示根据本发明的示例性抗CD38特异性CAR，涉及针对T细胞耗尽的不同mAb表位标注(epitope tagging)，特别是一个或多个CD20模拟表位，其被设计成减轻可能的与CAR阳性细胞注射相关的副作用。

(A)根据本发明的抗CD38特异性CAR原型，不涉及用于分选或耗尽细胞的表位标签序列：V1和V2分别表示抗体结合性CD38的VH或VL链，TM：跨膜结构域，L：接头，TM：跨膜结构域(优选CD8α跨膜结构域)，4-1BB：胞内共刺激结构域，CD3ITAM：激活结构域。

(B)根据本发明的抗CD38特异性CAR结构，进一步包括插入在CAR的细胞外配体结合结构域中的至少一个表位，其中所述表位插入所述VH和VL链之间；所述表位由不同的接头邻接(border)。

(C)：根据本发明的抗CD38特异性CAR结构，其中两个表位插入在CAR的细胞外配体结合结构域中，一个插在CAR的N端末端与VH链之间，所述表位由至少一种或两种接头邻接；第二表位插入在VH链和VL链之间，所述第二表位还由2个至少一个或两个接头邻接。本文所示的结构区别在于用于邻接第二表位的接头。

(D)：根据本发明的抗CD38特异性CAR结构，其中，两个表位插入在CAR的细胞外配体结合结构域中，一个插入在VH链和VL链之间；另一个表位插入在VL链和铰链之间，每个所述表位也由至少一个或两个接头邻接。本文所示的结构区别在于用于邻接第一表位的接头。

(E)：根据本发明的抗CD38特异性CAR结构，其中两个表位插入在CAR的细胞外结构域中，一个插入在CAR的N端末端与VH链之间，所述表位由至少一个或两个接头来邻接；第二表位插入在VL链和铰链之间，所述第二表位也由这些接头邻接。

(F)：根据本发明的抗CD38特异性CAR结构，其中三个表位插入在CAR的细胞外结构域中，一个插入在CAR的N端末端与VH链之间，所述表位由至少一个或两个接头来邻接；第二表位插入在VH链和VL链之间，所述表位也由这些接头邻接；以及第三表位插入在VL链和铰链之间。这两种结构区别在于用于邻接第二表位的接头。

(G)：根据本发明的抗CD38特异性CAR结构，其中至少两个表位(优选CD20表位)插入在铰链和抗CD38VH链和VL链之间的细胞外配体结合结构域中。在第三示例性结构中，一个CD34表位包含在两个CD20表位之间。可以考虑进一步的结构，其中CD34替换任何其他先前的CD20表位。

(H)：根据本发明的抗CD38特异性CAR结构，其中至少两个表位插入细胞外配体结合结构域的极末端。

图22：评价具有CD38敲除并且提供抗CD19CAR的T细胞(CAR CD38-/-CAR-CD19T细胞)的体内抗肿瘤活性；A)实验的时间标度；B)在以下四组小鼠中：未给予T细胞，给予具有KO CD38并且表达RQR8(CD38-/-RQR8)的T细胞，给予具有KO CD38并且共表达CD19CAR和RQR8的T细胞和给予具有WT CD38并且共表达CD19CAR和RQR8的T细胞，在第7天、第14天和第21天评价生物发光成像。第14天和第21天缺失的小鼠是由于用于表征目的而被处死的那些；C)在上述4组小鼠中，在第7天、第14天和第21天通过生物发光成像评价肿瘤进展：D)在上述四组小鼠中的作为时间函数的存活百分比的评价。

图23：在两个独立实验中CD38-KO效力的评价。该图表示电穿孔后5天的CD38阴性细胞的％(TpT：缓冲液T＝阴性对照)。

图24：评价CD38TALEN mRNA的量对以下各项的影响：KO效率A)和T细胞增殖率B)。图中mRNA的量对应于所用的mRNA总量(对于每个TALEN 10μg、5μg和2.5μg等价于2μg、1μg和0.5μg mRNA每10⁶个细胞)。

图25：在转导后第3天，评价通过CD38-fc或RQR8染色评估的转导效率。测试了针对编码抗CD38CAR(25A10-V1和V2；以及28F5V1和V2)的4种不同的rLV的三种MOI(5、10和15)。

图26：已经经历CD38/TRAC双重KO和抗CD38CAR转导的T细胞的筛选过程的时间标度。

图27：评价通过在T细胞中TALEN mRNA电穿孔的CD38/TRAC KO的效率，以及在培养过程结束时的CAR和RQR8共表达的效率。A)对应于CD38抗原的表达和抗CD38CAR(通过RQR8和CD38Fc)的表达的三个系列的FAC；对4个抗CD38CAR(25A10-V1和V2，以及28F5V1和V2)中的每一种进行这些测定，它们已经经历CD38/TRAC双重KO(DKO)。B)评价已经成功经历CD38/TRAC双重KO(DKO)的存活的T细胞的百分比。C)针对上述4种CAR，评价基于RQR8和CD38Fc的抗CD38CAR表达。NTD：未转导。

图28：表征已经成功经历双重CD38/TRAC KO并表达抗CD38CAR的T细胞表型。A)针对上述4种抗CD38CAR中的每一种，测定表达RQR8的T细胞中的CD4/CD8的比率。B)针对上述4种抗CD38CAR中的每一种，确定T细胞子集(subset)的比率：效应子T细胞(Teff)、记忆效应子T细胞(Tem)、中央记忆T细胞(Tcm)、干细胞记忆T细胞(Tscm)、另一类的记忆T细胞(Temra)和初始T细胞(Tn)。

图29：针对4种抗CD38CAR(25A10-V1和V2，以及28F5V1和V2)评价活性。A)评价它们的脱粒化：针对MM细胞系：MOLP8、U266(表达或不表达CD38抗原)和K562，针对自体T细胞，并在不使用细胞系时为阳性对照(单独的LT)：B)评价它们针对MM CD38表达性细胞系的细胞毒性，将其为MM表达性CD38细胞系的U266的值归一化至非表达性CD38细胞系的U266的值。对于这2个图，从上到下到下邻近它们的图标对应于从左到右的条棒。

图30：评价在三个T-急性成淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia)(T-ALL)细胞系(MOLT4、Loucy和CCFR-CEM)以及两个MM细胞系(U266CD38-和MOLP8)的细胞表面的CD38表达。

图31：通过测定纯化前和纯化后CCRF-CEM(T-ALL)细胞系中CD38阴性T细胞的百分比来评价KO CD38的建立。

图32：对于25A10-V1，评价抗CD38CAR的活性。A)针对T ALL细胞系评价它们的脱粒化：CCRF-CEM原始细胞和一种KO CD38，Loucy和MOLT4，表达CD38的MM1S MM细胞系，并且在不使用细胞系的情况下(单独的LT)作为阳性对照：B)针对上述T ALL CD38表达性细胞系评价它们的细胞毒性(将针对CCRF-CEM的值归一化至对应的未表达CD38的细胞系)。对于这2个图，从上到下邻近它们的图标对应于从左到右的条棒。

具体实施方式

除非在此特别定义，否则所使用的所有技术和科学术语具有与基因疗法、生物化学、遗传学和分子生物学领域中技术人员通常理解的相同含义。

所有与本文所描述的方法和材料类似或等价的方法和材料可用于本发明的实践或测试，在此描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均以引用的方式整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，除非另有说明，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不是限制性的。

除非另有说明，本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们都在本领域技术人员了解的范围内。在文献中充分解释了这些技术。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,(Sambrook et al,2001,ColdSpring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait ed.,1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic AcidHybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；系列丛书Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York)特别是Vols.154和155(Wu et al.eds.)以及Vol.185,"Gene Expression Technology"(D.Goeddel,ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)；和Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。

本发明更具体地涉及具有选自如在图8中所示出的V1、V2和V3的多肽结构中的一种的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)，所述结构包括：含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或者SEQ ID NO.22和18(29B4)。

针对病理细胞的表达嵌合抗原受体的工程化的T细胞

根据本发明引入T细胞的嵌合抗原受体可以采用不同的设计，如单链或多链CAR。这些不同的设计允许用于改善对于目标病理细胞的特异性和结合效率的各种策略。在本申请的附图中示出这些策略中的一些。单链CAR是本领域中最经典的版本。本申请人开发了多链CAR结构，以允许在特异性和强度方面调节T细胞的活性。多个亚基可以遮蔽额外的共刺激结构域或以一定距离保持这些结构域，以及其他类型的受体，但是经典的单链结构有时可以被认为对于多特异性相互作用太敏感且不太允许。

单链CAR

过继性免疫疗法，其涉及转移离体产生的自身抗原特异性T细胞，是治疗病毒感染和癌症的有前景的策略。可以通过扩增抗原特异性T细胞或通过基因工程重定向T细胞来产生用于过继性免疫疗法的T细胞(Park,Rosenberg et al.2011)。病毒抗原特异性T细胞的转移是用于治疗移植相关病毒感染和罕见病毒相关恶性肿瘤的众所周知的过程。类似地，已证明肿瘤特异性T细胞的分离和转移在治疗黑素瘤方面是成功的。

通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传转移已经在T细胞中成功地产生了新特异性(Jena,Dotti et al.2010)。CAR是由与单一融合分子中的一个或多个信号转导结构域相关联的靶向部分组成的合成受体。通常，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，包括由柔性接头连接的单克隆抗体的轻和可变片段。也已经成功地应用了基于受体或配体结构域的结合部分。用于第一代CAR的信号转导结构域来源于CD3ζ或Fc受体γ链的胞质区。已证明第一代CAR成功地重定向T细胞的细胞毒性。然而，它们未能在体内提供延长的扩增和抗肿瘤活性。将来自包括CD28、OX-40(CD134)和4-1BB(CD137)的共刺激分子的信号转导结构域单独加入(第二代)或组合加入(第三代)以增强存活率和增加CAR修饰的T细胞的增殖。CAR成功地允许T细胞针对在来自各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面表达的抗原重定向(Jena,Dotti et al.2010)。

根据一个实施方式，抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)具有选自如在图8中所示出的V1、V2和V3的多肽结构中的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

根据优选的实施方式，抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)具有选自如在图8中所示出的V1、V2和V3的多肽结构中的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括分别地与SEQ ID NO.14和10(25A10)以及SEQ ID NO 62和58(28F5)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

根据更优选的实施方式，抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)具有选自如在图8中所示出的V1和V2的多肽结构中的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括分别地与SEQ ID NO.14和10(25A10)以及,SEQ ID NO.62和58(28F5)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

根据优选的实施方式，上述抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)的所述跨膜结构域包括与SEQ ID NO.79(CD8αTM)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列。

根据优选的实施方式，上述抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)的所述V_H和V_L包括分别地与SEQ ID NO.14和10(25A10)或者SEQ ID NO.62和58(28F5)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

根据优选的实施方式，包含在所述抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)的所述V_H和V_L中的CDR序列是分别地SEQ ID NO.15-17和SEQ ID NO.11-13；分别地SEQ IDNO.63-65和SEQ ID NO.59-62；分别地SEQ ID NO.55-57和SEQ ID NO.51-53；分别地SEQ IDNO.31-33和SEQ ID NO.27-29；分别地SEQ ID NO.39-42和SEQ ID NO.35-37；分别地SEQ IDNO.47-49和SEQ ID NO.43-45；分别地SEQ ID NO.23-25和SEQ ID NO.19-22。

根据优选的实施方式，上述抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)的所述铰链包括与选自SEQ ID NO.76(FcεRIIIα)、SEQ ID NO.77(CD8α)和SEQ ID NO.78(IgG1)中的一种具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的序列。

根据更优选的实施方式，上述抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)的所述铰链包括与SEQ ID NO.77(CD8α)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。

根据优选的实施方式，上述抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)的所述铰链包括与选自SEQ ID NO.76(FcεRIIIα)中的一种具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的序列。

根据一个实施方式，本发明的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)包括与选自以下中的一种具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列：SEQ IDNO.82-84(25A10)、SEQ ID NO.100-102(28F5)、SEQ ID NO.97-99(13F11)、SEQ ID NO.88-90(16B5)、SEQ ID NO.91-93(10F7)、SEQ ID NO.94-96(27B6)和SEQ ID NO.85-87(29B4)。

包含在本发明范围内所有上述抗CD38 CAR的顺序列于下面的表1中(除了用作用于比较的工具CAR的GMB005 CAR)。还公开了用于它们的结构(根据图8的V1、V2和V3版本)组分的序列。

表1：基于图8中的V1、V2和V3版本的抗CD38CAR和用于制造它们的其相应组分的多肽序列。

根据优选的实施方式，本发明的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包括与选自SEQ ID NO.82-84(25A10)、SEQ ID NO.100-102(28F5)、SEQ ID NO.97-99(13F11)和SEQ ID NO.88-90(16B5)中的一种具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

根据更优选的实施方式，本发明的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包括与选自SEQ ID NO.82-84(25A10)和SEQ ID NO.100-102(28F5)中的一种具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列。

根据更优选的实施方式，本发明的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包括与SEQ ID NO.82-84(25A10)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列。

根据更优选的实施方式，本发明的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包括与SEQ ID NO.82(25A10-v1)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列。

根据更优选的实施方式，本发明的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包括与SEQ ID NO.100-102(28F5)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列

根据更优选的实施方式，本发明的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包括与选自SEQ ID NO.97-99(13F11)中的一种具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列。

本发明更具体地涉及免疫细胞，其具有与本申请中所述的那些存在一些同一性的CAR，并且其在编码由所述CAR靶向的细胞标志物的基因中具有稀切核酸内切酶诱导的突变(即，CAR显示与所述失活的基因的产物的亲和性)。同一性是指通过软件如FASTA或BLAST(它们可作为GCG序列分析包的一部分获得(University of Wisconsin,Madison,Wis.)确定的至少70％、优选80％、更优选90％、甚至更优选95％的多核苷酸或多肽同一性。BLASTP“同一性”显示在相同的高评分序列对中的总残基的数量和分数。本发明考虑和涵盖了具有与本文公开的氨基酸序列的这些程度的同一性或相似性、或者同一性或相似性的任何中间程度的氨基酸序列。同样适用于使用BLASTN的多核苷酸序列。

本发明还涉及一种工程化的免疫细胞(优选T细胞)，其表达抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)，如前所述，所述免疫细胞具有的内源性CD38基因被基因失活或突变，所述CD38抗原存在于所述免疫细胞和所述病理细胞两者的表面上。

在优选的实施方式中，所述工程化的免疫细胞表达抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)，所述免疫细胞具有的内源性CD38和TCR基因被基因失活或突变。

在一个实施方式中，所述工程化的免疫细胞表达抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)，所述免疫细胞具有的内源性CD38、TCR和dCK基因被基因失活或突变。

在优选的实施方式中，所述工程化的免疫细胞表达抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)，其具有选自如在图8中所示出的V1、V2和V3的多肽结构中的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或者SEQ ID NO.22和18(29B4)，

所述免疫细胞(优选T细胞)具有的内源性CD38基因被基因失活或突变，所述CD38抗原存在于所述免疫细胞和所述病理细胞两者的表面上。

在更优选的实施方式中，所述工程化的免疫细胞表达抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)，其具有选自如在图8中所示出的V1、V2和V3的多肽结构中的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

所述免疫细胞(优选T细胞)具有的内源性CD38和TCR基因被基因失活或突变，所述CD38抗原存在于所述免疫细胞和所述病理细胞两者的表面上。

在上述实施方式中，优选通过使用如在本发明中所描述的特异性稀切核酸内切酶来完成所述基因失活或突变。

本发明还涉及包含至少两种工程化的免疫细胞(优选T细胞)的群体，工程化的免疫细胞表达抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)，如前所述，所述免疫细胞具有的内源性CD38基因被基因失活或突变，所述CD38抗原存在于所述免疫细胞和所述病理细胞两者的表面上。

在优选的实施方式中，所述群体包括表达抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)的两种工程化的免疫细胞，其具有选自如在图8中所示出的V1、V2和V3的多肽结构中的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

细胞外结构域

本文所用的术语"细胞外配体-结合结构域"被定义为能够结合配体的寡肽或多肽。优选地，结构域能够与细胞表面分子相互作用。例如，可选择细胞外配体结合结构域以识别充当与特定疾病状态相关联的靶标细胞上的细胞表面标志物的配体。

单链可变抗体(scFv)

本发明的抗CD38 CAR的抗原结合结构域可以是与离开组织抗原(off-tissueantigen)结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体和它们的功能片段。

本文所用的术语"重组抗体"是指使用重组DNA技术产生的抗体或抗体片段，如，例如，由噬菌体、酵母表达系统或哺乳动物细胞表达系统表达的抗体或抗体片段，更特别是通过用包含编码抗体的CDR区的核酸序列的病毒载体转导的T细胞表达的抗体或抗体片段。该术语还应被解释为指通过合成编码抗体或抗体片段的DNA分子而产生的抗体或抗体片段，并且所述DNA分子表达抗体或抗体片段蛋白或者指定抗体或抗体片段的氨基酸序列，其中已经使用本领域可得到的和公知的重组或合成DNA或氨基酸序列的技术获得该DNA或氨基酸序列。

可以使用本领域已知的各种技术制备人源化抗体，技术包括但不限于，CDR-移植(CDR-grafting)(参见，例如欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089,其各自全部内容以引用的方式并入本文中)，镶面(veneering)或再表面化(resurfacing)(参见例如欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka et al.,1994,Protein Engineering,7(6):805-814；和Roguska et al.,1994,PNAS,91:969-973,其各自全部内容以引用的方式并入本文中)，链改组(chain shuffling)(参见，例如美国专利号5,565,332，其全部内容以引用的方式并入本文中)，以及在例如美国专利申请公开号US2005/0042664、美国专利申请公开号US2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公开号WO 9317105、Tan et al.,J.Immunol.,169:1119-25(2002)、Caldas etal.,Protein Eng.,13(5):353-60(2000)、Morea et al.,Methods,20(3):267-79(2000)、Baca et al.,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997)、Roguska et al.,Protein Eng.,9(10):895-904(1996)、Couto et al.,Cancer Res.,55(23Supp):5973s-5977s(1995)、Couto et al.,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995)、Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)和Pedersen et al.,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)中公开的技术，其各自全部内容以引用的方式并入本文中。通常，框架区中的框架残基会被来自CDR供体抗体的相应残基替换，从而改变(例如改善)抗原结合。这些框架替换是由本领域公知的方法来识别，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用进行建模以识别对于抗原结合和序列比较重要的框架残基，以在特定位置识别不常见的框架残基。(参见，例如，Queen et al.,美国专利号5,585,089和Riechmann et al.,1988,Nature,332:323，其全部内容以引用的方式并入本文中)。

保守的氨基酸替换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的那些。本领域已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-支化侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此本发明的CAR内的一种或多种氨基酸残基可用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所描述的功能测试来测试改变后的CAR结合GD3的能力。

根据一个实施方式，本发明的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)包括V_H和V_L可变链，其多肽序列分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ ID NO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或者SEQ ID NO.22和18(29B4)。

上述抗CD38VH链和VL链及其各自对应的CDR的序列列于下表2中。

表2：8对scFv抗CD38抗体和它们相应的CDR的VH链和VL链的序列。

根据优选的实施方式，本发明的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包括V_H和V_L可变链，其多肽序列分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ ID NO.54和50(13F11)或者SEQ ID NO.30和26(16B5)。

根据更优选的实施方式，本发明的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包括V_H和V_L可变链，其多肽序列分别地与SEQ ID NO.14和10(25A10)或SEQ ID NO.62和58(28F5)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。

根据一个实施方式，本发明所述抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包括包含以下各项的CDR序列的V_H和V_L可变区：分别地SEQ ID NO.15-17和SEQ ID NO.11-13；分别地SEQ ID NO.63-65和SEQ ID NO.59-62；分别地SEQ ID NO.55-57和SEQ ID NO.51-53；分别地SEQ ID NO.31-33和SEQ ID NO.27-29；分别地SEQ ID NO.39-42和SEQ ID NO.35-37；分别地SEQ ID NO.47-49和SEQ ID NO.43-45或者分别地SEQ ID NO.23-25和SEQ IDNO.19-22。

在优选的实施方式中，本发明的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包括包含以下各项的CDR序列的V_H和V_L可变区：分别地SEQ ID NO.15-17和SEQ ID NO.11-13；分别地SEQ ID NO.63-65和SEQ ID NO.59-62；分别地SEQ ID NO.55-57和SEQ ID NO.51-53或分别地SEQ ID NO.31-33。

在更优选的实施方式中，本发明的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包括含有以下各项的CDR序列的V_H和V_L可变区：分别地SEQ ID NO.15-17和SEQ ID NO.11-13或者分别地SEQ ID NO.63-65和SEQ ID NO.59-62。

除了靶向抗原标志物(其对于病理细胞和T细胞是常见的，如CD38)的CAR，可以设想表达针对不一定由T细胞表达的其他抗原标志物的另外的CAR，从而提高T细胞特异性。

在另一个实施方式中，本发明涉及包含每一种不同的细胞外配体结合结构域的CAR的群体。特别地，本发明涉及工程化的免疫细胞的方法，包括提供免疫细胞以及在所述细胞的表面表达每一种含有不同的细胞外配体结合结构域的CAR的群体。

可以被T细胞进一步表达以产生多特异性细胞的嵌合抗原受体的实例，是针对多重骨髓瘤或淋巴细胞性白血病抗原标志物的抗原受体，例如TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROT Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)和FCRL5(UNIPROT Q68SN8)。

作为用于连同CD38给予另一种特异性的进一步的实例，靶标的抗原可以是来自分化分子的任何群集(例如CD16、CD64、CD78、CD96,CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123和CD138)，肿瘤相关的表面抗原如ErbB2(HER2/neu)，癌胚抗原(CEA)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，表皮生长因子受体(EGFR)，EGFR变体III(EGFRvIII)，CD19，CD20，CD30，CD40，二唾液酸神经节苷脂GD2，导管上皮黏蛋白，gp36，TAG-72，糖鞘脂类，神经胶质瘤相关抗原，β-人绒毛膜促性腺激素，甲胎蛋白(AFP)，凝集素-反应性AFP，甲状腺球蛋白，RAGE-1，MN-CAIX，人端粒酶逆转录酶，RU1，RU2(AS)，肠羧基酯酶，突变hsp70-2，M-CSF，前列腺酶，前列腺酶特异性抗原(PSA)，PAP，NY-ESO-1，LAGA-1a，p53，前列腺特异性蛋白(prostein)，PSMA，存活和端粒酶，前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)，MAGE，ELF2M，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，肝配蛋白B2，CD22，胰岛素生长因子(IGF1)-I，IGF-II，IGFI受体，间皮素(mesothelin)，呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合物(MHC)分子，5T4，ROR1，Nkp30，NKG2D，肿瘤基质抗原，纤连蛋白的细胞外结构域A(extra domain A)(EDA)的细胞外结构域B(extra domainB)(EDB)以及肌腱蛋白-C(tenascin-C)的A1结构域(TnC A1)和成纤维细胞相关蛋白(fap)；谱系特异性或组织特异性抗原如CD3，CD4，CD8，CD24，CD25，CD33，CD34，CD133，CD138，CTLA-4，B7-1(CD80)，B7-2(CD86)，GM-CSF，细胞因子受体，内皮糖蛋白(endoglin)，主要组织相容性复合物(MHC)分子，BCMA(CD269，TNFRSF 17)，或者病毒特异性的表面抗原如HIV-特异性抗原(如HIV gp120)；EBV-特异性抗原，CMV-特异性抗原，HPV-特异性抗原，拉塞(Lasse)病毒特异性抗原，流感病毒特异性抗原以及这些表面标志物的任何衍生物或变体。抗原不一定是表面标志物抗原，也可以是由HLA I类在细胞表面呈递的内源性小抗原。

靶标抗原的下调或突变通常在癌细胞中观察到，产生抗原损失逃逸变体(antigen-loss escape variant)。因此，为了抵消肿瘤逃逸以及使免疫细胞对于靶标更具特异性，根据本发明的CD38特异性CAR可以包括另一种细胞外配体结合结构域，以同时结合靶标中的不同元件从而增强免疫细胞激活和功能。

在一个实施方式中，细胞外配体结合结构域可以串联放置在相同跨膜多肽上，并可选地可以由接头分隔。在另一个实施方式中，所述不同的细胞外配体结合结构域可以置于构成CAR的不同的跨膜多肽上。

具有对于CD38的较低亲和性的CAR

根据另一个实施方式，本发明的抗CD38包括具有对CD38抗原的较低亲和性的scFv。

设计这种CAR以防止与这种工程化的免疫细胞的体内使用相关的毒性的可能风险。

"亲和性(affinity)"是指抗体与简单半抗原或抗原决定簇之间的结合强度的量度。不受理论的束缚，亲和性取决于在抗体结合位点和抗原决定簇之间的立体化学配合的接近程度，它们之间的接触面积的大小，和带电和疏水基团的分布。亲和性还包括术语"亲合力(avidity)"，其指在形成可逆复合物后抗原-抗体键的强度。用于计算抗体对于抗原的亲和性的方法在本领域中是已知的，包括使用结合实验计算亲和性。在抗体(Ab)与抗原(Ag)结合的情况下，使用亲和常数(表达为离解常数的倒数(inverted dissociationconstant))。Ab Ag＝AbAg Ka＝[AbAca＝1[Ab)][Ag]K，抗体结合的化学平衡也是开启率(on-rate)(k向前)和关闭率(off-rate)(k向后)常数的比率。两种抗体可以具有相同的亲和性，但一个抗体可以具有高开启和关闭率常数，而另一个可具有低开启和关闭率常数。(k向前＝开启率，k向后＝关闭率)。在功能测试中的抗体活性(例如，细胞溶解测试)也反映抗体亲和性。在本发明的各种实施方式中，抗原识别性受体具有低亲和性。低亲和性包括微摩尔和纳米摩尔亲和性(例如10^-5、5x10^-6、10^-6、5x10^-7,10^-7、5x10^-8、10^-8、5x10^-9、10^-9M)。抗体和亲和性可以表型地表征并与使用功能测试(例如细胞溶解测试)进行比较。

本发明还包括具有对CD38抗原的低亲和性的抗CD38CAR，例如在它们对应于单克隆2C2、5G9、9E2、28B9、26D8、15D1和23F2抗体的scfv中含有VH链和VL链的那些。

根据一个优选的实施方式，具有对CD38抗原的低亲和性的所述抗CD38CAR在它们对应于单克隆2C2或5G9抗体(也称为m2C2和m5G9)的scfv中包括VH和VL链。

根据一个实施方式，具有对CD38抗原的较低的亲和性的所述scFv的V_H和V_L包括与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：分别地SEQID NO.132(EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMFWVRQTPEKRLEWVAYISNGDGNTYYPDTLKGRFTISRDNANNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARSISRYFDVWGAGTTVTVSS)和SEQ ID NO.133(DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDFLHWYQQKSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNAHSFPSTFGGGTKLEIK)的m2C2抗体的VH和VL链；或分别地SEQ ID NO.134(EIHLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYNIYWVKQSHGESLEWVGYIDPYNGGAYYNQKFKAMATLTVDKSSSTAFMHLNSLTSEDSAVYYCARKGVYGLAYWGQGTLVTVSS)和SEQ ID NO.135(DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASESIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYASTHLADGVPSRFSGSGSGAQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK)的m5G9抗体的VH和VL链；

或者分别地SEQ ID NO.142(EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTDYNMNWVKQSNGKSLEWIGNIDPDYGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLRSLTSEDSAVYYCARSGYRYGFVYWGQGTLVTVSA)和SEQ ID NO.143(DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIK)的m9E2抗体的VH和VL链；

或者分别地SEQ ID NO.144(EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYLHWMKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKSDPKFQDKATIDADTSSNTAYLQLNSLTSEDTAVYYCAKGPWFPYWGQGTLVTVSA)和SEQID NO.145(DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGKSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYHCQQLYRTPLTFGGGTKLEIK)的m28B9抗体的VH链和VL链；

或者分别地SEQ ID NO.146(QVQLQQPGAEMVRPGASVKLSCKASGYTFTDYWMHWVKQRPGQGLEWIGKIDPSDSETHYHQKFKDKATLTVDKSSSTAYLQFKSLTSEDSAVHYCAREGIWLRYAMDYWGQGTSVTVSS)和SEQ ID NO.147(DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTVSSVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTFGGGTKLEIK)的m26D8抗体的VH链和VL链；

或者分别地SEQ ID NO.148(EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCRASGYSITDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYIDPDNGATNNNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSEGYQYYYAMDYWGQGTSVTVSS)和SEQ ID NO.149(DIVMTQAAFSNPVALGTSASISCSSSKSLLHSNGITYLHWYLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQMVERPWTFGGGTKLEIK)的m15D1抗体的VH链和VL链；

或者分别地SEQ ID NO.150(QVQVQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPGSSSTNHNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARRGSSPSYTMDYWGQGTSVTVSS)和SEQ ID NO.151(DIVLTQSPASLAVALGQRATISCRASKSVSTFGYSYMHWYQQKPGQAPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLKIHPVEEEDAATYYCLHSRELPWTFGGGTKLEIK)的m23F2抗体的VH链和VL链。

根据优选的实施方式，具有对CD38抗原的较低亲和性的所述scFv的V_H和V_L包括与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列：分别地SEQ IDNO.132(EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMFWVRQTPEKRLEWVAYISNGDGNTYYPDTLKGRFTISRDNANNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARSISRYFDVWGAGTTVTVSS)和SEQ ID NO.133(DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDFLHWYQQKSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNAHSFPSTFGGGTKLEIK)的m2C2抗体的VH和VL链；和分别地SEQ ID NO.134(EIHLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYNIYWVKQSHGESLEWVGYIDPYNGGAYYNQKFKAMATLTVDKSSSTAFMHLNSLTSEDSAVYYCARKGVYGLAYWGQGTLVTVSS)和SEQ ID NO.135(DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASESIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYASTHLADGVPSRFSGSGSGAQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK)的m5G9抗体的VH和VL链。

根据一个实施方式，本发明的具有对CD38抗原的低亲和性的抗CD38CAR包含含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括信号转导结构域-优选CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和共刺激结构域—优选来自4-1BB，

其中所述V_H和V_L包括与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：分别地SEQ ID NO.132(EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMFWVRQTPEKRLEWVAYISNGDGNTYYPDTLKGRFTISRDNANNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARSISRYFDVWGAGTTVTVSS)和SEQ ID NO.133(DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDFLHWYQQKSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNAHSFPSTFGGGTKLEIK)的m2C2抗体的VH和VL链；和分别地SEQ ID NO.134(EIHLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYNIYWVKQSHGESLEWVGYIDPYNGGAYYNQKFKAMATLTVDKSSSTAFMHLNSLTSEDSAVYY CARKGVYGLAYWGQGTLVTVSS)和SEQ ID NO.135(DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASESIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYASTHLADGVPSRFSGSGSGAQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK)的m5G9抗体的VH和VL链。

根据特定的实施方式，抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)具有选自如在图8中所示出的V1、V2和V3的多肽结构中的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：分别地与SEQ ID NO.132(EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMFWVRQTPEKRLEWVAYISNGDGNTYYPDTLKGRFTISRDNANNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARSISRYFDVWGAGTTVTVSS)和SEQ ID NO.133(DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDFLHWYQQKSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNAHSFPSTFGGGTKLEIK)的m2C2抗体的VH和VL链；和分别地SEQ ID NO.134(EIHLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYNIYWVKQSHGESLEWVGYIDPYNGGAYYNQKFKAMATLTVDKSSSTAFMHLNSLTSEDSAVYYCARKGVYGLAYWGQGTLVTVSS)和SEQ ID NO.135(DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASESIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYASTHLADGVPSRFSGSGSGAQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK)的m5G9抗体的VH和VL链。

根据更具体的实施方式，本发明的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包括与SEQ ID NO.136-138(分别对应于m5G9版本V1、V2和V3)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

根据另一个更具体的实施方式，本发明所述抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包括与SEQ ID NO.139-141具有至少90％。至少95％，至少98％或至少99％的同一性的多肽序列(分别对应于m2C2版本V1、V2和V3)。

根据另一个实施方式，本发明的免疫细胞被工程化以表达具有对CD38抗原的低亲和性的抗CD38CAR。

根据另一个实施方式，被工程化以表达具有对CD38抗原的低亲和性的抗CD38CAR的免疫细胞被进一步工程化以使其内源性CD38基因通过敲除、优选通过使用稀切核酸内切酶敲除而失活。

跨膜结构域

根据本发明的CAR在细胞的表面膜上表达。因此，这种CAR还包括跨膜结构域。合适的跨膜结构域的区别特征包括在细胞表面被表达、以及一起相互作用以指导免疫细胞针对预定靶标细胞的细胞应答导的能力，上述细胞优选在本发明中是免疫细胞，特别是淋巴细胞或天然杀伤(NK)细胞。跨膜结构域可以从天然来源或从合成来源获得。跨膜结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。作为非限制性实例，跨膜多肽可以是T细胞受体的亚基如α、β、γ或ε亚基，构成CD3复合物的多肽，IL2受体p55(α链)、p75(β链)或γ链，Fc受体特别是Fcγ受体III的亚基链或CD蛋白。可替换地，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要包括疏水残基如亮氨酸和缬氨酸。在优选的实施方式中，所述跨膜结构域来源于人CD8α链(例如，NP_001139345.1)。

根据本发明的CAR通常进一步包括跨膜结构域(TM)如CD8α和4-1BB，更具体地是CD8α，显示出与SEQ ID NO.79至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。

所述跨膜结构域可以另外包括所述细胞外配体结合结构域和所述跨膜结构域之间的铰链区。

铰链

本文所用的术语"铰接区"一般指用于作用是将跨膜结构域连接到细胞外配体结合结构域的任何寡肽或多肽。特别地，铰链区用于为细胞外配体结合结构域提供更多的灵活性和可接近性。铰链区可包含至多300个氨基酸、优选10-100个氨基酸、最优选25-50个氨基酸。铰链区域可以来源于天然存在的分子的全部或部分，例如来自CD8、CD4或CD28的细胞外区域的全部或部分，或来自抗体恒定区的全部或部分。可替换地，铰链区域可以是对应于自然存在的铰链序列的合成序列，或者可以是完全合成的铰链序列。在优选的实施方式中，所述铰链结构域包括一部分的人CD8α链，FcγRIIIα受体或IgG1，其在本说明书中分别称为SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.76和SEQ ID NO.78，或其与这些多肽显示出优选至少80％、更优选至少90％、95％或99％的序列同一性铰链多肽。

细胞内结构域

根据本发明的CAR的信号转导结构域或细胞内信号转导结构域负责细胞外配体结合结构域与靶标结合之后的细胞内信号转导，从而激活免疫细胞和免疫应答。换而言之，信号转导结构域负责激活其中表达CAR的免疫细胞的正常效应子功能中至少一种。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或包括细胞因子分泌在内的辅助细胞活性。因此，术语"信号转导结构域"指的是蛋白质的部分，其转导效应子信号功能并指导所述细胞执行特定功能。

用于在CAR中使用的信号转导结构域的优选实例可以是共同作用以在抗原受体接合之后起始信号转导的T细胞受体和辅助受体(共受体，co-receptor)的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。信号转导结构域包括两种不同类型的胞质信号转导序列：起始抗原依赖性的初级活化的那些，以及以抗原非依赖的方式起作用以提供二级或共刺激信号的那些。初级胞质信号转导序列可包括已知为免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号基序。ITAM是在各种受体的胞质内尾中发现的良好定义的信号基序，其用作syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。在本发明中使用的ITAM的实例可以包括衍生自以下各项的那些作为非限制性的实例：TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在优选的实施方式中，CAR的信号转导结构域可以包括CD3ζ信号转导结构域，其与SEQ ID NO:81的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、95％、97％或99％的序列同一性的氨基酸序列。

在具体实施方式中，本发明的CAR的信号转导结构域包括共刺激信号分子。共刺激分子是除高效免疫应答所需的抗原受体或它们的配体之外的细胞表面分子。“共刺激配体”是指在抗原呈递细胞上的分子，其特异性地结合在T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除了通过例如使TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合所提供的初级信号(primarysignal)之外的信号，介导T细胞应答，包括但不限于增殖激活、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导型共刺激配体(ICOS-L)，细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。除其他外，共刺激配体也包括特异性结合存在于T细胞上的共刺激分子的抗体，共刺激分子如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体。

"共刺激分子"是指与共刺激配体特异性结合的T细胞上的同源结合伴侣(cognatebinding partner)，从而通过细胞介导共刺激应答，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。共刺激分子的实例包括CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体，等等。

在优选的实施方式中，本发明的CAR的信号转导结构域包括一部分的选自由以下各项组成的组的共刺激信号分子：4-1BB(GenBank:AAA53133.)和CD28(NP_006130.1)的片段。特别地，本发明的CAR信号转导结构域包含的氨基酸序列与选自由SEQ ID NO:80组成的组的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、95％、97％或99％的序列同一性。

多亚基CAR

引入T细胞中的来自现有技术的嵌合抗原受体是由单链多肽形成的，所述单链多肽需要串连附加(serial appending)信号转导结构域。然而，通过将信号转导结构域从它们的天然近膜位置移动可能干扰它们的功能。为了克服这一缺点，申请人最近设计了从FcεRI(图18)衍生的多链CAR以允许所有相关信号转导结构域的正常近膜位置。在这种新的结构中，通过细胞外配体结合结构域如scFv替换了FcεRIα链的高亲和性IgE结合结构域，以将T细胞针对细胞靶标特异性重定向，并且将FcεRIβ链的N-末端尾部和/或C-末端尾部用于将共刺激信号放置在正常的近膜位置。多链CAR(mcCAR)构造可以具有如图19所示的多顺反子结构。

因此，由根据本发明的工程化的T细胞表达的CAR可以是特别适用于本发明的工程化的T细胞的生产和扩增的多链嵌合抗原受体(CAR)。这种多链CAR包含以下组件中的至少两种：

a)一种多肽，包含FcεRIα链的跨膜结构域和细胞外配体结合结构域，

b)一种多肽，包括FcεRIβ链的一部分N-末端和C-末端胞质尾和跨膜结构域和/或

c)至少两种多肽，各自包括FcεRIγ链的一部分的胞质内尾和跨膜结构域，从而使不同的多肽自发地多聚在一起以形成二聚的、三聚的或四聚的CAR。

根据这样的结构，配体结合结构域和信号转导结构域被携带在分离的多肽上。不同的多肽以紧密接近的方式锚定在膜中，允许彼此相互作用。在这种结构中，信号转导和共刺激结构域可以是在近膜(juxtamembrane)位置(即，相邻其内侧的细胞膜)，其被认为使得能够获得改善的共刺激结构域的功能。多亚基结构还提供了设计具有对T细胞活化更多控制的CAR的更多灵活性和可能性。例如，可以包括具有不同特异性的多种细胞外抗原识别结构域，以获得多特异性CAR结构。还可以控制进入多链CAR的不同亚基之间的相对比率。本申请人在PCT/US2013/058005(WO2014/039523)中最近描述了这种类型的结构。

例如，通过使用针对IgE(FcεRI)的高亲和性受体的不同的α、β和γ链，使得将不同的链组装为单个多链CAR的一部分成为可能，其中已将信号转导和共刺激结构域与上述α、β和γ链融合(Metzger,AlCARaz et al.1986)。γ链包含跨膜区和含有一种免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的胞质尾(cytoplasmic tail)(Cambier 1995)

多链CAR可以包括多个细胞外配体结合结构域，以同时结合靶标中的不同元件，从而增强免疫细胞激活和功能。在一个实施方式中，可以以串联的方式将细胞外配体结合结构域放置在相同的跨膜多肽上，并且可选地由接头分隔开。在另一个实施方式中，可以将所述不同的细胞外配体结合结构域置于组成多链CAR的不同跨膜多肽上。在另一个实施方式中，本发明涉及每一种包含不同的细胞外配体结合结构域的多链CAR的群体。特别地，本发明涉及工程化的免疫细胞的方法，包括提供免疫细胞以及在所述细胞的表面表达多链CAR的群体，每一种多链CAR包含不同的细胞外配体结合结构域。在另一特定实施方式中，本发明涉及一种工程化的免疫细胞的方法，包括提供免疫细胞和向所述细胞引入编码构成多链CAR的群体的多肽的多核苷酸，每一种多链CAR包含不同的细胞外配体结合结构域。在特定的实施方式中，工程化免疫细胞的方法包括在细胞的表面表达至少一部分的融合至信号转导结构域的FcεRIβ链和/或FcεRIγ链以及多个部分的融合至不同细胞外配体结合结构域的FcεRIα链。在更具体的实施方式中，所述方法包括向所述细胞中引入至少一个多核苷酸，其编码一部分的融合至信号转导结构域的FcεRIβ链和/或FcεRIγ链和多个部分的融合至不同细胞外配体结合结构域的FcεRIα链。多链CAR的群体是指至少两个、三个、四个、五个、六个或更多种多链CAR，每一种多链CAR包含不同的细胞外配体结合结构域。根据本发明的不同细胞外配体结合结构域可以优选地同时结合靶标中的不同元件，从而增强免疫细胞激活和功能。

本发明还涉及分离的免疫细胞，其包括多链CAR的群体，每一种多链CAR包含不同的细胞外配体结合结构域。

本发明的多链CAR的信号转导结构域或细胞内信号转导结构域负责在细胞外配体结合结构域与靶标结合后的细胞内信号转导，从而激活免疫细胞和免疫应答。换而言之，信号转导结构域负责激活其中表达多链CAR的免疫细胞的正常效应子功能中至少一种。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或包括细胞因子分泌在内的辅助细胞活性。

在本申请中，术语"信号转导结构域"是指转导效应子信号功能信号并指导所述细胞执行特定功能的蛋白质的部分。

用于在单链或多链CAR中使用的信号转导结构域的优选实例可以是共同作用以起始抗原受体接合之后的信号转导的Fc受体或T细胞受体和辅助受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。信号转导结构域包括两种不同类型的胞质信号转导序列，起始抗原依赖性的初始活化(primary activation)的那些，以及以抗原非依赖性的方式起作用以提供次级信号或共刺激信号的那些。一级胞质信号转导序列(primary cytoplasmic signaling sequence)可包括已知为免疫受体酪氨酸激活基序ITAM的信号基序。ITAM是在各种受体的胞质内尾(intracytoplasmic tail)中发现的良好定义的信号基序，其用作syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。作为非限制性的实例，在本发明中使用的ITAM的实例可以包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在优选的实施方式中，多链CAR的信号转导结构域可以包括CD3ζ信号转导结构域，或FcεRIβ链或FcεRIγ链的细胞质内结构域。

在具体实施方式中，本发明的多链CAR的信号转导结构域包括共刺激信号分子。共刺激分子是除抗原受体或它们配体之外的细胞表面分子，其是高效免疫应答所需的。

配体结合结构域可以是先前使用的任何抗原受体，并且，相对于文献中所提及的单链CAR，特别提及来自单克隆抗体的scFv。WO 2014/4011988中所述的双特异性或多特异性CAR通过引用结合于此。

类似地，如前面关于单链CAR所描述的那样，本发明包括具有多链CAR的免疫细胞，该多链CAR特异性地靶向CD38细胞表面标志物。根据本发明的优选的实施方式，上述的CAR在免疫细胞中表达，而编码所述表面标志物的内源基因的失活是通过表达稀切核酸内切酶而诱导的。

根据优选的实施方式，本发明的多链CAR(mcCAR)包含融合至细胞外CD38配体结合结构域的来自高亲和性IgE受体(FcεRI)的α链的跨膜多肽。

根据更优选的实施方式，所述抗CD38多链CAR还包括融合至信号转导结构域的来自FcεRI的γ链或β链的第二跨膜多肽。

根据甚至更优选的实施方式，所述抗CD38多链CAR包含含有共刺激结构域的来自FcεRI的γ链或β链的第三跨膜多肽。

根据优选的实施方式，其中上述抗CD38mcCAR的所述CD38配体结合结构域(其融合至FcεRI的所述α链)是为CD38提供特异性的包含重链(V_H)和轻链(V_L)的单链可变片段(scFv)。

在更优选的实施方式中，上述抗CD38mcCAR的所述V_H包括与选自SEQ ID NO.14、62、54和30中的一种具有至少90％的同一性的多肽序列。

在另一个更优选的实施方式中，上述抗CD38mcCAR的所述V_L包括与选自SEQ IDNO.10、58、50和26中的一种具有至少90％的同一性的多肽。

在一个实施方式中，上述抗CD38mcCAR的FcεRI的所述α链由来自CD8α、IgG1或FcRIIIα蛋白的铰链融合至所述细胞外配体结合结构域。

在一个实施方式中，上述抗CD38mcCAR的信号转导结构域融合至FcεRI的γ链或β链，来自TCRζ链、FCεRβ链、FcεRIγ链，或包括免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。

在优选的实施方式中，上述抗CD38mcCAR的信号转导结构域来自CD3ζ，且优选包含与SEQ ID NO.81具有至少90％同一性的多肽序列。

在一个实施方式中，上述抗CD38mcCAR的所述第二多肽或第三多肽包括来自选自以下各项的共刺激分子的胞质结构域的共刺激结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1((LFA-1)、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性地结合的配体以及它们的任何组合。

在优选的实施方式中，上述的所述共刺激结构域来自4-1BB，并且包含与SEQ IDNO.80具有至少90％同一性的多肽序列。

在图20中给出根据本发明的CD38特异性多链CAR的不同结构的实例。

在下表3中给出包含三种多肽γ、α和β的示例性抗CD38mcCAR的构造。

表3：形成抗CD38多链CAR的示例性多肽

T细胞的激活和扩增

根据本发明的方法通常包括激活和/或扩增T细胞的进一步的步骤。这可以在T细胞的基因修饰之前或之后进行，使用例如以下各项中描述的方法：美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041和美国专利申请公开号20060121005。根据这些方法，可以通过以下来扩增本发明的T细胞：与已经在其上附着刺激CD3TCR复合物相关联的信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触。

特别地，可以在体外刺激T细胞的群体，例如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓虫素(bryostatin))连同钙离子载体(ionophore)接触。对于在T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，在适合于刺激T细胞增殖的条件下，可以使T细胞的群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中或连接至表面。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比率可取决于相对于靶标细胞的粒径。在本发明的进一步的实施方式中，细胞如T细胞与试剂涂覆的珠粒相结合，然后将珠粒与细胞分离，然后培养细胞。在可替换的实施方式中，在培养之前，试剂涂覆的珠粒和细胞不被分离而是一起培养。可以通过允许抗CD3和抗CD28附连至其上的顺磁性珠粒(3x28珠粒)与T细胞接触而连接细胞表面蛋白。在一个实施方式中，细胞(例如，4至10个T细胞)和珠粒(例如，M-450CD3/CD28T顺磁性珠粒，比率为1:1)在缓冲液、优选PBS(不含二价阳离子，如钙和镁)中结合。而且，本领域的普通技术人员可以容易地理解可以使用任何细胞浓度。可以将该混合物培养数小时(约3小时)至约14天或在其间的任何小时整数值。在另一个实施方式中，可以将该混合物培养21天。适合于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640，或X-vivo 5，(Lonza))其可包含增殖和存活所必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、和TNF-或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)以及还原剂如N-乙酰基半胱氨酸和2-巯基乙二醇。培养基可包括RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1和X-Vivo 20、Optimizer，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充适量的血清(或血浆)或限定组的激素和/或足以使T细胞的生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中而不存在于待注入受试者的细胞的培养物中。靶标细胞在支持生长所必需的条件下保持，例如，合适的温度(例如，37℃)和气氛(例如空气+5％CO2)。暴露于不同的刺激时间的T细胞可以表现出不同的特性。

在另一特定实施方式中，可以通过与组织或细胞共培养来扩增所述细胞。所述细胞也可以在体内扩增，例如在将所述细胞给予到所述受试者中之后在受试者的血液中扩增。

在一个实施方式中，本发明的所述T细胞可以经历强的体内T细胞扩增，并且可持续延长量的时间。

根据一个实施方式，本发明的所述T细胞在给予患者之后可经历强的体内T细胞扩增，并且可以在体液中持续延长量的时间、优选地持续一周、更优选2周、甚至更优选至少一个月。尽管预期根据本发明的T细胞在这些时间段内是持续的，但它们在患者体内的寿命旨在不超过一年、优选6个月、更优选2个月、并且甚至更优选一个月。

CD38抗原的基因失活

抗原标志物CD38已被用作诊断方法中的特异性标志物一段时间，特别是针对白血病病理细胞，但不是在疗法中。实际上，尽管该标志物在本领域中被识别为相当特异性的标志物，但是因为针对该标志物的抗体会被患者的T细胞破坏或干扰，因此它不能被用作免疫疗法的靶标。

在第一实施方式中，本发明的方法涉及制备合适的免疫细胞、优选用于免疫疗法的T细胞的方法，包括以下步骤：

(a)使免疫细胞中编码CD38基因的基因发生基因失活或突变，该基因参与CD38抗原标志物的表达或呈递，所述CD38抗原标志物存在于所述免疫细胞和病理细胞两者的表面上；

(b)将编码针对所述CD38抗原标志物的嵌合抗原受体的转基因表达到所述免疫细胞中，如在前面章节中提供的，所述抗原标志物存在于所述病理细胞的表面。

在另一个实施方式中，用于工程化的CD38抗原失活和CD38CAR表达性的合适的免疫细胞、优选用于免疫疗法的T细胞的方法包括以下步骤：

(a)如在本发明中所描述的，使免疫细胞中编码CD38基因的基因发生基因失活或突变，与另一基因或其他基因的失活或突变组合，所述一个或多个基因选自由涉及以下各项的基因组成的组：同种异体免疫细胞的植入、作为免疫检查点、提供耐药性或提供对免疫抑制剂的抗性；

(b)将编码针对所述CD38抗原标志物的嵌合抗原受体的转基因表达到所述免疫细胞中，如在其他部分和权利要求1中所描述的。

在特定实施方式中，用于工程化细胞的所述方法包括以下步骤中的至少一个：

(a)从血液样品中提供免疫细胞、优选T细胞；

(b)在所述免疫细胞中引入能够通过DNA切割、优选通过双链断裂以选择性失活以下各项的稀切核酸内切酶，分别地：

-所述编码CD38抗原的基因，和

-编码涉及同种异体免疫细胞的移植、作为免疫检查点、提供耐药性或提供对免疫抑制剂的抗性的组分的至少一个基因

(c)扩增所述细胞。

在优选的实施方式中，在步骤a)期间，将要被失活或突变的一个或多个另外的所述基因选自由以下各项组成的组：TCR、β2M、PD-1、CTLA-4、dCK、DHFR、MGMT、IMPDH2、MDR1、CD52、GR。

在另一个实施方式中，所述稀切核酸内切酶可以是大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALE核酸酶、Casp9核酸酶或Cpf1核酸酶。在优选的实施方式中，所述稀切核酸内切酶是TALE核酸酶。

在特定的实施方式中，可以在由特异性稀切核酸内切酶如TALE核酸酶所靶向的精确基因组位置处完成CD38抗原以及涉及同种异体免疫细胞的移植、作为免疫检查点、提供耐药性或提供对免疫抑制剂的抗性的一个或多个基因的失活，其中所述特异性核酸内切酶催化切割，并且其中外源核酸连续地包括至少一个同源区和使CD38靶向的基因和通过同源重组整合的上述其他基因失活的序列。在另一个实施方式中，通过使用分别地和特异性地靶向用于特异性基因失活的一个定义的基因和多种特异性多核苷酸的多种特异性稀切核酸内切酶，可以将多个基因连续或同时失活。

在优选的实施方式中，用于工程化KO CD38和抗CD38CAR表达性免疫细胞的所述方法包括以下步骤：

(a)在免疫细胞中使CD38基因发生基因失活，所述靶标CD38选自由SEQ ID 1、4和7组成的组，通过分别使用SEQ 2-3、SEQ 5-6和SEQ 8-9的左侧和右侧TALE核酸酶；

(b)将编码针对CD38抗原的嵌合抗原受体的转基因表达到所述免疫细胞中，所述特异性抗CD38CAR具有选自如在图8中所示出的V1、V2和V3的多肽结构中的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或SEQ ID NO.22和18(29B4)。

在另一优选的实施方式中，用于工程化KO CD38和CD38+表达性免疫细胞的所述方法包括以下步骤：

(b)在述免疫细胞中表达编码抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)的转基因，其中所述V_H和V_L包括以下CDR序列：分别地SEQ ID NO.15-17和SEQ ID NO.11-13；分别地SEQ ID NO.63-65和SEQ ID NO.59-62；分别地SEQ ID NO.55-57和SEQ ID NO.51-53；分别地SEQ ID NO.31-33和SEQ ID NO.27-29；分别地SEQ ID NO.39-41和SEQ ID NO.35-37；分别地SEQ ID NO.47-49和SEQ ID NO.45-43；分别地SEQ ID NO.55-57和SEQ ID NO.51-53；分别地SEQ ID NO.63-65和SEQ ID NO.59-61；分别地SEQ ID NO.71-73和SEQ ID NO.67-69。

在更优选的实施方式中，工程化KO CD38和抗CD38CAR表达性免疫细胞的所述方法包括以下步骤：

(a)在免疫细胞中使CD38基因发生基因失活，所述靶标CD38具有SEQ ID 4，通过分别使用SEQ 5-6的左侧和右侧TALE核酸酶；

(b)在所述免疫细胞中表达编码抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)的转基因，其包括与选自由以下各项中的一种具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.82-84(25A10)、SEQ ID NO.100-102(28F5)、SEQ ID NO.97-99(13F11)和SEQ ID NO.88-90(16B5)。

在甚至更优选的实施方式中，用于工程化KO CD38和抗CD38CAR表达性免疫细胞的所述方法包括以下步骤：

(b)在所述免疫细胞中表达编码抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)的转基因，其包括与选自SEQ ID NO.82-84(25A10)和SEQ ID NO.100-102(28F5)中的一种具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列。

在仍然更优选的实施方式中，用于工程化KO CD38和抗CD38 CAR表达性免疫细胞的所述方法包括以下步骤：

(b)在所述免疫细胞中表达编码抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)转基因，其包括与SEQ ID NO.82(25A10-v1CAR)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列。

根据本发明的免疫细胞被赋予针对CD38抗原标志物的抗CD38嵌合抗原受体，CD38抗原标志物通常是由病理细胞和免疫细胞表达的，或已知存在于所述T细胞的表面上。表述“已知存在”是指据报道发现该抗原标志物在体内自然条件下、特别是在血液中生长的免疫细胞表面上，但在体外培养时则不是必然。在任何情况下，本发明的方法导致在免疫细胞表面上缺少CD38抗原标志物，从而防止嵌合抗原受体与工程化的T细胞表面反应。在这方面，方法可包括通过排除在其表面上呈递所述标志物抗原的细胞来纯化得到的T细胞的另外步骤。

失活基因是指感兴趣的基因不以功能蛋白形式表达。在特定实施方式中，方法的基因修饰依赖于稀切核酸内切酶在所提供的待进行工程化的细胞中的表达，使得该稀切核酸内切酶催化一个被靶向的基因中的切割，从而使所述被靶向的基因失活。由核酸内切酶引起的核酸链断裂通常是通过同源重组或非同末源端连接(NHEJ)的不同机制而修复的。然而，NHEJ是一种不完美的修复过程，其经常导致切割位点处DNA序列的改变。这些机制涉及通过直接再连接(Critchlow and Jackson 1998)或通过所谓的微同源介导的末端连接(Betts,Brenchley et al.2003；Ma,Kim et al.2003)来重新连接两个DNA末端的剩余部分。经由非同源末端连接(NHEJ)的修复经常导致小的插入或缺失，并且可用于产生特异性的基因敲除。所述修饰可以是替换、缺失或添加至少一个核苷酸。可以通过本领域中公知的方法来识别和/或选择其中已经发生切割诱导的突变事件、即与NHEJ事件连续的突变事件的细胞。

根据本发明的优选的实施方式，上述方法步骤a)的基因突变或失活是采用稀切核酸内切酶进行的。

术语"稀切核酸内切酶(rare-cutting endonuclease)"是指能够催化水解(切割)DNA或RNA分子、优选DNA分子中的核酸之间的键的野生型或变体酶。特别地，所述核酸酶可以是核酸内切酶、更优选地是稀切核酸内切酶，其是高度特异性的，识别范围为10-45个碱基对(bp)长度、通常为10-35个碱基对长度、更通常为12-20个碱基对长度的核酸靶标位点。根据本发明的核酸内切酶识别特异性的多核苷酸序列，还被称为“靶标序列”；以及切割这些靶标序列内的核酸或切割在与其相邻的序列中，这取决于所述核酸内切酶的分子结构。稀切核酸内切酶可以识别并在特定的多核苷酸序列处产生单链或双链断裂。

在特定的实施方式中，根据本发明的所述稀切核酸内切酶是RNA指导的核酸内切酶，如Cas9/CRISPR复合物。RNA指导的核酸内切酶构成其中核酸内切酶与RNA分子相关联的新一代基因组工程化工具。在该系统中，RNA分子核苷酸序列确定靶标特异性并激活核酸内切酶(Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran etal.2013；Mali,Yang et al.2013)。

TAL核酸酶

在优选的实施方式中，上述方法的步骤a)中的CD38基因的失活是通过使用TAL核酸酶来进行的。

在更优选的实施方式中，所述TAL核酸酶靶向SEQ ID NO.1、4或7的CD38基因序列。

根据另一个更优选的实施方式，所述CD38抗原的失活是通过使用SEQ ID NO.2-3、5-6或8-9的TALE核酸酶来进行的。

在下表4中给出了上述针对CD38靶标及其相应的左侧和右侧TALE核酸酶的序列。

表4：两个其他CD38靶标和用于它们失活的对应TALEN的序列

"TALE核酸酶"或"MBBBD核酸酶"是指由通常来源于转录激活因子样效应蛋白(TALE)或模块化的碱基-碱基结合结构域(MBBBD)的DNA结合结构域与具有核酸内切酶活性的催化结构域的融合产生的工程化的蛋白质。这种催化结构域通常来自酶，例如I-TevI、ColE7、NucA和Fok-I。取决于所选择的催化结构域，TALE核酸酶可以以单体或二聚体形式形成(WO2012138927)。这种工程化的TALE核酸酶可以以商品名TALEN^TM(Cellectis,8rue dela Croix Jarry,75013Paris,法国)商购。

根据本发明的优选的实施方式，DNA结合结构域来源于转录激活因子样效应子(TALE)，其中序列特异性由来源于黄单胞菌属(Xanthomonas)或青枯菌属(Ralstonia)细菌蛋白AvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1c(作为非限制性实施例)的33-35个氨基酸重复的系列来驱动。

这些重复基本上区别在于两个氨基酸位置，其指定与碱基对的相互作用(Boch,Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009)。DNA靶标中的每一碱基对由单一重复进行接触，具有由重复的两种变体氨基酸产生的特异性(所谓的重复可变二肽，RVD)。TALE结合结构域还可以包括负责靶标序列的第一胸腺嘧啶碱基(T0)的需求的N-末端易位结构域，和包含核定位信号(NLS)的C-端结构域。TALE核酸结合结构域通常对应于包含多个TALE重复序列的工程化的核心TALE支架，每个重复包括对于TALE识别位点的每个核苷酸碱基具有特异性的RVD。在本发明中，所述核心支架的每个TALE重复序列由30-42个、更优选33或34个氨基酸组成，其中在位置12和13处定位的两个关键氨基酸(所谓的重复可变二肽，RVD)介导所述TALE结合位点序列的一个核苷酸的识别；等同的两种关键氨基酸可位于除了12和13之外的位置，特别是在大于33或34个氨基酸的TALE重复序列中。优选地，与不同核苷酸的识别相关联的RVD是用于识别C的HD、用于识别T的NG、用于识别A的NI、用于识别G或A的NN。在另一个实施方式中，关键氨基酸12和13可以向其他氨基酸残基突变以调节它们对核苷酸A、T、C和G的特异性，并且特别是增强该特异性。TALE核酸结合结构域通常包括8-30个TALE重复序列。更优选地，本发明的所述核心支架包括8-20个TALE重复序列；更优选15个TALE重复序列。它还可以包括由位于TALE重复序列的所述组的C-末端处的20个氨基酸组成的另外的单一截短的TALE重复序列，即另外的C端半TALE重复序列。

可以将其他工程化DNA结合结构域用作可替换的序列以形成所谓的模块化碱基-碱基特异性核酸结合结构域(MBBBD)，如在WO 2014/018601中所描述的那样。例如，可以从新识别的蛋白质，即，来自胞内共生的类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia Rhizoxinica)的新近测序的基因组的EAV36_BURRH、E5AW43_BURRH、E5AW45_BURRH和E5AW46_BURRH蛋白(Lackner,Moebius et al.2011)工程化所述MBBBD。这些核酸结合多肽包括约31至33个氨基酸的模块，它们是碱基特异性的。这些模块与黄单胞菌(Xanthomonas)TALE共同重复具有少于40％的序列同一性，并且存在更多的多肽序列可变性。来自伯克霍尔德菌(Burkholderia)和黄单胞菌(Xanthomonas)的上述蛋白质的不同结构域(模块，N和C-端)可用于工程化新的蛋白质或支架，所述新的蛋白质或支架具有与特定核酸序列的结合性质，并且可组合以形成嵌合的TALE-MBBBD蛋白。

本发明包括用于工程化的T细胞的方法，以通过使用特异性TALE核酸酶使编码CD38抗原标志物的基因的表达失活。

特别适用于实现本发明，TALE核酸酶如针对CD38基因的SEQ ID NO:2-3；5-6；8-9中的成员。这些特异性TALE核酸酶，它们的序列靶标和所用的方案在以下实施例1中更充分地提供。

Cas 9

在另一个实施方式中，在前述方法的步骤a)中的CD38的基因失活是使用Cas 9RNA指导的核酸内切酶进行的。

在另一个实施方式中，所述RNA指导的核酸内切酶被分成至少2个多肽，其中一个包含RuvC而另一个包含HNH。

Cas9，也称为Csn1(COG3513)，是参与crRNA生物生成和入侵DNA破坏的大蛋白。已经在不同的细菌种类如嗜热金黄色葡萄球菌菌(S.thermophiles)、无害利斯特菌(Listeria innocua)(Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012)和金黄色酿脓葡萄球菌(S.Pyogenes)(Deltcheva,Chylinski et al.2011)中描述了Cas9。大型Cas9蛋白(＞1200个氨基酸)含有两个预测的核酸酶结构域，即，位于蛋白的中间的HNH(McrA-样)核酸酶结构域和被拆分的RuvC样核酸酶结构域(RNase H折叠)(Makarova,Grishin et al.(2006)。

“Cas9”是指能加工靶标核酸序列的Cas9的工程化的核酸内切酶或同源物。在特定实施方式中，Cas9可以诱导核酸靶标序列中的切割，其可对应于双链断裂或单链断裂。Cas9变体可以是在自然界中并不天然存在的、并且是通过蛋白质工程或通过随机诱变获得的Cas9核酸内切酶。例如，可以通过突变获得根据本发明的Cas9变体，即，在金黄色酿脓葡萄球菌(S.pyogenes)Cas9核酸内切酶(COG3513)的氨基酸序列中的至少一种残基的缺失或插入或替换。在本发明的框架方面中，这样的Cas9变体保持功能，即它们保留了处理靶标核酸序列的能力。Cas9变体也可以是金黄色酿脓葡萄球菌Cas9的同源物，其可以包括金黄色酿脓葡萄球菌Cas9氨基酸序列中的至少一个残基的缺失或插入或替换。还可以进行缺失、插入和替换的任何组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有所需的活性，特别是结合向导RNA或核酸靶标序列的能力。

RuvC/RNaseH基序包括显示广谱的核酸水解功能的蛋白质，其作用于RNA和DNA上(RNaseH、RuvC、DNA转座酶和逆转录病毒整合酶以及Argonaut蛋白的PIWI结构域)。在本发明中，Cas9蛋白的RuvC催化结构域可以特征在于以下序列基序：D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A，其中X表示20种天然氨基酸中的任一种，并且[I/L]表示异亮氨酸或亮氨酸。在其他方面，本发明涉及包括至少D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A序列的Cas9变体，其中X表示20种天然氨基酸中的任一种，并且[I/L]表示异亮氨酸或亮氨酸。

HNH基序是许多在双链DNA上起作用核酸酶的特征，包括大肠杆菌素、限制性酶和归巢核酸内切酶。结构域HNH(SMART ID：SM00507，SCOP命名：HNH家族)与DNA结合蛋白的范围相关联，行使多种结合和切割功能。具有已知功能的那些涉及一定范围的细胞过程，包括细菌毒性、在第1组和第II组内含子和内含肽中的归巢功能、重组、发育控制的DNA重排、噬菌体包装和限制性核酸内切酶活性(Dalgaard,Klar et al.1997)。这些蛋白质在病毒、古细菌、真细菌和真核生物中都有发现。有趣的是，与具有LAGLI-DADG和GIY-YIG基序一样，HNH基序通常与自身繁殖元件如内含肽、第I组和第II组内含子的核酸内切酶结构域相关联(Dalgaard,Klar et al.1997)。HNH结构域可以特征在于存在保守的Asp/His残基，其侧翼是保守His(氨基末端)和His/Asp/Glu(羧基末端)残基(在一定距离处)。大量这些蛋白质也可以在中央Asp/His残基的任一侧上具有CX2C基序。在结构上，HNH基序表现为扭转的β-链的中心发夹，其由α螺旋在每一边侧接(Kleanthous,Kuhlmann et al.1999)。Cas9的较大的HNH结构域由SEQ ID NO.5表示。在本发明中，HNH基序可由以下序列基序表征：Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S，其中X表示20种天然氨基酸中的任一种。本发明涉及包括至少Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S序列的Cas9变体，其中X表示20种天然氨基酸中的任一种。

本发明特别关注于容易地进行靶向多重基因修饰，并通过将向导RNA引入到Cas9细胞产生可诱导的核酸酶系统。为了本发明的目的，发明人已经确立了可以将Cas9蛋白分成两个单独的拆分(split)的Cas9RuvC和HNH结构域，它们可以与向导RNA一起或单独地加工靶标核酸序列。

而且，可以组装来自不同的RNA指导的核酸内切酶或Cas同源物的RuvC和HNH结构域以提高核酸酶效率或特异性。来自不同物种的结构域可被拆分成两个蛋白质或彼此融合以形成变体Cas蛋白质。该Cas9拆分系统被认为特别适合于基因组靶向的可诱导的方法，并且避免了在细胞内的Cas9过量表达的潜在毒性效果。实际上，可以将第一拆分Cas9结构域引入到细胞中、优选通过用编码所述拆分结构域的转基因稳定转化所述细胞。然后，可以将Cas9的互补拆分部分引入细胞，使得两个拆分部分重新组装到所述细胞中从而在期望时间重新构成功能性Cas9蛋白。

与野生型Cas9相比，拆分Cas9的尺寸减小使得载体化和递送至细胞中例如通过使用细胞穿透肽更容易。使来自不同的Cas蛋白的结构域重新排列允许调节特异性和核酸酶活性，例如，通过靶向与金黄色酿脓葡萄球菌(S.pyogenes)Cas9稍微不同的PAM基序。

Split Cas9系统

RuvC和HNH结构域的前述表征已经促使本发明人对Cas9蛋白进行工程化以产生拆分Cas9蛋白。令人惊奇的是，本发明人发现，这两个拆分Cas9可以一起地或单独地加工核酸靶标。这一观察允许使用拆分Cas9蛋白开发新的Cas9系统。可以分别制备和使用每个拆分Cas9结构域。因此，该拆分系统显示了RNA指导的核酸内切酶在T细胞中的载体化(vectorization)和递送的多个优点，允许递送较短的和/或非活性的蛋白质，并且特别适合于在所期望的时间在T细胞中诱导基因组工程化并且因此限制了整合的Cas9核酸酶的潜在毒性。

本文中“拆分Cas9(Split Cas9)”是指Cas9蛋白或Cas9变体的减小的形式或截短的形式，其包括RuvC结构域或HNH结构域，但不包括这些域中的两者。这种“拆分Cas9”可独立于向导RNA或以互补的方式使用，例如，一个拆分Cas9提供RuvC结构域，而另一个提供HNH结构域。不同的拆分RNA指导的核酸内切酶可以一起使用(具有RuvC和/或NHN结构域)。

可以从相同或不同的Cas9同源物得到每个Cas9拆分结构域。在基因组数据库中已经识别了Cas9的许多同源物。

可以将所述Cas9拆分结构域(RuvC和HNH结构域)同时或顺序地引入细胞中，使得一个或多个所述拆分Cas9结构域加工细胞中的靶标核酸序列。如本文中其他部分所述，可以通过使用细胞穿透肽或其他转染方法将所述Cas9拆分结构域和向导RNA引入所述细胞中。

在本发明的另一个方面中，在所述细胞中仅引入了一个拆分Cas9结构域，其被称为紧凑Cas9(compact Cas9)。实际上，令人惊奇的是，发明人发现，如上所述包含RuvC基序的拆分Cas9结构域能够独立于包含HNH基序的拆分结构域切割靶标核酸序列。因此，他们能够确定向导RNA不需要存在HNH结构域以结合至靶标核酸序列，并且足够稳定以被RuvC拆分结构域结合。在一个优选的实施方式中，所述拆分Cas9结构域能够使所述靶标核酸序列形成切口。

每个拆分结构可以以N端和/或C端末端与至少一个活性结构域融合，所述活性结构域可以选自由以下各项组成的组：核酸酶(例如核酸内切酶或核酸外切酶)、聚合酶、激酶、磷酸酶、甲基化酶、脱甲基酶、乙酰化酶、脱乙酰化酶、拓扑异构酶、整合酶、转座酶、连接酶、螺旋酶、重组酶、转录激活因子(例如VP64、VP16)、转录抑制子(例如KRAB)、DNA末端加工酶(例如Trex2、Tdt)、报告分子(例如荧光蛋白、lacZ、萤光素酶)。

HNH结构域负责使靶标双链DNA中的一条链产生切口，而RuvC样RNaseH折叠结构域参与使双链核酸靶标的另一条链(包含PAM基序)产生切口(Jinek,Chylinski etal.2012)。然而，在野生型Cas9中，这两个结构域产生在PAM的紧邻位置处在相同靶标序列内(前间区(proto-spacer))的侵入性DNA的平末端切割(Jinek,Chylinski et al.2012)。Cas 9可以是切口酶并且诱导在不同的靶标序列中的切口事件。

作为非限制性实例，Cas9或拆分Cas9可包括在HNH或RuvC样结构域的催化性残基中的突变以在不同的靶标序列内诱导缺口事件。作为非限制性实例，Cas9蛋白的催化性残基是对应于氨基酸D10、D31、H840、H868、N882和N891或使用CLUSTALW方法在Cas家族成员的同源物上的对齐的位置的那些。这些残基中的任何一种可被任何其他氨基酸、优选被丙氨酸残基替换。催化性残基中的突变是指被另一种氨基酸替换，或氨基酸的缺失或添加，它们诱导Cas9的催化结构域中的至少一个的失活。(参见)。在特定的实施方式中，Cas9或拆分Cas9可以包括上述突变中的一种或多种。在另一特定实施例中，拆分Cas9仅包括两个RuvC和HNH催化结构域中的一种。在本发明中，可以使用来自不同物种的Cas9、Cas9同源物、工程化的Cas9及它们的功能性变体。本发明设想使用任何RNA指导的核酸内切酶或拆分RNA指导的核酸内切酶变体(split RNA guided endonucleases variants)从而在感兴趣的基因序列中进行核酸切割。

大范围核酸酶

稀切核酸内切酶也可以是归巢核酸内切酶，也已知为大范围核酸酶的名称。这样的归巢核酸内切酶是本领域公知的(Stoddard 2005)。归巢核酸内切酶是高度特异性的，识别从12至45个碱基对(bp)长度范围内、通常为14-40bp长度的DNA靶标位点。例如，根据本发明的归巢核酸内切酶可以对应于LAGLIDADG核酸内切酶、对应于HNH核酸内切酶或对应于GIY-YIG核酸内切酶。根据本发明的优选的归巢核酸内切酶可以是I-CreI变体。“变体”核酸内切酶，即，在自然界中并不天然存在的并且是通过基因工程化或通过随机诱变获得的核酸内切酶，可以结合与野生型核酸内切酶识别的那些不同的DNA序列(参见国际申请WO2006/097854)。

所述稀切核酸内切酶可以是模块化DNA结合核酸酶。模块化DNA结合核酸酶是指包含核酸内切酶的至少一个催化结构域和至少一个DNA结合结构域的任何融合蛋白或指定(specifying)核酸靶标序列的蛋白。DNA结合结构域通常是由独立折叠的多肽或蛋白质结构域形成的RNA或DNA结合结构域，所述独立折叠的多肽或蛋白质结构域包含识别双链或单链多核苷酸的至少一个基序。在本领域中已描述了许多这样的多肽具有结合特定核酸序列的能力。作为非限制性实例，这种结合结构域通常包括螺旋-转角-螺旋结构域、亮氨酸拉链结构域、翼状螺旋结构域、螺旋-环-螺旋结构域、HMG盒子结构域、免疫球蛋白结构域、B3结构域或工程化的锌指结构域。

锌指核酸酶

最初开发用于体外切割DNA的“锌指核酸酶”(ZFN)是在IIS类限制性酶FokI的切割结构域与含有3个或更多个C2H2锌指基序的DNA识别结构域之间的融合体。在精确取向的两个单独ZFN的DNA中的特定位置处的异源二聚化和间隔导致DNA中的双链断裂(DSB)。这种嵌合核酸内切酶的应用已经在本领域中被广泛报道，如Urnov et al.(Genome editing withengineered zinc finger nucleases(2010)Nature reviews Genetics11:636-646)的综述。

标准ZFN将切割结构域融合到每个锌指结构域的C末端。为了允许两个切割结构域二聚化和切割DNA，两个单独的ZFN以其C末端与DNA的相对链结合(一定距离间隔开)。在锌指结构域与切割结构域之间最常用的接头序列要求每个结合位点的5'边缘分隔开5-7bp。

产生新的锌指阵列的最直接的方法是组合已知特异性的较小的锌指"模块"。最常见的模块化组装过程涉及组合三个可以各自体识别3碱基对DNA序列的分离的锌指以产生可以识别9碱基对靶标位点的3指阵列。已经使用了多种选择方法来产生能够靶向所期望序列的锌指阵列。初始选择工作利用噬菌体展示来从部分随机化的锌指阵列的较大的池中选择结合给定的DNA靶标的蛋白质。最近的工作已经利用了酵母单杂交体系、细菌单杂交体系和双杂交体系，以及哺乳动物细胞。

递送方法

本发明人已经考虑本领域已知的任何方法以允许向细胞或所述细胞的亚细胞室内递送表达核酸内切酶的多核苷酸、它们的可能的辅助效应子(例如，与Cas9或Argonaute核酸酶相关联的向导RNA或DNA)以及嵌合抗原受体。这些方法包括病毒转导、电穿孔以及脂质体递送装置、聚合物载体(polymeric CARrier)、化学载体(chemical CARrier)、脂质聚体(lipoplex)、多聚体、树枝状聚合物、纳米颗粒、乳液、天然细胞内吞或吞噬途径作为非限制性实施例。

作为本发明的优选的实施方式，以mRNA形式转染编码本发明的核酸内切酶的多核苷酸从而获得瞬时表达并避免外来DNA的染色体整合，例如通过电穿孔。本发明人确定了在表5中显示的T细胞中mRNA电穿孔的不同的最佳条件。发明人使用了cytoPulse技术，其通过使用脉冲电场允许暂时渗透化活细胞用于将材料递送到细胞中(美国专利6,010,613和WO2004/083379)。可以修改脉冲持续时间、强度以及脉冲之间的间隔以达到高转染效率和最小死亡率的最佳条件。基本上，第一高电场脉冲允许孔形成，而随后的较低电场脉冲允许多核苷酸移动到细胞中。在本发明的一个方面中，本发明人描述了mRNA在T细胞中达到＞95％的转染效率的步骤，以及利用电穿孔方案在T细胞中瞬时表达不同种类的蛋白质。具体地，本发明涉及转化T细胞的方法，包括使所述T细胞与RNA接触，以及向T细胞施加灵活的脉冲序列，其由以下各项组成：

(a)一个电脉冲，电压范围为250至3000V/cm，脉冲宽度为0.1ms，并且在步骤(a)和步骤(b)的电脉冲之间的脉冲间隔为0.2至10ms；

(b)一个电脉冲，电压范围从2250至3000V，脉冲宽度为100ms，并且在步骤(b)的电脉冲和步骤(c)的第一电脉冲之间的脉冲间隔为100ms；以及

(c)4个电脉冲，电压为325V，脉冲宽度为0.2ms，4个电脉冲每个之间的脉冲间隔为2ms。

在特定的实施方式中，转化T细胞的方法包括使所述T细胞与RNA接触，并且向T细胞施加灵活的脉冲序列，其由以下各项组成：

(a)一个电脉冲，具有2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V/厘米的电压，脉冲宽度为0.1ms，步骤(a)和步骤(b)的电脉冲之间的脉冲间隔为0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ms；

(b)一个电脉冲，具有从2250即2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V的电压范围，脉冲宽度为100ms，在步骤(b)的电脉冲与步骤(c)的第一电脉冲之间的脉冲间隔为100ms；以及

在本申请中公开了包括在上述数值范围中的任何值。电穿孔培养基可以是本领域已知的任何合适的培养基。优选地，电穿孔培养基的电导率在0.01-1.0毫西门子的范围内。

表5：用于确定在衍生自PBMC的T细胞中电穿孔所需的最小电压的不同的cytopulse程序

病毒转导

根据本发明，逆转录病毒载体并且更优选慢病毒载体的应用特别适合于将嵌合抗原受体表达到T细胞中。病毒转导的方法在本领域中是公知的(Walther et al.(2000)Viral Vectors for Gene Transfer.Drugs.60(2):249-271)。整合的病毒载体允许多核苷酸稳定整合到T细胞基因组中以及在较长时间内表达嵌合抗原受体。

根据另一个实施方式，所选择的所述CD38CAR被克隆在编码自杀基因RQR8(其在启动子如EF1a的控制下)的慢病毒载体中。

根据优选的实施方式，CD38CAR在CD38缺陷型T细胞的T细胞上转导。通常通过流式细胞术评估CAR的表达，并测试抗CD38CAR T细胞表型和功能。此后更详细地描述这一点。

非同种异体反应性T细胞

虽然本发明的方法可以在体内作为基因疗法的一部分进行，例如，通过在血液循环中使用靶向T细胞的病毒载体，其会包括表达特异性稀切核酸内切酶的基因序列以及表达CAR的其他基因序列，本发明的方法更一般地希望在从患者或供体可获得的培养的T细胞上离体实施。

根据一个实施方式，如在所述本发明中呈现的待工程化的免疫细胞来源于始发态干细胞(primary stem cell)、iPS或hES细胞。

在另一个实施方式中，所述免疫细胞来源于由病理细胞的发展所影响的患者。

离体工程化的工程化的T细胞可被重新植入它们来源于的患者中作为自体疗法的一部分，或用作同种异体治疗的一部分。在后一种情况下，优选进一步工程化细胞以使它们不具有同种异体反应性，以确保它们适当的植入。因此，本发明的方法可以包括从供体获得T细胞的另外步骤和失活它们与MHC识别有关或作为免疫抑制药物的靶标的基因，例如WO2013/176915中所述。

T细胞受体(TCR)是响应于抗原的呈递参与T细胞活化的细胞表面受体。TCR通常由两个链，α和β构成，其可组装以形成异源二聚体并与所述CD3转导性亚基相关联以形成存在于细胞表面上的T细胞受体复合物。TCR的每个α链和β链是由以下各项组成的：免疫球蛋白样的N-末端可变区(V)和恒定区(C)、疏水跨膜结构域和短胞质区域。对于免疫球蛋白分子，α链和β链的可变区是由V(D)J重组产生的，使得在T细胞的群体内产生大量的多样化的抗原特异性。然而，与识别完整抗原的免疫球蛋白相反，T细胞是由与MHC分子相关联的加工后的肽片段激活，通过T细胞将额外维度引入抗原识别，称为MHC限制。通过T细胞受体识别供体和受体之间的MHC差异导致细胞增殖和GVHD的潜在发展。已经表明，TCR的正常表面表达依赖于复合物的所有七种组分的协同合成和组装(Ashwell and Klusner 1990)。TCRα或TCRβ的失活可以导致TCR从T细胞表面的消除，从而防止识别同种异体抗原和因此导致的GVHD。

因此，仍根据本发明，可以通过使编码TCR组分的至少一种基因失活来改善T细胞的移植。通过使TCRα基因和/或TCRβ基因失活，使得TCR在细胞中不起作用。

关于Cas9/CRISPR系统的使用，本发明人已经确定了在3个编码TCR的外显子内的合适的靶标序列，允许显著降低活细胞中的毒性，同时保持切割效率。优选的靶标序列在申请WO2014/191128的表2中给出。

MHC抗原也是在移植反应中起主要作用的蛋白质。排斥由T细胞介导，所述T细胞与植入组织的表面上的组织相容性抗原反应，这些抗原的最大的组为主要组织相容性抗原(MHC)。这些蛋白质表达于所有高等脊椎动物细胞的表面，并且在人细胞中称为HLA抗原(针对人白细胞抗原)。与TCR类似，MHC蛋白质在T细胞刺激中起重要作用。抗原呈递细胞(通常是树突细胞)在MHC上在细胞表面上展示肽，这些肽是外来蛋白质的降解产物。在存在共刺激信号的情况下，T细胞被激活并会作用于也展示相同肽/MHC复合物的靶标细胞上。例如，受到刺激的T辅助细胞会靶向展示与其MHC结合的抗原的巨噬细胞，或者细胞毒性T细胞(CTL)会作用于展示外来病毒肽的病毒感染的细胞上。

因此，为了提供较少的同种异体反应性T细胞，本发明的方法还可以进一步包括使一种HLA基因发生失活或突变的步骤。

人类中的I类HLA基因簇包括三个主位点(major loci)，B、C和A，以及多个小位点(minor loci)。II类HLA簇还包括三个主位点，DP、DQ和DR,，并且I类和II类基因簇均为多态性的，因为在群体中存在I类和II类基因的多种不同等位基因。还有多种也在HLA功能上起作用的辅助蛋白。Tapl和Tap2亚基是TAP转运复合物的部分，其在将肽抗原加载到I类HLA复合物上是重要的，LMP2和LMP7蛋白体亚基在抗原的蛋白水解降解成用于在HLA上展示的肽方面发挥作用。已证明LMP7的降低减少了细胞表面的MHC I类的量，可能通过缺乏稳定性((Fehling et al.(1999)Science 265:1234-1237)。除了TAP和LMP外，还存在TAP相关蛋白(tapasin)基因，其产物形成TAP复合物与HLA I类链之间的桥并且增强肽负载。TAP相关蛋白的减少导致细胞具有受损的MHC I类组装，减少的MHC I类的细胞表面表达和受损的免疫应答(Grandea et al.(2000)Immunity 13:213-222and Garbi et al.(2000)Nat.Immunol.1:234-238)。上述基因中任一种可以作为本发明所公开的一部分(如WO2012/012667中公开的)被失活。

在另一个实施方式中，制备免疫细胞的方法包括使编码β2m的基因失活的进一步的步骤。β-2微球蛋白，也称为B2M，是MHC I类分子的轻链，并且作为主要组织相容性复合物的不可分割的部分。在人类中，B2M由位于15号染色体上的b2m基因编码，与6号染色体上的作为基因簇定位的其他MHC基因相对。该人蛋白由119个氨基酸(SEQ ID NO:1)组成，并且分子量为11.800道尔顿。β-2微球蛋白缺陷的小鼠模型表明，B2M对于MHC I类的细胞表面表达和肽结合沟槽的稳定性是必要的。进一步表明，由于β-2微球蛋白基因中的靶向突变，来自缺乏正常细胞表面MHC I表达的小鼠的造血移植物被正常小鼠中的NK1.1+细胞排斥，表明MHC I分子的缺陷性表达使骨髓细胞易于被宿主免疫系统排斥(Bix et al.1991)。

在抗CD38单链CAR的细胞外结构域中插入至少一个表位

本发明的抗CD38CAR可至少包括所述CAR的细胞外结构域中的至少一个表位的插入。这旨在在体内不良效应子如细胞因子风暴(cytokine storm)的情况下临时耗尽具有CAR的免疫细胞。此外，表位或“表位标签”的这种插入可以是有用的以在其制造过程中对所述工程化的免疫细胞进行分选或纯化。所述至少一个表位可以是任何抗原肽，其具有足够的免疫原性以通过识别这种肽的特异性抗体来结合。例如，这可以通过例如将至少一个、并且优选2个拷贝的CD20模拟表位、优选具有序列CPYSNPSLCS(SEQ ID NO.114)的CD20模拟表位插入CAR多肽序列而获得。为了之后简化的目的，以下给出从N端到C端的scFv的顺序：VH链然后是VL链。然而，在本发明的范围内可以预见该顺序被反转：VL链然后是VL链。

在图21A和图21B中示出了本发明的抗CD38CAR内的至少一个CD20模拟表位的不同位置。CD20模拟表位的所述两个拷贝可以相互连接，并且还由接头连接到V_L。它们也可以通过使用可选的接头插入抗CD38 scFv和铰链(例如CD8α)之间。CD20模拟表位可由抗CD20抗体如利妥昔单抗结合(McLaughlin P,et al.1998)。

因此，本发明的抗CD38CAR可包括能够与CD38细胞表面抗原结合的VH和VL链，可选的人源化的接头L、自杀结构域、铰链或其一部分、跨膜结构域、共刺激结构域和刺激域。

更具体地，表位可以包括在本发明的CAR中，例如如下：

在一些实施方式中，细胞外结合结构域包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个mAb特异性表位。

在一些实施方式中，细胞外结合结构域包括至少1、2或3个mAb特异性表位。

在一些实施方式中，当细胞外结合结构域包括多个mAb特异性表位时，所有的mAb特异性表位是相同的。

在一些实施方式中，当细胞外结合结构域包括多个mAb特异性表位时，mAb特异性表位不相同。例如，细胞外结合结构域可以包括三个mAb特异性表位，其中两个是相同的而第三个是不同的。

在一些具体实施方式中，细胞外结合结构域包括VH、VL、一个或多个mAb特异性表位，优选1、2或3个、更优选2或3个mAb特异性表位。

在一些实施方式中，细胞外结合结构域包括下述序列(N端位于左手侧))：

V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位1-(L)_x；

V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x；

V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x；

(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-L₁-V₂；

(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-V₁-L₁-V₂；

表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x-V₁-L₁-V₂；

(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x；

(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x；

(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x-表位4-(L)_x；

(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位3-(L)_x；

(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位3-(L)_x-表位4-(L)_x；

V₁-(L)_x-表位1-(L)_x-V₂；

V₁-(L)_x-表位1-(L)_x-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x；

V₁-(L)_x-表位1-(L)_x-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x；

V₁-(L)_x-表位1-(L)_x-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x-表位4-(L)_x；

(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-(L)_x-表位2-(L)_x-V₂；

(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-(L)_x-表位2-(L)_x-V₂-(L)_x-表位3-(L)_x；

V₁-L₁-V₂-L-表位1；

V₁-L₁-V₂-L-表位1-L；

V₁-L₁-V₂-L-表位1-L-表位2；

V₁-L₁-V₂-L-表位1-L-表位2-L；

V₁-L₁-V₂-L-表位1-L-表位2-L-表位3；

V₁-L₁-V₂-L-表位1-L-表位2-L-表位3-L；

V₁-L₁-V₂-表位1；

V₁-L₁-V₂-表位1-L；

V₁-L₁-V₂-表位1-L-表位2；

V₁-L₁-V₂-表位1-L-表位2-L；

V₁-L₁-V₂-表位1-L-表位2-L-表位3；

V₁-L₁-V₂-表位1-L-表位2-L-表位3-L；

表位1-V₁-L₁-V₂；

表位1-L-V₁-L₁-V₂；

L-表位1-V₁-L₁-V₂；

L-表位1-L-V₁-L₁-V₂；

表位1-L-表位2-V₁-L₁-V₂；

表位1-L-表位2-L-V₁-L₁-V₂；

L-表位1-L-表位2-V₁-L₁-V₂；

L-表位1-L-表位2-L-V₁-L₁-V₂；

表位1-L-表位2-L-表位3-V₁-L₁-V₂；

表位1-L-表位2-L-表位3-L-V₁-L₁-V₂；

L-表位1-L-表位2-L-表位3-V₁-L₁-V₂；

L-表位1-L-表位2-L-表位3-L-V₁-L₁-V₂；

V₁-L-表位1-L-V₂；

L-表位1-L-V₁-L-表位2-L-V₂；

V₁-L-表位1-L-V₂-L-表位2-L；

V₁-L-表位1-L-V₂-L-表位2-L-表位3；

V₁-L-表位1-L-V₂-L-表位2-表位3；

V₁-L-表位1-L-V₂-L-表位2-L-表位3-表位4；

L-表位1-L-V₁-L-表位2-L-V₂-L-表位3-L；

表位1-L-V₁-L-表位2-L-V₂-L-表位3-L；

L-表位1-L-V₁-L-表位2-L-V₂-L-表位3；

L-表位1-L-V₁-L₁-V₂-L-表位2-L；

L-表位1-L-V₁-L₁-V₂-L-表位2-L-表位3；

L-表位1-L-V₁-L₁-V₂-L-表位2-表位3,或

表位1-L-V₁-L₁-V₂-L-表位2-L-表位3-表位4。

其中，

V1和V2是ScFv V_H和V_L(即，V₁是V_L而V₂是V_H，或V₁是V_H而V₂是V_L)

L₁是适于ScFv中将VH链连接到VL链的任何接头；

L是接头、优选包含甘氨酸和丝氨酸残基，并且细胞外结合结构域中L的每次出现可以是相同或不同于在相同细胞外结合结构域中L的其他出现；以及，

x为0或1，并且x的每次出现彼此独立；以及，

表位1，表位2和表位3是mAb特异性表位并且可以是相同的或不同的。

V_H-L₁-V_L-L-表位1-L-表位2-L；

L-表位1-L-V_H-L-表位2-L-V_L-L-表位3-L；

V_L-L¹-V_H-L-表位1-L-表位2-L；或

L-表位1-L-V_L-L-表位2-L-V_H-L-表位3-L。

其中L、L1、表位1、表位2和表位3是如上定义的。

在一些实施方式中，L₁是包含甘氨酸和/或丝氨酸的接头。在一些实施方式中，L₁是含有氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)_n或(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n的接头，其中n为1、2、3、4或5。在一些实施方式中，L₁是(Gly₄Ser)₄或(Gly₄Ser)₃。

在一些实施方式中，L是柔性接头、优选包含甘氨酸和/或丝氨酸。在一些实施方式中，L具有选自以下的氨基酸序列：SGG、GGS、SGGS、SSGGS、GGGG、SGGGG、GGGGS、SGGGGS、GGGGGS、SGGGGGS、SGGGGG、GSGGGGS、GGGGGGGS、SGGGGGGG、SGGGGGGGS或SGGGGSGGGGS，优选SGG、SGGS、SSGGS、GGGG、SGGGGS、SGGGGGS、SGGGGG、GSGGGGS或SGGGGSGGGGS。在一些实施方式中，当细胞外结合结构域包括多次出现的L时，所有的L均相同。在一些实施方式中，当细胞外结合结构域包括多次出现的L时，所述L不是全部相同的。在一些实施方式中，L是SGGGGS。在一些实施方式中，细胞外结合结构域包括多次出现的L，并且所有L均为SGGGGS。

在一些实施方式中，表位1、表位2和表位3是相同或不同的，并且选自具有如以下表6中所示的SEQ ID NO 114至SEQ ID NO 121中任一项的氨基酸序列的mAb特异性表位。

表6：具有其相应序列的模拟表位和表位

在一些实施方式中，表位1、表位2和表位3是相同或不同的并且选自由以下各项特异性识别的mAb特异性表位：替伊莫单抗、伊莫单抗、莫罗单抗CD3、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利西单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、英夫单抗、利妥昔单抗、阿司珠粒单抗、贝伐珠粒单抗、赛妥珠粒单抗、达克珠粒单抗、依库珠粒单抗、依法利珠粒单抗、吉妥单抗、那他珠粒单抗、奥马珠粒单抗、帕利珠粒单抗、兰尼单抗、托珠粒单抗、曲妥珠粒单抗、维多珠粒单抗、阿达木单抗、贝利木单抗、卡纳单抗、地诺单抗、戈利木单抗、依匹单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、QBEND-10、阿伦单抗或乌司奴单抗。

根据另一个实施方式，表位是模拟表位。作为大分子，通常是肽，其模拟表位的结构，模拟表位具有的优点是比常规表位更小，因此对于非构象序列可以是有利的，并且在长的多肽如CAR中更容易复制。对多种药学上批准的mAb模拟表位是已知的，例如用于西妥昔单抗的两个10氨基酸肽(Riemer et al.,2005)，或用于帕利珠粒单抗的24AA(Arbiza etal,1992)。由于这些模拟表位可以通过噬菌体展示来识别，可以尝试它们中的多个以获得不干扰用于相同的mAb的scFv的序列。此外，它们的用途可以增强补体依赖性的细胞毒性(CDC)。

在优选的实施方式中，在嵌合scFv内引入的表位是CD20模拟表位(SEQ IDNO.114)并且为该模拟表位提供亲和性以用于分选和/或耗尽目的的输注的mAb是利妥昔单抗。

在一个实施方式中，所述至少一个表位被插入抗CD38CAR的VH链和VL链之间，可选地由一个接头连接到所述VH链和VL链。

在一些实施方式中，在scFv的上下文中使用的术语"接头(linker)"是指肽接头，其由单独使用或组合使用的氨基酸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成，将可变重链和可变轻链区域连接在一起。在一个实施方式中，所述柔性多肽接头为甘氨酸/丝氨酸接头，并且包括氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)_n或(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n，其中n是等于或大于1的正整数。例如n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10。在一个实施方式中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly₄Ser)₄或(Gly₄Ser)₃。在另一个实施方式中，接头包括(Gly_xSer)_n的多个重复，其中x＝1、2、3、4或5并且n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，例如(GlySer)、(Gly₂Ser)或(Gly₅Ser)的多个重复。也包括在本发明的范围内的是WO2012/138475中描述的接头，其通过引用结合于此。

在一个实施方式中，所述CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)具有选自如在图8中所示出的V1、V2或V3的多肽结构中的一种，其中一个CD20模拟表位插入抗CD38CAR的VH链和VL链之间，可选地由一个接头连接到所述VH链和VL链。

在优选的实施方式中，所述CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)具有选自如在图8中所示出的V1、V2和V3的多肽结构中的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或SEQ ID NO.22和18(29B4)，

并且其中一个CD20模拟表位被插入在抗CD38CAR的VH链和VL链之间，可选地由一个接头连接到VH链和VL链。

在另一个实施方式中，所述至少一个表位插入CAR的N端末端—因此是scFv的最前端，可选地由接头连接到所述VH链和连接到CAR的N端末端。

在另一个实施方式中，所述至少一个表位被插入到CAR的scFv和铰链之间，可选地由一个接头接到VL链和铰链。

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或SEQ ID NO.22和18(29B4)，并且其中一个表位被插入CAR的scFv和铰链之间，可选地由一个接头连接到VL链和铰链。

在更优选的实施方式中，所述CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)具有选自如在图8中所示出的V1、V2和V3的多肽结构中的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或SEQ ID NO.22和18(29B4)，并且其中一个表位插入CAR的scFv和铰链之间，可选地由一个接头连接到VL链和铰链。

在优选的实施方式中，至少两个表位插入本发明的抗CD38CAR的胞外结构域。

在一个实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)具有选自如在图8中所示出的V1、V2和V3的多肽结构中的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

所述细胞外结合结构域包括针对CD38的VH链和VL链和FcγRIIIα或CD8α或IgG1铰链；

其中所述2个表位串联插入到scFv和所述铰链之间，并且可选地

接头在所述2个表位之间和/或所述VH和所述2个表位之间间隔开。

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或SEQ ID NO.22和18(29B4)，和两个CD20模拟表位，

其中，所述2个表位串联第插入scFv的最前面，即CAR的N端末端；

并且可选地，接头在2个表位和/或CAR的N端末端之间间隔开。

根据一个实施例，至少两个表位以这种方式插入细胞外结构域：即，VH位于它们之间，所有这些组分可选地被至少一个接头相互间隔开。

根据另一个实施方式，两个表位以这种方式插入细胞外结构域中：即，VL位于它们之间，所有这些组分可选地被至少一个接头相互间隔开。

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或SEQ ID NO.22和18(29B4)，并且其中两个表位以这种方式插入细胞外结构域中：即VL位于它们之间，所有这些组分可选地被至少一个接头相互间隔开。

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或者SEQ ID NO.22和18(29B4)，并且其中两个表位以这种方式插入细胞外结构域中：即VL位于它们之间，所有这些组分可选地被至少一个接头相互间隔开。

根据另一个实施方式，所述CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包括细胞外结合结构域，其中至少两个抗原表位以这种方式插入细胞外结构域中：即VH链和VL链位于它们之间，所有这些组分可选地被至少一个接头相互间隔开。

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或者SEQ ID NO.22和18(29B4)，并且其中两个表位以这种方式插入细胞外结构域中：即VH链和VL链位于它们之间，所有这些组分可选地被至少一个接头相互间隔开。

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或者SEQ ID NO.22和18(29B4)，并且其中两个表位以这种方式插入细胞外结构域中，即所述VH链和VL链位于它们之间，所有这些组分可选地被至少一个接头相互间隔开。

在另一个实施方式中，三个表位插入在本发明的抗CD38CAR的细胞外结构域中。

根据特定的实施方式，本发明的CD38特异性CAR含有细胞外结合结构域，其中三个表位以这样的方式插入到细胞外结构域中：即VH链和VL链位于它们之间，所有这些组分可选地被至少一个接头相互间隔开。

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或者SEQ ID NO.22和18(29B4)，并且其中三个表位以这种方式插入细胞外结构域中：即VH链和VL链位于它们之间，所有这些组分可选地被至少一个接头相互间隔开。

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或者SEQ ID NO.22和18(29B4)，所有这些组分可选地被至少一个接头相互间隔开。

在另一个实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)具有选自如在图8中所示出的V1、V2和V3的多肽结构中的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或者SEQ ID NO.22和18(29B4)，以及三个CD20表位。

其中所述3个表位以串联的方式插入到scFv和所述铰链之间，并且可选地

接头在3个表位之间和/或在VH和3个表位之间被间隔开。

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或者SEQ ID NO.22和18(29B4)，两个CD20表位和一个CD34表位；

所述2个表位以串联的方式插入到scFv和所述铰链之间，

并且所述CD34抗原表位插入所述2个CD20表位之间，所有的组分可选地由接头在它们之间相互间隔开。

在一些实施方式中，表位1是具有SEQ ID NO 114或116-119的氨基酸序列的mAb特异性表位。

在一些实施方式中，表位2是具有SEQ ID NO 114或116-119的氨基酸序列的mAb特异性表位。

在一些实施方式中，表位3和表位4是具有SEQ ID NO 114或116-119的氨基酸序列的mAb特异性表位。

在一些实施方式中，表位1、表位2、表位3和表位4中的一种是CD34表位、优选是SEQID NO 122或123的表位，在一些实施方式中，表位1、表位2、表位3和表位4中的一种是CD34表位、优选是SEQ ID NO 122或123的表位并且其他mAb特异性表位为CD20模拟表位(mimotope)、优选是SEQ ID NO 114的模拟表位。

在优选的实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)具有选自如在图8中所示出的V1、V2和V3的多肽结构中的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或者SEQ ID NO.22和18(29B4)，两个具有选自由SEQ ID NO 114或116-119组成的组的氨基酸序列的CD20表位，所述CD20表位是相同的或不同的。

在优选的实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)具有选自如在图8中所示出的V2的多肽结构中的一种，所述结构包括包含来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、CD8α铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括分别地与SEQ ID NO.14和10(25A10)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列，所述抗CD38CAR包含两个具有选自由SEQID NO 114或116-119组成的组的氨基酸序列的CD20表位，所述CD20表位是相同的或不同的。

在更优选的实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包含分别地与SEQID NO.124具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

在优选的实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)具有选自如在图8中所示出的V1的多肽结构中的一种，所述结构包括包含来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、FcRIIIα铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括分别地与SEQ ID NO.62和58(28F5)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列，所述抗CD38CAR包含两个具有选自由SEQ ID NO114或116-11组成的组的氨基酸序列的CD20表位，所述CD20表位是相同的或不同的。

在更优选的实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包含分别地与SEQID NO.126具有少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

其中所述V_H和V_L包括分别地与SEQ ID NO.14和10(25A10)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列，所述抗CD38CAR包含具有选自由SEQ IDNO 114或116-119组成的氨基酸序列的两个CD20表位，所述CD20表位是相同的或不同的。

在更优选的实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包含分别地与SEQID NO.126具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

在优选的实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)具有选自如在图8中所示出的V2的多肽结构中的一种，所述结构包括包含来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、FcRIIIα铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括分别地与SEQ ID NO.14和10(25A10)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列，所述抗CD38CAR包含具有选自由SEQ IDNO 114或116-119组成的组的氨基酸序列的两个CD20表位，所述CD20表位是相同的或不同的。

在更优选的实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包含分别地与SEQID NO.128具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或者SEQ ID NO.22和18(29B4)，3个具有选自由SEQ ID NO 114或116-119组成的组的氨基酸序列的CD20表位，所述CD20表位是相同的或不同的，以及一个具有SEQ IDNO.122或123的氨基酸序列的CD34表位。

其中所述V_H和V_L包括分别地与SEQ ID NO.62和58(28F5)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列，所述抗CD38CAR包含三个具有选自由SEQ ID NO114或116-119组成的组的氨基酸序列的CD20表位，所述CD20表位是相同的或不同的，以及一个具有SEQ ID NO.122或123的氨基酸序列的CD34表位。

在更优选的实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包含分别地与SEQID NO.125具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

其中所述V_H和V_L包括分别地与SEQ ID NO.62和58(28F5)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列，所述抗CD38CAR包含三个具有选自由SEQ ID NO114或116-119组成的组的氨基酸序列的CD20表位；所述CD20表位是相同的或不同的，以及一个具有SEQ ID NO.122或123的氨基酸序列的CD34表位。

在更优选的实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包含分别地与SEQID NO.127具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

其中所述V_H和V_L包括分别地与SEQ ID NO.14和10(25A10)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列，所述抗CD38CAR包含三个具有选自由SEQID NO 114或116-119组成的组的氨基酸序列的CD20表位；所述CD20表位是相同的或不同的，以及一个具有SEQ ID NO.122或123的氨基酸序列的CD34表位。

在更优选的实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包含分别地与SEQID NO.129具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

在优选的实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)具有选自如在图8中所示出的V1的多肽结构中的一种，所述结构包括包含来自单克隆抗CD38抗体的VH和VL的细胞外配体结合结构域、CD8α铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括分别地与SEQ ID NO.14和10(25A10)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列，所述抗CD38CAR包含两个具有选自由SEQID NO 114或116-119组成的组的氨基酸序列的CD20表位；所述CD20表位是相同的或不同的。

在更优选的实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包含分别地与SEQID NO.130具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

其中所述V_H和V_L包括分别地与SEQ ID NO.14和10(25A10)具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列，所述抗CD38CAR包含三个具有选自由SEQID NO 114或116-119组成的组的氨基酸序列的CD20表位，所述CD20表位是相同的或不同的，和一个具有SEQ ID NO.122或123的氨基酸序列的CD34表位。

在更优选的实施方式中，CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38CAR)包含分别地与SEQID NO.131具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

工程化耐药性T细胞的方法

为了改善癌症治疗和对同种异体T细胞的选择性植入，可以为工程化的T细胞提供耐药性以保护它们免受化疗或免疫抑制剂的毒副作用。实际上，发明人已经观察到，大多数患者用化疗和免疫消耗剂治疗作为治疗的标准(在接收T细胞免疫疗法之前)。还发现，他们可以利用这些治疗，通过在治疗之前在培养基中添加化疗药物以将细胞离体扩增，或通过在化疗或免疫抑制治疗的情况下在患者体内获得工程化的T细胞的选择性扩增，来帮助选择工程化的T细胞。

同样，T细胞的耐药性也允许它们在体内或离体富集，因为表达所述耐药基因的T细胞将存活并相对于所述药物敏感性细胞增殖。具体地，本发明涉及工程化耐受免疫疗法的同种异体和耐药性T细胞的方法，包括：

(a)提供T细胞；

(b)选择至少一种药物；

(c)修饰T细胞为所述T细胞提供耐药性；

(d)在所述药物的存在下扩增所述工程化的T细胞，并且可选地

前述步骤可与前述方法的步骤组合。

通过使负责细胞对药物的敏感性的一个或多个基因(一个或多个药物致敏基因)如次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因(Genbank:M26434.1)失活，可以为T细胞赋予耐药性。特别是可以失活工程化的T细胞中HPRT以提供对细胞抑制性代谢物的抗性，细胞抑制性代谢物是6-硫代鸟嘌呤(6TG)，其被HPRT转化为细胞毒性的硫代鸟嘌呤核苷酸，并且其目前用于治疗癌症特别是白血病患者(Hacke,Treger et al.2013)。另一实施例是在T细胞表面正常表达的CD3的失活可以提供对抗CD3抗体如替利珠粒单抗的抗性。

在一个实施方式中，待失活的抗性基因是编码脱氧胞苷激酶(dCk)的基因。需要脱氧胞苷激酶(DCK)以磷酸化多种脱氧核糖核苷和它们的核苷类似物。DCK的缺陷与抗病毒和抗癌化疗剂的抗性有关。相反，增加的脱氧胞苷激酶活性与这些化合物对细胞毒性的核苷三磷酸衍生物的增加的活化相关联。因为DCK与耐药性和敏感性的关系，它在临床上是重要的(Hazra S,Szewczak A,Ort S,Konrad M,Lavie A(2011)"Post-translationalphosphorylation of serine 74of human deoxycytidine kinase favors the enzymeadopting the open conformation making it competent for nucleoside binding andrelease".Biochemistry 50(14):2870–8)。

也可以通过表达耐药基因为T细胞提供耐药性。所述耐药基因是指编码对试剂如化疗剂(例如，甲氨蝶呤)"抗性"的核酸序列。换而言之，细胞中的耐药基因的表达使得在试剂存在下细胞增殖的程度高于在不含耐药性基因的相应细胞的增殖。本发明的耐药性基因可编码对于对以下各项的抗性：抗代谢物、甲氨蝶呤、长春碱、顺铂、烷基化剂、蒽环、细胞毒性抗生素、抗亲免素、它们的类似物或衍生物等。

已识别多种基因如二氢叶酸还原酶(DHFR)、肌苷单磷酸脱氢酶2(IMPDH2)、钙调磷酸酶或甲基鸟嘌呤转移酶(MGMT)的变体等位基因以为细胞提供耐药性。通过将编码所述基因的转基因引入细胞中或通过同源重组将所述耐药基因整合到细胞的基因组中，可以在细胞中表达所述耐药基因。已经识别了多种其他耐药性基因，其可潜在地用于为靶标细胞提供耐药性(Takebe,Zhao et al.2001；Sugimoto,Tsukahara et al.2003；Zielske,Reeseet al.2003；Nivens,Felder et al.2004；Bardenheuer,Lehmberg et al.2005；Kushman,Kabler et al.2007)。

DHFR是参与调节细胞中的四氢叶酸的量的酶并且它对DNA合成是重要的。叶酸类似物如甲氨蝶呤(MTX)抑制DHFR并且因此在临床上用作抗肿瘤剂。已经描述了DHFR的不同突变形式，通过在治疗中使用的抗叶酸物质其具有对抑制的增加抗性。在特定的实施方式中，根据本发明的耐药性基因可以是编码人野生型DHFR的突变形式的核酸序列(GenBank:AAH71996.1)，其包括提供对抗叶酸治疗的抗性的至少一种突变(例如甲氨蝶呤)。在特定实施方式中，DHFR的突变体包含在位置G15、L22、F31或F34、优选在位置L22或F31处的至少一种突变的氨基酸((Schweitzer,Dicker et al.1990)；国际申请WO 94/24277；美国专利US6,642,043)。

本文所用的"抗叶酸剂"或"叶酸类似物"是指在一定水平上干扰叶酸代谢途径的分子。抗叶酸剂的实例包括例如甲氨蝶呤(MTX)；蝶啶胺；三甲曲沙(Neutrexin^TM)；依达曲沙；N10-炔丙基-5,8-二脱氮杂叶酸(CB3717)；ZD1694(Tumodex)；5,8-二脱氮杂异叶酸(IAHQ)；5,10-二脱氮四氢叶酸(DDATHF)；5-脱氮杂叶酸；PT523(Nα-(4-氨基-4-脱氧蝶酰)-Nδ-半苯二甲酰-L-鸟氨酸)；10-乙基-10-脱氮杂氨蝶呤蝶啶胺(DDATHF,lomatrexol)；吡曲克辛；10-EDAM；ZD1694；GW1843；培美曲塞和PDX(10-炔丙基-10-脱氮杂蝶啶胺)。

耐药性基因的另一个实例也可以是突变形式或修饰形式的肌苷-5'-单磷酸脱氢酶II(IMPDH2)，其实从头合成鸟苷核苷酸中的限速酶。IMPDH2的突变形式或修饰形式为IMPDH抑制剂抗性基因。IMPDH抑制剂可以是霉酚酸(MPA)或其前药霉酚酸霉酚酯(MMF)。突变的IMPDH2可以包括野生型人IMPDH2(NP_000875.2)的MAP结合位点中的至少一个、优选的两个突变，这导致对IMPDH抑制剂的显著提高的抗性。突变优选在位置T333和/或S351处(Yam,Jensen et al.2006；Sangiolo,Lesnikova et al.2007；Jonnalagadda,Brown etal.2013)。在特定实施方式中，用异亮氨酸残基替换位置333处的苏氨酸残基，以及用酪氨酸残基替换位置351处的丝氨酸残基。

另一种耐药性基因是钙调磷酸酶的突变形式。钙调磷酸酶(PP2B)是一种普遍表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，其涉及许多生物学过程并是T细胞活化的核心。钙调磷酸酶是由催化亚基(CnA，三种同种型)和调控亚基(CnB，两种同种型)组成的异源二聚体。在T细胞受体接合后，钙调磷酸酶将转录因子NFAT去磷酸化，使其能够易位至核并激活关键靶标基因如IL2。FK506与FKBP12复合，或环孢霉素A(CsA)与CyPA复合阻断NFAT接近钙调磷酸酶的活性位点，防止其去磷酸化，从而抑制T细胞活化(Brewin,Mancao et al.2009)。本发明的耐药基因可以是编码对钙调磷酸酶抑制剂如FK506和/或CsA具有抗性的钙调磷酸酶的突变形式的核酸序列。在特定的实施方式中，所述突变形式可以包括在位置V314、Y341、M347、T351、W352、L354、K360处野生型钙调磷酸酶异源二聚体a的至少一种突变的氨基酸、优选在位置T351和L354或V314和Y341处的双突变。本文中所描述的氨基酸位置的对应性通常以野生型人钙调磷酸酶异源二聚体形式的氨基酸的位置表示(GenBank:ACX34092.1)。

在另一特定实施方式中，所述突变形式可包含在位置V120、N123、L124或K125处野生型钙调磷酸酶异源二聚体b的至少一种突变氨基酸、优选在位置L124和K125处的双突变。本文中所描述的氨基酸位置的对应性通常以野生型人钙调磷酸酶异源二聚体b多肽的形式的氨基酸的位置表示(GenBank:ACX34095.1)。

另一种耐药性基因为编码人烷基鸟嘌呤转移酶(hAGT)的0(6)-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)。AGT是一种DNA修复蛋白，其提供针对烷基化剂如亚硝基脲和替莫唑胺(TMZ)的细胞毒性作用抗性。6-苄基鸟嘌呤(6-BG)是AGT的抑制剂，其增强了亚硝基脲的毒性并与TMZ共同给予以增强该药剂的细胞毒性作用。编码AGT的变体MGMT的多种突变形式对于通过6-BG的失活具有很高的耐受性，但保留了其修复DNA损伤的能力(Maze,Kurpad etal.1999)。在特定的实施方式中，AGT突变体形式可以包括野生型AGT位置P140的突变的氨基酸(UniProtKB:P16455)。

另一种耐药性基因可以是多耐药蛋白1(MDR1)基因。该基因编码膜糖蛋白，称为P-糖蛋白(P-GP)，其涉及代谢副产物跨细胞膜的传输。P-Gp蛋白对多种结构上不相关的化疗剂具有广泛的特异性。因此，通过表达编码MDR-1(NP_000918)的核酸序列可以为细胞提供耐药性。

耐药性基因也可以是细胞毒性抗生素基因，如ble基因或mcrA基因。当暴露于化疗剂时，分别地博莱霉素或丝裂霉素C时，免疫细胞中的ble基因或mcrA的异位表达提供了选择性的优势。

还可以使T细胞对免疫抑制剂具有抗性。免疫抑制剂是通过多种作用机制中的一种抑制免疫功能的试剂。换而言之，免疫抑制剂是由这样的化合物所起的作用：该化合物表现出减少免疫应答的范围和/或程度(voracity)的能力。作为非限制性实例，免疫抑制剂可以是钙调磷酸酶抑制剂、雷帕霉素的靶标、白细胞介素-2α-链阻断剂、肌苷单磷酸脱氢酶的抑制剂、二氢叶酸还原酶的抑制剂、皮质类固醇或免疫抑制抗代谢物。经典的细胞毒性免疫抑制剂通过抑制DNA合成起作用。其他的可以通过T细胞的活化或通过抑制辅助细胞的活化起作用。根据本发明的方法允许通过失活T细胞中的免疫抑制剂的靶标为用于免疫疗法的T细胞提供免疫抑制抗性。作为非限制性实例，用于免疫抑制剂的靶标可以是用于免疫抑制剂的受体，如：CD52、糖皮质激素受体(GR)、FKBP家族基因成员和亲环素家族基因成员。

在免疫活性宿主中，宿主免疫系统通常快速地排斥同种异体细胞。已经证明，非照射血液产品中存在的同种异体白细胞持续不超过5至6天。因此，为了防止排斥同种异体细胞，必须有效地抑制宿主的免疫系统。糖皮质激素被广泛治疗性应用于免疫抑制。该类类固醇激素与存在于T细胞的细胞溶液中的糖皮质激素受体(GR)结合，导致易位到核中并且结合调节免疫过程中涉及的大量基因的表达的特定DNA基序。用糖皮质激素类固醇处理T细胞导致细胞因子产生的水平降低，使得T细胞失能(无细胞免疫反应性，anergy)并干扰T细胞活化。阿仑单抗，还称为CAMPATH1-H，是靶向CD52的人源化单克隆抗体，一种12氨基酸糖基磷脂酰肌醇-(GPI)连接糖蛋白(Waldmann and Hale,2005)。CD52在T和B淋巴细胞上以高水平表达，并且在不存在于粒细胞和骨髓前体上时在单核细胞上较低水平表达。已经证明用阿仑单抗(针对CD52的人源化单克隆抗体)治疗诱导循环淋巴细胞和单核细胞的快速耗尽。它经常用于治疗T细胞淋巴瘤，并且在某些情况下作为移植的处理方案的一部分。然而，在使用过继性免疫疗法的情况下，使用免疫抑制药物也对所引入的治疗性T细胞具有有害作用。因此，为了在这些条件下有效地使用过继性免疫疗法，所引入的细胞将需要抵抗免疫抑制治疗。

作为上述步骤的优选的实施方式，对于免疫抑制治疗具有特异性的步骤(b)的所述基因是CD52，并且步骤(d)的免疫抑制治疗包括靶向CD52抗原的人源化抗体。作为另一个实施方式，对于免疫抑制治疗具有特异性的步骤(b)的所述基因是糖皮质激素受体(GR)并且步骤(d)的免疫抑制治疗包括皮质类固醇如地塞米松。作为另一个实施方式，对于免疫抑制治疗具有特异性的步骤(b)的所述靶标基因是FKBP家族基因成员或其变体并且步骤(d)的免疫抑制治疗包括FK506，也称为他克莫司或藤霉素。作为另一个实施方式，所述FKBP家族基因成员是FKBP12或其变体。作为另一个实施方式，对于免疫抑制治疗具有特异性步骤(b)的所述基因是亲环素家族基因成员或其变体，并且步骤(d)的免疫抑制治疗包括环孢霉素。

在本发明的特定实施方式中，方法的基因修饰步骤依赖于选自由CD52和GR、CD52和TCRα、CDR52和TCRβ、GR和TCRα、GR和TCRβ、TCRα和TCRβ组成的组中的两种基因的失活。在另一个实施方式中，方法的遗传修饰步骤依赖于两个以上基因的失活。基因修饰优选通过使用至少两个靶向不同基因的RNA向导来进行离体操作。

失活基因是指感兴趣的基因不以功能性蛋白质形式表达。

工程化用于免疫疗法的高度活性T细胞

根据本发明，T细胞可以选自由炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞组成的组。在另一个实施方式中，所述细胞可以来源于由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。它们可以是从血液中提取的或衍生自干细胞。干细胞可以是成体干细胞、胚胎干细胞，更具体地是非人干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导的多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。代表性的人细胞是CD34+细胞。扩增和基因修饰本发明的细胞之前，细胞源可以通过多种非限制性方法从受试者中获得。T细胞可以从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴节组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织、肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可使用本领域技术人员可获得的和已知的任何数目的T细胞系。在另一个实施方式中，所述细胞可以来源于健康供体、来自诊断有癌症的患者或来自诊断有感染的患者。在另一个实施方式中，所述细胞是具有不同表型特征的细胞的混合群体的一部分。本发明的范围还包括根据前述方法从转化T细胞获得的细胞系。

作为本发明的另一个方面，根据本发明的T细胞可以进一步工程化、优选基因工程化以增强它们的活性和/或激活，特别是通过调节涉及整个T细胞调节的称为“免疫检查点”的蛋白质的表达。

免疫检查点

本领域的普通技术人员会理解，术语"免疫检查点"是指由T细胞表达的一组分子。这些分子有效地用作"制动器(brake)"以下调或抑制免疫应答。免疫检查点分子包括但不限于程序性死亡1(PD-1，也称为PDCD1或CD279，登录号：NM_005018)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4，也称为CD152，GenBank登录号AF414120.1)、LAG3(也称为CD223，登录号：NM_002286.5)、Tim3(也称为HAVCR2，GenBank登录号：JX049979.1)、BTLA(也称为CD272，登录号：NM_181780.3)、BY55(也称为CD160、GenBank登录号：CR541888.1)、TIGIT(也称为lVSTM3，登录号：NM_173799)、LAIR1(也称为CD305、GenBank登录号：CR542051.1、{Meyaard、1997#122})、SIGLEC10(GeneBank登录号：AY358337.1)、2B4(也称为CD244，登录号：NM_001166664.1)、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7{Nicoll，1999#123}、SIGLEC9{Zhang，2000#124；Ikehara，2004#125}、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF{Quigley，2010#121}、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3(其直接抑制免疫细胞)。例如CTLA-4是表达在某些CD4和CD8T细胞上的细胞表面蛋白；当由其配体(B7-1和B7-2)接合在抗原呈递细胞上时，抑制T细胞活化和效应子功能。因此，本发明涉及工程化的T细胞、特别是用于免疫疗法的T细胞的方法，包括通过失活包含在免疫检查点中的至少一种蛋白质，特别是PD1和/或CTLA-4或在表7中所述的任何免疫检查点蛋白来基因修饰T细胞。

表7：编码免疫检查点蛋白的基因的列表

治疗应用

在一般方面，本发明涉及用于治疗与病理细胞的发展相关的疾病如癌症、感染和自身免疫疾病的新的过继性免疫疗法策略的方法。

作为本发明的主要目的，可以靶向携带与T细胞共同的特异性抗原标志物的病理细胞。病理细胞是指存在于患者中的任何类型的细胞，其被认为引起健康恶化。

一般而言，病理细胞是需要减少或消除以获得患者缓解的恶性或感染细胞。

这些抗CD38CAR免疫细胞，特别是当经历CD38基因失活时，作为药物是有用的，该药物可用于治疗CD38表达性细胞介导的病理状况或特征在于由CD38表达性细胞的直接或间接活性的病症，例如MM、MM、RRMM、ALL、NHL淋巴瘤(如上所述)、它们的相关并发症以及它们的相关病症。

在一个实施方式中，使用了CD8基因失活的免疫细胞中所述抗CD38CAR作为药物，其包括与选自以下各项中的一种具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.82-84(25A10)、SEQ ID NO.100-102(28F5)、SEQ ID NO.97-99(13F11)、SEQ ID NO.88-90(16B5)、SEQ ID NO.91-93(10F7)、SEQ ID NO.94-96(27B6)和SEQ ID NO.85-87(29B4)，更优选选自SEQ ID NO.82-84(25A10)、SEQ ID NO.100-102(28F5)、SEQ ID NO.97-99(13F11)和SEQ ID NO.88-90(16B5)和更优选选自SEQ ID NO.82-84(25A10)和SEQ ID NO.100-102(28F5)。

在优选的实施方式中，在CD8基因失活的免疫细胞中所述抗CD38CAR用为药物，并且其包括与选自SEQ ID NO.82-84(25A10)和SEQ ID NO.100-102(28F5)中的一种具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列。

在更优选的实施方式中，在CD8基因失活的免疫细胞中抗CD38CAR用作药物，并且其包括与选自SEQ ID NO.82(25A10-V1CAR)中的一种具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列。

所述治疗可以是改善性、治疗性或预防性的治疗。其可以是自体免疫疗法的一部分或同种异体免疫疗法的一部分。自体是指用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞的群体来源于所述患者或来自人白细胞抗原(HLA)相容性供体。同种异体是指用于治疗患者的细胞或细胞的群体并非来源于所述患者而是来自供体。

根据前述方法中的一种工程化的免疫细胞如T细胞可以被汇集、冷冻并且给予一个或多个患者。因此，本发明包括通过如先前针对患者自身的T细胞描述的引导工程化的T细胞来治疗免疫疾病的方法。当使它们具有非同种异体活性时，它们可作为“现成的”(“offthe shelf”)治疗产品得到，这意味着它们可以被普遍地输注到需要其的患者中。

在一个实施方式中，由不同方法得到的分离细胞或由先前所描述的分离细胞得到的细胞系可用作药物。

在优选的实施方式中，根据本发明的所述分离的细胞或来源于所述分离的细胞的细胞系可以用于制备用于治疗需要其的患者中的癌症的药物。

在优选的实施方式中，可以使用本发明的抗CD38CAR表达性细胞治疗的癌症是白血病或淋巴瘤、与白血病或淋巴瘤相关的疾病或它们的并发症。

在特定的实施方式中，提供抗CD38CAR表达性T细胞作为用于治疗CD38+血液恶性肿瘤的药物，特别是在进行标准治疗或之后的那些，或对于不存在有效标准治疗(难治疗/复发性患者)的那些。

“复发”是指治疗和改善血液恶性肿瘤的受试者，但是其中血液恶性肿瘤复发。

"难治疗"：是指治疗血液恶性肿瘤但没有任何改善，并且因此的血液恶性肿瘤发展的受试者。

在本发明的上下文中，CD38+血液恶性肿瘤特别选自由以下各项组成的组：非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)(包括，例如伯基特氏淋巴瘤(BL)和T细胞淋巴瘤(TCL))、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)(例如B慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)或毛细胞白血病(HCL))、B和T急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、霍奇金氏淋巴瘤(HL)和慢性骨髓性白血病(CML)，其中所述癌细胞为或包括CD38+细胞。

特别地，CD38+血液恶性肿瘤是B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、急性骨髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(B-细胞ALL)和/或慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，更具体地是多发性骨髓瘤(MM)，最特别是复发性和/或难治疗的多发性骨髓瘤。

用于识别血液恶性肿瘤的方法是本领域技术人员已知的，并且包括作为第一步骤的全血计数(complete blood count)(CBC)以及外周血涂片的测试。确定性诊断通常需要用于形态学研究的足够骨髓抽吸和/或活检，最终通过流式细胞术分析、细胞遗传学和进一步的分子技术来补充。确认来源于该血液恶性肿瘤的细胞是CD38+的技术是本领域技术人员已知的，并且包括标准分子生物学技术，例如，聚合酶链式反应(PCR)和/或诸如蛋白质印迹分析的免疫化学方法。

在优选的实施方式中，本发明提供了用于CD38+血液恶性肿瘤的治疗，如在60岁以上患者或20岁以下的患者中以上给出的。

在优选的实施方式中，所述药物可用于治疗MM亚型的多发性骨髓瘤(MM)，例如难治疗/复发性多发性骨髓瘤(RRMM)。

在另一个实施方式中，所述药物可用于治疗急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。

多发性骨髓瘤

可以通过单克隆蛋白质(M蛋白)的存在检测多发性骨髓瘤。

“M蛋白”是指副蛋白(paraprotein)(单克隆蛋白或M蛋白)。该副蛋白是由血浆细胞的克隆增殖过量产生的免疫球蛋白或免疫球蛋白轻链。高于某一阈值的量指示多发性骨髓瘤。M蛋白通常在血清中以及尿中被量化。血清中的M蛋白水平通过典型的血清电泳或通过例如特异性免疫球蛋白测定来测量；但是，由于在结果中包含了正常的免疫球蛋白，所以特异性免疫球蛋白定量总是过度估计M蛋白。为此，通过相同的方法(Riches P G et al.,1991)对M蛋白进行基线和随后的测量。

有待治疗的具有MM的患者的剂量/组

在一个实施方式中，高于0.5g/dL的血清中的M蛋白表示多发性骨髓瘤。

在一个实施方式中，在24小时尿液中高于200mg的尿中的M蛋白指示多发性骨髓瘤(MM)。

在另一个实施方式中，升高的血清游离轻链(FLC)(具有大于约10mg/dL的FLC和异常的FLC比率)指示多发性骨髓瘤。MM可以进一步由尿中发现的免疫球蛋白轻链识别，该副蛋白称为Bence Jones蛋白，并且是由游离轻链组成的尿副蛋白，其中轻链为lambda(λ)和/或kappa(κ)游离轻链。这些游离轻链(FLC)可以通过商业测试来测量。游离轻链测量是指对FLCκ和FLCλ游离轻链的测量，给出FLCκ与FLCλ的游离轻链比率(FLC)(FLCκ/λ比率)，其中正常的FLCκ/λ比为0.26至1.65。

在具有多发性骨髓瘤的患者中，轻链中的任一种，κ或λ，可被主要地产生，这导致FLCκ/λ比的变化。因此，指示多发性骨髓瘤的异常FLCκ/λ比是FLCκ/λ比低于0.26或高于1.65。

因此，在一个实施方式中，具有多发性骨髓瘤的受试者具有a)大于约0.5g/dL的可测量的血清M蛋白，和/或b)大于约200mg尿M蛋白(24-hr尿液)，和/或c)升高的血清游离轻链(FLC)与大于约10mg/dL的FLC，具有异常的FLC比。

在一个实施方式中，由本发明的工程化的免疫细胞治疗的受试者具有多发性骨髓瘤和某些遗传特征，例如9号染色体和22号染色体之间的易位，称为费城(Philadelphia)染色体；或4号染色体和11号染色体之间的易位[t(4；11)(q21；q23)]；超二倍性，例如4、10、17号三体，或染色体9p缺失。

因此，在一个实施方式中，由本发明的分离细胞治疗的受试者具有17p缺失、t(4,14)、t(14,16)、t(14,20)和/或大于3个拷贝的1q21。本领域已知具有多种骨髓瘤和某些遗传特征的受试者，例如染色体缺失17p，易位t(4,14)、t(14,16)、t(14,20)或倍增如大于3个拷贝的1q21与糟糕的结果相关(Avet-Loiseau H et al.,2011)。研究人员如Van Laar etal.(2014)已经开发了用于患有多发性骨髓瘤的受试者的基因组图谱试验。这种类型的测试允许医生基于其基因组表达图谱而不仅仅是几个染色体异常对患有多发性骨髓瘤的受试者进行分类。

在一个实施方式中，受试者可具有高风险基因表达图谱(GEP)信号(signature)。例如，该主题在Shaughnessy et al(2007)中更详细地描述。

该主题可以具有上述特征的任何组合。

急性淋巴细胞白血病(ALL)

在一个实施方式中，可由本发明药物治疗的白血病为急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。

在上述任一种的另一个实施方式中，白血病是小儿(儿童)ALL。

在上述任一种的另一个实施方式中，白血病是复发性ALL

在上述任一种的另一个实施方式中，白血病是难治性ALL。

在上述任一种的另一个实施方式中，白血病是耐药性ALL

在另一个实施方式中，白血病是耐糖皮质激素的ALL。

在又一个实施方式中，所述药物可用于治疗B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)患者，例如套细胞白血病(MCL)。

其他CD38介导的病理病症

根据另一个实施方式，将本发明的工程化的免疫细胞用于治疗CD38+细胞介导的实体瘤，如前列腺、精囊、阑尾(appendix)的实体瘤或病理如糖尿病(Antonelli et al；2004)。

相关治疗

在一些实施方式中，受试者先前已用抗癌疗法进行治疗。特别地，所述先前抗癌疗法可以选自由以下各项组成的组：化疗、靶向癌症疗法、放疗、骨髓和/或干细胞移植和免疫疗法。在更优选的实施方式中，本发明提供了小儿治疗，特别是针对MM、RRMM或相关疾病或并发症的小儿治疗。

在一个实施方式中，受试者先前已用硼替佐米和/或来那度胺进行治疗。

“放射疗法”或“放射”利用高能辐射来去除癌细胞。可在骨髓或外周血干细胞移植之前使用疗法。

“骨髓和/或干细胞移植”是指目标在于恢复被高剂量化疗和/或放射疗法破坏的干细胞的细胞移植。干细胞来源包括骨髓、外周血或脐带血。取决于移植的干细胞来源，过程可被区分为骨髓移植(BMT)或外周血干细胞移植(PBSCT)或脐带血移植(UCBT)。此外，骨髓和/或干细胞移植可以指的是自体干细胞移植和/或同种异体移植。

对药物或免疫抑制剂的抗性

如先前所描述，当使工程化的免疫细胞对用作治疗的标准的化疗药物和免疫抑制药物、特别是甲氨蝶呤以及氟达拉滨和环磷酰胺的组合具有耐受性时，它们特别适用于治疗多种形式的癌症。实际上，本发明优选地依赖于细胞或细胞的群体。在这个方面，预期化疗和/或免疫抑制治疗应当有助于在体内的选择和扩增工程化的T细胞。

在本发明的某些实施方式中，将细胞与任何数量的相关治疗方式结合(例如，之前、同时或之后)给予患者，相关治疗方式包括但不限于用以下各项的治疗：诸如抗病毒治疗的药剂西多福韦和白细胞介素-2，阿糖胞苷(也称为ARA-C)，或针对MS患者的那他珠粒单抗，或针对银屑病患者的依法利珠粒单抗治疗，或针对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下各项组合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂、如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸盐和FK506、抗体，或其他免疫消融剂如CAMPATH、抗CD3抗体或其他抗体治疗、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢霉素和FK506)或抑制对生长因子诱导信号转导而言是重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu et al.,Cell 66:807-815,11；Henderson et al.,Immun.73:316-321,1991；Bierer et al.,Citrr.Opin.mmn.5:763-773,93)。在另一个实施方式中，本发明的细胞组合物与以下各项联合给予患者(例如：之前、同时或之后)：骨髓移植、使用化疗剂如氟达拉滨、外部束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或诸如OKT3或CAMPATH的抗体的T细胞消融疗法。在另一个实施方式中，在B-细胞消融疗法之后，例如与CD20反应的药剂例如利妥昔单抗之后给予本发明的细胞组合物。例如，在一个实施方式中，受试者可以经历用高剂量化疗的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些实施方式中，在移植之后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在另一个实施方式中，扩增的细胞是在手术前或之后给予的。通过本文所描述方法中的任何一种获得的所述修饰的细胞可用于本发明的特定方面，用于治疗需要其对抗宿主抗移植排斥(HvG)和移植物抗宿主疾病(GvHD)的患者；因此在本发明的范围内是治疗需要其对抗宿主抗移植(HvG)排斥和移植物抗宿主疾病(GvHD)的患者的方法，包括通过向所述患者给予有效量的包含失活的TCRα和/或TCRβ基因的修饰的细胞来治疗所述患者。

给予

在另一方面，本发明依赖于治疗需要其的患者的方法，所述方法包括以下步骤中的至少一种：

(a)提供通过以上所描述的方法中的任何一种可获得的免疫细胞；

(b)将所述转化的免疫细胞给予所述患者。

可以以任何方便的方式进行根据本发明的细胞或细胞的群体的给予，上述方式方式包括通过气雾剂吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。本文所描述的组合物可经皮下、皮内、肿瘤内、结内(intranodally)、髓内、肌内、通过静脉内或淋巴内注射或腹膜内给予患者。在一个实施方式中，优选通过静脉注射给予本发明的细胞组合物。

细胞或细胞的群体的给予可由以下各项组成：给予10⁴-10⁹个细胞/kg体重、优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括这些范围内的细胞数的所有整数值。可以以一种或多种剂量给予细胞或细胞的群体。在另一个实施方式中，将所述有效量的细胞作为单一剂量给予。在另一个实施方式中，将所述有效量的细胞在一段时间内以多于一个剂量给予。给予的时机在管理医生的判断内并取决于患者的临床状况。细胞或细胞的群体可以获自任何来源诸如血库或供体。当个体需要变化时，确定针对特定疾病或病症的给定细胞类型的有效量的最佳范围在本领域技术人员的认知范围内。有效量是指提供治疗益处或预防益处的量。给予的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，并行治疗的种类(如果有的话)，治疗的频率和所需效果的性质。

在另一个实施方式中，所述有效量的细胞或包含这些细胞的组合物是胃肠外给予的。所述给予可以是静脉内给予。所述给予可以通过在肿瘤内注射而直接进行。

本发明的实施方式涉及治疗患者的方法，包括：

(a)诊断所述患者存在呈递与免疫细胞相同的CD38特异性抗原标志物的病理细胞；

(b)根据以上详细描述的方法制备工程化的免疫细胞的群体，

(c)向诊断所述病理细胞的所述患者给予所述工程化的免疫细胞。

本领域技术人员公知的诊断步骤，例如，可参见Dürig J,Naschar M,SchmückerU,Renzing- T,Hüttmann A,Dührsen U,(2002)“CD38expression is animportant prognostic marker in chronic lymphocytic leukaemia”Leukemia.16(1):30-5。

工程化用于免疫疗法的根据本发明的T细胞的步骤的实施例

为了更好地理解本发明，以下提供了步骤的实例，遵循所述步骤以生产针对白血病CD38阳性细胞的T细胞：

1.从细胞培养物或从来自一个个体患者或来自血库的血液样品提供T细胞，并且使用抗CD3/C28活化子珠粒激活所述T细胞。珠粒提供了活化和扩增T细胞所需的初级信号和共刺激信号。

2.用逆转录病毒载体转导所述细胞，所述逆转录病毒载体包含编码由以下各项的融合蛋白组成的嵌合抗原受体的转基因：CD3ζ激活结构域，4-1BB共刺激结构域，跨膜结构域和来自CD28α、FcεIIIγ或IgG1的铰链(融合至编码抗CD38抗体的可变链的序列)。为了转化T细胞的安全性改进，可以如WO 2013/153391中所描述的那样，将对利妥昔单抗具有敏感性的自杀基因引入到被T2A拆分序列分离的慢病毒载体中。

3.(可选地)工程化非同种异体活性和/或抗性T细胞：

a)通过遵循WO 2013/176915中所述的方案，可能使所述细胞中的TCRα被失活以消除来自细胞表面的TCR并防止宿主组织被同种异体的TCR识别为外来物，从而避免GvHD。

b)如在WO 2013/176915中所描述的那样，同样可能使编码对于免疫抑制剂或化疗药物的靶标的一个基因失活，以使所述细胞耐受免疫抑制或化疗治疗，以防止移植物排斥而不影响移植的T细胞。在此实施例中，免疫抑制剂的靶标为CD52而免疫抑制剂为人源化单克隆抗CD52抗体(例如，阿仑单抗)。

4.通过用编码特异性的TAL核酸内切酶(TALEN^TM–Cellectis,8rue de la CroixJarry,France)的mRNA电穿孔T细胞进行基因失活。使用磁性珠粒分选未失活的T细胞。例如，可以通过固定在固体表面上去除仍表达CD38靶向的基因的T细胞，并且未激活的细胞没有暴露于通过柱的应力。该温和方法增加了被恰当地工程化的T细胞的浓度。

5.在给予患者之前在体外扩增工程化的T细胞，或者在给予患者之后通过刺激CD3复合物在体内扩增工程化的T细胞。在给予步骤之前，可以对患者进行免疫抑制处理，例如CAMPATH1-H，一种人源化的单克隆抗CD52抗体。

6.可选地在给予患者之前离体地将所述细胞暴露于双特异性抗体，或在给予患者之后体内地将所述细胞暴露于双特异性抗体，

从而使所述工程化细胞接近靶标抗原。

一般方法

-原代T细胞培养

使用EasySep^TMDirect Human T Cell Isolation Kit(Stem cells)从由EFS(Etablissementdu Sang,Paris,法国)提供的血沉棕黄层样品中纯化T细胞。在补充有20ng/mL人IL-2、5％人血清和Dynabeads人T激活剂CD3/CD28(珠粒:细胞比1:1(LifeTechnologies))的X-Vivo^TM-15培养基(Lonza)中激活纯化的T细胞。

-CD38TALEN转染

图8示出了示意性表示。

设计并生产被CD38基因内的15-bp间隔子分开的靶向两个17-bp长序列(称为半靶标)的异源二聚TALE核酸酶。每个半靶标由在表3中列出的半TALE核酸酶的重复来识别。CD38靶标的序列如图5所示。利用在T7启动子的控制下在哺乳动物表达载体(pCSL10794)中的限制性酶消化(插入物：SfaNI-BbvI，载体：BsmBI)对每个TALE核酸酶构建体进行亚克隆。使用mMESSAGE mMACHINE T7Kit(Life Technologies)生产编码切割CD38基因组序列的TALE核酸酶的mRNA，并且使用RNeasy Mini Spin Columns(Qiagen)进行纯化。使用Cytopulse技术，通过在0.4cm间隙比色杯中在200μl的“Cytoporation buffer T”(BTXHarvard Apparatus)的最终体积中，以3000V/cm施加两个0.1mS脉冲，然后是以325V/cm施加4个0.2mS脉冲来进行转染。将细胞立即稀释在X-Vivo^TM-15培养基(Lonza)中，并且在30℃下用5％CO₂孵育。电穿孔之后2h，以20ng/mL加入IL-2(来自Miltenyi Biotec)。18小时后，在37℃和5％CO₂下转移细胞。

-CD38阴性T细胞纯化

CD38TALEN转染后6天，根据制造商的说明书，用CD38微珠粒试剂盒(Miltenyi)通过磁性分离来纯化CD38阴性细胞。

-CAR mRNA转染

在T细胞纯化和活化后第4天或第11天进行转染。用编码不同CAR构建体的15μgmRNA转染5百万个细胞。CAR mRNA是使用mMESSAGE mMACHINE T7Kit(Life Technologies)生产的，并是使用RNeasy Mini Spin Columns(Qiagen)纯化的。使用Cytopulse技术，通过在0.4cm间隙比色杯中、在200μl“Cytoporation buffer T”(BTX Harvard Apparatus)的最终体积中，以3000V/cm下施加两个0.1mS脉冲，接着以325V/cm施加4个0.2mS的脉冲来进行转染。将细胞立即稀释在X-Vivo^TM-15培养基(Lonza)中，并且在37℃下用5％CO₂孵育。在电穿孔后2h，以20ng/mL加入IL-2(来自Miltenyi Biotec)。

-脱粒测试(CD107a迁移)

将T细胞在96孔板(40，000细胞/孔)中、连同等量的表达各种水平的CD38蛋白的细胞一起孵育。在37℃，5％CO₂下，将共培养物维持在最终体积为100μl的X-Vivo^TM-15培养基(Lonza)中6小时。在细胞刺激期间进行CD107a染色，该染色是在共培养的开始时加入荧光的抗CD107a抗体，连同1μg/ml的抗CD49d、1μg/ml的抗CD28和1x Monensin溶液。在5h孵育期后，用可固定的活性染料以及荧光染料偶联的抗CD8和抗CD3染色细胞，并且通过流式细胞仪分析。脱粒活性被确定为存活/CD3+/CD8+/CD107a+细胞的％，并且通过测定CD8+细胞中CD107a染色的平均荧光强度信号(MFI)。在mRNA转染后24h进行脱粒测试。

-细胞毒性测试

将T细胞在96孔板(100,000细胞/孔)中、连同在相同孔中的10,000个靶标细胞(表达CD38)和10,000个对照(CD38阴性)细胞一起孵育。用荧光细胞内染料(CFSE或Cell TraceViolet)标记靶标和对照细胞，之后将它们与CAR+T细胞共培养。在37℃和5％CO₂下孵育共培养物4小时。在该孵育期后，用可固定的活性染料标记细胞，并通过流式细胞术分析。测定每个细胞的群体(靶标细胞或CD38阴性对照细胞)的活性并且计算特异性细胞裂解的％。在mRNA转染后48h进行细胞毒性测试。

实施例1：使用TALE核酸酶通过敲除(KO)失活T细胞中的CD38抗原

CD38也由活化的T细胞高度表达。通过FACS每3-4天分析用CD3/CD28珠粒和IL-2激活后的T细胞的CD38表达，持续17天(图3A)。观察到超过90％的T细胞在激活后在第6天和第17天之间表达CD38(图3B)。

因此，为了避免经活化的T细胞被抗CD38CAR+T细胞杀伤，需要防止T细胞中的CD38表面表达。这可以通过使用TALE核酸酶失活CD38基因来实现。如图4A所示进行实验。

设计并生产了靶向CD38基因内由13-pb间隔子分离的2个17-pb长序列的异源二聚TALE核酸酶。每个半靶标通过表4和图5中列出的半TALE核酸酶的重复来识别。

在T7启动子的控制下，在哺乳动物表达载体中使用限制性酶消化来亚克隆每个TALE核酸酶构建体。从携带来自T7启动子下游的编码序列的质粒合成编码切割CD38的TALE核酸酶的mRNA。

用编码两个半TALE核酸酶的2mRNA(各10ug)的每一个、通过电穿孔(Cytopulse)转染用抗CD3/CD28涂覆的珠粒和重组IL-2在4天期间内活化的纯化的T细胞。为了研究CD38KO，在第7天通过流式细胞术评估CD38阴性T细胞的百分比(图6)。三种TALEN能够诱导CD38KO，但CD38-1是最有效的(60.95％+/-7.6CD38^阴性T细胞)。

在培养3周中，由CD38-1TALEN诱导的CD38失活是稳定的(图7A)。可以使用抗CD38微珠粒(Miltenyi)容易地分选CD38缺陷型T细胞(图7A)。纯化的CD38缺陷型T细胞的增殖速率与未转染的或未纯化的T细胞是可比的(图7B)。

在两个独立的实验中，通过使用2μg RNA每10⁶个T细胞和使用电穿孔来进行的CD38TALEN转染，其在图23中示出，该转染以高频率诱导CD38KO。另一种实验，测试了2μg和1μg或0.5μg每百万个细胞的比较。mRNA TALEN的量不改变T细胞的增殖速率(图24B)但降低了CD38阴性细胞的％(图24A)。

实施例2：在WT T细胞中mRNA转染后抗CD38CAR活性的研究

CAR结构

已测试了八对scFv，在表2中给出它们的序列SEQ ID NO:10至73(包括其相应的CDR)。

对于每一对scFv，已经设计了3个不同的CAR构建体，分别具有41BB共刺激结构域、CD3ζ激活结构域、CD8α跨膜结构域和序列SEQ ID NO:76、77和78的3个不同铰链：

V1：FcεRIIIα铰链

V2：CD8α铰链

V3：IgG1铰链。

图9和图2A分别示出了用于亚克隆产生的CAR的不同版本的质粒和用作骨架的那些的名称。此外，还提供了它们各自的scFv的Kd值。

表1显示了对于所有24种不同的抗CD38CAR(8对scFv×3个版本，V1、V2&V3)和它们的组分(除了表2中所示的scFv之外)的序列SEQ ID NO:82至105。

靶标细胞的选择

在用CAR mRNA瞬时转染T细胞之后，针对表达CD38的靶标细胞系的脱粒和细胞毒性活性筛选所产生的CAR分子。将表达不同表达水平的CD38的靶标细胞系(图3B)用于活性测试(图10A和图10B)。

用Qifikit测试(DAKO Company)针对以下细胞系评估每个细胞的CD38分子的数量：

-利用抗CD38微珠粒通过磁性分离，由U266B1细胞系(TIB-196^TM)得到的U266 CD38+B细胞骨髓瘤(48216个分子/细胞)和U266CD38-(230个分子/细胞)；

-MOLP8，表达高水平CD38(259889分子/细胞)的多发性骨髓瘤细胞系(#DSMZ ACC569)；

-Daudi(CCL-213^TM)，来源于表达高水平CD38的伯基特淋巴瘤的细胞系；

-K562(CCL-243)，来源于慢性骨髓性白血病的细胞系CD38阴性细胞系。

T细胞活化后第5天的WT T细胞中的CAR mRNA转染

T细胞是从血沉棕黄层样品中纯化的，并使用抗CD3/CD28涂覆的珠粒激活。用15μg的编码抗CD38CAR的mRNA激活后5天转染细胞(在图4C中给出了实验的时间标度)。在转染后24小时评估CAR T细胞的CAR表达和脱粒能力。

尽管在T细胞上表达CD38，在CAR mRNA转染后第5天没有观察到显著的T细胞死亡率。

表达

在活化后5天，在转染的细胞上评估三种检测方法：抗Fab抗体，L-蛋白染色和CD38-Fc蛋白(由LakePharma生产)染色(图11)。抗CD38CAR 13F11-V2、16B5-V2&V3、25A10-V1&V2、28F5-V1&V2,、GMB005-V1&V2&V3是通过至少一种方法可检测的。一些CAR是通过这些方法中的任何一种不可检测的，但能够以CD38依赖性的方式脱粒(见下面的章节)。

脱粒能力

通过流式细胞术评估CAR T细胞脱粒。读出值是在与靶标细胞孵育5小时后的T细胞质膜处的CD107a表达(图12)。除了10F7、27B6和29B4之外，大部分的scFv以CD38依赖性的方式诱导T细胞脱粒。

选择scFv的13F11、16B5、25A10、28F5的3个版本(V1、V2和V3)和工具CAR GMB005-V1用于在第12天筛选。

实施例3：评价CD38KO的效果和CD38阴性T细胞的纯化对通过mRNA转染获得的系列抗CD38CAR的活性的影响

i.在WT/CD38缺陷型/纯化的CD38缺陷T细胞中比较CAR mRNA筛选

T细胞是从血沉棕黄层样品中纯化的，并且用抗CD3/CD28涂覆的珠粒活化(实验的时间刻度在图4B中给出)。用15μg的编码抗CD38CAR的mRNA活化后12天转染细胞，并且在CARmRNA转染后24h，观察到T细胞的显著死亡率。

已经测试和评估CD38KO和CD38阴性纯化。在用抗CD3/CD28涂覆的珠粒活化后第4天在T细胞中转染(或未转染)CD38-1TALEN mRNA。6天后通过采用磁性分离(Miltenyi方案)纯化(或不纯化)CD38阴性细胞。一天后，转染CAR mRNA。在转染后24小时评估CAR T细胞的CAR表达和脱粒能力。在转染后48小时评估CAR T细胞的CAR表达和细胞毒性能力。采用抗CD38CAR，13F11-V2和-V3用于分析。在CAR mRNA转染24小时后，T细胞活力在CD38KO T细胞中增加，其中纯化的CD38KO T细胞显示出最好的活性(图13A)。

表达

使用CD38-Fc蛋白通过流式细胞术分析CAR表达。CAR表达在第1天和第2天在CD38缺陷型T细胞中以较高水平可检测。在纯化的或未纯化的CD38KO T细胞之间没有观察到显著差异(图13B)。

脱粒能力

与靶标细胞系孵育后脱粒的T细胞的百分比在wt CAR T细胞中是不依赖于CD38的，但当CAR T细胞是CD38缺陷型时，则是依赖于CD38的(图14A)。该纯化步骤对试验条件下的CAR T细胞脱粒没有影响。

细胞毒性活性

在CAR mRNA转染后四十八小时，没有针对靶标细胞系的CAR T细胞的细胞毒性活性。该细胞毒性活性在CD38缺陷型CAR T细胞中恢复。该细胞毒性活性是CD38依赖性的，但在纯化的和未纯化的CD38缺陷型T细胞之间没有观察到差异(图14B)。

总之，这些结果表明在T细胞中在抗CD38CAR mRNA转染前CD38失活对于细胞毒性活性的改善作用(由CD38-1TALEN引起)。通过使用纯化的CD38缺陷型T细胞进行下面的实验。

ii在纯化的CD38缺陷型T细胞中在T细胞活化后第12天CAR mRNA转染

T细胞是从血沉棕黄层样品中纯化的，并且用抗CD3/CD28涂覆的珠粒和IL-2活化。活化后第4天在T细胞中转染CD38-1TALEN mRNA，6天后，使用磁性分离(Miltenyi)纯化CD38阴性细胞。一天后，转染CAR mRNA。在转染后24小时评估CAR T细胞的CAR表达和脱粒能力。在转染后48小时评估CAR T细胞的CAR表达和细胞毒性能力。

表达

在转染后24h检测所有CAR，除了25A10-V3外。然而，后者表达的抗CD38CAR高于背景。13F11-V2、25A10-V1、25A10-V2和28F5-V2高度表达(大于80％)。在48h，CAR-V2和-V3表达比-V1更稳定(图15)。

脱粒能力

大多数CAR T细胞能够针对CD38表达性细胞系脱粒。只有16B5-V3、28F5-V3、5A10-V3显示出低的脱粒能力。表现出针对U266CD38+和U266CD38-的脱粒的最佳比率(>2)的CART细胞是13F11-V1、-V3，16B5-V1、-2，25A10-V1，28F5-V1、-V2和GMB005-V1(图16)。CAR-V1和-V3能够以与CAR-V2相比针对自身T细胞CD38+较低水平脱粒。

细胞毒性活性

大多数CAR T细胞能有效杀伤(在4小时内大于20％)CD38+靶标细胞系(图17)。针对CD38+靶标细胞系具有高度细胞毒性的16B5-V2、25A10-V2和28F5-V2同样针对自体的活化的T细胞具有高度细胞毒性。有趣的是，25A10和28F5的-V1版本是针对CD38^高细胞系具有细胞毒性的，但对自体T细胞表现出较低的细胞毒性活性。

从所有这些结果以及从所有测试的CAR中，可以看出CAR25A10-V1、25A10-V2、28F5-V1和28F5-V2—特别地是当它们的CD38基因被失活时—在针对癌性CD38表达性细胞的细胞毒性方面显示更高的潜能，同时显示与T细胞相互作用的减少的效果(即，来自相同供体的其他激活的CD38T细胞)。

实施例4：评估CD38-KO对于抗CD19CAR体外活性的影响

为了评价CD38-KO对于CAR活性的影响，在注射T细胞前8天对NOG小鼠进行亚致死照射。第(-7)天，静脉注射5x10⁵-Daudi萤光素酶细胞/小鼠。然后用wt或CD38-/-CAR-CD19RQR8T细胞灌注小鼠。包含FMC63scfv的工具CD19CAR对应于具有在WO2014/184143中公开的序列SEQ ID NO.16的多核苷酸。通过根据现有技术(例如Donnelly ML et al,(2001)JGen Virol.；82(Pt 5):1027-1041.)中公开的方法共表达抗CD19和RQR8获得CAR-CD19RQR8T细胞。在T细胞注射后在D(-1)、D7、D14、D21和D28评估生物发光信号(图22A和图22B)。当评估肿瘤进展和存活率时，显示与CAR-CD19RQR8T细胞相比，CD38-/-CAR-CD19RQR8细胞提供相同的体内抗肿瘤活性(图22C)并且具有CD19CAR和KO CD38缺陷型T细胞存活更长(图22D)。因此，CD38-KO并不影响CAR T细胞体内的抗肿瘤活性。

实施例5：评价通过在双重KO TRAC/CD38T细胞中慢病毒转导获得的抗CD38CAR活性

在表达质粒中的CAR克隆

使用限制性酶XmaI将4种抗CD38CAR 25A10-v1、25A10-v2、28F5-v1和28F5-v2克隆至在EF1a启动子的控制下的包含RQR8(pCCL-RQR8-T2A-CAR)的最终rLV骨架中。分析这些质粒的序列并且将质粒送至Vectalys(法国)进行rLV生产。

在rLV MOI的作用下rLV CD38CAR转导

在T细胞活化后第7天评估转导原代T细胞所需的CAR CD38rLV剂量。

在激活后第3天用CD38TALEN mRNA转染T细胞，并且4天后用4种CAR候选物rLV(25A10-v1、-v2，28F5-v1和-v2)，以MOI 5、10和15转导。

转导后3天，通过检测阳性CAR或阳性RQR8细胞的百分比，评估转导效率。未观察到3种MOI之间的转导效率的显著差异(分别地图25A和图25B)。进行下面的rLV筛选将以MOI 5的转导进行。

用CD38-KO和TCR-KO属性筛选

该方法的规划如图26所示。参数如下：通过使用Dynabeads CD3-CD28激活T细胞，使用培养基Xvivo+5％热失活的人血清+IL-2 20ng/ml制备培养物，使用2μg TALEN mRNA每百万细胞(5百万细胞/比色杯)的比率进行双重KO(DKO)CD38-TRAC；使用来自Vectalys(法国)的rLV、以MOI为5进行转导。

为了评估CAR的细胞毒性能力，使用MOLP8、Daudi、U266CD38+和U266CD38-作为先前使用的mRNA筛选中的靶标细胞。这些细胞系主要是表达不同水平的CD38的多发性骨髓瘤细胞系(除了Daudi之外)。

在3个不同实验中，使用3种不同的PBMC供体进行rLV CAR筛选。分析CAR表达、CAR转导后CD38阴性细胞的富集和4种CAR 25A10-v1、–v2，28F5-v1和-v2的细胞毒性能力。

评价抗CD38CAR表达和CAR T表型分析

在DKO T细胞中在rLV转导之后筛选4种CAR 25A10-v1、-v2，28F5-v1和-v2显示所有CAR高效地(>40％)表达于T细胞表面并且它们中的3种超过80％(图27C)。RQR8表达与CAR表达相关联(图27A)。当由CD38CAR转导T细胞时，大多数T细胞是CD38阴性的(图27A)。还显示了60-85％的具有上述4种CAR的T细胞是DKO TRAC/CD38(图27B)。

DKO CD38CAR T细胞主要是CD8+(图28A)并且存在效应子/效应子记忆表型。在CAR构建体之间没有差异(图28B)

评价体外CAR活性

通过流式细胞术评价CART脱粒。读出值是在用靶标细胞孵育5小时后在T细胞质膜上的CD107a表达。这些CAR能够以高效率针对CD38+多发性骨髓瘤细胞系以及针对CD38+T细胞脱粒(图29A)。4种CD38CAR候选物能够以CD38剂量依赖性方式诱导CD38+多发性骨髓瘤细胞系的溶解(图29B)。

实施例6：评价抗CD38CAR T细胞针对T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)

如图30所示，T-ALL细胞表达高表达水平的CD38。该病理可以是基于在患者中给予抗CD38T细胞的治疗的另一应用。

用CD38-KO开发新的T-ALL细胞系

测试的所有T-ALL细胞系都是CD38+。为了评估针对T-ALL的CAR活性，需要阴性细胞系作为对照。通过用CD38TALEN mRNA转染CCRF-CEM细胞产生CD38-KO CCRF-CEM细胞系。通过磁性分离(抗CD38微珠粒，Miltenyi-图31)纯化CD38阴性细胞。新细胞系用作细胞毒性测试的阴性对照。

评价针对T-ALL细胞系的抗CD38CAR T细胞活性

在与表达CD38的多个T-ALL细胞系共培养后通过分析它们的脱粒评估针对T-ALL细胞系的抗CD38CAR T细胞活性。大部分(＞70％)的UCART38能够在T-ALL CD38+细胞的存在下脱粒(图32A)。通过在4h期间与T-ALL细胞共培养评价UCART38在体外针对T-ALL细胞的细胞毒性。UCART38细胞能够诱导CD38+T-ALL细胞的溶解(图32B)。

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<400> 1

tgaggtgggt tggcgactaa ggcgcaccgg tgggcactgc ggggaca 47

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<211> 49

<212> PRT

<213> 智人（homo sapiens）

<220>

<221> CHAIN

<223> CD38-2_TALEN 靶标

<400> 7

Thr Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Gly Thr Cys Gly Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Gly Cys Thr Cys Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Thr Cys Gly Thr Cys

20 25 30

Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys

35 40 45

Ala

<210> 8

<211> 936

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> CD38-2 左侧 TALEN

<400> 8

Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Tyr Pro Tyr Asp

1 5 10 15

Val Pro Asp Tyr Ala Ile Asp Ile Ala Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr

20 25 30

Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val

35 40 45

Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His

50 55 60

Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val

65 70 75 80

Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Ala

85 90 95

Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala

100 105 110

Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp

115 120 125

Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Val

130 135 140

Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn

145 150 155 160

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

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210 215 220

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225 230 235 240

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

325 330 335

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

340 345 350

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

355 360 365

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

370 375 380

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

385 390 395 400

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

405 410 415

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

420 425 430

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

435 440 445

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

450 455 460

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465 470 475 480

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

485 490 495

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

500 505 510

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

515 520 525

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

530 535 540

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

545 550 555 560

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

565 570 575

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

580 585 590

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

595 600 605

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

610 615 620

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

625 630 635 640

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

645 650 655

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

660 665 670

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675 680 685

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705 710 715 720

Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly Asp Pro Ile Ser Arg

725 730 735

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755 760 765

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805 810 815

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820 825 830

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835 840 845

Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser

850 855 860

Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly

865 870 875 880

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885 890 895

Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile

900 905 910

Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn

915 920 925

Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp

930 935

<210> 9

<211> 942

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> CD38-2 右侧 TALEN

<400> 9

Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Lys Glu Thr Ala

1 5 10 15

Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Ile Asp Ile Ala Asp

20 25 30

Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro

35 40 45

Lys Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His

50 55 60

Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro

85 90 95

Glu Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly

100 105 110

Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly

115 120 125

Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg

130 135 140

Gly Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu

145 150 155 160

Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

165 170 175

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

180 185 190

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

195 200 205

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

210 215 220

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

225 230 235 240

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

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Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

325 330 335

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

340 345 350

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

355 360 365

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370 375 380

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

385 390 395 400

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

405 410 415

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

420 425 430

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

435 440 445

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

450 455 460

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

465 470 475 480

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

485 490 495

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

500 505 510

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

515 520 525

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

530 535 540

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

545 550 555 560

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

565 570 575

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580 585 590

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Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

625 630 635 640

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645 650 655

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660 665 670

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675 680 685

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Ala Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu

725 730 735

Gly Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu

740 745 750

Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr

755 760 765

Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu

770 775 780

Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly

785 790 795 800

Lys His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val

805 810 815

Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser

820 825 830

Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr

835 840 845

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850 855 860

Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val

865 870 875 880

Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn

885 890 895

His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu

900 905 910

Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val

915 920 925

Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp

930 935 940

<210> 10

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于25A10的 VL 链

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

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Asp Tyr Asp Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于25A10的 VL 链的CDR1

<400> 11

Gln Ser Leu Leu His Ser Gly Asn Gln Arg Asn Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于25A10的 VL 链的CDR2

<400> 12

Trp Ala Ser

1

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于25A10的 VL 链的CDR3

<400> 13

Gln Asn Asp Tyr Asp Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 14

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于25A10的VH 链

<400> 14

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser

20 25 30

Leu Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Asp Lys Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Thr Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Ser Arg Tyr Ile Asn Tyr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于25A10的VH 链的CDR1

<400> 15

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser Leu

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于25A10的 VH 链的CDR2

<400> 16

Ile Asp Pro Glu Asp Asp Lys Thr

1 5

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于25A10的VH 链的CDR3

<400> 17

Val Ser Arg Tyr Ile Asn Tyr Tyr Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于29B4的VL 链

<400> 18

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ala Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于29B4的VL 链的CDR1

<400> 19

Gln Asp Val Asn Thr Ala

1 5

<210> 20

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用 29B4的VL 链的CDR2

<400> 20

Trp Ala Ser

1

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于29B4的VL 链的CDR3

<400> 21

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr

1 5

<210> 22

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于29B4的VH 链

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ile Ile Ser Asp Gly Gly Ile Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Arg Asp Asp Tyr Asp Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于29B4的VH 链的CDR1

<400> 23

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Phe

1 5

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于29B4的VH 链的CDR2

<400> 24

Ile Ser Asp Gly Gly Ile Tyr Thr

1 5

<210> 25

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于29B4的VH 链的CDR3

<400> 25

Ala Arg Asp Gly Arg Asp Asp Tyr Asp Gly Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10 15

<210> 26

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于16B5的VL 链

<400> 26

Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Thr Thr Phe Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于16B5的VL链的CDR1

<400> 27

Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Thr Thr Phe

1 5 10

<210> 28

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于16B5的VL链的CDR2

<400> 28

Leu Ala Ser

1

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于16B5的VL链的CDR3

<400> 29

Gln Gln Asn Lys Glu Asp Pro Trp Thr

1 5

<210> 30

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于16B5的VH链

<400> 30

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Leu His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于16B5的VH链的CDR1

<400> 31

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn

1 5

<210> 32

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于16B5的VH链的CDR2

<400> 32

Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr

1 5

<210> 33

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于16B5的VH链的CDR3

<400> 33

Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 34

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于10F7的VL链

<400> 34

Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Thr Phe Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Val

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 35

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于10F7的VL链的CDR1

<400> 35

Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Thr Phe

1 5 10

<210> 36

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于10F7的VL链的CDR2

<400> 36

Leu Ala Ser

1

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于10F7的VL链的CDR3

<400> 37

Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Trp Thr

1 5

<210> 38

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于10F7的VH链

<400> 38

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gln Leu Gly Arg Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于10F7的VH链的CDR1

<400> 39

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn

1 5

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于10F7的VH链的CDR2

<400> 40

Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr

1 5

<210> 41

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于10F7的VH链的CDR3

<400> 41

Ala Arg Gly Gly Gln Leu Gly Arg Pro Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 42

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于27B6的VL链

<400> 42

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Thr Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Asn Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于27B6的VL链的CDR1

<400> 43

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 44

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于27B6的VL链的CDR2

<400> 44

Asp Thr Ser

1

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于27B6的VL链的CDR3

<400> 45

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr

1 5

<210> 46

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于27B6的VH链

<400> 46

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Ile Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Lys Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg His Ser Pro Leu Val Ser Thr Pro Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 47

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于27B6的VH链的CDR1

<400> 47

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asn

1 5

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于27B6的VH链的CDR2

<400> 48

Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 49

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于27B6的VH链的CDR3

<400> 49

Ala Arg His Ser Pro Leu Val Ser Thr Pro Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10 15

<210> 50

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于13F11的VL链

<400> 50

Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp

20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asn Asn Met Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 51

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于13F11的VL链的CDR1

<400> 51

Thr Asp Ile Asp Asp Asp

1 5

<210> 52

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于13F11的VL链的CDR2

<400> 52

Glu Gly Asn

1

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于13F11的VL链的CDR3

<400> 53

Leu Gln Ser Asn Asn Met Pro Tyr Thr

1 5

<210> 54

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于13F11的VH链

<400> 54

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Lys Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Tyr Tyr Gly Ser Thr Pro Ser Ser Tyr Thr Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于13F11的VH链的CDR1

<400> 55

Gly Tyr Thr Phe Lys Lys Tyr Gly

1 5

<210> 56

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于13F11的VH链的CDR2

<400> 56

Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro

1 5

<210> 57

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于13F11的VH链的CDR3

<400> 57

Ala Arg Trp Tyr Tyr Gly Ser Thr Pro Ser Ser Tyr Thr Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 58

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于28F5的VL链

<400> 58

Gln Ile Ile Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Thr Ser Ser Leu Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser His Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Leu Ser Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 59

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于28F5的VL链的 CDR1

<400> 59

Ser Ser Leu Ser Ser Ser Tyr

1 5

<210> 60

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于28F5的VL链的 CDR2

<400> 60

Ser Thr Ser

1

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于28F5的VL链的 CDR3

<400> 61

His Gln Tyr His Leu Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210> 62

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于28F5的VH链

<400> 62

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Ser Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr Asp Gly Glu Val Ser Tyr Tyr Ala

100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 63

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于28F5的VH链的 CDR1

<400> 63

Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr Gly

1 5

<210> 64

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于28F5的VH链的 CDR2

<400> 64

Ile Asn Thr Asn Ser Gly Glu Pro

1 5

<210> 65

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于28F5的VH链的 CDR3

<400> 65

Ala Arg Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr Asp Gly Glu Val Ser Tyr Tyr Ala

1 5 10 15

Met Asp Tyr

<210> 66

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于GMB005的VL链

<400> 66

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 67

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于GMB005的VL链的CDR1

<400> 67

Gln Ser Val Ser Ser Tyr

1 5

<210> 68

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于GMB005的VL链的CDR2

<400> 68

Asp Ala Ser

1

<210> 69

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于GMB005的VL链的CDR3

<400> 69

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr

1 5

<210> 70

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于GMB005的VH链

<400> 70

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120

<210> 71

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于GMB005的VH链的CDR1

<400> 71

Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala

1 5

<210> 72

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于GMB005的VH链的CDR2

<400> 72

Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr

1 5

<210> 73

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于GMB005的VH链的CDR3

<400> 73

Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 74

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> CD8a;-信号肽 (SP)

<400> 74

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 75

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> GS 接头

<400> 75

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 76

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人（homo sapiens）

<220>

<221> CHAIN

<223> FCRIIIa; 铰链

<400> 76

Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln

1 5 10 15

<210> 77

<211> 45

<212> PRT

<213> 智人（homo sapiens）

<220>

<221> CHAIN

<223> CD8a; 铰链

<400> 77

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 78

<211> 231

<212> PRT

<213> 智人（homo sapiens）

<220>

<221> CHAIN

<223> IgG1 铰链

<400> 78

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

35 40 45

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

50 55 60

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

85 90 95

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

100 105 110

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

115 120 125

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

145 150 155 160

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

165 170 175

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

180 185 190

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

195 200 205

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 79

<211> 24

<212> PRT

<213> 智人（homo sapiens）

<220>

<221> CHAIN

<223> CD8a; TM 结构域

<400> 79

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 80

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人（homo sapiens）

<220>

<221> CHAIN

<223> 4-1 BB 共刺激结构域

<400> 80

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 81

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（homo sapiens）

<220>

<221> CHAIN

<223> CD3ζ 激活结构域

<400> 81

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 82

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 25A10-V1 CAR

<400> 82

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Asn Ile Lys Asp Ser Leu Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Asp Lys Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Ala Pro Lys Phe Gln Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Thr Leu Thr Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Ser Arg Tyr Ile Asn Tyr Tyr Phe Ala Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser

165 170 175

Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Gly Asn Gln Arg Asn Tyr

180 185 190

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

195 200 205

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

225 230 235 240

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Asp Tyr Pro Tyr

245 250 255

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser

260 265 270

Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala

275 280 285

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

290 295 300

Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

305 310 315 320

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

325 330 335

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

340 345 350

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

355 360 365

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

370 375 380

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225 230 235 240

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

245 250 255

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser

260 265 270

Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala

275 280 285

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

290 295 300

Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

305 310 315 320

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

325 330 335

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

340 345 350

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

355 360 365

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

370 375 380

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

385 390 395 400

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

405 410 415

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

420 425 430

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

435 440 445

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 104

<211> 490

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> GMB005-V2 CAR

<400> 104

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe

35 40 45

Thr Phe Asn Ser Phe Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro

115 120 125

Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

165 170 175

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

180 185 190

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

195 200 205

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

225 230 235 240

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

245 250 255

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

305 310 315 320

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 105

<211> 676

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> GMB005-V3 CAR

<400> 105

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe

35 40 45

Thr Phe Asn Ser Phe Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro

115 120 125

Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

165 170 175

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

180 185 190

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

195 200 205

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

225 230 235 240

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

245 250 255

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro

260 265 270

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly

275 280 285

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

290 295 300

Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

305 310 315 320

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

325 330 335

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

340 345 350

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

355 360 365

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

370 375 380

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

385 390 395 400

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

405 410 415

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

420 425 430

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

435 440 445

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

450 455 460

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

465 470 475 480

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

485 490 495

Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

500 505 510

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys

515 520 525

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

530 535 540

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

545 550 555 560

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

565 570 575

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

580 585 590

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

595 600 605

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

610 615 620

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

625 630 635 640

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

645 650 655

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

660 665 670

Leu Pro Pro Arg

675

<210> 106

<211> 18

<212> PRT

<213> 智人（homosapiens）

<220>

<221> CHAIN

<223> FcεRI γ- 信号肽 (SP)

<400> 106

Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala

1 5 10 15

Ala Ala

<210> 107

<211> 43

<212> PRT

<213> 智人（homosapiens）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于IgE的Fc受体, γ链, 无ITAM) (FcεRI γ - DITAM)

<400> 107

Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu Phe Leu

1 5 10 15

Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile Gln Val

20 25 30

Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser

35 40

<210> 108

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> GSG-P2A 核糖体跳跃肽 (GSG-P2A)

<400> 108

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 109

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> GSG-T2A 核糖体跳跃肽 (GSG-T2A)

<400> 109

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 110

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（homosapiens）

<220>

<221> CHAIN

<223> FcεRI a- 信号肽 (SP)

<400> 110

Met Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu

1 5 10 15

Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala

20 25

<210> 111

<211> 52

<212> PRT

<213> 智人（homosapiens）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于IgE的Fc 受体, α 链, 跨膜和细胞内结构域 (FcεRI a-TM-IC)

<400> 111

Phe Phe Ile Pro Leu Leu Val Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly

1 5 10 15

Leu Phe Ile Ser Thr Gln Gln Gln Val Thr Phe Leu Leu Lys Ile Lys

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Gly Phe Arg Leu Leu Asn Pro His Pro Lys Pro Asn

35 40 45

Pro Lys Asn Asn

50

<210> 112

<211> 215

<212> PRT

<213> 智人（homosapiens）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于IgE的受体, β链, 无 ITAM (FcεR1γ-ΔITAM)

<400> 112

Met Asp Thr Glu Ser Asn Arg Arg Ala Asn Leu Ala Leu Pro Gln Glu

1 5 10 15

Pro Ser Ser Val Pro Ala Phe Glu Val Leu Glu Ile Ser Pro Gln Glu

20 25 30

Val Ser Ser Gly Arg Leu Leu Lys Ser Ala Ser Ser Pro Pro Leu His

35 40 45

Thr Trp Leu Thr Val Leu Lys Lys Glu Gln Glu Phe Leu Gly Val Thr

50 55 60

Gln Ile Leu Thr Ala Met Ile Cys Leu Cys Phe Gly Thr Val Val Cys

65 70 75 80

Ser Val Leu Asp Ile Ser His Ile Glu Gly Asp Ile Phe Ser Ser Phe

85 90 95

Lys Ala Gly Tyr Pro Phe Trp Gly Ala Ile Phe Phe Ser Ile Ser Gly

100 105 110

Met Leu Ser Ile Ile Ser Glu Arg Arg Asn Ala Thr Tyr Leu Val Arg

115 120 125

Gly Ser Leu Gly Ala Asn Thr Ala Ser Ser Ile Ala Gly Gly Thr Gly

130 135 140

Ile Thr Ile Leu Ile Ile Asn Leu Lys Lys Ser Leu Ala Tyr Ile His

145 150 155 160

Ile His Ser Cys Gln Lys Phe Phe Glu Thr Lys Cys Phe Met Ala Ser

165 170 175

Phe Ser Thr Glu Ile Val Val Met Met Leu Phe Leu Thr Ile Leu Gly

180 185 190

Leu Gly Ser Ala Val Ser Leu Thr Ile Cys Gly Ala Gly Glu Glu Leu

195 200 205

Lys Gly Asn Lys Val Pro Glu

210 215

<210> 113

<211> 41

<212> PRT

<213> 智人（homosapiens）

<220>

<221> CHAIN

<223> CD28 共刺激结构域 (CD28-IC)

<400> 113

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 114

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> CD20 模拟表位

<400> 114

Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser

1 5 10

<210> 115

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于帕利珠单抗的表位

<400> 115

Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp

1 5 10 15

Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn

20

<210> 116

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于西妥昔单抗的模拟表位1

<400> 116

Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys

1 5 10

<210> 117

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于西妥昔单抗的模拟表位2

<400> 117

Cys Gln Tyr Asn Leu Ser Ser Arg Ala Leu Lys Cys

1 5 10

<210> 118

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于西妥昔单抗的模拟表位3

<400> 118

Cys Val Trp Gln Arg Trp Gln Lys Ser Tyr Val Cys

1 5 10

<210> 119

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于西妥昔单抗的模拟表位4

<400> 119

Cys Met Trp Asp Arg Phe Ser Arg Trp Tyr Lys Cys

1 5 10

<210> 120

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于纳武单抗的表位A

<400> 120

Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp

1 5 10 15

Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg

20 25

<210> 121

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于纳武单抗的表位B

<400> 121

Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln

1 5 10 15

Ile Lys Glu

<210> 122

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于CD34的表位1

<400> 122

Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu Thr

1 5 10

<210> 123

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 用于CD34的表位2

<400> 123

Asn Thr Asn Ser Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser

1 5 10

<210> 124

<211> 533

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 28F5v2 CAR 具有 2 个CD20 模拟表位

<400> 124

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Lys Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Ser Gly Glu Pro Thr

65 70 75 80

Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser

85 90 95

Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr Asp Gly Glu

115 120 125

Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

130 135 140

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Ile Ile Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser

165 170 175

Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Thr Ser Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys

195 200 205

Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser His Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

210 215 220

Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser

225 230 235 240

Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Leu

245 250 255

Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Asp

260 265 270

Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu

275 280 285

Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys

290 295 300

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

305 310 315 320

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

325 330 335

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

340 345 350

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

355 360 365

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

370 375 380

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

385 390 395 400

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

405 410 415

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

420 425 430

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

435 440 445

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

450 455 460

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

465 470 475 480

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

485 490 495

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

500 505 510

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

515 520 525

Ala Leu Pro Pro Arg

530

<210> 125

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 28F5v2 CAR 具有 2个 CD20 模拟表位和 1个 CD34 表位

<400> 125

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro

20 25 30

Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile

35 40 45

Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val

50 55 60

Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr Gly Met

65 70 75 80

Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp

85 90 95

Ile Asn Thr Asn Ser Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly

100 105 110

Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln

115 120 125

Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg

130 135 140

Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr Asp Gly Glu Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp

145 150 155 160

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

165 170 175

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Ile Leu Thr

180 185 190

Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met

195 200 205

Thr Cys Thr Ala Thr Ser Ser Leu Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr

210 215 220

Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser

225 230 235 240

His Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly

245 250 255

Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala

260 265 270

Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Leu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

275 280 285

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro

290 295 300

Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro

305 310 315 320

Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys

325 330 335

Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Thr Thr

340 345 350

Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln

355 360 365

Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala

370 375 380

Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala

385 390 395 400

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

405 410 415

Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

420 425 430

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

435 440 445

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

450 455 460

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

465 470 475 480

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

485 490 495

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

500 505 510

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

515 520 525

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

530 535 540

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

545 550 555 560

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

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<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 25A10v2 CAR 具有 2个 CD20 模拟表位和 1 个 CD34 表位

<400> 129

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro

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Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

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Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln

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Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

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Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

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405 410 415

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

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Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

530 535 540

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

545 550 555 560

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

565

<210> 130

<211> 501

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 25A10v1 CAR 具有 2 个 CD20 模拟表位

<400> 130

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1 5 10 15

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln

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180 185 190

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

195 200 205

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

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Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly

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Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly

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Gly Gly Ser Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro

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Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

325 330 335

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

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355 360 365

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Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

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485 490 495

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500

<210> 131

<211> 541

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> 25A10v1 CAR 具有 2个 CD20 模拟表位和 1个 CD34 表位

<400> 131

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

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His Ala Ala Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro

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Leu Ser Thr Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Ser

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Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val

180 185 190

Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu

195 200 205

Leu His Ser Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys

210 215 220

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225 230 235 240

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

245 250 255

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr

260 265 270

Cys Gln Asn Asp Tyr Asp Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

275 280 285

Leu Glu Ile Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn

290 295 300

Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly

305 310 315 320

Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

370 375 380

Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

450 455 460

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

465 470 475 480

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485 490 495

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<210> 132

<211> 117

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<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> m2C2的VH链

<400> 132

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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

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<210> 133

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> m2C2的VL链

<400> 133

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

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Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Phe

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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

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<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> m5G9的VH链

<400> 134

Glu Ile His Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

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Asn Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Val

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Lys Ala Met Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Gly Val Tyr Gly Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 135

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> m5G9的 VL链

<400> 135

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

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Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

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Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

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<213> 人工序列（artificial sequence）

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<223> m9E2的VL链

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<213> 人工序列（artificial sequence）

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<223> m28B9的VL链

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35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Val Ser Tyr His Cys Gln Gln Leu Tyr Arg Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 146

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> m26D8的VH链

<400> 146

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Met Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Lys Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr His Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Phe Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ile Trp Leu Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 147

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> m26D8的VL链

<400> 147

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 148

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> m15D1的VH链

<400> 148

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Asp Asn Gly Ala Thr Asn Asn Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Glu Gly Tyr Gln Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 149

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> m15D1的VL链

<400> 149

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Ala Leu Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Ser Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Met

85 90 95

Val Glu Arg Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 150

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> m23F2的VH链

<400> 150

Gln Val Gln Val Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ser Thr Asn His Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Ser Ser Pro Ser Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 151

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> CHAIN

<223> m23F2的VL链

<400> 151

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ala Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Phe

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.一种抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，具有选自如在图8中所示出的V1、V2和V3的多肽结构中的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD38抗体的V_H和V_L的细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号转导结构域的胞质结构域和来自4-1BB的共刺激结构域，

其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项显示出至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ IDNO.54和50(13F11)、SEQ ID NO.30和26(16B5)、SEQ ID NO.38和34(10F7)、SEQ ID NO.46和42(27B6)或者SEQ ID NO.22和18(29B4)。

2.根据权利要求1所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，其中所述跨膜结构域包括与SEQ ID NO.79(CD8αTM)显示出至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，其中所述V_H和V_L包括分别地与以下各项表现出至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.14和10(25A10)、SEQ ID NO.62和58(28F5)、SEQ ID NO.54和50(13F11)或者SEQ ID NO.30和26(16B5)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，其中所述V_H和V_L包括分别地与SEQ ID NO.14和10(25A10)或SEQ ID NO.62和58(28F5)表现出至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，其中所述V_H和V_L包括以下CDR序列：分别地SEQ ID NO.15-17和SEQ ID NO.11-13；分别地SEQ IDNO.63-65和SEQ ID NO.59-62；分别地SEQ ID NO.55-57和SEQ ID NO.51-53；分别地SEQ IDNO.31-33和SEQ ID NO.27-29；分别地SEQ ID NO.39-42和SEQ ID NO.35-37；分别地SEQ IDNO.47-49和SEQ ID NO.43-45；分别地SEQ ID NO.23-25和SEQ ID NO.19-22。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，包括与选自以下各项的一种表现出至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQ ID NO.82-84(25A10)、SEQ ID NO.100-102(28F5)、SEQ ID NO.97-99(13F11)、SEQ ID NO.88-90(16B5)、SEQ ID NO.91-93(10F7)、SEQ ID NO.94-96(27B6)和SEQ IDNO.85-87(29B4)。

7.根据权利要求6所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，包括与选自以下各项的一种表现出至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列：SEQ IDNO.82-84(25A10)、SEQ ID NO.100-102(28F5)、SEQ ID NO.97-99(13F11)和SEQ ID NO.88-90(16B5)。

8.根据权利要求6或7所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，包括与选自以下各项的一种表现出至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列：SEQID NO.82-84(25A10)和SEQ ID NO.100-102(28F5)。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，包括与SEQ ID NO.82(25A10-v1)表现出至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，所述细胞外结合结构域进一步包含至少一个mAb特异性表位。

11.根据权利要求10所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，其中所述至少一个mAb特异性表位具有选自由SEQ ID 114至121组成的组中的氨基酸序列。

12.根据权利要求10或11所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，其中两个SEQ ID NO.114的CD20模拟表位插入所述细胞外配体结合结构域中。

13.根据权利要求10所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，其中两个SEQID NO.114的CD20模拟表位插入所述细胞外配体结合结构域的铰链中。

14.根据权利要求10所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，其中三个SEQID NO.114的CD20模拟表位和一个SEQ ID NO.122或123的CD34表位插入所述细胞外配体结合结构域中。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，包括铰链，所述铰链的多肽与选自SEQ ID NO.76(FcεRIIIα)、SEQ ID NO.77(CD8α)和SEQ IDNO.78(IgG1)中的一种表现出至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，包括铰链，所述铰链的多肽与SEQ ID NO.77(CD8α)表现出至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。

17.根据权利要求1至15中任一项所述的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，包括跨膜结构域，所述跨膜结构域的多肽与选自SEQ ID NO.76(FcεRIIIα)的一种表现出至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。

18.一种制备用于针对病理细胞的免疫疗法的免疫细胞的方法，所述免疫细胞优选是T细胞，所述方法包括以下步骤：

(a)使免疫细胞中编码CD38基因的基因发生基因失活或突变，该基因参与CD38抗原标志物的表达或呈递，所述CD38抗原标志物存在于所述免疫细胞和所述病理细胞两者的表面上；

(b)在所述免疫细胞中表达权利要求1-17中任一项所述的编码针对所述CD38抗原标志物的嵌合抗原受体的转基因，所述抗原标志物存在于所述病理细胞的表面上。

19.根据权利要求18中任一项所述的方法，其中使用稀切核酸内切酶执行步骤a)。

20.根据权利要求19的方法，其中使用TAL核酸酶执行步骤a)。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述TAL核酸酶靶向SEQ ID NO.1、4或7的序列。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述TAL核酸酶靶向SEQ ID NO.4(CD38-1靶标)的序列。

23.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中通过使用SEQ ID NO.2-3、5-6或8-9的TALE核酸酶进行CD38抗原的所述失活。

24.根据权利要求23所述的方法，其中通过使用SEQ ID NO.5-6的TALE核酸酶进行CD38抗原的所述失活。

25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中所述方法包括激活和扩增所述免疫细胞的进一步的步骤。

26.根据权利要求18-25中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过排除在其表面上呈递所述抗原标志物的细胞来纯化得到的免疫细胞的进一步的步骤。

27.根据权利要求18-26中任一项所述的方法，其中所述方法包括从供体取得免疫细胞的先前步骤。

28.根据权利要求18-26中任一项所述的方法，其中所述方法包括从受所述病理细胞的发展影响的患者取得所述免疫细胞的先前步骤。

29.根据权利要求18-28中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞来源于始发态干细胞、iPS或hES细胞。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述免疫细胞来源于iPS细胞，所述iPS细胞来源于受所述病理细胞的发展影响的所述患者。

31.根据权利要求18至30中任一项所述的方法，其中使用RNA指导的核酸内切酶执行步骤a)。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述RNA指导的核酸内切酶是Cas9。

33.根据权利要求32所述的方法，其中将RNA指导的核酸内切酶拆分成至少2种多肽，一种包含RuvC而另一种包含HNH。

34.根据权利要求18至33中任一项所述的方法，其中所述核酸内切酶是由转染的mRNA表达的。

35.根据权利要求18至34中任一项所述的方法，其中，所述方法包括使编码T细胞受体(TCR)的组分的基因发生失活的进一步的步骤。

36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述T细胞受体的所述组分是TCRα。

37.根据权利要求18至36中任一项所述的方法，其中，所述方法包括使编码HLA的组分的基因发生失活的进一步的步骤。

38.根据权利要求18至36中任一项所述的方法，其中所述方法包括使编码β2m的基因发生失活的进一步的步骤。

39.根据权利要求18至38中任一项所述的方法，其中所述方法包括使编码选自以下各项的免疫检查点蛋白的基因发生失活的进一步的步骤：CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述基因座参与PD1或CTLA-4基因的表达。

41.根据权利要求18至40中任一项所述的方法，其中所述方法包括使为所述免疫细胞赋予对化疗或免疫抑制药物的敏感性的基因发生失活的进一步的步骤。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述其他基因编码CD52。

43.根据权利要求41所述的方法，其中所述其他基因是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)。

44.根据权利要求41所述的方法，其中所述其他基因编码糖皮质激素受体(GR)。

45.根据权利要求41所述的方法，其中所述其他基因参与DCK调节途径，特别是DCK表达。

46.根据权利要求18至45中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述免疫细胞来源于炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述T细胞来源于CD4+T淋巴细胞和/或CD8+T淋巴细胞。

48.根据权利要求18至47中任一项所述的方法，其中在体外扩增所述转化的免疫细胞。

49.根据权利要求18至47中任一项所述的方法，其中在体内扩增所述转化的免疫细胞。

50.根据权利要求18至49中任一项所述的方法，其中所述病理细胞选自恶性细胞或感染的细胞。

51.根据权利要求18至50中任一项所述的方法，用于制备待用作药物的免疫细胞。

52.根据权利要求51所述的方法，用于制备用于治疗需要其的患者的癌症、免疫疾病或感染的免疫细胞。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述药物用于治疗CD38⁺血液恶性肿瘤。

54.根据权利要求53的方法，其中所述药物用于治疗B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、急性骨髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(B细胞ALL)和/或慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，更特别是多发性骨髓瘤(MM)。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述药物用于治疗多发性骨髓瘤(MM)。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述药物用于治疗MM亚型，所述MM亚型是难治性/复发性多发性骨髓瘤(RRMM)。

57.根据权利要求54所述的方法，其中所述药物用于治疗急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。

58.根据权利要求54所述的方法，其中所述药物用于治疗B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)患者，如套细胞白血病(MCL)。

59.根据权利要求18至53中任一项所述的方法，其中所述病理细胞为实体肿瘤细胞。

60.一种工程化的免疫细胞(优选T细胞)，其表达根据权利要求1至17中任一项的抗CD38特异性嵌合抗原受体(抗CD38 CAR)，所述免疫细胞的内源性CD38基因被基因失活或突变。

61.根据权利要求60所述的工程化的免疫细胞，其中所述免疫细胞的内源性CD38和TCR基因被基因失活或突变。

62.根据权利要求60或权利要求61所述的工程化的免疫细胞，其中所述免疫细胞的内源性CD38、TCR和dCK基因被基因失活或突变。

63.根据权利要求60至62中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中通过使用一种或多种特异性稀切核酸内切酶的敲除(KO)来使所述CD38基因和一个或多个另外的基因失活。

64.一种根据权利要求18至59中任一项所述的方法能够获得的工程化的免疫细胞。

65.根据权利要求60所述的工程化的免疫细胞，得到表型[CAR CD38]⁺[CD38]^-。

66.一种免疫细胞的群体，包含至少两种根据权利要求60至65中任一项所述的工程化的免疫细胞。

67.一种治疗患者的方法，包括：

(a)诊断所述患者是否存在呈递与免疫细胞相同的特异性CD38抗原标志物的病理细胞；

(b)制备根据权利要求60至65中任一项所述的工程化的免疫细胞的群体或根据权利要求18至59中任一项所述的方法制备的工程化的免疫细胞的群体；

(c)向诊断具有所述病理细胞的所述患者给予所述工程化的免疫细胞。