CN108473527A

CN108473527A - 用于消除免疫抑制疗法期间jc病毒激活和pml(进行性多灶性白质脑病)风险的基因编辑方法和组合物

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Publication number: CN108473527A
Application number: CN201680071662.5A
Authority: CN
Inventors: K·哈利利; 托马斯·马尔科姆; 肯尼斯·I·科恩
Original assignee: Resection Biotherapy Co; Temple Univ School of Medicine
Current assignee: Resection Biotherapy Co; Temple Univ School of Medicine
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2016-12-08
Publication date: 2018-08-31
Also published as: US20230233654A1; WO2019135829A1; EP3387001A2; WO2017100431A2; US20180140682A1; US11491207B2; CA3006305A1; US20190247470A1; EP3387001A4; RU2018124657A; RU2018124657A3; WO2017100431A3; JP2019508364A; AU2016366229A1; US10279014B2

Abstract

一种通过施用有效量的指向JCV基因组中的至少一种靶序列的基因编辑组合物、切割JCV基因组中的靶序列、破坏JCV基因组、消除JCV感染、消除JCV激活的风险、并且用免疫抑制疗法治疗受试者来消除接受免疫抑制疗法的受试者中JCV激活风险的方法。披露了一种药物组合物，所述药物组合物包括编码CRISPR相关内切核酸酶的至少一种分离的核酸序列和具有与JCV DNA中的靶序列互补的间隔子序列的至少一种gRNA，所述分离的核酸序列被包括在至少一种表达载体中。披露了包括至少一种分离的核酸序列的药物组合物，所述分离的核酸序列编码靶向JCV基因组的至少一种核苷酸序列的至少一种TALEN、至少一种ZFN、或至少一种argonaute蛋白。

Description

用于消除免疫抑制疗法期间JC病毒激活和PML(进行性多灶性白质脑病)风险的基因编辑方法和组合物

技术领域

本发明涉及用于在施用免疫抑制疗法之前和期间从宿主细胞中消除约翰坎宁安(John Cunningham)病毒(JCV)的方法和组合物，以消除潜伏JCV的激活以及随后发生的进行性多灶性白质脑病(PML)的风险。具体地，本发明涉及通过施用包括成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关内切核酸酶和一种或多种特异性指导RNA序列的组合物以切割JCV基因组内的靶位点来消除JCV的策略。本发明还涉及包括施用包括锌指核酸酶(ZFN)或转录激活子样效应核酸酶(TALEN)的JCV靶向组合物的策略。

背景技术

已开发出疗法来治疗多种以前难治的疾病或病症，如多发性硬化症；各种癌症、自身免疫疾病(例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、和类风湿性关节炎)；和器官移植排斥。表1示出了这些疗法中的某些的部分列表及其作用机制。从表1可以看出，这些疗法通过失活、抑制、或固定免疫效应细胞(B细胞、T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞)、或通过对免疫效应细胞的细胞毒性副作用而引起免疫抑制。

表1.已经显示能够触发JC病毒并导致PML的药物：

这些疗法的免疫抑制作用具有激活通常由免疫系统阻止的机会致病菌的风险。最严重的风险之一是人类嗜神经多瘤病毒约翰坎宁安病毒(JCV)激活的风险。JCV是致命的脱髓鞘疾病进行性多灶性白质脑病(PML)的病原体。JCV在中枢神经系统(CNS)的神经胶质细胞中的裂解性感染导致少突胶质细胞的死亡，该少突胶质细胞负责产生脑中神经元的髓鞘。这导致范围广泛的轻度至重度神经障碍并最终导致死亡(Berger，2011)。PML有许多发病诱因，所有这些都涉及免疫系统的一定程度的损害。

血清流行病学数据指示75％-80％的人群感染JCV。这种感染大部分发生在儿童时期，通过大部分未知的途径(Saribas等人，2010)。该病毒典型地保持潜伏，不会引起症状。在免疫受损，特别是细胞免疫受损的情况下，病毒可以再激活，增殖并诱导PML的症状(Wagoner等人，2009)。潜伏病毒可以维持在尿道和骨髓、脾和其他淋巴组织以及CNS中(Bayliss等人，2012)。免疫抑制期间的再激活可以反映CNS中潜伏病毒的再激活以及再激活病毒向CNS的血源性扩散(Bag等人，2010)。

JCV基因组由5.1kb大小的双链环状DNA构成，其在病毒感染的早期即DNA复制之前和感染周期的后期编码两类蛋白(DeCaprio等人，2013)。位于早期基因和晚期基因之间的双向编码序列负责病毒基因表达并且包含病毒DNA复制的起点。病毒早期蛋白大T抗原(T-Ag)和较小尺寸的T-Ag蛋白家族通过可变剪接产生，并且在协调病毒复制周期中具有调节作用。具体地，大T-Ag负责病毒DNA复制的起始和病毒晚期基因转录的刺激，因此对于病毒生命周期的各个方面都是关键的(综述参见White和Khalili，2004)。T-Ag结合几种细胞蛋白如p53和pRb，并使宿主细胞的增殖失调。晚期蛋白包括病毒衣壳蛋白VP1、VP2、和VP3以及称为agnoprotein的小调节蛋白(Khalili等人，2005)。

用新的治疗性免疫调节性单克隆抗体(包括那他珠单抗(Chakley和Berger，2013)、依法珠单抗(Schwab等人，2012)和利妥昔单抗(Clifford等人，2011))治疗自身免疫疾病如多发性硬化症和类风湿性关节炎被认为是PML的发病诱因(Nagayama等人，2013)。作为JCV激活和PML的风险的结果，这些治疗以及表1中列出的许多其他治疗必须在广泛的患者监护下以次佳浓度施用。在某些情况下，PML风险足以导致免疫抑制药物从市场撤出，从而阻止患者获得潜在的救生治疗。

许多治疗选择已经应用于PML，大部分没有成功(Tavazzi等人，2012)。多种方法已靶向病毒生命周期中的各个点，如细胞进入和复制。由于已报道JCV与血清素2A受体(5-HT2AR)之间的相互作用是病毒进入所必需的(Elphick等人，2004)，已经测试了结合5HT2AR的利培酮，但发现其没有影响(Chapagain等人，2008)。已经在体外和体内测试了病毒复制的小分子抑制剂如西多福韦，但是产生了相互冲突的结果(Andrei等人，1997，Hou和Major，1998)。迫切需要替代性策略来处理这种致命性脱髓鞘疾病。

一种潜在有效的策略是在免疫抑制疗法开始之前或疗法过程中和之后从患者的宿主细胞中消除潜伏的JCV。没有潜伏病毒被激活，就不需要治疗活性JCV感染。靶向JCV病毒基因组的新的和正在发展的基因编辑系统将成为JCV消除的特别有吸引力的工具。实例系统包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)和成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸酶系统(Gaj等人，2013)。

具体地，基于CRISPR/内切核酸酶DNA编辑系统的工具和技术对基因组编辑提供了前所未有的控制(Mali等人，2013，Hsu等人，2014)。CRISPR/Cas9(CRISPR相关内切核酸酶9)系统是从细菌和古细菌的适应性免疫系统开发的。CRISPR/Cas9系统使用短指导RNA(gRNA)来指导Cas9内切核酸酶切割特定核酸靶序列(Bhaya等人，2011)。切割，通常是平端双链切割，可能会引起由DNA修复缺陷导致的DNA片段的缺失、插入和切除。最近，据报道CRISPR/Cas9可用于消除来自潜伏感染细胞的JCV并阻止新的JCV感染(Wollebo等人，2015)。最近，通过引入CRISPR系统扩大了靶标的范围，所述的系统利用由不同于指导Cas9的gRNA指导的可替代性内切核酸酶Cpf1，靶向不同于被Cas9切割的序列的那些(Zetsche等人，2015)。需要用于在治疗中采用这些基因编辑系统以在免疫抑制疗法之前消除来自患者细胞的潜伏JCV的组合物和方法。

发明内容

本发明提供了一种在施用基因编辑组合物之前、期间或之后通过施用有效量的指向JCV基因组中的至少一种靶序列的基因编辑组合物、切割JCV基因组中的靶序列、破坏JCV基因组、消除JCV感染、消除JCV激活的风险、并且用免疫抑制疗法治疗受试者来消除接受免疫抑制疗法的受试者中JCV激活风险的方法。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括编码CRISPR相关内切核酸酶的至少一种分离的核酸序列和具有与JCV DNA中的靶序列互补的间隔子序列的至少一种gRNA，所述分离的核酸序列被包括在至少一种表达载体中。

本发明进一步提供了药物组合物，所述药物组合物包括至少一种分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码靶向JCV基因组的至少一种核苷酸序列的至少一种TALEN，所述分离的核酸序列被包括在至少一种表达载体中。

本发明还进一步提供了药物组合物，所述药物组合物包括编码至少一种ZFN的至少一种分离的核酸序列，所述ZFN靶向JCV基因组的至少一种核苷酸序列，所述分离的核酸序列被包括在至少一种表达载体中。

本发明还提供了用于从感染约翰坎宁安病毒(JCV)的宿主细胞中消除JCV的药物组合物，所述药物组合物包括编码至少一种argonaute蛋白的至少一种分离的核酸序列，所述argonaute蛋白靶向JCV基因组的至少一种核苷酸序列，所述分离的核酸序列被包括在至少一种表达载体中。

附图说明

在与以下附图结合考虑时，参照以下详细描述，会容易认识到也将更好地理解本发明的其他优点：

图1示出了编码JCV的大T抗原的核苷酸序列。

具体实施方式

本发明代表了基因编辑技术在免疫抑制疗法候选患者中针对潜伏JCV储库问题的首次应用。由于基因编辑系统消除了储库，JCV激活PML的风险就被消除了。免疫抑制疗法以前被认为面对潜伏JCV使用风险过高，现在可以自由施用，不需要有意的治疗不足以降低风险。本发明的方法和组合物可以用作表1中列出的任何治疗的共治疗，并且可以用于可能激活JCV的所有免疫抑制疗法，包括目前现存的治疗以及将来要开发的治疗。

CRISPR组合物和用于消除免疫抑制疗法期间JCV激活风险的方法。

一种用于消除潜伏JCV的优选的基因编辑方式是RNA指导的CRISPR技术。在CRISPR系统中，CRISPR簇编码间隔子，所述间隔子是与病毒核酸中或另一个待靶向的核酸中的靶序列(“原型间隔子”)互补的序列。CRISPR簇被转录并加工成成熟的CRISPR RNA(crRNA)。CRISPR簇也编码CRISPR相关(Cas)蛋白，包括DNA内切核酸酶。crRNA与靶DNA序列结合，从而Cas内切核酸酶在靶序列处或邻近靶序列切割靶DNA。

一种有用的CRISPR系统包括CRISPR相关内切核酸酶Cas9。Cas9由成熟的crRNA指导，该成熟的crRNA含有大约20-30个碱基对(bp)的间隔子和反式激活的小RNA(tracrRNA)，所述反式激活的小RNA可用作前crRNA的核糖核酸酶III辅助加工的指导。crRNA：tracrRNA双链体通过crRNA上的间隔子和靶DNA上的靶序列之间的互补碱基配对将Cas9引导至靶DNA。Cas9识别三核苷酸(NGG)原型间隔子邻近基序(PAM)以决定切割位点(来自PAM的第3个核苷酸)。crRNA和tracrRNA可以单独表达或通过合成茎环(AGAAAU)工程化到人工嵌合小指导RNA(sgRNA)中以模拟天然crRNA/tracrRNA双链体。这样的sgRNA可以合成或体外转录以用于直接RNA转染，或者它们可以原位表达，例如，从U6或H1启动的RNA表达载体表达。术语“指导RNA”(gRNA)将用于表示crRNA：tracrRNA双链体或sgRNA。应理解的是术语与靶序列“互补的gRNA”指示其间隔子序列与靶序列互补的gRNA。

其他可用的CRISPR系统包括CRISPR/Cpf1，这是一种类似于CRISPR/Cas9系统的DNA编辑技术，由博德研究所和麻省理工学院的张锋(Feng Zhang)小组于2015年表征。Cpf1是II类CRISPR/Cas系统的RNA指导型内切核酸酶。这种获得性免疫机制见于普雷沃菌属(Prevotella)和弗朗西丝氏菌属(Francisella)细菌中。它可以防止病毒对基因的损伤。Cpf1基因与CRISPR基因座相关联，编码使用指导RNA来发现和裂解病毒DNA的内切核酸酶。Cpf1是一种比Cas9更小更简单的内切核酸酶，克服了CRISPR/Cas9系统的一些局限性。下文进一步描述了Cpf1。

也可以使用Argonaute蛋白。Argonaute蛋白是PIWI蛋白超家族的蛋白，其含有PIWI(P元件诱导的wimpy睾丸)结构域、MID(中间)结构域、PAZ(Piwi-Argonaute-Zwille)结构域和N末端结构域。Argonaute蛋白能够结合小RNA，如微小RNA、小干扰RNA(siRNA)和Piwi相互作用RNA。可以将Argonaute蛋白引导至具有这些RNA的靶序列以切割mRNA、抑制翻译或诱导靶序列中的mRNA降解。有几种不同的人类Argonaute蛋白，包括与小RNA相关的AGO1、AGO2、AGO3和AGO4。AGO2具有切片能力，即充当内切核酸酶。Argonaute蛋白可以用于基因编辑。来自Argonaute蛋白家族的内切核酸酶(来自格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacteriumgregoryi)Argonaute)也使用寡核苷酸作为降解侵入性基因组的指导。Gao等人的工作显示，格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAgo)是一种适用于人类细胞基因组编辑的DNA指导的内切酶。NgAgo与约24个核苷酸的5'磷酸化单链指导DNA(gDNA)结合，当装载gDNA时有效地产生位点特异性DNA双链断裂。与Cas9一样，NgAgo-gDNA系统不需要原型间隔子邻近基序(PAM)，并且初步表征表明指导靶标错配的低耐受性和对编辑(G+C)丰富的基因组靶标的高效性。本发明中使用的Argonaute蛋白内切核酸酶也可以是类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)Argonaute(RsArgo)。RsArgo可以提供与靶DNA链和指导RNA的稳定相互作用，因为它能够在N末端和PIWI结构域之间在指导RNA的3'区中保持碱基配对。RsArgo还能够特异性识别指导RNA的5'碱基-U，并且PAZ结构域与指导RNA的双链体识别环在DNA沉默活性中可能是重要的。其他原核Argonaute蛋白(pAgos)也可用于DNA干扰和切割。Argonaute蛋白可以源自拟南芥、果蝇、超嗜热菌(Aquifex aeolicus)、极端嗜热菌(Thermusthermophiles)、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、极端嗜热菌JL-18、极端嗜热菌菌株HB27、超嗜热菌菌株VF5、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、好热黄无氧芽孢菌(Anoxybacillus flavithermus)、伯林盐几何菌(Halogeometricum borinquense)、铜绿微囊藻(Microsystis aeruginosa)、巴氏梭菌(Clostridium bartlettii)、嗜冷嗜盐菌(Halorubrum lacusprofundi)、细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)、和细长聚球藻(Synechococcus elongatus)。还可以使用Argonaute蛋白，它们在内切核酸溶解方面无活性，但是可以对保守的催化残基进行翻译后修饰以将它们作为内切核酸酶进行激活。因此，本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包括至少一种分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码靶向JCV基因组的至少一种核苷酸序列的至少一种argonaute蛋白，所述分离的核酸序列被包括在至少一种表达载体中。

在本发明的优选实施例中，所述的CRISPR相关内切核酸酶是Cas9核酸酶。所述的Cas9核酸酶可以是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的序列。Cas9核酸酶也可以具有与野生型酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)序列相同的核苷酸序列。在一些实施例中，CRISPR相关内切核酸酶可以是来自其他物种的序列，例如其他链球菌属物种，例如嗜热链球菌(Streptococcus Thermophiles)；铜绿假单胞菌、大肠杆菌或其他测序细菌基因组和古细菌、或其他原核微生物。可替代地，可以修饰野生型酿脓链球菌Cas9序列。优选地，核酸序列经密码子优化以在哺乳动物细胞中有效表达，即“人源化”。人源化Cas9核酸酶序列可以是例如由Genbank登录号KM099231.1GI:669193757；KM099232.1GI:669193761；或KM099233.1GI:669193765中列出的任何表达载体编码的Cas9核酸酶序列。可替代地，Cas9核酸酶序列可以是例如包含在可商购载体例如来自Addgene公司(剑桥，马萨诸塞州)的PX330或PX260内的序列。在一些实施例中，Cas9内切核酸酶可以具有氨基酸序列，所述的氨基酸序列是Genbank登录号KM099231.1GI:669193757；KM099232.1GI:669193761；或KM099233.1GI:669193765的任何Cas9内切核酸酶序列的变体或片段或PX330或PX260的Cas9氨基酸序列(Addgene公司，剑桥，马萨诸塞州)。

可以修饰Cas9核苷酸序列以编码Cas9的生物活性变体，并且这些变体可以具有或可以包括例如由于含有一个或多个突变(例如，添加、缺失或取代突变或这些突变的组合)而与野生型Cas9不同的氨基酸序列。一个或多个取代突变可以是取代(例如，保守氨基酸取代)。例如，Cas9多肽的生物活性变体可具有与野生型Cas9多肽具有至少或约50％序列同一性(例如至少或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。保守性氨基酸取代典型地包括在下组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。

Cas9氨基酸序列中的氨基酸残基可以是非天然存在的氨基酸残基。天然存在的氨基酸残基包括由遗传密码天然编码的氨基酸残基以及非标准氨基酸(例如具有D-构型而不是L-构型的氨基酸)。本发明的肽还可以包括氨基酸残基，其是标准残基的经修饰形式(例如吡咯赖氨酸可以用来替代赖氨酸、硒代半胱氨酸可以用来替代半胱氨酸)。非天然存在的氨基酸残基是那些在自然界中未发现的氨基酸残基，但符合氨基酸的基本分子式并可以并入肽中。这些包括D-别异亮氨酸(2R,3S)-2氨基-3-甲基戊酸和L-环戊基甘氨酸(S)-2-氨基-2-环戊基乙酸。对于其他实例，可以咨询教科书或万维网(一个目前由加利福尼亚理工学院维护的网站，并显示已经成功并入功能性蛋白的非天然氨基酸的结构)。

Cas9核酸酶序列可以是突变序列。例如，Cas9核酸酶可以在保守的HNH和RuvC结构域中突变，所述结构域参与链特异性切割。例如，RuvC催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸(D10A)突变允许Cas9切口酶突变体(Cas9n)切口而不是切割DNA以产生单链断裂，并且随后通过HDR22的优先修复可潜在地降低来自脱靶双链断裂的不想要的InDel突变的频率。

除了先前描述的野生型和变体Cas9内切核酸酶之外，本发明还涵盖CRISPR系统，其包括显著减少脱靶切割的“特异性增强的”酿脓链球菌Cas9变体(eSpCas9)。这些变体用丙氨酸取代来工程化以中和与DNA的非靶链相互作用的沟中的带正电荷的位点。该修饰减少了Cas9与非靶链的相互作用，从而促进了靶链与非靶链之间的重新杂交。此修饰的效果是gRNA与靶DNA链之间更严格的沃森-克里克配对的要求，这限制了脱靶切割(Slaymaker等人，2015)。

尤其优选的是发现具有最好的切割效率和最小的脱靶效应的三种变体：SpCas9(K855a)、SpCas9(K810A/K1003A/r1060A)(又称作eSpCas9 1.0)、和SpCas9(K848A/K1003A/R1060A)(又称作eSPCas9 1.1)。用于克隆和诱导这些特异性增强的变体的细胞表达的技术可以在Slaymaker等人(2015)中找到，将其以全文结合在此。本发明决不限于这些变体，并且还涵盖由Slaymaker等人(2015年)披露的所有Cas9变体。

在一些实施例中，本发明的组合物可以包括由上述任何核酸序列编码的CRISPR相关内切核酸酶多肽。多肽可以通过多种方法产生，包括例如重组技术或化学合成。一旦产生，可以通过本领域公知的方法将多肽分离并纯化至任何希望的程度。例如，随后可以使用例如反相(优选)或正相HPLC、或在多糖凝胶介质例如Sephadex G-25上的尺寸排阻或分配层析来冻干。通过标准方式、通过氨基酸测序或通过FAB-MS技术降解肽后，通过氨基酸分析可以确认最终多肽的组成。

在示例性实施例中，本发明包括工程化CRISPR系统，该系统包括Cas9和与JCV T-Ag序列互补的一种或多种gRNA。示例性的JCV基因组序列是Mad-1菌株，NCBI参考序列，GenBank号：NC_001699.1，公共GI(Frisque等人，1984)。在Mad 1菌株中，T-Ag编码区开始于5130nt环状Mad-1JCV基因组的核苷酸(nt)5013。T-Ag编码区的核苷酸序列在图1中示出为SEQ ID NO:13。

本发明包括在免疫抑制疗法期间消除患者中JC病毒激活风险的方法，所述方法包括以下步骤：向潜伏或活跃感染JCV的患者施用有效量的指向JCV基因组中至少一种靶序列的基因编辑组合物，切割JCV基因组中的靶序列，破坏JCV基因组，消除JCV感染，消除JCV病毒激活的风险，并且在选自施用基因编辑组合物之前、期间和之后的时间对患者施用免疫抑制疗法。应当理解，免疫抑制疗法可以在不同的时间点施用。PML在患者进行免疫疗法之前可能不会发生，此时基因编辑组合物可以在患者保持或暂时停用免疫抑制疗法时使用。基因编辑组合物可以是上文所述的那些中的任何一个。

在一个优选的实施例中，所述方法包括以下步骤：施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含编码CRISPR相关内切核酸酶的分离的核酸，和编码至少gRNA(包括与JCVDNA中的靶序列互补的间隔子序列)的至少一种分离的核酸；在患者的细胞中表达该CRISPR相关内切核酸酶和该至少一种gRNA；切割JCV基因组中的靶序列；破坏JCV基因组；消除JCV感染；消除JCV病毒的激活风险；并且在选自施用该CRISPR相关内切核酸酶之前、期间和之后的时间对患者施用免疫抑制疗法。CRISPR相关内切核酸酶可以是上文所述的那些中的任何一个。

Wollebo等人已经披露了可抑制宿主细胞中的JCV复制和T-Ag表达并破坏JCV基因组的完整性的CRISPR/Cas9系统。这些影响引起游离附加型病毒和整合到宿主基因组中的病毒两者的切除。没有产生对健康基因的有害脱靶效应(Wollebo等人，2015，以其全文并入本文)。Wollebo等人(2015)披露的Cas9和gRNA组合物用于本发明方法的一个实施例中。

在预期性实例1中，本文披露了假定的示例性治疗方法。该实例包括免疫抑制性多发性硬化症药物那他珠单抗其在携带PML血清阳性的患者中携带诱导PML的1/1000至13/1000风险(处方信息，Biogen Idec Inc.，剑桥，马萨诸塞州)。示例性方法容易地被修改以用于任何免疫抑制药物方案的修饰，包括但不限于表1中列出的药物。

实例1中的gRNA是由Wollebo等人(2015)披露的那些，但应该理解，本发明不限于那些gRNA。gRNA包括与TM1、TM2或TM3区JCV T-抗原序列互补的gRNA间隔子序列。靶序列可以延伸从约20到40或更多个核苷酸(nt)的长度。应该理解的是，在不同的JCV菌株或突变变体中，可以通过熟知的测序和基因组技术容易地鉴定与TM1、TM2和TM3同源的序列。

TM1中的示例性靶序列包括SEQ ID NO：1或反向平行链上的其互补序列SEQ IDNO:2。在靶序列中可以包括每条链中的PAM序列(在图1以小写字母粗体示出)，使得靶序列可以包括SEQ ID NO:3或反向平行链上的其互补序列SEQ ID NO:4。因此指定为gRNAm1的与TM1互补的gRNA可以包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4互补的间隔子序列。

核苷酸序列如下：

AAATGCAAAGAACTCCACCCTGATGAAGGTG(SEQ ID NO:1)

AAATGCAAAGAACTCCACCCTGATGAAGGTG(SEQ ID NO:2)

CACCTTTATCAGGGTGGAGTTCTTTGCATTT(SEQ ID NO:3)

cccCACCTTTATCAGGGTGGAGTTCTTTGCATTT(SEQ ID NO:4)

TM2中的示例性靶序列包括SEQ ID NO:5或反向平行链上的其互补序列SEQ IDNO:6。在靶序列中可以包括每条链中的PAM序列，使得靶序列也可以包括SEQ ID NO:7或反向平行链上的其互补序列SEQ ID NO：8。因此指定为gRNAm2的与TM2互补的gRNA可以包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8互补的间隔子序列。

核苷酸序列如下：

GATGAATGGGAATCCTGGTGGAATACATTTAATGAGAAGT(SEQ ID NO:5)

GATGAATGGGAATCCTGGTGGAATACATTTAATGAGAAGT(SEQ ID NO:6)

ACTTCTCATTAAATGTATTCCACCAGGATTCCCATTCATC(SEQ ID NO:7)

cccACTTCTCATTAAATGTATTCCACCAGGATTCCCATTCATC(SEQ ID NO:8)

TM3中的示例性靶序列包括SEQ ID NO:9或反向平行链上的其互补序列SEQ IDNO:10。在每条链中也可以包括PAM序列，使得靶序列可以包括SEQ ID NO:11或其互补序列SEQ ID NO：12。因此指定为m3的与TM3互补的gRNA可以包括与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12互补的间隔子序列。

核苷酸序列如下：

AAGGTACTGGCTATTCAAGGGGCCAATAGACAG(SEQ ID NO:9)

AAGGTACTGGCTATTCAAGGGGCCAATAGACAG(SEQ ID NO:10)

CTGTCTATTGGCCCCTTGAATAGCCAGTACCTT(SEQ IN NO:11)

ccaCTGTCTATTGGCCCCTTGAATAGCCAGTACCTT(SEQ ID NO:12)

应该理解的是，本发明的gRNA还可以包括另外的5'和/或3'序列，其可以或可以不与靶序列互补。每种gRNA的间隔子可以具有与其靶序列的少于100％的互补性，例如95％的互补性。还应该理解的是，除了与JCV大T-Ag编码区互补的那些之外的gRNA也在本发明的范围内。这包括与编码VP1、VP2、和VP3以及agnoprotein的区内的靶序列互补的gRNA。与不同PAM邻近的任何现有的另外的序列同样在本发明的范围内。

gRNA可以被配置为单个序列或者被配置为一个或多个不同序列的组合，例如多重配置。多重配置可以包括两种、三种、或更多种不同gRNA的组合。当组合物以表达载体施用时，指导RNA可以由单个载体编码。可替代地，可以工程化多种载体，每种载体包括两种或更多种不同的指导RNA。引起切割位点之间病毒序列切除的尤其有用的gRNA护理组合，导致JCV基因组或JCV蛋白表达的消融。切除的区可以在大小上从单个核苷酸到几百个核苷酸变化。

RNA分子(例如crRNA、tracrRNA、gRNA)可以被工程化以包含一个或多个修饰的核碱基。例如，RNA分子的已知修饰可见于例如Genes VI，第9章(“解释遗传密码”)，Lewin编辑(1997，牛津大学出版社，纽约)以及RNA的修饰和编辑，Grosjean和Benne编辑(1998，ASM出版社，华盛顿特区)。修饰的RNA组分包括以下：2'-O-甲基胞苷；N⁴-甲基胞苷；N⁴-2'-O-二甲基胞苷；N⁴-乙酰基胞苷；5-甲基胞苷；5,2’-O-二甲基胞苷；5-羟甲基胞苷；5-甲酰基胞苷；2'-O-甲基-5-甲酰基胞苷；3-甲基胞苷；2-硫代胞苷；赖胞苷；2'-O-甲基尿苷；2硫尿苷；2-硫代-2'-O-甲基尿苷；3,2’-O-二甲基尿苷；3-(3-氨基-羧基丙基)尿苷；4-硫尿苷；胸腺嘧啶核糖核苷；5,2’-O-二甲基尿苷；5-甲基-2硫尿苷；5-羟基尿苷；5-甲氧基尿苷；尿苷5-氧基乙酸；尿苷5-氧基乙酸甲酯；5-羧甲基尿苷；5-甲氧羰基甲基尿苷；5甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基-2'-硫尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基-2’-O-甲基尿苷；5-(羧基羟甲基)尿苷；5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯；5-氨基甲基-2-硫尿苷；5甲氨基甲基尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷；5-甲基氨基甲基-2硒尿苷；5-羧甲基氨基甲基尿苷；5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基-尿苷；5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷；二氢尿苷；二氢胸腺嘧啶核糖核苷；2'-甲基腺苷；2-甲基腺苷；N⁶-甲基腺苷；N⁶,N⁶-二甲基腺苷；N⁶,2'-O-三甲基腺苷；2-甲硫基-N⁶N-异戊烯基腺苷；N⁶-(顺式-羟基异戊烯基)-腺苷；2-甲硫基-N⁶-(顺式–羟基异戊烯基)-腺苷；N⁶-(甘氨酰基氨基甲酰)腺苷；N⁶-苏氨酰氨基甲酰腺苷；N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰氨基甲酰腺苷；2-甲硫基-N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰氨基甲酰腺苷；N⁶-羟基正缬氨酰基氨基甲酰腺苷；2-甲硫基-N⁶-羟基正缬氨酰基氨基甲酰腺苷；2-O-腺嘌呤核糖苷(磷酸)；肌苷；2'O-甲基肌苷；1-甲基肌苷；1；2'-O-二甲基肌苷；2'-O-甲基鸟苷；1-甲基鸟苷；N²-甲基鸟苷；N²,N²-二甲基鸟苷；N²,2’-O-二甲基鸟苷；N²,N²,2’-O-三甲基鸟苷；2'-O-核糖基鸟苷(磷酸)；7-甲基鸟苷；N²；7-二甲基鸟苷；N²；N²；7-三甲基鸟苷；怀俄苷；甲基怀俄苷；修饰不足的羟基怀丁苷；怀丁苷；30羟基怀丁苷；过氧怀丁苷；辫苷；环氧辫苷；半乳糖基-辫苷；甘露糖基-辫苷；7-氰基-7-脱氮鸟苷；arachaeosine[也称为7-甲酰氨基-7-脱氮鸟苷]；和7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷。本发明的方法或本领域的其他方法可用于鉴定另外的修饰的RNA分子。

本发明的gRNA不限于与JCV T-抗原的TM1、TM2或TM3区内发现的序列互补的那些gRNA。CRISPR系统可以通过合适设计的gRNA将其他JCV区作为靶标。对于采用酿脓链球菌Cas9的CRISPR系统，PAM序列可以是AGG、TGG、CGG或GGG。候选靶序列可以通过邻近5'PAM如AGG、TGG、CGG或GGG来鉴定。其他Cas9直系同源物可能具有不同的PAM特异性。例如，来自嗜热链球菌(S.Thermophiles)的Cas9需要CRISPR 1的5'-NNAGAA和CRISPR 3的5'-NGGNG并且来自脑膜炎奈瑟菌(Neiseria menigiditis)的Cas9需要5'-NNNNGATT。gRNA的特异序列可能有所不同，但有用的gRNA序列将是那些实现高效率和完全消除JCV的同时使脱靶效应最小化的序列。候选gRNA的效率和脱靶效应可以通过Wollebo等人(2015年)披露的测定来确定。

CRISPR/Cas9组合物优选作地为药物组合物施用，所述药物组合物能以本领域普通技术人员已知的各种方式制备。优选地，CRISPR/Cas9组合物在表达载体中编码，其被配制在用于施用于患者的组合物中，或者在一些情况下用于治疗培养的患者细胞以便过继性转移给患者。这些组合物能以制药领域公知的方式制备，并且可以通过多种途径施用。由于潜伏JCV可以居住在大脑和其他CNS组织的胶质细胞以及各种淋巴和非淋巴外周组织中，通过局部和全身多种途径进行递送可能是所希望的。

给药可以是局部的(包括眼的和至粘膜，包括鼻内、阴道和直肠递送)、肺部的(例如，通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮肤)、眼部的、口腔的或肠胃外的。用于眼部递送的方法可以包括局部给药(滴眼剂)，结膜下、眼周或玻璃体内注射或者通过用手术方法放置在结膜囊中的气囊式导管或眼科插入件引入。肠胃外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注或导管插入术；或颅内，例如，鞘内或心室内施用，例如通过套管。肠胃外给药可以处于单次推注剂量的形式，或者可以例如通过连续灌注泵。用于局部给药的药物组合物和配制品可以包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、粉剂等。常规的药物载体、水性基质、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必要的或希望的。用基因编辑组分转导的胶质细胞和间充质细胞可用于将这些组分转导入CNS中的位点(Lee等人，2013，San Sebastian等人，2013)

本发明还包括药物组合物，其含有作为活性成分的本文所述的核酸、载体、外来体和纳米线团(nanoclew)，这些成分与一种或多种药学上可接受的载体组合。我们使用术语“药学上可接受的”(或者“药理学上可接受的”)指当施用于适当的动物或人类时，不产生不利的、过敏的或者其他不良反应的分子实体和组合物。如在此所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、黏合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等，其可以用作用于药学上可接受的物质的介质。在制备本发明的组合物中，典型地将活性成分与赋形剂混合，用赋形剂稀释或封装在这样一种载体之内，该载体呈例如胶囊、片剂、药袋(sachet)、纸或其他容器的形式。当赋形剂用作稀释剂时，其可以是固体、半固体、或液体材料(例如，生理盐水)，用作活性成分的媒介、载体或介质。因此，这些组合物可以呈片剂、丸剂、粉剂、锭剂、药袋、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆剂、气溶胶(作为固体或在液体介质中)、洗剂、乳膏、软膏、凝胶剂、软和硬明胶胶囊剂、栓剂、无菌可注射溶液以及无菌包装粉剂的形式。如本领域已知的，稀释剂的类型可以根据预期的给药途径而变化。所得组合物可包括另外的试剂，例如防腐剂。在一些实施例中，载体可以是或可以包括基于脂质或基于聚合物的胶体。在一些实施例中，载体材料可以是配制成脂质体、水凝胶、微粒、纳米颗粒或嵌段共聚物胶束的胶体。如指出的，载体材料可以形成胶囊，并且该材料可以是基于聚合物的胶体。进一步示例性的药学上可接受的载体和稀释剂连同药物配制品的描述可以在本领域内的标准文本雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)以及在USP/NF中找到。可以将其他物质添加到这些组合物中以稳定化和/或保存这些组合物。

如本文所使用的，术语药物组合物的“有效量”是指诱导希望的应答而不诱导患者显著毒性的任何量。对于本发明，基因编辑组合物的希望的效果是从宿主组织中消除JCV。该量可以通过在施用已知量的特定的组合物后评估患者的反应来确定。此外，毒性水平(如果有的话)可以通过在施用已知量的特定组合物之前和之后评估患者的临床症状来确定。应当指出，可以根据希望的结果以及患者的反应和毒性水平来调整施用于患者的特定组合物的有效量。对每个特定患者的显著毒性可能不同，且取决于多种因素，包括但不限于患者的疾病状态、年龄和对副作用的耐受性。

本发明的核酸序列可以被递送至受试者的合适的细胞。这可以通过例如使用聚合的，生物可降解的微粒或微胶囊递送媒介物来实现，其尺寸被设计成通过吞噬细胞如巨噬细胞优化吞噬作用。例如，可以使用直径约1-10μm的PLGA(聚-乳酸-共-乙交酯)微粒。将多核苷酸包封在这些微粒中，这些微粒被巨噬细胞吸收并在细胞内逐渐生物降解，由此释放多核苷酸。一旦释放，DNA在细胞内表达。第二种类型的微粒意图不被细胞直接吸收，而是主要起核酸的缓释储库的作用，其仅在通过生物降解从微粒释放时才被细胞吸收。因此这些聚合物颗粒应该足够大以排除吞噬作用(即大于5μm并且优选地大于20μm)。实现核酸吸收的另一种方式是使用通过标准方法制备的脂质体。核酸可以单独掺入这些递送媒介物中或与组织特异性抗体共同掺入，例如靶向HIV感染常见的潜伏感染储库(例如脑巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和肠相关淋巴细胞)的细胞类型的抗体。可替代地，可以通过静电或共价力制备由质粒或附接至聚-L-赖氨酸的其他载体构成的分子复合物。聚-L-赖氨酸结合可结合靶细胞受体的配体。将“裸DNA”(即不含递送媒介物)递送到肌内、皮内或皮下位点是实现体内表达的另一种方式。在相关多核苷酸(例如表达载体)中，编码包含CRISPR相关内切核酸酶编码序列的分离的核酸序列和指导RNA的核酸序列与启动子或增强子-启动子组合有效连接。上面描述了启动子和增强子。

在一些实施例中，本发明的组合物可以被配制成纳米颗粒，例如纳米颗粒由与DNA复合的高分子量直链聚乙烯亚胺(LPEI)的核心构成，并被聚乙二醇修饰的(聚乙二醇化的)低分子量LPEI的壳包围。

核酸和载体也可以应用于装置(例如导管)的表面或包含在泵、贴片或其他药物递送装置内。本发明的核酸和载体可以是在药学上可接受的赋形剂或载体(例如生理盐水)的存在下单独或以混合物的形式施用。根据给药方式和途径选择赋形剂或载体。用于药物制剂的合适的药物载体以及药用辅料描述于本领域公知的参考文献雷明顿的药学科学(E.W.Martin)，以及USP/NF(美国药典和国家处方集)中。

在一些实施例中，组合物可以被配制成包封编码Cas9或变体Cas9、或Cpf1、或Cpf1变体或任何其他有效g-RNA指导DNA内切核酸酶的核酸的纳米颗粒；和与靶HIV互补的至少一种gRNA序列；或者它可以包括编码这些组分的载体。可替代地，可以将组合物配制成包封CRISPR相关内切核酸酶的纳米颗粒，所述多肽由本发明的核酸组合物中的一种或多种编码。

优选地，基因编辑治疗仅施用于被确定为需要治疗的患者，即，确定患有潜伏JCV感染的患者。该确定可以通过本领域已知的任何有效筛选测试来进行。用于抗JCV抗体的ELISA测定和用于JCV DNA的定量PCR在血液、血清、CSF或其他体液中是优选的。可替代地采用包涵体诊断测定法。因此，本发明的方法可以在施用步骤之前包括施用步骤之前的步骤，即筛选患者的潜伏或活性JCV感染的步骤。

还优选监护被鉴定为具有潜伏或活性JCV感染的患者以确保在开始免疫抑制疗法之前感染得到解决。如果长期递送免疫抑制剂疗法，则还令人希望的是监护患者JCV感染的复发，例如，通过重新激活小的、未经治疗的潜伏病毒储库。监护可以通过任何合适的方法进行，如先前所述的ELISA和PCR方法。因此，本发明的方法还可以包括，在破坏JCV基因组的步骤之后的任何点，确定JCV感染已被解决的步骤。

基因编辑组合物的剂量、毒性和疗效可以通过在细胞培养或实验动物中的标准药物的程序而被确定，这些程序是如用于确定LD₅₀(致死50％的群体的剂量)和ED₅₀(对于50％的群体具治疗有效性的剂量)。在毒性和治疗效果之间的剂量比为治疗指数，它可以表示为LD₅₀/ED₅₀。展现高的治疗指数的Cas9/gRNA组合物是优选的。尽管可以使用展现出脱靶效应或其他毒副作用的Cas9/gRNA组合物，但是应该小心设计将此类组合物靶向受累组织的部位的递送系统，从而将对未感染的细胞的潜在损伤最小化，并且由此减少副作用。还可以通过在表达载体中包括一种或多种组织特异性启动子来实现对副作用的限制。另外，为了增加所施用组合物的体内半衰期，可以将组合物装入胶囊、引入到脂质体的腔中、制备为胶体，或者可以采用提供延长组合物血清半衰期的其他常规技术。多种方法可用于制备脂质体，如在例如，Szoka等人的美国专利号4,235,871、4,501,728和4,837,028中所述的，将其各自通过引用结合在此。另外，能以靶向药物递送系统进行该药物的给予，例如，在用组织特异性抗体包衣的脂质体中。所述脂质体靶向于所述器官并由所述组织选择性地吸收。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制一系列的用于在人类中使用的剂量。通常这种组合物的剂量处于包括ED₅₀在内的循环浓度范围内，有很少的毒性或没有毒性。该剂量可根据所应用的剂型和所使用的给药途径在该范围内变化。对于用于本发明方法的任何组合物，均可根据细胞培养试验初步估计治疗有效剂量。

载体。本发明包括含有用于表达CRISPR组分(如一种或多种gRNA)和Cas内切核酸酶(如Cas9)的一种或多种盒的载体。载体可以是本领域已知的适合表达所需希望的表达盒的任何载体。已知许多载体能够介导到哺乳动物细胞的基因产物的传递，如在本领域熟知并且在此描述的。“载体”(有时称为基因递送或基因传递“媒介物”)是指包含有待在体外或体内递送到宿主细胞的多核苷酸的一种大分子或分子复合物。这种有待递送的多核苷酸可以包含基因疗法中感兴趣的编码序列。

优选的载体是慢病毒载体。慢病毒载体具有提供增殖和静息细胞的有效转导，通过整合到宿主染色质中稳定表达所递送的基因，以及不存在来自先前存在的病毒免疫力的干扰的优点。在Wollebo等人(2015)中披露的实验中，显示用于Cas9/gRNA组分的药物诱导型慢病毒表达载体在感染细胞中消除JCV T-Ag表达是有效的。在示例性配置中，宿主细胞在多西环素诱导型慢病毒载体中用Cas9或另一种合适的CRISPR内切核酸酶稳定转导。当希望消除JCV时，将宿主细胞用一种或多种gRNA转导并用多西环素处理，以激活Cas9的表达，引起JCV基因组的指导切割和病毒的失活。可替代地，能以药物诱导型方式稳定地转导一种或多种gRNA，或者可以如此转导CRISPR相关内切核酸酶和gRNA两者。在临床情况下，这种治疗方法可用于有JCV感染风险的患者，CRISPR组分在初始或复发感染证据时被激活。

因此，本发明涵盖用于从宿主细胞消除JCV的载体组合物。载体组合物包括编码CRISPR相关内切核酸酶的至少一种分离的核酸序列和具有与JCV DNA中的靶序列互补的间隔子序列的至少一种gRNA。分离的核酸序列被包括在至少一种表达载体中，所述表达载体在宿主细胞中诱导CRISPR相关内切核酸酶和至少一种gRNA的表达。

本发明不限于实例1-2中描述的质粒和慢病毒载体。其他优选的载体包括腺病毒载体和腺相关病毒载体。这些具有不整合到宿主细胞DNA中的优点。腺病毒具有包装能力大的另外的优点(Ding等人，2014)。许多其他重组病毒载体也是合适的，包括但不限于水疱性口炎病毒(VSV)载体、痘病毒载体、和逆转录病毒载体。

“重组病毒载体”是指含一种或多种异源基因产物或序列的病毒载体。由于许多病毒载体表现出与包装(packaging)相关的尺寸限制，所以这些异源基因产物或序列典型地通过替代该病毒基因组的一个或多个部分而引入。此种病毒可能变成复制缺陷型的，从而要求在病毒的复制和包封过程中以反式提供一种或多种删除功能(通过使用，例如，携带复制和/或包封所必需的基因产物的辅助病毒或包装细胞系)。其中在病毒颗粒外面上携带一种有待递送的多核苷酸的改性病毒载体已经进行了描述。

逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒以及基于HIV的病毒。一种优选的基于HIV的病毒载体包括至少两种载体，其中gag和pol基因是来自HIV基因组并且env基因是来自另一种病毒。DNA病毒载体是优选的。这些载体包括痘病毒载体如正痘病毒或禽痘病毒载体、疱疹病毒载体如I型单纯疱疹病毒(HSV)载体。

痘病毒载体可将基因导入到细胞质内。禽痘病毒载体只产生核酸的短期表达。腺病毒载体、腺-相关的病毒载体以及单纯疱疹病毒(HSV)载体可以是一些发明实施例的指示。腺病毒载体产生比腺相关病毒更短期的表达(例如，小于约一个月)，在一些实施例中可以显示远远更长期的表达。选择何种载体要根据耙细胞和所要治疗的疾病而定。适当的启动子的选择可以很容易地完成。在一些实施例中，可以使用高表达启动子。适合的启动子的一个实例是763个碱基对的巨细胞病毒(CMV)启动子。劳斯肉瘤病毒(RSV)和MMT启动子也可以使用。某些蛋白可以使用其天然启动子表达。还可以包括其他的增强表达的元件，例如导致高水平表达的增强子或系统，例如tat基因和tar元件。这种盒然后可以插入到载体中，例如质粒载体，如pUC19、pUC118、pBR322或其他已知的质粒载体，该盒包括例如大肠杆菌复制起点。这种质粒载体还可以包括可选择的标记物，例如用于氨苄青霉素耐药性的β-内酰胺酶基因，条件是这种标记物多肽不会不利地影响正在治疗的有机体的新陈代谢。该盒还可以在合成递送系统，例如在WO 95/22618中披露的系统中结合到核酸结合的部分上。

另一种递送方法是使用产生单链DNA的载体，这些载体可以在细胞内生产生表达产物。参见，例如Chen(陈)等人，BioTechniques(生物技术)，34:167-171(2003)，将其通过引用以其全文结合在此。

表达可以通过本领域已知的任何启动子/增强子元件控制，这些元件对表达所选择的宿主是功能性的。除了实例部分中描述的启动子之外，可用于基因表达的其他启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40早期启动子区、包含在劳斯肉瘤(Roussarcoma)病毒的3'长末端重复序列中的启动子、疱疹胸苷激酶启动子、金属硫蛋白基因的调节序列；原核表达载体如β-内酰胺酶或tac启动子；来自酵母或其他真菌的启动子元件，如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；以及显示组织特异性且已用于转基因动物的动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区；在胰岛β细胞中有活性的胰岛素基因控制区、在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区、在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区、在肝中有活性的白蛋白基因控制区、在肝中有活性的甲胎蛋白基因控制区、在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区、在髓样细胞中有活性的β-球蛋白基因控制区、在脑中的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区、和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区。

广泛多样的宿主/表达载体组合可以在表达本发明的核酸序列中采用。有用的表达载体例如可以由染色体、非染色体和合成DNA序列的区段组成。合适载体包括SV40的衍生物和已知细菌质粒，例如大肠杆菌质粒col E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9及其衍生物，质粒例如RP4；噬菌体DNA，例如，噬菌体1的众多衍生物，例如，NM989、及其他噬菌体DNA，例如，M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒例如2μ质粒或其衍生物；在真核细胞中有用的载体，例如在昆虫或哺乳动物细胞中有用的载体；衍生自质粒和噬菌体DNA组合的载体，例如已修饰为采用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒；等等。

如果需要，本发明的多核苷酸还可以与微量递送媒介物例如阳离子脂质体和其他含脂质复合物以及能够介导多核苷酸递送至宿主细胞的其他大分子复合物一起使用。

载体还可以包含进一步调节基因递送和/或基因表达或者以其他方式对靶细胞提供有益特性的其他组分或功能性。这样的其他组分包括，例如，影响与细胞结合或靶向的组分(包括介导细胞型或组织特异性结合的组分)；影响细胞吸收载体核酸的组分；影响吸收后多核苷酸在细胞内的定位的组分(例如介导核定位的试剂)；和影响多核苷酸表达的组分。此种组分还可以包括标记物，例如可以用来检测或选择细胞的可检测和/或可选择的标记物，细胞已经摄取所述标记物并且正在表达由该载体递送的核酸。此类组分可以作为载体(例如使用某些具有或介导结合以及吸收的组分或功能性的病毒载体)的自然特征而提供，或者载体可以被改性为提供此种功能性。其他载体包括例如由Chen(陈)等人，BioTechniques(生物技术)，534:167-171(2003)描述的那些。大量的不同的此类载体是在本领域中已知的，并且总体上是可得的。

载体的传递也可以由外来体介导。外来体是由许多细胞类型释放的脂质纳米囊泡。它们通过在细胞之间转运核酸和蛋白来介导细胞间通讯。外来体含有RNA、miRNA、和来自内吞途径的蛋白。它们可能通过内吞作用、融合、或两者被靶细胞吸收。典型地，内体内容物的接收改变了接受细胞的功能(Lee等人，2012)。

可以利用外来体将核酸递送至靶细胞。在优选的方法中，外来体由生产细胞在体外产生、纯化、并通过电穿孔或通过脂质转染剂装载核酸货物(Marcus和Leonard，2013，Shtam等人，2013)。货物(cargo)可以包括Cas内切核酸酶和一种或多种gRNA的表达构建体。合适的技术可以在Kooijmans等人(2012)、Lee等人(2012)、Marcus和Leonard(2013)、Shtam等人(2013)、或其中的参考文献中找到。用于产生和装载外来体的示例性试剂盒是ExoFect^TM试剂盒(系统生物科学有限公司(System Biosciences,Inc.)，美国加州山景城)。

外来体也可以靶向于特定细胞类型的优先吸收。Alvarez-Ervitti等人(2011)披露了对本发明尤其有用的靶向策略。使用其中披露的技术，外来体可以用狂犬病病毒糖蛋白(RVG)肽修饰。携带RVG的外来体特异地积聚于大脑，尤其是神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞中，其他组织中的非特异性积聚很少。

本发明的表达构建体也可以通过纳米线团的方式递送。纳米线团是一种茧样DNA纳米复合材料(Sun等人，2014)。它们可以装载核酸供靶细胞吸收并释放到靶细胞的细胞质中。在Sun等人(2014)和Sun等人(2015)的文章中可以找到构建纳米线团、装载它们、和设计释放分子的方法。

本发明的基因编辑构建体也可以不通过宿主细胞的诱导表达而通过直接递送递送，即递送Cas核酸酶蛋白，例如Cas9蛋白，加上一种或多种gRNA。外来体是用于直接递送的优选媒介物，因为它们可以同时装载蛋白和RNA(Alvarez-Ervitti等人，2011；Marcus和Leonard，2013)。蛋白装载到外来体中的示例性方法是通过在外来体生产细胞中表达蛋白，所述蛋白为与内体蛋白如乳凝集素的融合物。如前所述，外来体的另一个有利特征是它们对特异性位点如脑的靶向性。可以将gRNA装载到与Cas核酸酶蛋白相同的外来体中，优选地，以Cas/gRNA复合物的形式装载。可以将Cas内切核酸酶和gRNA可替代地装载到单独的外来体中，用于同时或分阶段递送。

基因编辑复合物的直接传递也可以通过纳米线团的方式完成。Sun等人(2015)披露了用于将Cas9/gRNA复合物装载到纳米线团中以吸收和释放到接收细胞中的技术。

直接递送媒介物可以通过合适的途径施用，包括但不限于静脉内、腹膜内、直肠、鞘内、颅内、吸入和口服，包括丸剂形式。

本发明不限于包括Cas9内切核酸酶的CRISPR系统。它还涵盖需要使用任何CRISPR相关内切核酸酶的组合物和方法，所述内切核酸酶能够在通过gRNA指导至PAM位点后切割病毒基因组。实例包括Cpf1家族的内切核酸酶(来自普雷沃菌属和弗朗西丝氏菌属1的CRISPR)(Zetsche等人，2015)。到目前为止，已显示两种Cpf1内切核酸酶在培养的人肾细胞系统中编辑基因是有效的：氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)BV3L6Cpf1、和毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006Cpf1。

Cpf1内切核酸酶扩展了JCV和其他多瘤病毒中可能的靶标范围，因为它们识别与Cas9识别的富含胞嘧啶的PAM不同的PAM。Cpf1识别具有共有序列TTN的富含胸腺嘧啶的PAM，并且该PAM位于靶序列的5'末端。Cpf1由比Cas9系统更小、更简单的gRNA指导。除了包括crRNA和tracrRNA的两个单位的gRNA，或者crRNA和tracrRNA的工程化嵌合杂合体，Cpf1由单个指导RNA(称为gRNA)指导。Cpf1分子也比Cas9分子小。这种更大的简单性和更小的尺寸促进设计和使用CRISPR/Cpf1系统，以及将内切核酸酶组分递送至宿主细胞核。

基于JCV T-Ag基因组中5'TTN序列的3'邻接物，Cpf1的假定靶标序列被披露为预期性实例，即实例2。在实例2中还披露了消除免疫抑制疗法方案期间JCV激活风险的假定方法。因此，本发明涵盖在免疫抑制疗法期间消除受试者中JCV激活风险的方法，所述方法包括以下步骤：向感染JCV的受试者施用有效量的基因编辑组合物，所述组合物包括编码Cpf1的至少一种分离的核酸序列和具有与在JCV DNA中的靶序列互补的间隔子序列的至少一种gRNA；切割JCV基因组中的靶序列；破坏JCV基因组；消除JCV感染；消除JCV病毒激活的风险；并且对受试者施用免疫抑制疗法。

通常如Zetsche等人所描述的合成本发明的gRNA。如Hu等人，2014，和Khalili等人在WO 2015/031775所描述的将gRNA克隆到用于在宿主细胞中表达的载体中，二者均以其全文并入。如Hu等人，2014，和Khalili等人在WO2015/031775中所披露的，通过基因组分析、Surveyor测定、以及病毒感染、激活和表达的测定来筛选用于基因编辑活性的Cpf1/gRNA组合。使用Cpf1/gRNA组合的详细技术包括提出的载体，如先前对于Cas9/gRNA组合的描述。

本发明不限于包括Cas9或Cpf1核酸酶的CRISPR系统，或先前披露的gRNA。本发明涵盖所有通过任何gRNA指导核酸酶消除JCV的方法，所述核酸酶既是现存的也含将来被发现的，所述方法可以根除或破坏JCV复制周期并随后通过PML破坏神经细胞。

ZFN和TALEN组合物和用于消除免疫抑制疗法期间JCV激活风险的方法。

本发明包括ZFN(锌指核酸酶)和TALEN(转录激活子样效应核酸酶)家族的工程化限制酶的组合物。与CRISPR系统不同，这些核酸酶不被gRNA指导到靶位点，而是被工程化成识别特异性靶序列，然后它们与之结合并且进行切割。当切割后接着进行非同源末端连接时，在切割位点发生随机插入或缺失，通常引起受影响基因的功能性敲除。

ZFN是杂合蛋白，其将锌指DNA结合结构域与源自限制性内切核酸酶FokI的核酸酶结构域的DNA切割结构域组合。为了产生双链断裂，施用一对ZFN，它们各自识别不同的12-18个碱基靶序列，靶序列被4-7个碱基对分开，以允许形成活性FokI二聚体。典型地将ZFN编码成用于在靶细胞中表达的质粒、病毒、或其他载体(Urnov等人，2010)。可以通过使用可公开获得的程序如ZiFiT(Sander等人，2010)来设计对JCV基因组中靶序列具特异性的ZFN。

TALEN是含有由一系列33-35个氨基酸重复结构域构成的DNA结合结构域的蛋白，每个结构域都识别单个碱基对。模块化TALEN重复序列可以连接在一起以识别连续的DNA序列。TALEN重复序列可以组合以识别和切割实际上任何所希望的DNA序列(Miller等人，2011)。可以通过使用可公开获得的设计程序，如可免费在线获得的TALE-NT 2.0网络界面(Doyle等人，2012)来设计对JCV基因组中靶序列具特异性的TALEN。

本发明包括所有ZFN和TALEN分子及其现存的或将来要开发的变体，其可用于切割JCV基因组以破坏病毒复制周期并根除病毒。

实例1：CRISPR/Cas9组合物和用于消除JCV的方法，作为与那他珠单抗的共治疗性治疗。

那他珠单抗是一种抗细胞黏附分子α4-整合素的人源化单克隆抗体。在共治疗性治疗方案中，用CRISPR/Cas9药物组合物治疗发现患有潜伏JCV感染的受试者直至感染被消除。然后用那他珠单抗治疗患者，用于治疗多发性硬化症或另一种自身免疫性疾病。

可以通过ELISA针对受试者中JCV感染的存在与否对血液或血清中的抗JCV抗体进行筛选。示例性的ELISA是可从百健公司(Biogen)，剑桥，马萨诸塞州获得的可替代地，可以通过定量PCR分析在体液如脑脊液、血液、或尿液中针对JCV DNA进行筛选。可从Viracor-IBT实验室(利斯萨米特公司(Lee’s Summit)，密苏里州)获得合适的PCR测试。

如果发现受试者感染JCV，则开始共治疗性治疗过程，其中施用药物组合物，所述药物组合物包括编码成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关内切核酸酶的至少一种分离的核酸序列，以及具有与JCV DNA中的靶序列互补的间隔子序列的至少一种gRNA。如前所述，优选的靶序列包括m1、m2、和m3的任何组合。

继续治疗直至消除所有JCV感染的证据，例如通过ELISA或定量PCR确定。在那个点，那他珠单抗疗法开始。那他珠单抗的典型疗程包括每四周在一小时内300mg静脉内输注2.6mg/mL溶液(处方信息)。优选的是，在那他珠单抗治疗过程中以合适的时间间隔重复筛选JCV，以便新的或隐藏的病毒储库的任何再激活可以在PML症状发生之前反应。

有可能使得患有活性JCV感染和症状性PML的受试者可考虑用那他珠单抗治疗。在这种情况下，筛选测试建立了JCV存在的基线。除此之外，该方法如前所述进行，那他珠单抗治疗从解决症状和消除残余JCV两者后开始。

实例2：CRISPR/Cpf1组合物和用于消除JCV的方法，作为与那他珠单抗的共治疗性治疗。

基于JCV T-Ag基因组中5'TTN序列的3'邻接物，Cpf1的假定靶标序列被披露于表2中(作为靶标序列cm1-cm236)。本发明的基因编辑组合物包括与所列靶序列之一互补的至少一种gRNA。本发明的gRNA可以包括或不包括与靶序列的PAM序列互补的序列，其在表2中每个靶序列的5’末端的括号中列出。gRNA可以与所列序列的截短变体互补，例如在3'末端被截短了1、2、3、或更多个核苷酸的序列。gRNA可能与表2中列出的靶序列少于100％的互补。例如，gRNA可以与列出的靶序列95％的互补。gRNA序列可以包括另外的5'和/或3'序列，其可能不与靶序列互补。本发明包括与每个列出的靶序列(未显示)的反义链互补的gRNA、或95％互补的gRNA、或与被截短了1、2、3、或更多个核苷酸的反义序列互补的gRNA。gRNA序列能以多重配置采用，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种不同gRNA的组合。

应当理解，表2仅包括JCV T-Ag基因组中靶序列的代表性样品。JCV基因组其他区中的另外的序列也在本发明的范围内，例如编码VP1、VP2、和VP3以及agnoprotein的区。与不同PAM邻近的任何现有的另外的序列同样在本发明的范围内。

在开始那他珠单抗疗法之前，向需要消除潜伏JCV的受试者施用有效剂量的组合物，所述组合物包括与表2中列出的序列互补的gRNA中的一种或任何组合，以及Cpf1。优选地，如预期性实例1中所述，在合适的药物组合物中将gRNA和Cpf1编码在一种或多种表达载体中。那他珠单抗治疗方案也如实例1中所述。

已经以示例性的方式描述了本发明，并且应理解，已经使用的术语的目的是处于说明性词语的性质，而非限制性的。显而易见地，能够根据以上教导进行本发明的很多修改和变化。因此，应当理解，在所附权利要求的范围内可以用不同于具体描述的方式来实践本发明。

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Claims

1.一种在经受免疫抑制疗法期间消除受试者中约翰坎宁安病毒(JCV)激活风险的方法，所述方法包括以下步骤：

向潜伏感染JCV的受试者施用有效量的指向JCV基因组中的至少一种靶序列的基因编辑组合物；

切割JCV基因组中的该靶序列；

破坏JCV基因组；

消除JCV感染；

消除JCV激活的风险；并且

在选自下组的时间用免疫抑制疗法治疗该受试者，该组由以下组成：施用基因编辑组合物之前、期间或之后。

2.根据权利要求1所述的方法，该方法还另外地包括在所述施用步骤之前，筛选潜伏JCV感染的受试者并验证潜伏JCV感染的存在的步骤。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑组合物被定义为有效量的药物组合物，所述药物组合物包括编码成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关内切核酸酶的至少一种分离的核酸序列，以及具有与JCV DNA中的靶序列互补的间隔子序列的至少一种指导RNA(gRNA)。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述CRISPR相关内切核酸酶选自野生型Cas9、人类优化的Cas9、切口酶突变体Cas9、SpCas9(K855a)、SpCas9(K810A/K1003A/r1060A)、或SpCas9(K848A/K1003A/R1060A)。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述具有与JCV DNA中的靶序列互补的间隔子序列的至少一种gRNA被进一步定义为具有与JCV DNA的大T抗原(T-Ag)编码区中的靶序列互补的间隔子序列的至少一种gRNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述具有与JCV DNA的T-Ag编码区中的靶序列互补的间隔子序列的至少一种gRNA包括具有与T-Ag编码区的TM1区中的靶序列互补的间隔子序列的gRNA、具有与T-Ag编码区的TM2区中的靶序列互补的间隔子序列的gRNA、具有与T-Ag编码区的TM3区中的靶序列互补的间隔子序列的gRNA、或所述gRNA的任何组合。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述具有与TM1区中的靶序列互补的间隔子序列的gRNA是gRNA m1，所述具有与TM2区中的靶序列互补的间隔子序列的gRNA是gRNA m2，且所述具有与TM3区中的靶序列互补的间隔子序列的gRNA是gRNA m3。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑组合物被定义为药物组合物，所述药物组合物包括编码来自普雷沃菌属和弗朗西丝氏菌属1内切核酸酶1(Cpf1)的CRISPR的至少一种分离的核酸序列和具有与JCV DNA中的靶序列互补的间隔子序列的至少一种gRNA。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种gRNA包括具有与选自下组的靶序列互补的间隔子序列的至少一种gRNA，该组由以下组成：SEQ ID NO:14-SEQ ID NO:249、或其任何组合。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑组合物被定义为药物组合物，所述药物组合物包括靶向JCV基因组的至少一种核苷酸序列的至少一对锌指核酸酶(ZFN)。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑组合物被定义为药物组合物，所述药物组合物包括靶向JCV基因组的至少一种核苷酸序列的至少一种转录激活子样效应核酸酶(TALEN)。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑组合物由包括在至少一种表达载体中的至少一种分离的核苷酸序列编码。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述至少一种表达载体选自下组，该组由以下组成：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、水疱性口炎病毒(VSV)载体、痘病毒载体、和逆转录病毒载体。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫抑制疗法被进一步定义为用选自贝伦妥单抗-维多汀、利妥昔单抗、那他珠单抗、芬戈莫德、依法珠单抗、维多珠单抗、富马酸二甲酯、贝拉西普、他克莫司、西罗莫司、糖皮质激素、甲氨喋呤、硫唑嘌呤、环孢菌素、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、吗替麦考酚酯、达利珠单抗、和英夫利昔单抗的组合物进行的治疗。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑组合物是一种argonaute蛋白。

16.一种用于从感染约翰坎宁安病毒(JCV)的宿主细胞中消除JCV的药物组合物，所述组合物包含：

编码来自普雷沃菌属和弗朗西丝氏菌属1内切核酸酶1(Cpf1)的CRISPR的至少一种分离的核酸序列，以及

具有与JCV DNA中的靶序列互补的间隔子序列的至少一种gRNA，

所述分离的核酸序列被包括在至少一种表达载体中。

17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述至少一种gRNA包括具有与选自下组的靶序列互补的间隔子序列的至少一种gRNA，该组由以下组成：SEQ ID NO:14-SEQ ID NO:249、及其组合。

18.一种用于从感染约翰坎宁安病毒(JCV)的宿主细胞中消除JCV的药物组合物，所述组合物包含编码至少一种转录激活子样效应核酸酶(TALEN)的至少一种分离的核酸序列，所述转录激活子样效应核酸酶靶向JCV基因组的至少一种核苷酸序列，所述分离的核酸序列被包括在至少一种表达载体中。

19.一种用于从感染约翰坎宁安病毒(JCV)的宿主细胞中消除JCV的药物组合物，所述组合物包含编码至少一种锌指核酸酶(ZFN)的至少一种分离的核酸序列，所述锌指核酸酶靶向JCV基因组的至少一种核苷酸序列，所述分离的核酸序列被包括在至少一种表达载体中。

20.一种用于从感染约翰坎宁安病毒(JCV)的宿主细胞中消除JCV的药物组合物，所述组合物包含编码至少一种argonaute蛋白的至少一种分离的核酸序列，所述argonaute蛋白靶向JCV基因组的至少一种核苷酸序列，所述分离的核酸序列被包括在至少一种表达载体中。