CN108463218A

CN108463218A - 减弱寄生虫毒性的方法

Info

Publication number: CN108463218A
Application number: CN201680069479.1A
Authority: CN
Inventors: L·M·席尔瓦; M·M·迪亚斯莫塔
Original assignee: Institute Of Drug Molecules
Current assignee: Institute Of Drug Molecules
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2018-08-28
Also published as: WO2017055925A2; WO2017055925A3; EP3355876A2; US20190054096A1

Abstract

本发明介绍了治疗疟疾的药物组合物和方法。该组合物和方法可以靶向疟疾寄生虫即疟原虫、寄生虫宿主细胞或两者的能量感应路径。在本发明的某些方面，该组合物靶向信号传导路径，信号传导路径涉及宿主AMP‑蛋白激活的激酶(AMPK)和/或寄生虫AMPK同系物KIN，其控制寄生虫的复制和毒性。

Description

减弱寄生虫毒性的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求了2015年9月30日提交的美国申请号62/234,808的优先权以及于2015年9月30日提交的美国申请号62/234,811的优先权。

技术领域

用于减弱细胞内寄生虫增殖的能量依赖性机制。

背景技术

寄生虫需要宿主才能存活。因此，它们还必须具有感知和响应其宿主营养状况的机制，营养状况不仅决定了营养的可用性，而且还反映了宿主环境的质量和生活力。疟原虫(Plasmodium)是疟疾的致病因子，是一种迅速繁殖的原生动物寄生虫，其在脊椎动物和蚊子寄主中经历复杂的发育生命周期。在哺乳动物的血液中，疟原虫寄生虫通过在红细胞(RBC)内分裂生殖来入侵并复制，每1-3天产生10-30个新的裂殖子(merozoites)，这取决于物种。疟原虫裂殖子新的RBC感染的持续循环最终导致与疟疾相关的症状、发病和死亡，这可能在疾病发展期间改变宿主环境。由于快速增殖需要充足的营养供应，疟原虫寄生虫必须适当分配这些营养以保证存活和传播。

疟原虫用于感知和响应营养需求变化的机制和信号传导机制可以成为有效的化学预防疟疾的目标。因此，以下段落描述了治疗疟疾的新方法，该方法利用疟原虫寄生虫使用的机制，以对其毒性产生显著影响的方式来快速调节营养波动，从而影响感染过程和疾病发作过程。

发明内容

本发明涉及用于减弱细胞内寄生虫增殖的方法和组合物。通常，这些方法和组合物上调5'AMP-激活的蛋白激酶(AMPK)活性，从而模拟寄生虫或宿主细胞中(AMP:ATP)比值的波动引起的AMPK的自然激活。

在本发明的各个方面，本发明的方法和组合物通过用AMPK激活剂激活寄生虫的能量感应路径，以在卡路里限制进食(calorie-restricted diet)下模拟AMPK活性在抑制寄生虫增殖中的天然作用来减弱疟原虫寄生虫的增殖。在本发明的另一个相似方面，本发明的方法和组合物通过用AMPK激活剂激活宿主细胞的能量感应路径来减弱疟原虫寄生虫的增殖。本发明的前述方面对于减弱所有疟原虫物种的增殖都是有效的，包括在人体中与疟疾相关的所有物种：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodiumvivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)，三日疟原虫(Plasmodium malariae)和诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)。

附图说明

图1举例说明了通过卡路里限制(CR)来减弱疟原虫的毒性，示出了自由采食(AL)对照组和CR组(n＝10只小鼠/组)中伯氏疟原虫(P.berghei)感染的C57BL/6小鼠的存活率。感染前2-3周及感染后，相对于自由采食(AL)对照组消耗的食物，每天给予CR组的小鼠60-70％的食物。通过腹腔注射1×10⁶红细胞来感染小鼠，红细胞用伯氏疟原虫感染。数据代表两个独立的实验。****P<0.0001。

图2举例说明了CR进食对伯氏疟原虫肝脏阶段感染的结果的改变。该图示出了C57BL/6小鼠中感染的红细胞(寄生虫血症的量度)的百分比，C57BL/6小鼠用新鲜解剖的孢子体感染并保持在AL或CR进食组中。在72h.p.i通过流式细胞仪分析GFP表达的寄生虫来获得数据。示出了来自两个独立实验(≥8只小鼠/组，每个点代表一只动物)的数据。**P<0.01。

图3举例说明了伯氏疟原虫血液阶段感染过程中寄生虫生长速率的降低。数据来自从C57BL/6小鼠尾部收集的血液，C57BL/6小鼠用伯氏疟原虫感染的1×10⁶个红细胞来感染。通过流式细胞术每天监测寄生虫血症的进展。数据代表来自两个独立实验(10只小鼠/组)的平均值±标准误差(mean±sem)。****P<0.0001。

图4举例说明了CR和CR-模拟化合物对AMPK的激活。蛋白质印迹分析(Westernblotanalysis)肝脏匀浆，肝脏匀浆来自AL和DR进食组中(顶部图)未感染的小鼠和注射水杨酸盐或载体1小时(底部小图)后未感染的小鼠。泳道号1-3与来自单个小鼠的肝脏匀浆相关。用抗-磷酸AMPKα(pAMPKα^T172)和抗-肌动蛋白抗体检测代表性印迹。

图5举例说明了AMPK激活化合物减少了伯氏疟原虫肝脏阶段感染。示出了C57BL/6小鼠的相对寄生虫血症，C57BL/6小鼠用新鲜解剖的伯氏疟原虫孢子体感染，并用水杨酸盐或二甲双胍处理，或保持在对照条件下。在感染前一小时，每天通过腹腔注射给药水杨酸盐(300mg/Kg)。在感染前一周或感染期间，在饮用水中提供二甲双胍(500mg/Kg)。(≥10只小鼠/组；每个点代表一只小鼠)。***P<0.001；****P<0.0001。

图6举例说明了用AMPK激动剂处理保护伯氏疟原虫感染的小鼠免于严重的疟疾，使得小鼠存活率提高。如图5所示，感染和处理C57BL/6小鼠(≥10只小鼠/组；p<0.05)。

图7A举例说明了伯氏疟原虫野生型(wt)、Δkin和补充的Δkin(Δkin+kin)寄生虫的每个分节裂殖体(schizont)中的裂殖子的数目的显微镜分析和定量。允许血液阶段寄生虫在体外补充有AL和CR血清的培养基中成长24小时成为裂殖体。在疟原虫寄生虫中，KIN是AMPK同系物。****P<0.0001。

图7B举例说明了在CR-模拟化合物、水杨酸盐(625μM；底部图)存在下，寄生虫复制减少。****P<0.0001。

图8举例说明了伯氏疟原虫寄生虫中由CR进食诱导的全局转录变化。该图表示伯氏疟原虫wt和Δkin同步的寄生虫的RNA测序分析，伯氏疟原虫wt和Δkin同步的寄生虫收集自重新入侵后10小时AL和CR喂养的小鼠(3只小鼠/组)。在该图中，浅灰色代表与AL小鼠相比在CR中不改变表达的寄生虫基因。对于野生型寄生虫(左)，灰色的浅黑色和黑色阴影分别突出显示了CR中诱导的和抑制的基因(绝对倍数变化大于2)。在Δkin图(右)中突出显示了相同的基因，但没有差异表达。数据表明KIN是介导转录的寄生虫响应CR的卡路里营养传感器。

图9举例说明了CR-模拟化合物对人恶性疟原虫(P.falciparum)血液阶段的剂量依赖性作用。将同步的培养物设定为0.1％初始寄生虫血症，用各种化合物处理，在处理72小时或96小时后，用SYBR Green标记寄生虫DNA，通过流式细胞术分析。将每个实验(3-5个独立实验/化合物)的数据(平均值±标准偏差)与未处理的对照组进行归一化。使用非线性回归变量斜率(归一化)分析，通过GraphPad Prism确定IC50值。计算的IC50值如下：水杨酸盐(sal)，1.3mM；二甲双胍(met)，868μM；A769662，71μM；白藜芦醇(rsv)，32μM；SRT1720，786nM。在处理后72小时收集rsv和SRT1720的数据，在处理后96小时收集其他化合物的数据。

具体实施例

本文描述了减弱细胞内寄生虫增殖的方法和组合物。更具体地，在各个实施例中，公开的发明的方法和组合物激活寄生虫或宿主或两者的能量感应路径。根据本发明，能量感应路径的激活可以通过直接或间接的细胞信号传导机制发生。在各个实施例中，通过直接或间接激活寄生虫宿主细胞中的5'AMP-激活的蛋白激酶(AMPK)，继而激活AMPK-依赖性能量感应路径，本发明的方法或组合物减弱寄生虫生物体的增殖。因此，应当理解，在各个实施例中，寄生虫宿主中AMPK的激活或寄生虫中AMPK同系物的激活，模拟细胞中(AMP：ATP)比值的波动引起的AMPK活性的自然上调，这继而导致寄生虫的复制减少。

在此还应理解，通过本发明的AMPK激活剂激活寄生虫宿主细胞中的AMPK信号传导或激活寄生虫AMPK同系物的信号传导，可以直接和/或间接激活减弱寄生虫增殖的信号传导路径。在各个其它实施例中，通过本发明的AMPK激活剂激活寄生虫宿主细胞中的AMPK信号传导或激活寄生虫AMPK同系物的信号传导，同时介导信号传导路径的直接和间接激活，该信号传导路径减弱寄生虫增殖。另外，本发明的方法适于寄生虫生命周期的所有阶段。

在各个实施例中，本发明的方法减弱属于疟原虫属的寄生虫的增殖。因此，在一个实施例中，用一定量的AMPK激活剂使AMPK激活剂与疟原虫寄生虫感染的宿主细胞接触，该一定量的AMPK激活剂有效地直接或间接激活AMPK-或AMPK同系物-、依赖性信号传导路径，该信号传导路径介导减弱疟原虫的增殖，或者更具体地，复制。例如，本发明的方法适于至少减弱恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫。另外，如上所述，本发明的方法适于在疟原虫寄生虫的发育和生命周期的各个阶段减弱疟原虫寄生虫。例如，在各个实施例中，本发明的方法在疟原虫寄生虫的血液阶段减弱疟原虫寄生虫，而在其他实施例中，本发明的方法在疟原虫寄生虫的肝脏阶段减弱疟原虫寄生虫。

如上所述，本发明各种实施的方法适于激活宿主AMPK和寄生虫AMPK-同系物。例如，在各个实施例中，通过激活伯氏疟原虫AMPK同系物(如KIN，推定的丝氨酸/苏氨酸激酶，其控制复制和毒性)，本发明的方法减弱疟原虫物种的增殖。KIN由与桑格研究院(SangerInstitute)的GeneDB标识符PBANKA_1318000相关的多核苷酸序列和(SEQ.ID.NO.1)编码。在各个实施例中，通过本发明的AMPK激活剂直接或间接激活KIN激活了减弱寄生虫增殖的寄生虫信号传导路径。在一些实施例中，通过介导多肽T环中高度保守的苏氨酸(对应于伯氏疟原虫KIN多肽的氨基酸位置616)的磷酸化，通过AMPK激活剂激活KIN。在此应当理解，本发明的方法包括在任何疟原虫物种(包括与人宿主相关的所有疟原虫寄生虫，例如但不限于恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫)中激活KIN。

如本文所用，“AMPK激活剂”是指直接或间接激活AMPK的化合物或其药学上可接受的盐或生物制剂。AMPK激活剂还包括刺激一种或多种路径从而导致AMPK激活的活性剂。

本发明的组合物包含的AMPK激活剂包括但不限于噻吩并吡啶酮衍生物(thienopyridone derivatives)(在WO2009135580、WO2009124636、US20080221088和EP1754483中列举)、咪唑衍生物(在WO2008120797、EP2040702中列举)、噻唑衍生物(在EP1907369中列举)、胍及其衍生物(山羊豆碱(galegine)、双胍和噻唑烷二酮)及其药学上可接受的盐。合适的双胍包括丁双胍、苯乙双胍和二甲双胍及其药学上可接受的盐。

本发明的方法包含的合适的天然产物衍生的AMPK激活剂包括但不限于噻唑烷酮类(Thiazolidinones)(包括环格列酮、MCC-555、利格列酮(rivoglitazone)、曲格列酮(troglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)和匹格列酮(pioglitazone)及其药学上可接受的盐)、脂联素、瘦蛋白(Leptin)、睫状节神经细胞营养因子(Ciliary NeurotrophicFactor)(CNTF)、饥饿激素(Ghrelin)、水杨酸盐、α-硫辛酸(alpha-lipoic acid)、生物碱类和苦瓜提取物。

其它合适的AMPK激活剂包括植物多酚，例如白藜芦醇、诺卡酮、葫芦烷型三萜(cucurbitane triterpenoid)、苦瓜甙A(momordicoside A)、甘密脂素Bnectandrin(nectandrin B)、obovatol、光甘草定、damulin B、槲皮素、人参皂甙、姜黄素、小檗碱、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)、茶黄素、高车前素及其药学上可接受的盐。

本发明还包括药物组合物激活寄生虫或宿主细胞信号传导路径的用途，该细胞信号传导路径介导降低寄生虫复制速率，从而为宿主提供时间和机会来对抗寄生虫。因此，本发明的方法还涉及提供有效的药物活性剂，其适于短期和长期的预防和治疗。

本文所用的术语“治疗”意指治愈性/治疗性治疗和预防性治疗。本文所用的术语“治愈性和治疗性”意指通过治疗已经出现的疾病(例如疟疾)来恢复健康的功效。然而，本文所用的术语“预防性(prophylactic)”或“预防(prevention)”是指预防疟疾的发作或复发，旨在通过预防不良影响来维持健康。本文所用的术语“受试者”是指人或非人动物，包括动物。

在各个实施例中，减少或抑制疟原虫物种生长的方法包括使物种与有效量的疟原虫KIN或AMPK激活化合物或其药学上可接受的盐或包含其的组合物接触。在该实施例中，KIN或AMPK激活化合物或其药学上可接受的盐或包含其的组合物在上文中描述为KIN或AMPK激活化合物或包含其的组合物。

在其他实施例中，减少或抑制疟原虫物种生长的方法包括使寄生虫宿主细胞与有效量的AMPK激活化合物或其药学上可接受的盐或包含其的组合物接触。在该实施例中，AMPK激活化合物或其药学上可接受的盐或包含其的组合物在上文中描述为AMPK激活化合物或包含其的组合物。

根据本发明治疗疟疾的方法的另一个方面是，治疗(即本文所述的药物组合物)可以在寄生虫的肝脏或血液生长阶段削弱疟原虫生长，从而允许活性剂更特异性地针对寄生虫。因此，在某些实施例中，根据本发明的疟疾治疗在发育的肝脏阶段削弱疟原虫的生长，而在其它实施例中，其在发育的血液阶段或两者(发育的肝脏阶段和发育的血液阶段)削弱疟原虫的生长。

本发明的药物组合物的治疗有效量取决于许多因素，包括生物活性、给药方式、治疗频率、同期治疗的类型(如果有的话)、年龄、体重、性别、总体健康状况、待治疗的疟原虫感染的严重程度，以及适当的药代动力学性质。在各个实施例中，根据本发明的治疗方法有效治疗由物种(恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫)引起的疟原虫感染。

给药和剂型：在本发明的各个实施例中，药物组合物包括药物活性AMPK激活剂。例如，在某些此类实施例中，药物组合物包含二甲双胍、水杨酸盐或白藜芦醇。在另一些此类实施例中，单一的药物组合物包含至少两种药物活性AMPK激活剂。本文所用的术语“药物组合物”是指固体或液体组合物、药物活性成分(例如二甲双胍)和至少一种载体、稀释剂或赋形剂，其中所有成分的给药量通常是生物学所需的。

本发明的药物组合物可以通过药物制剂领域已知的方法制备，例如，参见雷明顿的药物科学，第22版，(制药出版社，2012)(Remington's Pharmaceutical Sciences,22ndEd.,(Pharmaceutical Press,2012))，其通过引用并入本文。在固体剂型中，本发明的化合物可以与至少一种药学上可接受的赋形剂混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙或(a)(a)填充剂或膨胀剂(extenders)，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；(b)粘合剂，诸如，例如纤维素衍生物、淀粉、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，诸如，例如甘油；(d)崩解剂，诸如，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、交联羧甲基纤维素钠、复合硅酸盐和碳酸钠；(e)溶液缓凝剂，诸如，例如石蜡；(f)吸收促进剂，诸如，例如季铵化合物；(g)润湿剂，诸如，例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯、硬脂酸镁等；(h)吸附剂，诸如，例如高岭土和膨润土；及(i)润滑剂，诸如，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠或其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况中，剂型还可以包含缓冲剂。

本发明的药物组合物也可以使用药物制剂领域已知的药学上可接受的佐剂，包括但不限于防腐剂、润湿剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)可以确保抑制微生物的活动。还可以包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。如果需要，本发明的药物组合物还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、抗氧化剂等，诸如，例如柠檬酸、山梨醇酐月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基羟基甲苯等。

上述固体剂型可以制备成具有包衣和外壳，例如肠溶衣和其他，如制药领域已知的那样。它们可以包含安慰剂，并且可以是这样的组合物，即它们以延迟的方式将一种活性化合物或多种活性化合物释放到肠道的某个部分。可以使用的嵌入组合物的非限制性实例是聚合物和蜡。如果合适，活性化合物也可以是具有一种或多种上述赋形剂的微胶囊形式。

除活性化合物外，悬浮液可以包含悬浮剂，诸如，例如乙氧基异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏铝氢氧化物(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂和黄蓍或这些物质的混合物等。液体剂型可以是水性的，可以包含有药学上可接受的溶剂以及本领域已知的传统液体剂型赋形剂，其包括但不限于缓冲剂、调味剂、甜味剂、防腐剂和稳定剂。

实例

实例1宿主进食影响存活和寄生虫负载。允许C57BL/6小鼠(5-8周龄，体重20-28g)自由进食水和食物，或置于卡路里限制(CR)组。相对于自由采食对照组(AL)消耗的食物，每天给予CR组小鼠60-70％的食物。两组的食物摄入量每天测量一次，且每周至少测量3次体重。当达到15 20％体重损失时，调整分配给CR小鼠或大鼠的每日食物量以稳定较低的体重，用于剩余的实验阶段。通过皮内(i.d.)注射5×10³新鲜解剖的伯氏疟原虫孢子体(图2)或通过腹腔(i.p.)注射10⁶个伯氏疟原虫感染的红细胞来感染小鼠，伯氏疟原虫感染的红细胞通过先前C57BL/6小鼠传代获得(图3)。每笼饲养3-5只小鼠。

与对照AL小鼠相比，在CR动物中，感染导致肝脏阶段感染显著降低，并且抑制了无性血液阶段寄生虫血症。在伯氏疟原虫血液阶段感染5-6天后，AL喂食的小鼠体重损失并死于严重的疾病，而CR小鼠存活且只有轻微的体重变化，并且寄生虫血症随时间缓慢增加，参见图1-3。通过流式细胞术分析(BD或BD)在PBS中的一滴尾血(来自C57BL/6小鼠，其用表达GFP的伯氏疟原虫寄生虫感染，并保留在AL或CR进食组中)来测定寄生虫血症。随后进行分析，参见图2和3。获得的总事件数量在10-20万之间。基于其尺寸，首先在FSC和SSC上门控，然后在FITC(绿色)和PE(红色)通道上选择受感染的红细胞。在FITC通道中检测到表达GFP的寄生虫。通过绘制抗PE的FITC来消除假GFP阳性细胞(红细胞的自体荧光)。

实例2AMPK激活化合物模拟CR-介导的AMPK激活。蛋白质印迹分析肝脏匀浆中的AMPK磷酸化，肝脏匀浆来自AL和DR进食组中未感染的C57BL/6小鼠以及注射水杨酸盐或载体一小时后未感染的小鼠，参见图4。将肝脏在冰冷的裂解缓冲液(50mM HEPES、150mMNaCl、10mM NaF、1mM焦磷酸钠、0.5mM EDTA、1mM DTT、1％辛基酚聚乙二醇醚(triton)、1mMNa₃VO₄、250mM蔗糖、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂)中匀浆。根据生产商的说明，通过Bradford法(Bradford Assay)(Bio-Rad)测量每个匀浆中的总蛋白含量。将50μg的总肝脏裂解物溶解在8％SDS-PAGE或Any kD^TM 预制凝胶(Bio-Rad)中，并使用具有1×Tris-甘氨酸缓冲液(含有20％甲醇)的标准湿转移器转移至硝酸纤维素膜，在100V恒定电压下保持2小时，或使用凝胶转移栈(gel Transfer Stacks)(赛默飞(ThermoFisher))转移。在室温下将膜在5％BSA TBS吐温(TBSTween)0.2％中封闭1小时，并与初级抗体在4℃孵育过夜。

使用兔抗-磷酸-AMPKαT172(anti-phospho-AMPKαT172)(mAb 40H9，1:1000，细胞信号科技公司(Cell Signaling Technology))(在4℃孵育过夜)检测pAMPK。使用抗肌动蛋白(1：1000，Sigma-Aldrich A2066)兔抗体作为负载对照(在室温下孵育1小时)。辣根过氧化物酶(HRP)连接的山羊抗兔IgG、Fc片段特异性和HRP连接的山羊抗小鼠IgG、轻链特异性(均来自杰克逊免疫研究中心(Jackson ImmunoResearch))用作第二抗体。

实例3通过AMPK激活化合物减少疟原虫肝脏阶段感染。用新鲜解剖的伯氏疟原虫孢子体感染C57BL/6小鼠72小时后(hours post infection h.p.i.)，对于水杨酸盐或二甲双胍处理，或维持在对照条件下，未处理条件下的小鼠，通过流式细胞术分析(如实例1中所述)C57BL/6小鼠中的相对寄生虫血症。在感染前一小时，通过腹腔注射每天给药一次水杨酸盐(300mg/Kg，Sigma号71945)。在感染前一周和感染期间，在饮用水中提供二甲双胍(500mg/Kg，Sigma号D150959)。结果见图5。

实例4用AMPK激动剂处理的寄生虫感染的小鼠的存活率提高。为了确定AMPK激活剂、水杨酸盐和二甲双胍对寄生虫感染后15天内动物的存活率的影响，通过皮内(i.d.)注射5×10³个伯氏疟原虫孢子体感染C57BL/6小鼠。在感染前一小时，通过腹腔注射每天给药一次水杨酸盐(300mg/Kg，Sigma号71945)。在感染前一周和感染期间，在饮用水中提供二甲双胍(500mg/Kg，Sigma号D150959)。结果见图6，表明用AMPK激活剂处理的小鼠的存活率明显增加。

实例5AMPK同系物、KIN调节疟原虫寄生虫的CR效应。通过减少每个周期中子代裂殖子的数量，伯氏疟原虫寄生虫野生型响应CR。通过比较，缺乏kin基因(Δkin)的寄生虫无法响应CR并产生与野生型寄生虫相当的裂殖子数量，在AL和CR组中都是如此。通过将kin基因重新引入Δkin寄生虫系可以获得CR效应表型，参见图7A。类似地，尽管野生型和补充的Δkin在AMPK激动剂水杨酸存在下减少复制，但Δkin寄生虫对药物无响应，参见图7B。

伯氏疟原虫血液阶段寄生虫在体外仅可以维持一个发育周期(20-24h)，其中环状形式发育为成熟裂殖体，而没有爆裂。受感染的血液从活体感染获得，主要包含1-3％寄生虫血症的环状阶段形式。将寄生虫在RPMI1640培养基(含有25mM HEPES、0.05mg/ml庆大霉素或青霉素/链霉素(全部来自Gibco/Invitrogen))中培养于96孔板中。用收集自AL或CR进食组动物的25％小鼠血清补充培养基。对于药物测试，培养基补充有25％胎牛血清。在5％O₂、5％CO₂、90％N₂中于37℃孵育24h后，制作血液涂片并用吉姆萨(Giemsa)染色。然后使用光学显微镜和ImageJ(http://rsbweb.nih.gov/ij/)评估每个裂殖体的寄生虫发育和裂殖子的数量。只评分具有明显分离的裂殖子的成熟裂殖体(节体(segmenters))。

实例6由CR进食诱导伯氏疟原虫寄生虫的全局转录变化。进行伯氏疟原虫野生型和Δkin寄生虫的RNA测序分析。分析表明，与AL相比，CR进食组中野生型寄生虫中大约600个基因的显著差异转录，而两种进食组的Δkin寄生虫中没有观察到差异基因表达，参见图8。这些数据表明KIN是介导寄生虫响应CR的卡路里营养传感器。

实例7CR-模拟化合物对人恶性疟原虫血液阶段的剂量依赖性作用。将恶性疟原虫寄生虫系3D7的同步培养设定为0.1％初始寄生虫血症，用各种化合物处理，并在处理后72小时或96小时用SYBR Green标记寄生虫DNA，通过流式细胞术分析。计算的IC₅₀值如下：水杨酸盐(sal)，1.3mM；二甲双胍(met)，868μM；A769662A769662(Calbiochem)，71μM；白藜芦醇(rsv)，32μM；SRT1720，786nM。在处理后72小时收集rsv和SRT1720的数据，在处理后96小时收集所有其他化合物的数据，参见图9。

在补充有0.5％Albumax II(Invitrogen)、200mM次黄嘌呤(Sigma)和20μg/ml庆大霉素(Invitrogen)的RPMI 1640中，在4％血细胞比容的人红细胞中连续培养恶性疟原虫3D7。将培养物保持在37℃及5％O₂、5％CO₂、90％N₂的气氛中，并通过5％山梨糖醇(Sigma)连续处理进行同步。对于剂量响应分析，将化合物的连续稀释液加入到96孔板中恶性疟原虫的同步环状阶段。初始寄生虫血症设定为0.1％，红细胞比容为2％。基于恶性疟原虫DNA的荧光标记，通过流式细胞术在指定时间评估寄生虫复制和再入侵(reinvasion)。在SL Blue或BD流式细胞仪上分析SYBR Green I(Invitrogen)染色的样品，并使用FlowJo软件(TreeStar)评估数据，以确定感染的红细胞的百分比。使用GraphPadPrism计算IC50的值。

序列表

<110> 药物分子研究所

<120> 减弱寄生虫毒性的方法

<130> 131.0001-WO01

<150> US 62/234,808

<151> 2015-09-30

<150> US 62/234,811

<151> 2015-09-30

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2888

<212> DNA

<213> 伯氏疟原虫

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(2888)

<300>

<308> PBANKA / 1318000

<309> 2015-01-23

<313> (1)..(2888)

<400> 1

atgataaata ttggcaatgc tattaaaaag acacatttgc ctaagaaaga aaaaaaacgt 60

gtctctaaaa ttttgctaag taaaaataga atagaaaata atattttttg taggaacaat 120

aaacttgaaa aagaccacct agaaataaag aatacaaata gaaatataga atatcaattt 180

caacctgtaa aaactaataa aacatatagt attaataaaa aggttataag taataaaata 240

aacaatgaag agttgtatat aaaaaaagaa ggccacgcaa cctttcacat gaatactgac 300

ataagagaaa aagatataaa taatatattg atgcattcta atgttactac aacaaatttt 360

aacagtgacc ctattactag tacctcccaa aaatgctcgt ctaaaaaaag aatatgtaaa 420

catgctccta taaataaaaa attagattcc aataaagaaa atttcgaatc atatacaaat 480

aatgcacaag gcgattttgg aaactttccc cgatttttaa gaaaatttga aaaaataaaa 540

agaaatcccc caattgaaca tagtaatgtg cataaaaacg taggaaaagg taaaaaaaat 600

gaaatttata agaccaccaa aaattatgaa agcttacaaa ataataccaa tagaaaaatt 660

tatcaaaatt gtaaaaacca ttatatagga ggcattttta ataaaatcga aaaattaaaa 720

agggataact atcctattat ggcaccatca aattttaaaa ataaaaataa attaatcagc 780

aatcattcat taaaatatga atataccaag gaatggaatg aggaagaaaa taaaaataat 840

gataatgcac aaggggatga atttaaaaaa gaagaaaaaa atagttctaa taaagatgct 900

tattcaagat atataaagaa aaaaaaatgg attaattcag atactattga aagaattata 960

tccaaaaata gccaacctga tgaacaggta aaaagaaatc caaacgaaaa tattcccaaa 1020

aatgatattc caataataga agtttcacaa tggaaagtat ttcctgatgt tatatcccaa 1080

ttgggtgcac ctctcataga agcatctaat tttgaagcac cattacacaa gccaacaaaa 1140

tgtgctgctt cttccaactt ttcatacaag ttatcagaaa atttttcagg cacactttca 1200

acaaaattag aatgggatga aaatgaaatt ttgaaaaatg ggaaaactaa gaaaaaaaaa 1260

aacgaattag acggggttga agaacatgat tatacaattc gaaatacctc gatcacacct 1320

gcgtataaac aatataaaat aataatcata aaaagcaata acatagaagt agggaactac 1380

ataataataa aaaatatagg gaaaggtacg tttggaaagg tgtgtctagg aatgcataca 1440

tatacatacg aaatagttgc aataaaaata ttaaataaga aaaaattatt acgtataatt 1500

agttatgata aaatattaag ggaaataaaa atccataaaa aaatagatca taatcatata 1560

tgtcgttttt atgaagtaca tgaaaataaa aataatatat atatgatatt agaatattta 1620

ggaaatggag atttattaac atatatatgt aaaaatagta atataaatga aaacattgcg 1680

aaaaggatat tataccaatt aataagtgct atagaatatt tacataaaat aaatatagta 1740

catagagatt taaaaccaga aaatatatta ctggatcata ataataatat taaattaatt 1800

gattttggtt tgtcaacaat atatagtaaa aataattttt tacaaacatc atgtggatcc 1860

cctttttata cacctccaga aatactgtta ggaaagaaat acaatcctga attaacagat 1920

gtctggtctt taggtataat ccttttttta ttactcaata aaaaattgcc atttaatcat 1980

aatgacataa ataaattatt tcaacaaatt ataaaaggat taatgcaatt cgaaccccat 2040

gtgtccataa acgcaaaaaa ccttattcaa aatatgctca atgtaaattg taaaaataga 2100

tataatttaa atcagatcaa aaatcatata tggttttcta actataatgc taaaaaggat 2160

gtatacttaa attgtcatca agtatgcaat ttaatggatt gtaatacttg catatatata 2220

catataatta aaaccagtaa atattataac aattttttaa ttaatagaat aaataaaata 2280

tacaacatag ataaaactat gatattaaaa gaattaaaaa atgaagaaca aaattgtatt 2340

aaaacaacat actatctttt gctgaacaaa atggttaaga ttttatcaaa aactaattac 2400

ttatattcgc attatatttt tataaaaaaa gaaacagatt cagaaatctt aatttctgat 2460

gatgattctc gatctattag tttaaaggat aatcatggat cctctaattt tacaccattt 2520

aataatttag gaattttcaa ttttttgatc tttcaaaaat tcaaaaccat gcaccaaaag 2580

aataccatgc taatcgaatg aaaaatcgaa acaatggaat tagtgaagat atagaacaaa 2640

ttaatacaca caatttatta ctattgcaac gaaaagaaaa gtataatata tttcatataa 2700

ataaaacaca agtatcaaca aattgttacc attacaaaca accaaaatgt agattaatta 2760

aaaatcaaag aaaagactcg ttattttctg acaaacgagg tagtatcaac aatcctaaaa 2820

aatgtatcat taaccctgat aaagtgctta aagaaaatat agataaaaag aaaattaaca 2880

aaatataa 2888

Claims

1.减弱宿主细胞中疟原虫生物体增殖的方法，包括使宿主细胞与有效量的5'AMP-激活的蛋白激酶(AMPK)激活剂接触，其中宿主细胞中AMPK激酶活性的激活减弱疟原虫生物体的增殖。

2.减弱疟原虫生物体增殖的方法，包括使疟原虫生物体与有效量的AMPK激活剂接触，其中疟原虫AMPK同系物激酶活性的激活减弱疟原虫生物体的增殖。

3.治疗个体疟原虫感染的方法，包括向个体给药有效量的5'AMP-激活的蛋白激酶(AMPK)激活剂，其中疟原虫感染的宿主细胞中AMPK的激活减少疟原虫寄生虫复制。

4.治疗个体疟原虫感染的方法，包括向个体给药有效量的5'AMP-激活的蛋白激酶(AMPK)激活剂，其中疟原虫AMPK同系物的激活减少疟原虫寄生虫复制。

5.根据权利要求2或权利要求4所述的方法，其中所述疟原虫AMPK同系物是KIN。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在疟原虫感染的肝脏阶段或血液阶段减少疟原虫寄生虫增殖。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中AMPK激活剂激活在营养限制条件下自然上调的能量感应路径。

8.根据权利要求7所述的方法，其中AMPK激活剂直接激活能量感应路径。

9.根据权利要求7所述的方法，其中AMPK激活剂间接激活能量感应路径。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中AMPK激活剂是胍、双胍、噻唑烷二酮、水杨酸盐或植物多酚。

11.根据权利要求10所述的方法，其中AMP-激活剂是双胍。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述双胍是丁福明、苯乙双胍、二甲双胍或其药学上可接受的盐。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述双胍是二甲双胍或其药学上可接受的盐。

14.根据权利要求10所述的方法，其中AMPK激活剂是水杨酸盐。

15.根据权利要求6所述的方法，其中AMPK激活剂是植物多酚。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述植物多酚为白藜芦醇、诺卡酮、葫芦烷型三萜、苦瓜甙A、甘密脂素B、obovatol、光甘草定、damulin B、槲皮素、人参皂甙、姜黄素、小檗碱、表没食子儿茶素没食子酸酯、茶黄素和高车前素，或其药学上可接受的盐。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述植物多酚是白藜芦醇。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中AMPK激活剂以药物组合物给药，所述药物组合物包含药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或其组合。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述药物组合物是适于胃肠外给药或口服给药的形式。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中疟原虫生物体能够在人宿主细胞中增殖。

21.根据权利要求20所述的方法，其中疟原虫生物体是恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫或卵形疟原虫。