CN108430481B - 冻干粪便微生物群样品的方法 - Google Patents
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Abstract
冻干粪便微生物群样品的方法。本发明涉及冻干来自供者受试者的粪便微生物群样品的方法，其包括下列步骤：A)将来自供者受试者的粪便微生物群样品与选自多元醇、二至五糖、麦芽糖糊精和其混合物的稀释剂相混合，和B)将在A)中获得的混合物在低于‑50℃，优选地‑70℃至‑100℃的温度下进行冷冻，然后将其冻干。
Description
本发明涉及冻干粪便微生物群样品的方法。本发明还涉及所获得的冻干物在粪便微生物群移植中的用途，优选地为了治疗肠道生态失调，尤其是艰难梭菌(Clostridiumdifficile)感染。
人肠道微生物群是存在于人胃肠系统(胃、肠和结肠)中的微生物(细菌、酵母和真菌)的全体。目前，微生物多样性据估计为大约103个构成了成年个体的占优势的肠道微生物群的细菌物种，其中具有1014个细菌的丰度，其代表了在每个个体中200,000至800,000个基因的占优势的细菌宏基因组(metagenome)，即为人基因组的基因数目的10至50倍。
肠道(在子宫中是无菌的)从生命的头几天起发生菌落移生，直至向独特的个体微生物群演变。每个人拥有就物种而言相对接近的细菌，但其微生物群的确切组成(物种、比例)在很大程度上(超过2/3的物种)是宿主所特异的。
因此，人肠道微生物群是一个非常多样化的、复杂的且特异于每个个体的生态系统。
对于个体的健康来说，必要的是维持稳定的微生物群，其同时能够在变化后回到其初始状态和对于侵袭具有抗性。维持微生物群的大的多样性有助于其稳定性。然而，某些病理学状况或治疗使微生物群失衡：例如，抗生素，以及具有炎症性组分的疾病，例如慢性炎症性肠病(CIBD)，可以限制肠道中微生物群的多样性。
抗生素治疗(或抗生素疗法)尤其导致微生物群的改变和其屏障功能的丧失，这可以有助于致病生物例如艰难梭菌的增殖。
艰难梭菌感染对于医院内腹泻负有责任；该细菌可以呈现出对于传统的抗生素疗法(广谱的，例如万古霉素或甲硝唑)的抗性。为了重建肠道微生物群，和对抗艰难梭菌类型的感染，并因此重建内环境稳定(即共生)，考虑并测试了粪便微生物群移植。它在于将来自健康供者受试者的粪便引入到受者患者的消化道中，以便使宿主的经改变的肠道微生物群重新平衡。该粪便微生物群移植通常是同种异体的(即从健康供者个体至患者)。对于艰难梭菌类型的感染所获得的结果是令人鼓舞的，并且某些患者已被成功地治疗(Tauxe等人,Lab Medicine,2015年冬,第46卷,第1期；或van Nood E,Speelman P,Nieuwdorp M,KellerJ.2014Faecal microbiota transplantation:facts and controversies.Curr OpinGastroenterol 30(1):34-9)。
但是，目前的移植方法是经验性的，并且没有采取任何特别的预防措施以最好地保存厌氧细菌(其是肠道微生物群的主要组分)的生存力。此外，粪便微生物群移植的功效是可变的，并且可能需要多于一种治疗。
因此，对于拥有使人安心的、有效的且易于获得的(尤其是以工业规模)粪便微生物群样品存在需要。此外，对于其中细菌的生存力得到保存并具有长的保存期的粪便微生物群样品存在需要。
本发明使得能够满足这些需要。
因此，本发明涉及制备来自供者受试者的粪便微生物群冻干物的方法，其包括下列步骤：
A)将来自供者受试者的粪便微生物群样品与选自多元醇、二至五糖、麦芽糖糊精和其混合物的稀释剂相混合，和
B)将在A)中获得的混合物在低于-50℃，优选地-70℃至-100℃的温度下进行冷冻，然后将其冻干。
在一个特别的实施方案中，所所述稀释剂为盐水水溶液，其包含：(i)至少一种选自多元醇、二至五糖或其混合物的冷冻保护剂，和(ii)麦芽糖糊精。
在另一个实施方案(其可以与前一个实施方案相组合)中，所述稀释剂为盐水水溶液，其至少包含半乳糖-乳糖或海藻糖作为冷冻保护剂。
在另一个实施方案(其可以与前述实施方案之一相组合)中，所述稀释剂为盐水水溶液，其至少包含麦芽糖糊精混合物作为填充剂，优选地以相对于该溶液的总体积而言4至20％的量。
在另一个实施方案(其可以与前述实施方案之一相组合)中，在所述盐水水溶液中冷冻保护剂的总量为相对于该溶液的总体积而言3至30重量％，优选地相对于该溶液的总体积而言4至20重量％。
优选地，在步骤A)中所使用的粪便微生物群样品是预先经纯化的。
优选地，本发明涉及制备来自供者受试者的粪便微生物群冻干物的方法，其包括下列步骤：
A1)任选地，制备通过冷冻-解冻而形成的碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的连续梯度，
A2)在厌氧生活条件下，将至少一种来自供者受试者的粪便微生物群样品与任选地包含碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的盐水缓冲液相混合，
A3)任选地，将在A2)中获得的混合物放置于在A1)中获得的梯度之下，
A4)将在A2)或A3)中获得的混合物进行在厌氧生活条件下以低的加速度的顺次离心，或者进行超离心，
A5)在厌氧生活条件下回收在步骤A4)结束时形成的细菌环或上清液，
A6)将在A5)中回收的细菌环或上清液与选自多元醇、二至五糖、麦芽糖糊精和其混合物的稀释剂相混合，和
B)将在A6)中获得的混合物在低于-50℃，优选地-70℃至-100℃的温度下进行冷冻，然后将其冻干。
在这样的方法中，步骤A1)以及事实上步骤A3)是可自行选择的。
如此，这样的方法是易于施行的，并且其功效可以通过将在该方法后获得的微生物群体与初始取样物相比较来进行估计。
本发明还涉及能够通过根据本发明的方法获得的粪便微生物群冻干物在功能基因组学中、在宏蛋白质组学(metaproteomics)中或在免疫学中作为研究工具的用途。
例如，能够通过根据本发明的方法获得的冻干物可以用于产生细菌粒状沉淀，其在当被固定在琼脂糖(或其他凝胶)基质中时使得能够提取具有非常大的大小的DNA片段，其用于克隆和功能研究。它还可以用于制备胞质蛋白质或细菌群落的包膜蛋白质的提取物，以为了宏蛋白质组学分析。最后，它可以用于研究宿主的免疫系统对于完整细菌的识别。
本发明还涉及能够通过根据本发明的方法获得的来自供者受试者的粪便微生物群冻干物在自体或同种异体粪便微生物群移植中的用途。
本发明还涉及能够通过根据本发明的方法获得的来自供者受试者的粪便微生物群冻干物的用途，所述用途为用于治疗由于感染(尤其是艰难梭菌感染)而引起的肠道生态失调，由药物治疗、由物理治疗(尤其是辐射)、由外科手术(尤其是肠的)、由结肠镜检查或由营养摄入所诱导的生态失调。本发明还涉及能够通过根据本发明的方法获得的来自供者受试者的粪便微生物群冻干物用于治疗选自下列的病理学状况的用途：慢性炎症性肠病(CIBD)、肠道功能性障碍、肥胖症、代谢疾病(尤其是2型糖尿病、代谢综合征)和自身免疫性疾病(尤其是1型糖尿病)、变态反应、肝脏疾病(尤其是脂肪变性、肝硬化)、某些神经性疾病(尤其是孤独症)和某些癌症(尤其是结肠直肠癌)。
“肠道生态失调”是指肠道微生物群的任何持久失衡。“肠道微生物群的持久失衡”是指有益微生物的任何损失，和/或微生物多样性的任何损失，和/或在共生体中的侵袭性微生物(病理生物(pathobiont))的任何扩张或发展，和/或致病微生物(尤其是艰难梭菌)的任何增殖。这是因为，人肠道微生物群的任何持久改变都可以引起或伴随(长期地)病理学状态。尤其是，微生物群内多样性的减少是与生态失调相关的疾病(尤其是肥胖症、克罗恩病、糖尿病或变应反应)的特征(Sansonetti,Collège de France,2014年1月22日)。
优选地，所述待治疗的病理学状况为肠道生态失调。
“慢性炎症性肠病(CIBD)”尤其是指克罗恩病、出血性直肠结肠炎。
“肠道功能性障碍”尤其是指结肠易激惹综合征、痉挛性结肠炎。
因此，根据本发明的制备来自供者受试者的粪便微生物群冻干物的方法包括下列步骤：
A)将来自供者受试者的粪便微生物群样品与选自多元醇、二至五糖、麦芽糖糊精和其混合物的稀释剂相混合，和
B)将在A)中获得的混合物在低于-50℃，优选地-70℃至-100℃的温度下进行冷冻，然后将其冻干。
根据本发明的方法的步骤A)包括将来自供者受试者的粪便微生物群样品与稀释剂相混合，所述稀释剂选自冷冻保护剂例如多元醇、二至五糖；填充剂例如麦芽糖糊精；和其混合物。
优选地，所述来自供者受试者的粪便微生物群样品为来自所述供者的粪便样品。这是因为，粪便样品包含供者受试者的微生物群。优选地，根据本发明，所述供者受试者为健康的人受试者。“健康的受试者”是指未患有肠道微生物群失衡或由医疗机构诊断/识别出的病理学状况的受试者。优选地，所述来自供者受试者的粪便微生物群样品是预先经纯化的。
备选地，优选地，根据本发明，所述供者受试者为患病的人受试者。
优选地，所述粪便样品具有至少20g的质量。
所述粪便微生物群样品总是在厌氧生活条件下(即在没有氧气的气氛中)获得和混合。在厌氧生活条件下，构成粪便微生物群和存在于样品中的细菌的生存力因此得到保存。
优选地，在其使用之前，在厌氧生活条件下将粪便微生物群样品进行过滤。该预先的过滤步骤可以包括在厌氧生活条件下通过使用配备有过滤器的Seward袋来进行过滤。
优选地，通过使用不透气的收集装置，在厌氧生活条件下获取粪便微生物群样品。优选地，该装置以包含下述部分的类型的形式存在：
-容器，其包含具有适合于接纳来自供者受试者的粪便微生物群样品的内部空间的本体，和界定出进入本体的内部空间的开口的颈部，和
-盖子，其适合于可拆卸地且密封地安装在所述容器的颈部上以便阻塞颈部的进入开口并封闭本体的内部空间，
其中所述容器的本体由柔软的袋子构成，并且其中所述容器和所述盖子之中的至少一个配备有排放机构，其适合于排出包含在所述容器的本体的内部空间中的气体的至少一部分。
备选地，所述不透气的收集装置以包含下列部分的类型的形式存在：
-容器，其包含具有适合于接纳来自供者受试者的粪便微生物群样品的内部空间的本体，和界定出进入本体的内部空间的开口的颈部，和
-盖子，其适合于可拆卸地且密封地安装在所述容器的颈部上以便阻塞颈部的进入开口并封闭本体的内部空间，
其中所述容器的本体的内部空间任选地包含中和氧气的化学装置。
所述稀释剂可以选自下列化合物：
-冷冻保护剂，例如二至五糖，即二糖、三糖、四糖和五糖；或多元醇，例如甘油、甘露醇、山梨醇、丙二醇或乙二醇，
-填充剂，例如淀粉(amidon)(尤其是小麦或玉米淀粉)或者淀粉(fécule)的部分水解产物，其包含大量的麦芽糖糊精，
-和其混合物。
优选地，所述稀释剂为盐水水溶液，其包含至少一种冷冻保护剂和/或填充剂。因此，典型地，所述盐水水溶液包含水和生理学上可接受的盐。典型地，所述盐为钙、钠、钾或镁与负氯离子、葡糖酸根离子、乙酸根离子或碳酸氢根离子的盐。
所述盐水水溶液还可以任选地包含至少一种抗氧化剂。所述抗氧化剂尤其选自抗坏血酸及其盐(抗坏血酸盐)、生育酚(尤其是α-生育酚)、半胱氨酸及其成盐形式(尤其是盐酸盐)以及其混合物。
优选地，所述盐水水溶液包含：
-至少一种盐，其选自氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钾、葡糖酸钠和乙酸钠，和
-任选地，至少一种抗氧化剂，其优选地选自L-抗坏血酸钠、生育酚、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物和其混合物。
典型地，所述盐以5至20g/L，优选地7至10g/L的浓度存在于所述盐水水溶液中。
典型地，所述抗氧化剂以相对于溶液总体积而言0.3至1重量％的量，优选地以相对于溶液总体积而言0.4至0.6重量％的量存在于所述盐水水溶液中。
优选地，当所述抗氧化剂为L-抗坏血酸钠和L-半胱氨酸盐酸盐一水合物的混合物时，L-抗坏血酸钠以相对于溶液总体积而言0.4至0.6重量％的量存在，并且L-半胱氨酸盐酸盐一水合物以相对于溶液总体积而言0.01至0.1重量％的量存在。
优选地，所述盐水水溶液包含至少一种冷冻保护剂。冷冻保护剂是用于保护样品免于由冷冻所引起的(尤其是由于冰晶形成而引起的)损害的物质。
优选地，所述冷冻保护剂选自多元醇、二至五糖(即二糖、三糖、四糖和五糖)和其混合物。优选地，所述冷冻保护剂选自多元醇、三糖和二糖以及其混合物。更优选地，在所述盐水水溶液中存在的冷冻保护剂为二糖或三糖。
在可使用的多元醇中，尤其找到甘油、甘露醇、山梨醇，但也找到丙二醇或乙二醇。
在可使用的二至五糖中，可以提及相同或不同单元的二聚体、三聚体、四聚体和五聚体，所述单元选自葡萄糖、果糖、半乳糖、岩藻糖和N-乙酰神经氨酸。
在可使用的二糖中，尤其找到海藻糖或其类似物，或蔗糖。
这些冷冻保护剂可以单独地或以混合物进行使用。
典型地，在所述盐水水溶液中存在的冷冻保护剂的总量为相对于溶液总体积而言3至30重量％，优选地相对于溶液总体积而言4重量％至20重量％。
优选地，所述冷冻保护剂选自甘油、甘露醇、山梨醇、丙二醇、乙二醇、海藻糖及其类似物、蔗糖、半乳糖-乳糖和其混合物。更优选地，所述冷冻保护剂为半乳糖-乳糖或海藻糖。
优选地，根据本发明的盐水水溶液包含至少一种填充剂。
所述填充剂优选地选自淀粉(amidon)或淀粉(fécule)的部分水解产物。淀粉(amidon)(尤其是小麦或玉米淀粉)的部分水解产物以及淀粉(fécule)(例如马铃薯淀粉)的部分水解产物包含大量的麦芽糖糊精。麦芽糖糊精是淀粉(amidon)或淀粉(fécule)部分水解的结果，并且由各种不同的糖(葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、寡糖和多糖)构成，它们的比例随水解程度而变化。
优选地，在所述盐水水溶液中存在的填充剂为麦芽糖糊精混合物，其中麦芽糖糊精的量为相对于溶液总体积而言4至20重量％。
优选地，步骤A)通过将粪便微生物群样品与稀释剂相混合来进行，以1:1至1:10的“微生物群(优选地，经纯化的)的重量(g)/稀释剂的体积(mL)”的比例。
然后，将在A)中获得的混合物在低于-50℃，优选地-70℃至-100℃的温度下进行冷冻，然后经历冻干：这是步骤B)。它优选地在下列条件下进行：
B1)将在A)中获得的混合物在低于-50℃，优选地-70℃至-100℃的温度下，优选地在大约-80℃的温度下进行冷冻，
B2)在大气压下，将在B1)中获得的经冷冻的混合物加载到预冷却至在-50℃和-30℃之间的温度的冷冻干燥器中，然后
B3)至少一个使在B2)中加载的混合物进行首次干燥的步骤，其包括降低压力直至在80和200μbar之间(优选地在100和150μbar之间)的值，然后通过应用0.2至0.5℃/分钟的加热速度来提高搁架的温度直至在-20℃和+25℃之间(优选地-10℃)的值。选择压力和搁架温度的值，以便使得产物的温度在整个升华期间保持在崩塌温度之下。参数保持不变直至从混合物中完全去除冰，然后
B4)使在B3)中获得的混合物进行二次干燥，其包括降低压力至低于或等于80μbar的值，优选地对于设备而言可能的最小值，和以0.1至0.3℃/分钟的加热速率升高搁架的温度至在+25℃和+35℃之间的值，优选地25℃，并保持在那里8至15小时。
优选地，步骤B1)的冷冻在低于-50℃，优选地-70℃至-100℃的温度下进行。优选地，冷冻温度为-70℃至-100℃；更优选地，它为大约-80℃或大约-100℃。为了进行冷冻，可以将在A)中获得的混合物预先分成等分试样，以确保具有恒定体积的样本。
因此，在大气压下，将经冷冻的样品加载到预冷却至在-50℃和-30℃之间的温度的冷冻干燥器中；这是步骤B2)。
然后，发生在B2)中加载的混合物的首次干燥；这是步骤B3)。它包括至少一个使在B2)中加载的混合物进行首次干燥的步骤，其包括降低压力直至在80和200μbar之间(优选地在100和150μbar之间)的值，然后通过应用0.2至0.5℃/分钟的加热速度来提高搁架的温度直至在-20℃和+25℃之间(优选地-10℃)的值。选择压力和搁架温度的值，以便使得产物的温度在整个升华期间保持在崩塌温度之下。参数保持不变直至从混合物中完全去除冰。
最后，B4)进行在B3)中获得的混合物的二次干燥。它包括降低压力至低于或等于80μbar的值，优选地对于设备而言可能的最小值，和以0.1至0.3℃/分钟的加热速率升高搁架的温度至在+25℃和+35℃之间的值，优选地25℃，并保持在那里8至15小时。
因此，最终获得根据本发明的冻干物。
优选地，根据本发明的方法在步骤A)中包括粪便微生物群样品的预先的处理步骤，这在将其与稀释剂相混合之前。
因此，优选地，步骤A)包括下列子步骤：
A1)任选地，制备通过冷冻-解冻而形成的碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的连续梯度，
A2)在厌氧生活条件下，将至少一种来自供者受试者的粪便微生物群样品与任选地包含碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的盐水缓冲液相混合，
A3)任选地，将在A2)中获得的混合物放置于在A1)中获得的梯度之下，
A4)将在A2)或A3)中获得的混合物进行在厌氧生活条件下以低的加速度的顺次离心，或者进行超离心，
A5)在厌氧生活条件下回收在步骤A4)结束时形成的细菌环或上清液，和
A6)将在A5)中回收的细菌环或上清液与选自多元醇、二至五糖、麦芽糖糊精和其混合物的稀释剂相混合。
在这样的方法中，步骤A1)以及事实上步骤A3)是可自行选择的。
优选地，在上面所描述的各种不同的子步骤中所使用的盐水缓冲液为HEPES水溶液，其包含氯化钠，优选地以7至15g/l的浓度。优选地，HEPES以8至50mM，优选地9至42mM的浓度存在。
第一备选方案
优选地，根据第一备选方案，根据本发明的方法包括下列步骤：
A1)制备通过冷冻-解冻而形成的碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的连续梯度，
A2)在厌氧生活条件下，将至少一种来自供者受试者的粪便微生物群样品与添加了包含碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的水溶液的盐水缓冲液相混合，所述盐水缓冲液优选地为包含氯化钠的HEPES水溶液，
A3)将在A2)中获得的混合物放置于在A1)中获得的梯度之下，
A4)将在A3)中获得的混合物在2℃至6℃的温度下以13000至16000x g的加速度超离心40至50分钟的持续时间，
A5)在厌氧生活条件下，回收在步骤A4)结束时形成的细菌环，
A6)将在步骤A5)中回收的细菌环与选自多元醇、二至五糖、麦芽糖糊精和其混合物的稀释剂相混合，和
B)将在A6)中获得的混合物在低于-50℃，优选地-70℃至-100℃的温度下进行冷冻，然后将其冻干。
因此，步骤A1)包括制备通过冷冻-解冻而形成的碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的连续梯度。
“碘克沙醇的连续梯度”是指密度从1.03至1.24变动，优选地从1.06至1.24变动的碘克沙醇的连续梯度。
“5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的连续梯度”是指密度从1.03至1.22变动的5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的连续梯度。
优选地，该步骤A1)按照下列步骤来进行：
A1.a)将碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的溶液在-70℃至-100℃的温度下冷冻至少12小时。优选地，所述溶液是经除气的。“经除气的碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的溶液”是指这样的碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的溶液，其中溶解的空气的浓度被降低，例如在真空中。这使得能够产生在纯化方法的过程中有利于细菌存活的微厌氧生活条件；然后
A1.b)将在A1.a)中获得的溶液在环境温度下解冻2至4小时，以便获得碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的连续梯度。
优选地，在步骤A1)中所使用的碘克沙醇溶液为具有15至25重量％，优选地20重量％左右的碘克沙醇/溶液体积(w/v)的浓度的溶液。更优选地，所使用的碘克沙醇溶液通过将以名称OptiPrep进行销售的60％的碘克沙醇的商业水溶液(具有60％w/v的碘克沙醇的无菌水溶液)在盐水缓冲液，优选地包含15mM HEPES和9g/L NaCl的缓冲液(具有7.0的pH)中稀释3倍来获得。
优选地，5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺溶液为包含20重量％的5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺/溶液体积(w/v)的溶液。更优选地，所使用的5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺由Progen Biotechnik以名称Nycodenz进行销售。
优选地，在步骤A1.a)中，碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的溶液的冷冻可以进行几天，甚至1个月。
一旦在步骤A1)中获得了碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的连续梯度，就在厌氧生活条件下进行后面的步骤A2)、A4)和A5)。
步骤A2)包括在厌氧生活条件下，将至少一种来自供者受试者的粪便微生物群样品与添加了包含碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的水溶液的盐水缓冲液相混合。优选地，所述盐水缓冲液为包含氯化钠的HEPES水溶液。优选地，HEPES在所述盐水缓冲液中以30至50mM的浓度存在。优选地，氯化钠在所述盐水缓冲液中以7至15g/l的浓度存在。优选地，碘克沙醇水溶液处于50％至70％，优选地大约60％(w/v)的浓度。优选地，“盐水缓冲液:碘克沙醇水溶液”的比例为大约1:3。
优选地，5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺水溶液处于60％(w/v)的浓度。优选地，“盐水缓冲液:5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺水溶液”的比例为大约1:3。
因此，按照步骤A2)，预先将盐水缓冲液与碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的水溶液相混合；因此获得包含碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的盐水缓冲液。然后，将所得的混合物与粪便微生物群样品相混合。
优选地，粪便微生物群样品与包含碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的盐水缓冲液的混合以3至4克的样品/22至30ml的包含碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的盐水缓冲液的比例来进行。
优选地，当在步骤A2)和A3)之间将粪便微生物群样品进行过滤时，它经历在厌氧生活条件下对在A2)中获得的混合物进行过滤的步骤，尤其是通过使用配备有过滤器的Seward袋。
然后，将在A2)中获得的混合物(任选地经过滤的)放置于在A1)中获得的梯度之下：这是步骤A3)。步骤A3)可以在需氧生活条件下或在厌氧生活条件下进行。
优选地，在A2)中获得的混合物存在于配备有针头的注射器中，并且碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的梯度存在于管类型的容器中。在这种情况下，通过下述方式来放置在A2)中获得的混合物：将注射器的针头刺入至包含碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的梯度的管的底部，并且排空注射器的内容物。
然后，将在A3)中获得的制备物在真空中在超速离心机中以低的加速度进行离心：这是步骤A4)。该超离心在2℃至6℃的温度下以13000至16000x g的速度进行40至50分钟的持续时间。优选地，该超离心在大约4℃的温度下以大约14500-14600x g的速度进行40至50分钟的持续时间。
在该步骤结束时，在所述梯度内形成了细菌环。在步骤A5)中在厌氧生活条件下回收该环。它包含目的微生物群。
第二备选方案
优选地，根据第二备选方案，所述制备方法包括下列步骤：
A2)在厌氧生活条件下，将至少一种来自供者受试者的粪便微生物群样品与盐水缓冲液相混合，
A4)在厌氧生活条件下，将在A2)中获得的混合物进行以低的加速度的顺次离心，
A5)在厌氧生活条件下，回收在步骤A4)结束时形成的上清液，
A6)将在A5)中回收的上清液与选自多元醇、二至五糖、麦芽糖糊精和其混合物的稀释剂相混合，和
B)将在A6)中获得的混合物在低于-50℃，优选地-70℃至-100℃的温度下进行冷冻，然后将其冻干。
该第二备选方案包括以低的加速度的顺次离心的步骤。“低的加速度”是指200至500x g的加速度。因此，存在于粪便微生物群样品中的各种不同的颗粒(碎片，随后细菌细胞)将会沉降。
步骤A2)包括在厌氧生活条件下，将至少一种来自供者受试者的粪便微生物群样品与盐水缓冲液相混合。优选地，所述盐水缓冲液为包含氯化钠的HEPES水溶液。优选地，HEPES以5至15mM的浓度存在。优选地，氯化钠以7至15g/l的浓度存在。
优选地，粪便微生物群样品与盐水缓冲液的混合以1:20至1:25的“样品:缓冲液”的重量比例来进行。
优选地，当在步骤A2)和A4)之间将粪便微生物群样品进行过滤时，它经历在厌氧生活条件下对在A2)中获得的混合物进行过滤的步骤，尤其是通过使用配备有过滤器的Seward袋。
然后，在厌氧生活条件下，使在A2)中获得的混合物(任选地经过滤的)经历以低的加速度的离心：这是步骤A4)。
步骤A4)的以低的加速度的顺次离心优选地在20至30℃的温度下以200至500x g的加速度进行5至15分钟的时间。更优选地，所述以低的加速度的顺次离心在20至25℃的温度下以大约300x g的加速度进行5至15分钟的时间。
在该步骤结束时，在厌氧生活条件下，回收上清液(步骤A5))。它包含目的微生物群。
优选地，步骤d)的以低的加速度的顺次离心和随后的回收上清液的步骤e)进行数次，优选地至少2次，其中每个步骤d)在20至30℃的温度下以200至500x g的加速度进行5至15分钟的时间。
因此，优选地，在步骤A5)中：
A5.1)回收在步骤A4)结束时形成的上清液，
A5.2)将在A4)中获得的粒状沉淀与盐水缓冲液(与步骤A2)的相同)相混合，然后使其经历以低的加速度的顺次离心(如在步骤A4)中所描述的)，并将如此获得的上清液与级分A5.1)的上清液相混合。粒状沉淀的该洗涤操作可以随意地重复，直至排尽粒状沉淀中的细菌。在实践中和作为节省时间和提取体积的措施，典型地实施单次粒状沉淀的洗涤。
无论根据本发明的方法是什么(第一或第二备选方案)，它可以包括在厌氧生活条件下的下列步骤作为步骤A6)：
a)将在A5)中获得的并重新悬浮在盐水缓冲液中的细菌环或在A5)中获得的上清液在20至30℃的温度下以3000至4000xg的加速度离心5至15分钟的时间，
b)回收在步骤a)结束时获得的粒状沉淀，并将其重新悬浮在盐水缓冲液中，然后在20至30℃的温度下以200至500xg的加速度离心5至15分钟的时间，
c)回收在步骤b)结束时获得的上清液，并将其重新悬浮在盐水缓冲液中，然后在20至30℃的温度下以3000至4000xg的加速度离心5至15分钟的时间，
d)回收在步骤c)结束时获得的粒状沉淀，和
e)将在d)中回收的粒状沉淀与选自多元醇、二至五糖、麦芽糖糊精和其混合物的稀释剂相混合。
因此，这些步骤a)至e)可以是步骤A6)的子步骤。步骤a)至d)旨在洗涤在A5)中获得的微生物群。优选地，步骤a)至d)的温度为20至25℃。
优选地，在这些步骤a)至d)中，所述盐水缓冲液为HEPES水溶液，其包含氯化钠，优选地以7至15g/l的浓度。优选地，HEPES以8至15mM的浓度存在。
在步骤d)中获得的粒状沉淀包含目的微生物群。因此，可以将它与稀释剂相混合，如在步骤e)中所描述的。
在步骤A5)或d)结束时(与采用根据第一备选方案还是第二备选方案的方法没有关系)，将所回收的级分与稀释剂相混合，所述稀释剂选自冷冻保护剂例如多元醇、二至五糖；填充剂例如麦芽糖糊精；和其混合物。
然后，进行冷冻和冻干的步骤B)，如上面所描述的。
本发明还涉及能够通过根据本发明的方法获得的冻干物作为研究工具的用途，尤其是如上面所描述的，在功能基因组学中、在宏蛋白质组学中或在免疫学中。
本发明还涉及能够通过根据本发明的方法获得的来自供者受试者的粪便微生物群冻干物，其用于在自体或同种异体粪便微生物群移植中进行使用。由此，可以向受者患者施用根据本发明的方法进行纯化的粪便微生物群冻干物。
受者患者可以不同于供者受试者，那么所述移植是同种异体的。
受者患者也可以与供者受试者相同，那么所述移植是自体的。该类型的移植可以在受试者(当时是健康的)在其微生物群改变之前给出样品的情况下发生。在这种情况下，将所述冻干物进行保存，然后移植给该相同的受试者(受者患者)，如果后者尤其具有艰难梭菌感染。自体粪便微生物群移植具有避免源自另一个供者的致病因子的传播这样的优点。
本发明还涉及能够通过根据本发明的方法获得的来自供者受试者的粪便微生物群冻干物，其用于为了治疗艰难梭菌感染来进行使用。本发明还涉及能够通过根据本发明的方法获得的来自供者受试者的粪便微生物群冻干物，其用于为了伴随所述治疗或为了治疗选自下列的病理学状况来进行使用：慢性炎症性肠病(CIBD)、肠道功能性障碍、肥胖症、代谢疾病和自身免疫性疾病、变态反应、神经性疾病和癌症。本发明还涉及能够通过根据本发明的方法获得的冻干物，其用于为了限制选自下列的治疗的副作用来进行使用：抗生素疗法、化学疗法、放射疗法和外科手术(尤其是消化系统的)。
能够通过根据本发明的方法获得的冻干物具有良好的所存在的细菌的生存力，如在实施例4中所证明的。
典型地，粪便微生物群的细菌的生存力通过用由ThermoFisher Scientific销售的LIVE/
BacLightTM细菌生存力试剂盒进行标记来进行测量。这是因为，该试剂盒使得能够基于其膜的完整性来区别活的细菌和死的细菌，其中采用两种荧光团，
和碘化丙锭(PI)。前者渗透入所有细胞(完整的或不完整的)中，固定至DNA，并且于在470nm(蓝色激光)处激发后在540nm(绿色)处发射。PI也靶向DNA，但是仅渗透入其膜被损坏的细胞中；它于在470nm处激发后在635nm(红色)处发射。这样的试剂盒可以与流式细胞术或表面荧光显微术相联合。
优选地，用两种荧光团
/PI的混合物对细菌进行的标记在厌氧生活条件下进行。
现在，将借助于下面的实施例(其不是限制性的)来举例说明本发明。
附图描述
图1是图解说明了在冻干物与粗制粪便之间的Pearson相关性的图。
实施例1：根据本发明通过碘克沙醇(OptiPrep)的连续梯度来纯化来自供者受试
者的粪便微生物群样品
原理：
通过在经由冷冻-解冻而自动形成的OptiPrep的连续梯度内的浮力来分开总细菌级分。将在OptiPrep中变重的粪便稀释物放置于通过冷冻-解冻而预形成的OptiPrep的连续梯度之下。在离心过程中，细菌在梯度内重新上升直至其浮力密度(1.110-1.190)，而食物的和内源性的碎片沉入梯度底部。整个过程在厌氧生活条件下。
材料与方法：
Hepes-NaCl缓冲液
通过冷冻-解冻来制备连续密度(步骤A1))：
-用吸移管吸取16mL的经除气的OptiPrep-20溶液，并转移到管中，同时避免使溶液通气，
-将所述管于-80℃冷冻过夜，
-在使用前将不动的且没有扰动的所述管在环境温度下解冻2-3小时；1.03-1.22的连续密度梯度自动地形成。
在厌氧围室内制备粪便稀释物(步骤A2))：
-将粪便样品收进厌氧围室中，
-在其上放置了具有双过滤器的无菌Seward小袋的天平上称取所希望的粪便重量(对于1个梯度来说最大3.5g，可能更少；在这种情况下，用10mM Hepes-9g/L NaCl缓冲液补足至3.5g)，
-在Seward袋的过滤器中添加24mL的用于粪便悬浮液的稀释剂，
-使混合物均质化，
-将经过滤的经均质化的粪便悬浮液转移到50mL的Falcon型管中，
-从该管开始，用粪便稀释物充满配备有针头的20mL的注射器。
在厌氧围室外制作梯度(步骤A3)和A4))：
-将在A2)中获得的注射器的针头刺入至在A1)中获得的通过冷冻-解冻而预形成的梯度的底部，
-将20mL的粪便稀释物轻轻地加载在预形成的梯度之下，
-对于其他梯度重新开始，
-对于所有管进行称重，并用10mM Hepes-9g/L NaCl缓冲液以2对2的方式将管精确地调整至相同的重量，
-将所述管细致地插入到用于摆动式转子的冷的离心插接件中，
-在4℃下以14,567x g离心45分钟。
在厌氧围室中回收和洗涤细菌细胞(步骤A5)、A6)和a)至d))：
-在不打开它们的情况下将离心插接件搬入厌氧围室中，
-打开一个插接件，
-借助于吸移管，去除上部相，
-用吸移管吸取中间的细胞相，并将其分配入2个50mL的Falcon管中，
-添加洗涤缓冲液(10mM Hepes-9g/L NaCl)直至所述2个Falcon管的50刻度处，
-以相同的方式抽取所有梯度的细菌相，
-在摆动式转子中在22℃下以4000x g离心10分钟，
-通过抽吸来去除上清液，
-添加洗涤缓冲液至所述Falcon管的～25mL刻度处，
-借助于吸移管来轻轻地使细菌重新悬浮；补足至50mL，
-在摆动式转子中在22℃下以300x g离心5分钟，以去除残留的碎片，
-用吸移管将上清液(其包含没有残留物的细菌)转移到2个新的50mL Falcon管中；抛弃碎片的粒状沉淀，
-在摆动式转子中在22℃下以3500x g离心10分钟，
-去除上清液。
可以将所获得的没有残留物的细菌粒状沉淀重新悬浮在所选择的载体中。
实施例2：根据本发明通过以低的加速度的顺次离心来纯化来自供者受试者的粪
便微生物群样品
原理：
通过以低的加速度的顺次离心来分开总细菌级分。
材料与方法：
Hepes-NaCl缓冲液
在厌氧围室中制备粪便稀释物：
-将粪便样品收进厌氧围室中，
-将所希望的粪便重量转移到Seward小袋的过滤器中，
-对于14g的粪便，用10mM Hepes-9g/L NaCl补足QS 350g(即1:25的稀释度)，并均质化(步骤b))，
-将50mL的经过滤的经均质化的粪便悬浮液转移到6个50mL的Falcon型管中，
-在摆动式转头中在22℃下以300x g离心10分钟，以去除碎片(步骤d))，
-将上清液(它们包含细菌)分配入12个新的50mL的管中(～25mL/管)，
-将所述6个粒状沉淀重新悬浮在50mL的10mM Hepes-9g/L NaCl中，并在摆动式转头中在22℃下以300x g离心10分钟(步骤d))，
-将所述6份新的上清液分配入12个已经包含首批上清液的待处理的管中；对于所述12个管，用10mM Hepes-9g/L NaCl补足QS 50mL，
-在摆动式转头中在22℃下以3500x g将所述12个管离心10分钟，以使细菌成粒状沉淀，
-借助于吸移管，细致地去除上清液。
最后，将所获得的没有残留物的细菌粒状沉淀重新悬浮在所选择的载体中。
实施例3：获得在实施例1和2中获得的粪便微生物群的冻干物
将在实施例1和2的方法结束时所获得的级分与下列稀释剂相混合：
-NaCl：9g/L
-在9g/L NaCl中的15/5或5/15的麦芽糖糊精:海藻糖
-碘克沙醇：在40mM HEPES-9g/L NaCl缓冲液中进行3倍稀释的60％的商业水溶液。
然后，将它们于-80℃或-100℃进行冷冻。
然后，使它们经历下述的冻干循环：
二次干燥在80μbar的压力下于+25℃进行大约900分钟。
在加载之前，将冷冻干燥器预冷却至-40℃。从接收样品起，将储存在干冰中的小瓶加载到仪器中，并且将冷冻干燥器从加载结束起置于真空中。将两个PT100温度探针放置在两个小瓶中。当在加载前对产物进行冷冻时，探针在产物的上面而不是在产物中。
循环持续时间为45小时。在循环结束时，将小瓶在冷冻干燥器中在真空中塞紧，然后在卸载后装上金属帽。
实施例4：在实施例3中获得的粪便微生物群冻干物中存在的细菌的生存力
实验方案：
按照下述的实验方案来测量在实施例3中获得的粪便微生物群冻干物中存在的细菌的生存力：
-在厌氧气氛中连续的十倍稀释，以便在用于进行标记的样品中最终处于大约106个细菌/mL；该操作应当紧接在将没有残留物的细菌粒状沉淀重新悬浮在所选择的载体中之后；最后一次稀释的标记也应当是立即的，
-在重新悬浮和标记之间历时少于30分钟，因为活的群体快速地增殖，如果所述载体包含营养底物：在环境温度下、在厌氧生活条件下和在单一营养底物存在下，经过4个小时的等待，该群体增长了半个log并且活细菌的百分比增加10％，
-按照制造商的说明书，通过使用LIVE/
BacLightTM细菌生存力试剂盒来对细菌进行标记，
-以流式细胞术来定量活的和死的细菌：在标记和定量之间的时间不超过20分钟，不论经标记的样品是在环境温度下还是在碎冰上等待(总是在避光下)。
结果：
结果列在下表中：
因此，结果显示，在将细菌用麦芽糖糊精进行冻干时，在根据本发明的经纯化的样品中存在的细菌的生存力是非常好的。
实施例5：在未纯化的粪便微生物群冻干物中存在的细菌的获得和生存力
收集微生物群，并重新悬浮在下列溶液中：
-NaCl：9g/L
-在9g/L NaCl中的15/5或5/15的麦芽糖糊精:海藻糖
然后，将悬浮液于-80℃或-100℃进行冷冻。
然后，使它们经历下述的冻干循环：
在加载之前，将冷冻干燥器预冷却至-45℃。从接收样品起，将储存在干冰中的产物加载到仪器中，并且将冷冻干燥器从加载结束起置于真空中。
循环持续时间为48小时。在循环结束时，将小瓶在冷冻干燥器中在真空中塞紧，然后在卸载后装上金属帽。
通过DNA提取和经由16S rDNA基因的测序而对其进行的分析，就多样性来对细菌群体的质量进行评价。然后，进行系统发育分析，以便建立各种不同样品的特性谱以比较它们。结果呈现在图1中。
因此，结果显示，在分类特性谱之间的相关性水平对于所述3种制剂来说是非常高的，这证明了所述方法有效地保存了大约90％的细菌群体。
以与在实施例4中所呈现的相同的方式来评价生存力，并且在保存10个月后的结果呈现在下面：
| 受试者A | 受试者B | |
| 具有海藻糖的冻干物 | 24.90％ | 31.20％ |
| 具有NaCl的冻干物 | 11.30％ | 20.20％ |
| 具有麦芽糖糊精的冻干物 | 33.80％ | 30.70％ |
在10个月后，用NaCl制作的悬浮液具有比其他2个明显更低的生存力。
因此，根据所述方法获得的微生物群同时使得能够保存细菌群体，因为系统发育特性谱的相关性是非常高的，但是它们此外还使得能够比在NaCl中的制剂更长时间地保存活的细菌。
Claims (22)
1.制备来自供者受试者的粪便微生物群冻干物的方法，其包括下列步骤：
A)将来自供者受试者的粪便微生物群样品与稀释剂相混合，所述稀释剂为盐水水溶液，其包含：(i)至少一种选自多元醇、二至五糖或其混合物的冷冻保护剂，和(ii)麦芽糖糊精，和
B)将在A)中获得的混合物在低于-50℃的温度下进行冷冻，然后将其冻干。
2.根据权利要求1的制备冻干物的方法，其特征在于，在步骤B)中，将在A)中获得的混合物在-70℃至-100℃的温度下进行冷冻，然后将其冻干。
3.根据权利要求1的制备冻干物的方法，其特征在于，所述稀释剂为盐水水溶液，其至少包含半乳糖-乳糖或海藻糖作为冷冻保护剂。
4.根据权利要求1的制备冻干物的方法，其特征在于，所述稀释剂为盐水水溶液，其至少包含麦芽糖糊精混合物，以相对于该溶液的总体积而言4至20％的量。
5.根据权利要求1的制备冻干物的方法，其特征在于，在所述盐水水溶液中冷冻保护剂的总量为相对于该溶液的总体积而言3至30重量％。
6.根据权利要求5的制备冻干物的方法，其特征在于，在所述盐水水溶液中冷冻保护剂的总量为相对于该溶液的总体积而言4至20重量％。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤A)包括下列步骤：
A1)任选地，制备通过冷冻-解冻而形成的碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的连续梯度，
A2)在厌氧生活条件下，将至少一种来自供者受试者的粪便微生物群样品与任选地包含碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的盐水缓冲液相混合，
A3)任选地，将在A2)中获得的混合物放置于在A1)中获得的梯度之下，
A4)将在A2)或A3)中获得的混合物进行在厌氧生活条件下以低的加速度的顺次离心，或者进行超离心，
A5)在厌氧生活条件下回收在步骤A4)结束时形成的细菌环或上清液，
A6)将在A5)中回收的细菌环或上清液与稀释剂相混合。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于，所述方法包括在厌氧生活条件下的下列步骤作为步骤A6)：
a)将在A5)中获得的并重新悬浮在盐水缓冲液中的细菌环或在A5)中获得的上清液在20至30℃的温度下以3000至4000xg的加速度离心5至15分钟的时间，
b)回收在步骤a)结束时获得的粒状沉淀，并将其重新悬浮在盐水缓冲液中，然后在20至30℃的温度下以200至500xg的加速度离心5至15分钟的时间，
c)回收在步骤b)结束时获得的上清液，并将其重新悬浮在盐水缓冲液中，然后在20至30℃的温度下以3000至4000xg的加速度离心5至15分钟的时间，
d)回收在步骤c)结束时获得的粒状沉淀，和
e)将在d)中回收的粒状沉淀与稀释剂相混合。
9.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤B)的冻干在下列条件下进行：
B1)将在A)中获得的混合物在低于-50℃的温度下进行冷冻，
B2)在大气压下，将在B1)中获得的经冷冻的混合物加载到预冷却至在-50℃和-30℃之间的温度的冷冻干燥器中，然后
B3)至少一个使在B2)中加载的混合物进行首次干燥的步骤，其包括降低压力直至在80和200μbar之间的值，然后通过应用0.2至0.5℃/分钟的加热速度来提高搁架的温度直至在-20℃和+25℃之间的值，然后
B4)使在B3)中获得的混合物进行二次干燥，其包括降低压力至低于或等于80μbar的值，和以0.1至0.3℃/分钟的加热速率升高搁架的温度至在+25℃和+35℃之间的值，并保持在那里8至15小时。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于，在步骤B1)中，将在A)中获得的混合物在-70℃至-100℃的温度下进行冷冻。
11.根据权利要求7或8的方法，其特征在于，所述盐水缓冲液为HEPES水溶液，其包含氯化钠。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于，所述盐水缓冲液为HEPES水溶液，其以7至15g/l的浓度包含氯化钠。
13.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
A1)制备通过冷冻-解冻而形成的碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的连续梯度，
A2)在厌氧生活条件下，将至少一种来自供者受试者的粪便微生物群样品与添加了包含碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的水溶液的盐水缓冲液相混合，
A3)将在A2)中获得的混合物放置于在A1)中获得的梯度之下，
A4)将在A3)中获得的混合物在2℃至6℃的温度下以13000至16000x g的速度超离心40至50分钟的持续时间，
A5)在厌氧生活条件下，回收在步骤A4)结束时形成的细菌环，
A6)将在步骤A5)中回收的细菌环与稀释剂相混合，和
B)将在A6)中获得的混合物在低于-50℃的温度下进行冷冻，然后将其冻干。
14.根据权利要求13的方法，其特征在于，在步骤A2)中，所述盐水缓冲液为包含氯化钠的HEPES水溶液。
15.根据权利要求13的方法，其特征在于，在步骤B)中，将在A6)中获得的混合物在-70℃至-100℃的温度下进行冷冻，然后将其冻干。
16.根据权利要求7或13的方法，其特征在于，步骤A1)的通过冷冻-解冻而形成的碘克沙醇的连续梯度的制备按照下列步骤来进行：
A1.a)将碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的溶液在-70℃至-100℃的温度下冷冻至少12小时；然后
A1.b)将在A1.a)中获得的溶液在环境温度下解冻2至4小时，以便获得碘克沙醇或5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺的连续梯度。
17.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述方法包括在厌氧生活条件下的下列步骤：
A2)将至少一种来自供者受试者的粪便微生物群样品与盐水缓冲液相混合，
A4)将在A2)中获得的混合物进行以低的加速度的顺次离心，
A5)回收在步骤A4)结束时形成的上清液，
A6)将在A5)中回收的上清液与稀释剂相混合，和
B)将在A6)中获得的混合物在低于-50℃的温度下进行冷冻，然后将其冻干。
18.根据权利要求17的方法，其特征在于，在步骤B)中，将在A6)中获得的混合物在-70℃至-100℃的温度下进行冷冻，然后将其冻干。
19.根据权利要求18的方法，其特征在于，步骤A4)的以低的加速度的顺次离心在20至30℃的温度下以200至500xg的加速度进行5至15分钟的时间。
20.通过根据权利要求1至19之一的方法获得的来自供者受试者的粪便微生物群冻干物在制备药物中的用途，所述药物用于自体或同种异体粪便微生物群移植，或者用于治疗肠道生态失调。
21.通过根据权利要求1至19之一的方法获得的冻干物作为研究工具的用途。
22.通过根据权利要求1至19之一的方法获得的冻干物在功能基因组学中、在宏蛋白质组学中或在免疫学中作为研究工具的用途。
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