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CN110540941A - 一种从粪便中提取保存菌液的方法 - Google Patents

一种从粪便中提取保存菌液的方法 Download PDF

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CN110540941A
CN110540941A CN201910641528.XA CN201910641528A CN110540941A CN 110540941 A CN110540941 A CN 110540941A CN 201910641528 A CN201910641528 A CN 201910641528A CN 110540941 A CN110540941 A CN 110540941A
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CN
China
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freeze
liquid
excrement
dried powder
fecal
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Pending
Application number
CN201910641528.XA
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English (en)
Inventor
严菲月
孟和
郑书钰
徐珂
郑煜明
韩铖潇
秦超
罗凌霄
肖璐
何川
杨凌宇
丁金梅
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Shanghai Jiao Tong University
Original Assignee
Shanghai Jiao Tong University
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

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  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
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  • Biotechnology (AREA)
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Abstract

本发明涉及一种从粪便中提取保存菌液的方法，包括如下步骤：(1)粪菌液制备；(2)将步骤(1)所得粪菌液加入冻干保护剂后冷冻干燥，得粪菌冻干粉；(3)将步骤(2)所得粪菌冻干粉放入‑80℃冰箱保存；(4)取用步骤(3)所得粪菌冻干粉时，恢复至液体取用。与现有技术相比，本发明方法使得菌群较为集中，可于低温中长期保存，且将粪菌保存一周后的存活率达85.24％。粪菌冻干粉形式便于菌群移植，可直接使用口服灌喂方法进行移植。

Description

一种从粪便中提取保存菌液的方法
技术领域
本发明属于粪菌移植技术领域，尤其是涉及一种从粪便中提取保存菌液的方法。
背景技术
粪菌移植(FMT)，也称为粪菌治疗或肠微生菌移植，是将健康人粪便中的功能菌群，移植到患者胃肠道内，重建具有正常功能的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的诊疗。目前，粪菌移植已被视为一种特殊的器官移植，用于治疗难辨梭状芽胞杆菌感染、炎症性肠病、肠易激综合征、代谢综合征、神经发育不良与神经退行性疾病、自身免疫性肠病、肠道食物过敏等。现代粪菌移植技术主要是器械介入的方法，比如胃镜、胃管、肠镜.空肠管等，腹泻型IBS.溃疡性结肠炎等治疗需要多次移植，而每次粪便菌群都需要通过导管经过胃、十二指肠，注入十二指肠远端，过程复杂，患者有一定痛苦，应用受到限制。制备的粪菌样本在室温存放时间短，需要立即进行移植，加入无菌甘油后虽然可以置于-80'C冰冻，但是取用不便。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种从粪便中提取保存菌液的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种从粪便中提取保存菌液的方法，包括如下步骤：
(1)粪菌液制备；
(2)将步骤(1)所得粪菌液加入冻干保护剂后冷冻干燥，得粪菌冻干粉；
(3)将步骤(2)所得粪菌冻干粉放入-80℃冰箱保存；
(4)取用步骤(3)所得粪菌冻干粉时，恢复至液体取用。
优选地，步骤(1)中，粪菌液的制备方法为：
(11)初步搅拌：将供体粪便样本，加入无菌生理盐水进行初步均质处理，得到粪便浆体；
(12)将步骤(11)所得粪便浆体放于振荡器上振荡混匀；
(13)将步骤(12)所得样本过滤，得粪菌液。
优选地，步骤(11)中，无菌生理盐水的加入量为：以毫升和克为单位计，无菌生理盐水的体积为供体粪便重量的五倍。即无菌生理盐水加入体积(ml)为粪便重量(g)五倍。
优选地，步骤(13)中，将步骤(12)所得样本依次用70um、5um的细胞筛过滤。
优选地，步骤(2)中，所述冻干保护剂为质量(g)体积(ml)浓度为40％的海藻糖生理盐水溶液。即100ml海藻糖生理盐水溶液中海藻糖重量为40g。
优选地，步骤(2)中，所述冻干保护剂与步骤(1)所得粪菌液以1:1体积比添加。
优选地，步骤(2)中，粪菌液冷冻干燥所使用的冻干机为CHRIST公司生产的老式冻干机，其通过升温—抽真空—降温的方式来对菌液进行冻干。粪菌液冷冻干燥的操作条件是：粪菌液放置在维持在40℃的升温容器中以60s/r的速度旋转使水分蒸发，该容器与一-60℃的抽真空容器相连，将蒸发的水蒸气源源不断地抽到降温容器中冷凝，通过这种方式进行冻干。
优选地，步骤(4)中，取用冻干粉时，将冻干粉37℃恒温水浴十分钟，加入生理盐水恢复冻干前体积取用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、菌群较为集中，可放于低温长久保存；
2、便于菌群移植的实施，可直接使用口服灌喂法；
3、本发明冻干保护剂的使用对于粪便菌群都具有好的保护效果。在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。海藻糖作为二糖既能在冻结过程中起到低温保护剂的功能；又能在干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用。冷冻干燥方法，比常规一步预冻后真空干燥，能够更好地保护粪菌中各种重要菌群的细胞结构。常规方法中细菌会受到低温效应、冻结效应和脱水效应从而受损。而冷冻干燥过程中菌液并不直接冻结而是通过周围空气的低温和低压达到脱水的作用，降低了对细菌的损伤作用。二者的配合，有效得提高了粪菌菌群的冻干存活率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
一种从粪便中提取保存菌液的方法，包括如下步骤：
(1)粪菌液制备：
(11)初步搅拌：取1g动物粪便，加入5ml无菌生理盐水进行振荡混匀；
(12)将粪便浆体所得样本依次用70um、5um的细胞筛过滤，得粪菌液；
(13)向粪菌液中加入相同体积的质量(g)体积(ml)浓度为40％的海藻糖生理盐水溶液；
(2)将步骤(1)所得粪菌液加入冻干保护剂后冷冻干燥，得粪菌冻干粉：
(21)预冻：使用CHRIST alpha 1-2LD冻干机，先打开抽真空容器等待其温度下降到-60℃；
(22)放样：将粪菌液分装到2ml离心管中，每管1ml菌液；将离心管放入升温旋转器中，等待30min左右，观察到菌液水分脱干即可；
(3)将步骤(2)所得粪菌冻干粉放入-80℃冰箱保存；
(4)取用步骤(3)所得粪菌冻干粉时，将离心管放于37℃恒温水浴十分钟，加入1ml生理盐水摇匀取用。
粪菌菌群冻干一周后的存活率为85.24％，冻干两周后存活率为85.96％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种从粪便中提取保存菌液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)粪菌液制备；
(2)将步骤(1)所得粪菌液加入冻干保护剂后冷冻干燥，得粪菌冻干粉；
(3)将步骤(2)所得粪菌冻干粉放入-80℃冰箱保存；
(4)取用步骤(3)所得粪菌冻干粉时，恢复至液体取用。
2.根据权利要求1所述的一种从粪便中提取保存菌液的方法，其特征在于，步骤(1)中，粪菌液的制备方法为：
(11)初步搅拌：将供体粪便样本，加入无菌生理盐水进行初步均质处理，得到粪便浆体；
(12)将步骤(11)所得粪便浆体放于振荡器上振荡混匀；
(13)将步骤(12)所得样本过滤，得粪菌液。
3.根据权利要求2所述的一种从粪便中提取保存菌液的方法，其特征在于，步骤(11)中，无菌生理盐水的加入量为：以毫升和克为单位计，无菌生理盐水的体积为供体粪便重量的五倍。
4.根据权利要求2所述的一种从粪便中提取保存菌液的方法，其特征在于，步骤(13)中，将步骤(12)所得样本依次用70um、5um的细胞筛过滤。
5.根据权利要求1所述的一种从粪便中提取保存菌液的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述冻干保护剂为质量(g)体积(ml)浓度为40％的海藻糖生理盐水溶液。
6.根据权利要求1所述的一种从粪便中提取保存菌液的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述冻干保护剂与步骤(1)所得粪菌液以1:1体积比添加。
7.根据权利要求1所述的一种从粪便中提取保存菌液的方法，其特征在于，步骤(2)中，粪菌液冷冻干燥的操作条件是：粪菌液放置在维持在40℃的升温容器中以60s/r的速度旋转使水分蒸发，该容器与一-60℃的抽真空容器相连，将蒸发的水蒸气源源不断地抽到降温容器中冷凝，通过这种方式进行冻干。
8.根据权利要求1所述的一种从粪便中提取保存菌液的方法，其特征在于，步骤(4)中，取用冻干粉时，将冻干粉37℃恒温水浴十分钟，加入生理盐水恢复冻干前体积取用。
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