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CN108367099B - 来自多能干细胞的人皮肤类器官的衍生 - Google Patents

来自多能干细胞的人皮肤类器官的衍生 Download PDF

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CN108367099B
CN108367099B CN201680061721.0A CN201680061721A CN108367099B CN 108367099 B CN108367099 B CN 108367099B CN 201680061721 A CN201680061721 A CN 201680061721A CN 108367099 B CN108367099 B CN 108367099B
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CN
China
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skin
hair follicle
cell
dermal
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卡尔·R·克勒
李智允
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Indiana University Research and Technology Corp
Original Assignee
Indiana University Research and Technology Corp
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Abstract

本文提供了用于指导人多能干细胞分化成三维多层皮肤组合物的方法，所述三维多层皮肤组合物包含表皮层、真皮层和能够形成功能性毛囊的多种细胞。本文还提供了三维多层工程化皮肤组合物以及使用其进行药物筛选、针对对毛发生长的作用筛选化合物和用于其他应用的方法。

Description

来自多能干细胞的人皮肤类器官的衍生
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年10月21日提交的美国临时申请No.62/244,612的权益，其通过引用并入本文，如同其整体阐述一样。
关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
本发明是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的DC013294和DC015624的政府支持下完成的。政府在本发明中享有特定的权利。
技术领域
本文提供了用于指导人多能干细胞分化成包含毛干(hair shaft)的人皮肤类器官的方法。更特别地，本文提供了用于获得含有功能性毛囊的包含人多能干细胞来源的表皮层和真皮层的三维培养物的方法。
背景技术
皮肤是身体与外界之间的主要屏障：其调节温度和水保持，提供针对感染和外来物侵入的保护，并且介导触觉和痛觉。作为第一道防线，皮肤对可能引起烧伤以及癌症和遗传缺陷的温度或辐射极限是敏感的。每年在全球范围内烧伤影响超过1100万人。在美国，每年进行约7000万例外科手术；其中这些手术中有三分之一导致疤痕形成。从临床观点来看，头和颈的皮肤是特别脆弱的并且在重大损伤之后难以重建。现今，如果需要替换大块皮肤，典型的做法是从身体的其他部分移植皮肤或使用人工皮肤替代品来闭合伤口。然而，用于自体移植的充足组织的可用性和皮肤替代品没有产生毛发(例如眉毛和头皮毛发)或汗腺的能力是显著的临床问题。此外，体外皮肤模型已经在化妆品和制药公司中用于毒理学和药物筛选多年，然而这些模型仅包含不产生汗腺或毛囊的基本表皮和真皮。成年发生型脱发是所有人群中普遍存在的问题，主要影响男性。极端的遗传性脱发情况(例如秃发)影响男性和女性两者。存在很少治疗脱发的药理学、遗传学或细胞治疗。皮肤具有提供针对外部病原体和环境损害的功能性屏障的复杂细胞构造。自1981年以来，研究者已经能够使用人皮肤等同物(human skin equivalent，HSE)体外培养物来重建皮肤的基本3D架构。参见Bell等，Science 211，1052-1054(1981)；Oh等，The Journal of investigativedermatology 133，e14(2013)。HSE最低程度地由包埋在基于胶原的基质中的真皮成纤维细胞层和叠加的表皮角质形成细胞层组成。现今，使用这些基本组分建立的HSE被广泛用于学术界和工业用于进行对皮肤疾病或皮肤护理药物的研究。与单层(即二维(2D))培养物相比，HSE提供了对体内表型、细胞信号传导、细胞迁移和药物响应的优异建模。然而，用于制备HSE的细胞的来源是该技术的长期限制。HSE通常由从皮肤活检物或来自外科手术的剩余皮肤获得的初级细胞构成。由于使用有限的或非标准化的组织样品，皮肤的主要细胞组分(角质形成细胞和成纤维细胞)需要在用于HSE之前在培养物中扩增。该过程通常选择出数量较少的细胞，例如梅克尔细胞(Merkel cell)或毛囊隆起干细胞(hair follicle bulgestem cell)2。虽然更加标准化，由永生化角质形成细胞或成纤维细胞构建的HSE同样地缺乏特化细胞类型。迄今为止，没有HSE模型已成功地产生与正常皮肤相关的附件(例如毛囊和汗腺)。
因此，本领域中需要有效且可重现的方法用于修复和替换受损人皮肤，以及用于可重现地对体内皮肤表型进行建模以开发不具有副作用和现有技术的限制的治疗，所述现有技术例如使用不能够产生毛发的人皮肤等同物的药物组合物以及当前的组织工程和皮肤移植方案。
发明概述
在第一方面，本文提供了获得三维多层皮肤组合物的方法。本文所述的方法包括：(a)在包含骨形态发生蛋白4(Bone Morphogenetic Protein 4，BMP4)和转化生长因子β(Transforming Growth Factor Beta，TGFβ)信号传导的抑制剂的培养基中培养人多能干细胞聚集体约8至约10天，由此在聚集体中形成非神经上皮(还称为表面外胚层)；(b)将(a)的培养的聚集体包埋在包含细胞外基质的半固体培养基中；以及(c)在以下条件下培养(b)的包埋的聚集体约25至约30天，所述促进包埋的聚集体中的细胞自组装成三维多层组合物，所述三维多层组合物包含表皮层、真皮层和能够形成功能性毛囊的多种细胞。TGFβ1介导的信号传导的抑制剂可以选自SB431542和A-83-01。细胞外基质可以是基底膜提取物(basement membrane extract，BME)。表皮层可以与真皮层直接接触。表皮层可以包含P63+KRT5+表皮角质形成细胞。真皮层包含毛囊起始真皮乳头细胞。能构形成功能性毛囊的多种细胞可以包含选自以下的细胞：间充质干细胞、真皮乳头细胞、真皮鞘细胞和毛囊表皮干细胞。
在另一方面，三维多层工程化皮肤组合物包含：含有体外来源的表皮角质形成细胞的表皮层、含有体外来源的真皮成纤维细胞的真皮层、和能够形成功能性毛囊的多种细胞，其中表皮层和真皮层直接接触。能够形成功能性毛囊的多种细胞可以包含选自以下的细胞：间充质干细胞、真皮乳头细胞、真皮鞘细胞和毛囊表皮干细胞。所述组合物还可以包含至少一个功能性毛囊和至少一个功能性皮脂腺。所述组合物还可以包含支架。所述支架可以是生物可降解的或生物可吸收的。所述组合物可以能够被活体移植和植入到人对象中。
在另一方面，本文提供了测试化合物对毛发生长或发育的作用的方法，所述方法包括使受试化合物暴露于本文提供的工程化皮肤组合物并检测毛发生长或发育的变化。
本文所述的这些和其他特征、方面和优点在考虑下面的附图、详细描述和所附权利要求书之后将被更好地理解。
附图简述
图1是示出了由人多能干细胞(human pluripotent stem cell，hPSC)来源的人皮肤类器官的示例性方案的示意图。在存在细胞外基质(extracellular matrix，ECM)组分的情况下在化学成分确定的(chemically defined)培养基中培养hPSC聚集体以产生非神经外胚层(还称为表面外胚层)上皮。表面外胚层上皮产生表面上皮细胞和颅神经嵴样细胞(cranial neural crest-like cell，CNCC)二者。在培养的第二阶段，在化学成分确定的类器官培养基中漂浮时，CNCC和上皮自组织成具有突出毛囊的囊(cyst)。建议的培养形式在每个步骤下指出。“旋转下漂浮培养”可以使用放置在培养箱内定轨振动器上的旋转瓶或24孔板来实现。
图2A至2I描述了由小鼠多能干细胞(mouse pluripotent stem cell，mPSC)产生的皮肤类器官。(A)内耳和皮肤类器官培养的示意图。(B)经抗细胞角蛋白-5(Krt5)和DAPI免疫染色的皮肤类器官的冷冻切片。(C)正发育毛球中的Sox2+真皮乳头细胞。(D)具有延伸到类器官核心中的毛干的透明类器官(箭头)。(E)从第30天皮肤类器官中突出的毛囊。(F-H)在皮肤类器官中观察到的毛囊的部分。(I)随培养时间每个聚集体的毛囊数的量化(误差棒，min/max)。ECT，外胚层；MES，中胚层；NNE，非神经外胚层；EPI，表皮；OTP/OTV，听板/听泡；DERM，真皮。比例尺，100μm(B、D、H)、50μm(E、F、G)、25μm(C)。
图3A至3G表明，角质形成细胞来源于三维(3D)培养物中的人多能干细胞(hPSC)聚集体。(A)角质形成细胞诱导的示意图。(B-D)第0天、第6天和第20天聚集体的差分干涉对比(differential interference contrast，DIC)显微术图像。注意包含细胞的细胞结构从核心向上皮迁移。(E-F)第3天聚集体的冷冻切片，其示出了在外上皮和下面组织中的非神经TFAP2+细胞。(G)在第20天聚集体的上皮中的KRT5+TFAP2+角质形成细胞样细胞。比例尺，200μm(D)、100μm(C、E、F)、50μm(B)。
图4A至4C表明，在人胚胎干细胞(WA25)和诱导性多能干细胞(mND2-0)中发生非神经外胚层诱导，而没有中内胚层细胞的脱靶诱导。在第0天用10ng/rnl BMP4(a)、10μM SB(b)和10μM SB+2.5ng/ml BMP4(c)处理的第4天聚集体的代表性Brachyury(BRA)免疫组织化学。比例尺，50μm。
图5A至5D表明，FGF-2和BMP抑制剂(LDN)的处理可以产生颅后表面外胚层上皮。A，诱导方案的示意图。在胚胎发育期间的颅区域中，前表面外胚层表达转录因子PAX6，而后表面上皮表达PAX8。在第4天用FGF-2和LDN对非神经诱导性聚集体进行处理并培养8至12天。根据使用的细胞系，括号中的培养试剂(即BMP4)是任选的。B，在第0至12天期间用10μM SB-431542和4ng/ml FGF-2(用SB表示)处理的聚集体产生表达前标志物PAX6而不是后标志物PAX8的TFAP2+ECAD+非神经外胚层上皮。C，在第0至12天期间用10μM SB-431542和4ng/mlFGF-2(用SB表示)处理和在第4至12天期间用50ng/ml FGF-2和200nM LDN-193189处理的聚集体产生表达后标志物PAX8而不是前标志物PAX6的TFAP2+ECAD+非神经外胚层上皮。D，表明这些结果使聚集体沿前体-后体轴图案化的启示的示意图。调节FGF-2和LDN的浓度可以产生体被前或体被后组织。
图6A至6D显示，当包埋在Matrigel液滴中时，在第0至12天期间用SB/FGF/LDN处理的非神经聚集体产生颅神经嵴细胞(CNCC)。在第0天用SB处理并在第4天用FGF/LDN处理后，将第12天聚集体包埋在基Matrigel液滴中以支持自组织。c-d，在没有任何附加处理下，样品产生径向迁移的TFAP2+ PDGFRa+颅神经嵴样细胞(cncc)。该现象在100％的受试细胞聚集体中观察到。
图7A至7C示出了具有表皮层和真皮层的皮肤类器官的形成。A，发育期间颅区域中CNCC迁移的概况。迁移后CNCC细胞的子集形成邻接角质形成细胞祖细胞的表面层的真皮成纤维细胞。B，在分化的第18至50天期间皮肤类器官形成的示意图。C，皮肤类器官囊形成的DIC图像。注意到表皮内层和细胞碎片填充的核心被真皮组织覆盖。
图8A至8B显示，从分化培养基中除去胰岛素产生更大的皮肤类器官。A-b，在第0至12天期间的处理条件是：没有处理(NT)、LDN(从第4天至第12天)、LDN/FGF(从第4天至第12天)和LDN/FGF(从第4天至第12天)+CHIR(从第8天至第12天)。从第22天至第55天，在有或无胰岛素的LDN/FGF和LDN/FGF/CHIR条件下形成皮肤类器官。然而，与具有胰岛素的条件相比，在无胰岛素条件下产生的皮肤类器官具有约2.5至3.5倍大的长轴直径(n＝6个类器官/条件)。
图9A至9H显示毛囊如何从皮肤类器官发芽并展现体内毛囊发育的特征。A，示出了人胚胎中毛囊诱导的前三个阶段的示意图。该过程开始于受精后约10至12周(70至84天)。B-D，在第65至85天(大致等于人胎儿发育的第80至10天)期间从皮肤类器官的表皮中出现毛囊基板、毛芽(germ)和毛钉(peg)的DIC图像。E-G，包含TFAP2+ KRT5+角质形成细胞的表皮与PDGRFa+真皮层中的SOX2+真皮乳头细胞协作以形成毛囊基板、毛芽和毛钉(f图中的星号)。H，第85天皮肤类器官的三维重建显示形成多个具有SOX2+真皮乳头细胞簇的毛囊。
图10A至10C显示，可以在分化的第8至12天期间使用CHIR处理来控制皮肤类器官的CNCC群中细胞的组成。A，显示有两个CNCC群(外胚层间质的和神经源性的)的示意图。外胚层间质CNCC产生成纤维细胞、脂肪细胞、肌细胞、软骨和骨，然而神经源性CNCC产生神经元、胶质和黑素细胞。B-C，只有在第8至12天期间用CHIR99021(一种Wnt信号传导激动剂)处理的类器官在75％的类器官中产生色素沉着的毛囊；由此，黑素细胞从未经CHIR处理的样品中消失。
图11A至11E显示，皮肤类器官可以产生色素沉着的皮肤和毛发。A-B，具有色素沉着毛囊的第120天和第140天皮肤类器官的活细胞图像。C，MITF+黑素细胞位于第120天类器官的E-钙黏蛋白+(ECAD+)毛囊表皮和真皮中。P75在真皮乳头细胞中表达。D-E，图B中通过方框突出显示的毛囊的免疫染色。D，在毛囊基质区中的黑素细胞表达gp100，指示黑色素的产生。E，在毛囊球区域中的Ki67+角质形成细胞和缺乏经切割的半胱天冬酶-3表达细胞指示该类器官毛囊处于生长阶段。
图12A至12G显示，皮肤类器官毛囊具有皮脂腺、立毛肌、角质层和隆起干细胞，包含与胎儿期毛发相似的完整的毛囊皮脂腺单位。A，示出了指示晚期毛囊发育的四个特化细胞区室的示意图。每个细胞群在皮肤类器官中自发地产生。B-C，具有色素沉着毛囊的第115天皮肤类器官的DIC图像。珍珠状脂肪细胞在类器官表面可见。在毛囊的漏斗形区域附近(C)可见起源于毛干的皮脂腺样结构。D:C图中毛囊的截面显示，皮脂腺细胞富含脂质(LipidTOX+)并且具有皮脂腺(sg)样形态。脂肪细胞(ap)同样是LipidTOX+并且具有皮下脂肪细胞的典型形态。E，α-SMA+ITGA8+立毛肌样细胞与类器官毛囊联合发育。F-G，显示具有使人联想到毛囊隆起干细胞的KRT15+斑块的数个毛囊的低和高放大倍数图像。H，截止第120天，在皮肤类器官表皮的角质层(sc)中表达丝聚蛋白，指示基底表皮角质形成细胞的分化。
图13A至13D表明，CNCC来源的感觉神经元在皮肤类器官周围的真皮中形成神经网络。A至B，示出了围绕第60天皮肤类器官的KRT5+表皮的TUJ1+神经元突起的3D重建。C，截止分化的第35天，SOX10+P75+感觉神经元样细胞出现在CNCC来源的间充质中。D，在成熟的皮肤类器官(第100至140天)中，神经丝-H+神经元突起在毛囊周围交织并且显示与表皮和毛囊上皮接触。
图14A至14G显示，皮肤类器官表皮产生接受来自邻近感觉神经元的支配的梅克尔细胞。A，描述梅克尔细胞在表皮和毛囊内的取向和位置的示意图。B，来自用ATOH1-2A-eGFP干细胞系产生的皮肤类器官的示例性数据，其显示梅克尔细胞祖细胞样细胞(eGFP+)在毛囊的隆起区域中。C-E，eGFP+细胞类似于天然梅克尔细胞祖细胞分布在基底表皮和毛囊外根鞘中。eGFP+细胞还是Islet1+(ISL1+)，与梅克尔细胞发育一致。F-G，用ISL1和神经丝-L(NF-L)对第140天类器官进行共标记揭示，梅克尔细胞接受来自类器官真皮层中感觉神经元的支配。
图15A至15B显示，皮肤类器官可以被解离并包埋在多孔基质中而而不丧失形成组织化表皮组织和真皮组织的能力。使第9天类器官完全解离并将解离的细胞重平板接种在Matrigel层上(A，条件1)或细胞和Matrigel混合物的液滴中(B，条件2)，分别使得形成较大的角质形成细胞层或许多单独的角质形成细胞囊。
图16显示，发生hPSC来源的聚集体中的表面外胚层诱导(SEI)而没有中胚层诱导。对于人PSC，截止分化的第3至6天，TGFβ抑制和内源性BMP信号传导促进TFAP2+ECAD+表面外胚层的形成。这些聚集体缺少中胚层，而中胚层是通过单独BMP处理的聚集体中的诱导性(BRA+)细胞。
图17显示，FGF的时间处理和BMP的抑制促进CNCC与表面外胚层的共诱导。BMP信号传导的抑制与FGF处理一起共诱导TFAP2+和PDGFRa+ CNCC与TFAP2+和ECAD+表面外胚层。最后，这样的共诱导诱导CNCC来源的组织类型，包括软骨和皮肤类器官。
发明详述
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入本文，如同每篇单独的出版物、专利和专利申请被具体且单独地指明通过引用并入一样。
本发明至少部分地基于发明人的以下发现：人多能干细胞来源的前体细胞当在允许分化和重建的限定条件下体外培养时形成重现人皮肤和毛干的复杂性和组织化的高度均一皮肤类器官。发明人还发现，可以产生具有大规模定量体外建模和筛选应用所需的均一性的复杂人表皮层和真皮层。
因此，本发明涉及包括三维组织构建体和培养物的组合物，以及使用这样的组合物作为人组织的高度均一模型和用于筛选药物候选物的方法。特别地，本文提供了有效且可重现地产生和扩增包含功能性汗腺和毛囊的复杂组织化人表皮和真皮的方法，所述表皮和真皮适合于体内移植、对遗传性皮肤病和癌症建模，并且可用作筛选平台用于临床前药物测试和其他研究应用。
本文提供的方法和系统的一个重要优点是由单一细胞来源产生毛发的能力。尽管多种用于体外重建皮肤的细胞模型目前是可用的，但是本文提供的方法和系统忠实地重现复杂的组织化皮肤层的体内发育并仅使用人细胞来体外产生毛发。本发明提供了重要的机会来在体外人模型中研究这些细胞。此外，本发明可用于确定用于人组织工程的材料和组合策略。本发明还提供了使用皮肤类器官和包含所述皮肤类器官的三维组织构建体作为人组织的高度均一模型以及用于筛选潜在治疗剂或毒性剂的方法。在本发明提供的优点中，本发明的皮肤类器官提供关于不同试剂在人皮肤的复杂环境中的作用的生物学相关信息。此外，本文提供的皮肤类器官衍生方法是化学成分确定的、有效的(一个细胞聚集体可以产生10至30个或更多个毛囊)，并且模拟正常的胚胎发育时机，其中毛囊生成(folliculogenesis)发生在培养约60天后；相当于人胚胎发育的第10周。此外，该方法排他性地由外胚层的胚层产生皮肤类器官，并且由于真皮由颅神经嵴细胞来源，因此所得的皮肤代表颅皮肤。最后，本发明使用支持广泛多种皮肤细胞的材料并且提供了用于各种体外人组织工程系统的组合策略。
方法
如本文所述，本公开内容提供了用于从人多能干细胞产生皮肤组织的方法。在一些示例性实施方案中，本文提供的方法产生以下皮肤类器官培养物，其重现体内组织结构组织化、复杂性、功能性分化、化学和机械信号，并且因此与初级细胞或永生化细胞的2D培养物相比，可以在生理学上更加相关。本文所用的术语“皮肤类器官”是指以下组织样结构(即展现出特定组织类型的结构特性)，其与整体器官相似并且通过不同细胞类型的单独添加和自组织而体外组装，所述细胞类型包括但不限于多能干细胞、胎儿神经干细胞和分离的器官祖细胞。参见例如Lancaster和Knoblich，Science 345(6194)(2014)。优选地，根据本公开内容的方法获得的皮肤类器官是多层的(例如包含人表皮和真皮)体外皮肤模型，其在组织学上和功能上都基本上对应于天然皮肤。如以下段落中所述，本公开内容的方法如下产生重现人皮肤和毛干的复杂性和组织化的皮肤类器官培养物：在促进人多能干细胞分化成非神经上皮和颅神经嵴细胞并随后分化成适合于毛发产生皮肤移植物的上皮和真皮组织层的条件下，使所述多能干细胞分化。在一些情况下，根据本公开内容的方法获得的皮肤类器官还包含具有一个或更多个特化细胞区室或细胞类型的毛囊，例如皮脂腺、外分泌腺、黑素细胞、感觉神经元、类似于皮下脂肪的脂肪细胞、毛囊隆起干细胞和梅克尔祖细胞。
在第一方面，获得人皮肤类器官的方法包括使人多能干细胞聚集成球形聚集体并在存在小分子和重组转录因子以及其他蛋白质的情况下培养球形聚集体，由此多能细胞被诱导分化成能够生成毛发的表皮和真皮的多层组织。参照图1，该方法包括使人多能干细胞聚集成球形聚集体并在除促进非神经诱导的因子之外还存在化学成分确定的培养基和细胞外基质(ECM)组分的情况下培养球形聚集体。在这样的情况下，化学培养基可以包含以下限定组分或基本上由以下限定组分组成：化学成分确定的基础细胞培养基(还在段落24中描述)、骨形态发生蛋白信号传导的激动剂(活化剂)和转化生长因子β(TGFβ)信号传导的抑制剂(参见图1中的“TGFi”)。当根据这些步骤培养时，聚集的人多能干细胞的至少子集被诱导分化以在每个聚集体中形成中胚层细胞核心。优选地，将包含中胚层细胞核心的聚集体在存在BMP信号传导的激动剂(例如骨形态发生蛋白-4(BMP4))和TGFβ信号传导的抑制剂(″TGFi″)的情况下培养约8天至约10天。
在约8天至约10天的培养之后，中胚层核心的细胞迁移到聚集体的表面并产生衬于聚集体核心的非神经外胚层的层和颅神经嵴样细胞(CNCC)。再次参照图1，在培养12至18天之后，CNCC迁移到聚集体表面并形成充间质。截止培养的第30天，外胚层和间充质细胞产生包含基底角质形成细胞和真皮成纤维细胞的皮肤类器官。显然，在培养约75天至约120天(例如约75天、80天、85天、90天、95天、100天、105天、110天、115天、120天)之后，衍生皮肤产生向外生长的毛囊。与正常的胚胎皮肤相比，根据本公开内容的方法获得的皮肤类器官形成具有角质形成细胞(在内层中)和成纤维细胞(在外层中)的同心层的囊。皮肤和毛囊装备有许多在正常皮肤中可见的特化细胞区室，例如感觉神经元、皮脂腺、皮下脂肪、色素沉着的黑素细胞和触觉感受性梅克尔细胞。
在一些示例性实施方案中，BMP信号传导的激动剂选自BMP4、BMP2和BMP7。作为替选地，BMP信号传导的激动剂是模拟通过促使Smad1/5/8磷酸化而与其受体进行BMP结合的下游信号传导级联反应的任何蛋白质或小分子。当TGFβ-1和激活素A是TGFβ信号传导的激动剂时，可以使用例如小分子抑制剂SB-431542(″SB″，其是ALK5的有效的选择性抑制剂)来拮抗TGFβ信号传导。TGFβ信号传导的另一些抑制剂/拮抗剂包括但不限于SB525334(TGFβ受体I的选择性抑制剂)、对一种或更多种TGFβ受体具有特异性的RNAi核酸和抗TGFβ抗体。
在下一步中，将在存在BMP信号传导的激动剂和TGFβ信号传导的抑制剂的情况下培养的聚集体包埋到含有细胞外基质(ECM)组分的半固体培养基中。将包埋的聚集体在促进非神经外胚层上皮和神经嵴样细胞定向分化成表皮和包含真皮成纤维细胞的间充质的条件下进行培养。优选地，将包埋的聚集体在促进包埋的聚集体中的细胞自组装获得三维多层皮肤组合物的条件下培养约25至约30天，所述三维多层皮肤组合物包含表皮层、真皮层和能够形成功能性毛囊的多种细胞。获得的皮肤组合物包含两个组织层(表皮和真皮)，其协作发育以形成包含功能性毛囊的全厚度皮肤。能够形成功能性毛囊的细胞包括但不限于毛囊特异性间充质干细胞、真皮乳头细胞、真皮鞘细胞和毛囊表皮干细胞。
优选地，将人多能干细胞在包含限定组分的化学成分确定的基础培养基制剂中培养。在一些情况下，化学成分确定的基础培养基是Chen等，Nature Methods 8：424-429(2011)中所述的“DF3S”培养基，其通过引用并入本文中，如同其整体陈述一样。在另一些情况下，化学成分确定的基础培养基是E6、E7或E8培养基。本文所用的术语“E7培养基”和“E7”可互换使用并且是指包含被补充还包含胰岛素(20μg/mL)、转铁蛋白(10.67ng/mL)和人成纤维细胞生长因子2(FGF2)(100ng/mL)的DF3S或基本上由其组成的化学成分确定的培养基。本文使用的术语“E8培养基”和“E8”可互换使用并且是指包含通过添加胰岛素(20μg/mL)、转铁蛋白(10.67ng/mL)、人FGF2(100ng/mL)和人TGFβ1(转化生长因子β1)(1.75ng/mL)进行补充的DF3S或基本上由其组成的化学成分确定的培养基。作为一个可替选方案，E8培养基也可作为Essential 8从Thermal Fisher/Life Technologies Inc.获得或作为
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从Stem Cell Technologies获得。本文使用的术语“E6培养基”和“E6”可互换使用并且是指包含通过添加胰岛素(20μg/mL)和转铁蛋白(10.67ng/mL)进行补充的DF3S或基本上由其组成的化学成分确定的培养基。E6与E8培养基类似但没有FGF2和TGF-β。该培养基可以基于以前出版物中的配方(Chen等，Nature Methods 8：424-429，2011)制备。类似的培养基可作为Essential 6从Thermal Fisher/Life Technologies Inc.获得，或作为
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从Stem Cell Technologies获得。
可以将多能干细胞的汇合培养物化学地、酶促地或机械地从表面(例如
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)或化学成分确定的基底(例如水凝胶)解离成团块、聚集体或单细胞。在一些示例性实施方案中，将解离的细胞(例如团块、聚集体或单细胞)平板接种在不含蛋白质的基础培养基中的表面上，所述基础培养基例如Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco′s ModifiedEagle′s Medium，DMEM)/F12、mTeSRTM(StemCell Technologies；Vancouver，BritishColumbia，Canada)和TeSRTM。TeSRTM的完全成分和使用方法在Ludwig等中描述。参见例如Ludwig T，等，″Feeder-independent culture of human embryonic stem cells，″Nat.Methods 3：637-646(2006)；和Ludwig T，等，″Derivation of human embryonic stemcells in defined conditions，″Nat.Biotechnol.24：185-187(2006)，其各自通过引用并入本文，如同整体陈述一样。另一些适合于本文使用的DMEM制剂包括例如X-VivoTM(BioWhittaker，Walkersville，MD)和
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(Invitrogen；Carlsbad，CA)。
近年来，与限定浓度的细胞外基质蛋白交联的基于聚乙二醇(PEG)的水凝胶已经成为难以限定的基质例如
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的化学成分确定的替选方案。因此，在本发明的一些示例性实施方案中，本文提供的方法可以包括将细胞包埋或包封在化学成分确定的多孔生物材料例如水凝胶中。术语“水凝胶”是指包含合成或生物组分的高度水化的多孔材料，所述组分在使有机聚合物(天然或合成的)通过共价键、离子键或氢键交联时形成以产生捕获水分子以形成凝胶的3D开放晶格结构。适合于构建本发明的3D皮肤类器官的水凝胶包括但不限于合成水凝胶、生物活性水凝胶、生物相容性水凝胶、细胞相容性水凝胶、化学成分确定的水凝胶、化学成分确定的合成水凝胶和蛋白水解可降解的水凝胶。本文所用的“生物活性的”旨在表示促进细胞或组织响应的能力，所述细胞或组织响应例如多能干细胞的分化、血管生成的诱导、神经干细胞分化、细胞附着的促进、细胞自组装的促进和细胞-细胞相互作用的促进。本文所用的术语“生物相容性的”是指聚合物或水凝胶作为支持细胞活性的基底的能力，包括促进分子和机械信号传导系统，以允许适当的细胞自组装或细胞功能例如组织形成、可溶性生物活性分子(例如生长因子)的产生、特定的细胞行为例如迁移和增殖。在一些情况下，“生物相容性”意指不存在具有细胞或组织损伤效应的组分。本文所用的术语“细胞相容性的”意指水凝胶材料是基本上无细胞毒性的并且不产生或基本上不产生细胞毒性降解产物，而本文所用的术语“蛋白水解可降解的”意指交联骨架可以被酶促或非酶促切割以分解支架网络。
本文所用的术语“化学成分确定的”是指组合物(例如水凝胶)中每种组分的身份和量都是已知的。多能干细胞培养和多能干细胞的定向分化领域的一个重要目标是开发提供提高的性能一致性和可重现性的培养材料和培养基。在一些情况下，用于衍生本公开内容的皮肤类器官的化学成分确定的水凝胶包含极少数量的限定组分/成分。
在一些情况下，将外源性细胞添加到根据本文提供的方法获得的皮肤类器官或包含皮肤类器官的体外组织构建体中可以是有利的，使得所得组合物包含不是根据本公开内容的方法来源的但是对重现体内皮肤和提供具有附加结构复杂性的皮肤类器官有利的细胞类型。例如，可以向组织构建体接种表皮免疫细胞(例如朗格汉斯细胞(Langerhan'scell))、中胚层来源的细胞类型(例如如Prasain等，Nature Biotech 32，1151-1157(2014)所述的用于血管形成的集落形成内皮细胞)或内皮细胞。用于接种皮肤类器官的细胞可以从天然组织中获得或根据其他体外衍生方案来源。例如，由hiPSC来源的内皮集落形成细胞已被表明在不同的体外和体内条件下有效地生成血管系统(Mervin Yoder博士，私人交流)。
适合于根据本文提供的方法使用的水凝胶可以使用不同的聚合物来制备，所述聚合物包括但不限于聚(乙二醇)(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰胺和多糖。PEG是可溶解于水和多种有机溶剂中并且通常没有毒性、抗原性或免疫原性的聚合物。PEG可以在每个末端被激活以成为双官能的。在另一些情况下，一个末端可以被修饰以具有反应性部分。例如，PEG单体可以被修饰以在一个末端具有相对惰性的甲氧基部分(例如甲氧基-PEG-OH)，而另一个末端是可易于化学修饰的羟基基团。多糖水凝胶通过使天然或半合成的多糖例如藻酸盐、羟甲基纤维素、透明质酸和壳聚糖交联来制备。交联反应允许形成由聚合物链之间的共价键构成的三维网络-在生理条件下稳定的网络。
在一些实施方案中，适于根据本文提供的方法使用的水凝胶至少部分地包含在三维结构框架之内。优选地，结构框架包含由包括生物聚合物在内的一种或更多种聚合物材料制备的三维结构。
本文所用的适于根据本发明方法使用的“多能干细胞”是能够分化成所有三个胚层的细胞的细胞。本文所用的合适多能细胞包括人胚胎干细胞(hESC)和人诱导性多能干(iPS)细胞。本文所用的“胚胎干细胞”或“ESC”意指由囊胚的内细胞团来源的多能细胞或多能细胞群。参见Thomson等，Science 282：1145-1147(1998)。这些细胞表达Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81，并且显现为具有高核质比和显著核仁的紧凑集落。ESC可以从例如WiCell研究所(Madison，Wis.)的来源商购获得。本文所用的“诱导性多能干细胞”或“iPS细胞”意指以下多能细胞或多能细胞群，其可以根据其来源分化体细胞而不同、可以根据具体的潜能决定因子组而不同并且可以根据用于对其进行分离的培养条件而不同，但是尽管如此，其基本上在遗传上与其各自的来源分化体细胞相同并且展现出与潜能性更高的细胞例如本文所述的ESC类似的特征。参见例如Yu等，Science 318：1917-1920(2007)。
诱导性多能干细胞展现出类似于ESC的形态学特性(例如圆形形状、大核仁和较少的细胞质)和生长特性(例如约17至18小时的倍增时间)。此外，iPS细胞表达多能细胞特异性标志物(例如Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60或Tra-1-81，但不表达SSEA-1)。然而，诱导性多能干细胞不是直接来源于胚胎。此处所用的“不是直接来源于胚胎”意指产生iPS细胞的起始细胞类型是非多能细胞，例如专能细胞或终末分化细胞，例如从出生后个体获得的体细胞。
人iPS细胞可以根据本文所述的方法使用用于获得具有特定人对象的遗传互补体的皮肤类器官。例如，可以有利地获得表现出与特定哺乳动物对象的特定疾病或病症相关或由其引起的一种或更多种特定表型的皮肤类器官。在这样的情况下，iPS细胞通过根据本领域已知的方法对特定人对象的体细胞进行重编程来获得。参见例如Yu等，Science 324(5928)：797-801(2009)；Chen等，Nat.Methods 8(5)：424-9(2011)；Ebert等，Nature 457(7227)：277-80(2009)；Howden等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108(16)：6537-42(2011)。
特别地，本文提供的方法可用于获得适于自体皮肤移植物以及其他临床和研究应用的诱导性多能干细胞(iPSC)来源的皮肤类器官。例如，如本文所提供获得的iPSC来源的表皮和真皮可以用于使用重现个体(例如患有特定疾病的个体)中皮肤层的体外皮肤类器官对药物响应进行建模。因此，对象特异性iPSC来源的皮肤类器官特别地用于确定导致药物响应在人对象之间可变的遗传因子和表观遗传影响。
用于重编程为诱导性多能干细胞的对象特异性体细胞可以通过活检或其他组织取样方法从目的靶组织中获得或分离。在一些情况下，将对象特异性细胞在用于本发明的三维组织构建体之前进行体外操作。例如，可以在引入三维组织构建体之前将对象特异性细胞扩增，分化，遗传修饰，接触多肽、核酸或其他因子，冷冻保存，或以其他方式修饰。
优选地，将人多能干细胞(例如，人ESC或iPS细胞)在化学成分确定的条件下且在不存在饲养层(例如，成纤维细胞层)、条件化培养基或含有难以限定或未限定组分的培养基的情况下进行培养。本文使用的术语“化学成分确定的培养基”和“化学成分确定的培养介质”也是指含有完全公开或可确定成分的制剂的培养基，所述成分的确切量是已知的或可确定的且可以单独控制。因此，如果(1)所有培养基成分的化学和结构身份都未知、(2)培养基含有未知量的任何成分或(3)二者皆有，则该培养基不是化学成分确定的。通过使用化学成分确定的培养基使培养条件标准化使细胞在细胞培养期间暴露于的材料的批间或批次间变化的可能性最小化。因此，当将各种分化因子加入到在化学成分确定的条件下培养的细胞和组织时，其作用是更加可预测的。本文使用的术语“无血清”是指不含从动物(例如，胎牛)血液中获得的血清的细胞培养材料。一般来说，在不存在动物来源材料的情况下(即，在没有异种材料的条件下)培养细胞或组织降低或消除交叉物种病毒或朊病毒传播的可能性。
在一些情况下，将多能干细胞聚集体在存在激酶抑制剂(例如Rho-kinse(ROCK)抑制剂)的情况下进行培养。已知ROCK抑制剂保护单个细胞和小的细胞聚集体。参见，例如，美国专利申请公开No.2008/0171385，其通过引用并入本文，如同其整体陈述一样；以及Watanabe K等，“A ROCK inhibitor permits survival of dissociated humanembryonic stem cells，”Nat.Biotechnol.25：681-686(2007)。下文表明，ROCK抑制剂显著提高在化学成分确定的表面上的多能细胞存活。适于在本文使用的ROCK抑制剂包括但不限于：(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]高哌嗪二盐酸盐(非正式名称：H-1152)、1-(5-异喹啉磺酰基)哌嗪盐酸盐(非正式名称：HA-100)、1-(5-异喹啉磺酰基)-2-甲基哌嗪(非正式名称：H-7)、1-(5-异喹啉磺酰基)-3-甲基哌嗪(非正式名称：iso H-7)、N-2-(甲基氨基)乙基-5-异喹啉-磺酰胺二盐酸盐(非正式名称：H-8)、N-(2-氨基乙基)-5-异喹啉硫酰胺二盐酸盐(非正式名称：H-9)、N-[2-对-溴-肉桂酰基氨基)乙基]-5-异喹啉磺酰胺二盐酸盐(非正式名称：H-89)、N-(2-胍基乙基)-5-异喹啉磺酰胺盐酸盐(非正式名称：HA-1004)、1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪二盐酸盐(非正式名称：HA-1077)、(S)-(+)-2-甲基-4-甘氨酰基-1-(4-甲基异喹啉基-5-磺酰基)高哌嗪二盐酸盐(非正式名称：甘氨酰基H-1152)和(+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐(非正式名称：Y-27632)。激酶抑制剂可以以足够高使得细胞存活并保持附着在表面上的浓度提供。约3μM至约10μM的抑制剂浓度可以是适宜的。在更低的浓度下，或当未提供ROCK抑制剂时，未分化的细胞通常会脱落，而分化的细胞保持附着在限定表面上。
在另一方面，本文提供了用于产生包含具有和不具有色素沉着的毛囊的皮肤类器官的方法。如后续实施例中所述，hPSC来源的皮肤类器官中黑素细胞的产生依赖于本公开内容所述皮肤类器官衍生方法在第8天至第12天期间活性典型Wnt信号传导的存在。因此，本公开内容提供了用于产生缺乏色素沉着毛囊(例如，包含白化毛囊)的皮肤类器官的方法，以及用于产生具有色素沉着毛囊的皮肤类器官的方法。任何在第8天至第12天期间激活典型Wnt信号传导的合适方法都可以使用。例如，该方法可以包括使hPSC聚集体与典型Wnt信号传导的激动剂接触。Wnt激动剂包括但不限于：分子糖原合酶激酶3(GlycogenSynthase Kinase 3，GSK3)的抑制剂。例如，CHIR-99021是分子糖原合酶激酶3(GSK3)的小分子抑制剂，并且因此是典型Wnt信号传导的有效激动剂。在一些情况下，有利的是，获得包含未色素沉着(白化)毛囊的皮肤类器官并随后使用从具有不同皮肤和毛发颜色的供体获得的黑素细胞接种这样的皮肤类器官。
在另一方面，本文提供了用于由hPSC获得纯或基本上纯的表皮角质形成细胞群的方法。
在另一方面，本文提供了使用本文所述的三维皮肤类器官模型来产生不同类型人皮肤组织的方法。
任何合适的方法都可以用于检测本文所述的细胞类型特征性的生物标志物的表达。例如，可以使用例如RNA测序、免疫组织化学、聚合酶链式反应、qRT-PCR或其他检测或测量基因表达的技术来检测一种或更多种生物标志物的存在或不存在。在一些示例性实施方案中，对根据本文提供的方法获得的细胞群评价前-非神经外胚层的生物标志物(例如AP2)的表达(或其不存在)。用于评价细胞群中标志物在蛋白质水平的表达的定量方法在本领域中也是已知的。例如，流式细胞术用于确定给定细胞群中表达或不表达目的生物标志物的细胞的分数。如下面实施例部分中所述，根据本发明方法的人多能干细胞向多层皮肤类器官的分化可以基于例如软骨细胞和神经元的非真皮细胞类型的不存在以及具有表皮或真皮身份的细胞的存在来确定。分化细胞的身份还与多能性标志物如NANOG和OCT4的下调(相对于人ES细胞或诱导性多能干细胞)相关。
可以使用任意一种或更多种合适的方法来确定本文提供的皮肤类器官或包含皮肤类器官的组织构建体的均一性或其中某些组分的存在或不存在。例如，可以检测本文所述细胞类型特征性的生物标志物的表达。用于检测生物标志物的存在或不存在的合适方法在本领域中是公知的，并且包括但不限于免疫组织化学、qRT-PCR、RNA测序以及用于在RNA水平评价基因表达的类似方法。在一些情况下，使用例如免疫组织化学的方法来检测和确定皮肤类器官或包含皮肤类器官的组织构建体中的细胞类型或生物分子。例如，可以将整个组织构建体或其部分通过免疫组织化学针对特定分化标志物进行染色。在一些情况下，有利的是，进行双标记免疫荧光以评估单独标志物蛋白的相对表达或者在构建体中检测多种祖细胞或分化细胞类型。合适的一抗和二抗对本领域从业人员来说是已知和可获得的。用于评价细胞群中标志物在蛋白质水平的表达的定量方法在本领域也是已知的。例如，流式细胞术用于确定给定细胞群中表达或不表达目的生物标志物的细胞的分数。在一些情况下，有利的是，固定或冷冻本发明的皮肤类器官或组织构建体用于组织学或显微术。例如，可以使用常规方法将本发明的皮肤类器官固定在福尔马林或多聚甲醛中用于塑料包埋和切片。在一些示例性实施方案中，共焦显微术可以揭示细胞类型和结构在本发明的整个三维组织构建体中的分布。在一些情况下，通过共焦显微术获得的图像的三维组合体被用于分析各种细胞和结构的分布和组织化。
组合物
在另一方面，本文提供了根据本文提供的方法获得的三维多层体外来源的皮肤类器官。还提供了包含如本文所述获得的皮肤类器官和工程材料的三维(3D)组织构建体或组织组合物。例如，3D组织构建体可以如下获得：根据本公开内容中所述的方法在基于胶原的基底中使多能干细胞的聚集体分化，由此在这样的培养条件下分化的细胞自组织成相互接触并且能够产生毛发的真皮层和表皮层。在一些情况下，本发明的3D组织构建体还包含分离的生物组分。本文使用的“分离的”生物组分(例如蛋白质或细胞器)已与该组分天然所在生物体的细胞中的其他生物组分(例如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器)基本上分离或从其纯化出。本文使用的术语“分离的蛋白质”包括通过标准纯化方法纯化的蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达所制备的蛋白质，以及化学合成的蛋白质或其片段。
在一些情况下，将皮肤类器官或包含皮肤类器官的3D组织构建体与用于构建新组织的支持结构一起提供或者将其并入到所述支持结构之上或之中。支持结构可以是支架、网状物、固体支持物、管、多孔结构和/或水凝胶。支持结构可以是组织工程支架、基质或形成基质的材料。支持结构可以整体或部分地是生物可降解的或非生物可降解的。本文使用的术语“生物可降解的”意指材料通过生化过程降解或分解成其组分亚单元。支持物可以由天然或合成聚合物、金属(例如钛)、骨或羟基磷灰石、或陶瓷形成。天然聚合物包括但不限于胶原、透明质酸、多糖和糖胺聚糖。合成聚合物包括但不限于聚羟基酸(例如聚乳酸、聚乙醇酸、及其共聚物)、聚羟基链烷酸酯(例如聚羟基丁酸酯)、聚原酸酯、聚酐、聚氨酯、聚碳酸酯和聚酯。
虽然本发明中优先使用人细胞，但用于本发明组织构建体的细胞并不限于来自人来源的细胞。也可以使用来自其他哺乳动物物种的细胞，包括但不限于马、犬、猪、牛、猫、山羊、鼠和绵羊来源。细胞供体可以在发育和年龄方面有差异。细胞可以来源于胚胎、新生儿或较年长个体(包括成人)的供体组织。
在一些情况下，本发明的皮肤类器官可以包含重组细胞或经遗传修饰的细胞代替未经修饰或野生型(“正常”)细胞，或者作为其补充。例如，在一些情况下包括以下重组细胞和经遗传修饰细胞可以是有利的，其在持续的时间量内或根据需要当因培养物中存在的条件而生物、化学或热信号传导时产生重组细胞产物、生长因子、激素、肽或蛋白质(例如，可检测的报道蛋白)。用于获得重组细胞或经遗传修饰细胞的操作在本领域是公知的，并在Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中有所描述，其通过引用并入本文。
在一个具体实施方案中，可以使用包含可检测报道基因(例如，荧光报道基因、用于比色检测的报道基因)的iPS细胞来来源的具有例如荧光标记的毛囊隆起干细胞和真皮乳头细胞的皮肤类器官。这样的皮肤类器官有利于在药物测试期间快速评估毛囊周期阶段。如以下实施例中所述(参见图14B至14D)，可以使用CRISPR/Cas9方法来产生包含靶报道构建体的iPS细胞。在一些情况下，获得包含双报道系统的iPS细胞将是有利的，在所述双报道系统中，不同的细胞类型被不同的报道蛋白标记以用于快速鉴定和细胞追踪。作为示例，可以获得以下iPSC来源的皮肤类器官，其中使用增强型绿色荧光蛋白(eGFP)或另一种GFP或GFP变体来标记毛囊隆起干细胞，并使用tdTomato报道构建体来标记真皮乳头细胞和/或梅克尔祖细胞。
在另一方面，本文提供了组合物，其包含人工皮肤基质和机械或酶促解离的根据本公开内容方法获得的皮肤类器官(参见图15A至15B)。这样的组合物可以用于产生携带毛发的皮肤移植物。适于在这些组合物中使用的人工皮肤基质包括但不限于双层基质创伤敷料IntegraTM(Integra LifeSciences Corp.)和
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创伤基质(Smith&Nephew，Inc.)，其来源于猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa，SIS)。为了得到这样的组合物，可以使用任何合适的方法来机械或酶促解离皮肤类器官，或者使用机械和酶促解离方法的组合。皮肤类器官的机械解离或分离可以通过用移液管尖端研磨、声处理、旋涡解聚、使用细胞刮器、或经由网或筛子强制过滤来完成。酶促解离可以通过使用一种或更多种基于酶的解离试剂来完成，所述解离试剂例如分散酶、Accutase和TrypLE。优选地，基于酶的解离试剂是Accutase。EDTA-PBS溶液也可以用于解离。
在另一方面，本发明提供了包含从特定哺乳动物对象(例如，特定人对象)获得的一种或更多种细胞类型的人皮肤类器官。在一些情况下，得到的一种或更多种细胞类型表现出与该特定哺乳动物对象的特定疾病或病症相关或由其引起的一种或更多种特定表型。对象特异性细胞可以通过活检或其他组织取样方法从目的靶组织中获得或分离。在一些情况下，将对象特异性细胞在用于本发明的组织构建体之前进行体外操作。例如，可以在用于本发明的组织构建体之前将对象特异性细胞扩增，分化，遗传修饰，接触多肽、核酸或其他因子，冷冻保存，或以其他方式修饰。在一些情况下，可以在将对象特异性细胞接种到根据本文所述方法获得的皮肤类器官之上或之中之前、期间或之后使其分化。在另一些情况下，在本发明的皮肤类器官中使用的对象特异性细胞是通过根据本领域已知方法重编程对象的体细胞获得的诱导性多能干细胞。参见，例如，Yu等，Science 324(5928)：797-801(2009)；Chen等，Nat Methods 8(5)：424-9(2011)；Ebert等，Nature 457(7227)：277-80(2009)；Howden等，Proc Natl Acad Sci USA 108(16)：6537-42(2011)。人诱导性多能干细胞允许对在遗传多样性个体群(包括患有遗传性疾病的那些个体)中的药物响应进行建模。即使最安全的药物也可能在具有特定遗传背景或环境史的某些个体中引起不良反应。因此，包含由从已知对不同药物或疾病具有易感性或抗性的个体获得的iPS细胞来源的细胞的皮肤类器官将可用于鉴定导致可变药物响应的遗传因子和表观遗传影响。
对于本文所述的组合物，可以使用本领域公知的任何移植方法将三维皮肤类器官和工程化皮肤产品移植到对象中。除用于皮肤移植物移植之外，根据本文提供的方法获得的hPSC来源的皮肤类器官还可用作用于筛选可能治疗剂的体外模型。根据本文提供的方法获得的hPSC来源的皮肤类器官的另一些应用包括但不限于：使用皮肤类器官作为体外模型来研究许多皮肤病的病因和/或确定用于其的新治疗，所述皮肤病例如银屑病、脱发、外胚层发育异常、念珠状发、内瑟顿综合征(Netherton syndrome)和皮肤癌(例如，梅克尔细胞癌)。受试化合物对本发明皮肤类器官的特定生物活性产生作用的方式将取决于受试化合物的性质、皮肤类器官或组织构建体的特定组成以及被测定的特定生物活性。然而，本发明的方法一般包括以下步骤：(a)在存在受试化合物的情况下培养本文提供的皮肤类器官；(b)在暴露于受试化合物之后，测定皮肤类器官的选定结构或功能属性；以及(c)将在该测定中确定的值与使用以下皮肤类器官进行的相同测定的值进行比较，所述皮肤类器官与在存在受试化合物的情况下培养的类器官具有相同组成但是在不存在受试化合物的情况下(或在存在对照的情况下)进行培养。检测皮肤类器官细胞的生物特性(结构或功能)的积极或不利变化可以包括检测受试化合物对所接触类器官中细胞或组织的形态或寿命的至少一种作用。在一些情况下，检测包括进行例如RNA测序、基因表达谱绘制、转录组分析、代谢组分析、检测报道子或传感器、蛋白质表达谱绘制、福斯特共振能量转移(
Figure BDA0001635828630000191
resonance energy transfer，FRET)、代谢谱绘制和微透析的方法。可以针对对所接触组织构建体中基因表达的作用来筛选受试化合物，其中检测与未接触组织构建体相比的差异基因表达。
在另一方面，本文提供了商业级iPSC来源的皮肤组织，其中商业级皮肤组织是根据本文提供的方法获得的。商业级组合物可以是在一些情况下如本文所述被并入到支持结构(例如，人工皮肤基质)之中或之上的3D多层工程化皮肤构建体。
本文所述的人皮肤类器官和商业级iPSC来源的皮肤组织可以用于各种体外和体内应用。用于临床应用的制剂必须按照由政府机构如美国食品和药品管理局(U.S.Foodand Drug Administration)强加的规定获得。因此，在一些示例性实施方案中，本文提供的方法是根据良好操作规范(Good Manufacturing Practice，GMP)、良好组织规范(GoodTissue Practice，GTP)和良好实验室规范(Good Laboratory Practice，GLP)进行的。不使用包含动物来源组分的试剂，并且所有试剂都是从符合GMP的来源购买的。在用于人的生物工程化iPSC来源的皮肤组织的临床操作的情况下，GTP规范细胞供体同意、可追溯性和感染性疾病筛查，而GMP则与生产一致安全且有效的供人使用的产品的设施、方法、测试和实践相关。参见Lu等Stem Cells 27：2126-2135(2009)。在适当情况下，预想由各机构和机构小组对患者方案进行监督以确保获得知情同意；在各个阶段研究产品的安全性、生物活性、合适剂量和效力；结果是统计学显著的；并且遵循道德准则。
制品
在另一方面，本文提供了包含可用于获得三维(3D)多层体外皮肤组合物的一种或更多种组分的试剂盒。该试剂盒的组分可以包括信号转导途径(例如TGFβ信号传导途径)的一种或更多种小分子抑制剂，和/或信号转导途径(例如典型Wnt信号传导途径)的一种或更多种小分子激动剂。该试剂盒还可以包含用于形成如本文所述与支持结构(例如人工皮肤基质)一起提供或者并入到所述支持结构之中或之上的3D多层工程化皮肤构建体的成分。在一个实施方案中，该试剂盒包括用于本文提供的皮肤组合物的一种或更多种支持结构。支持结构可以是组织工程支架、基质(例如，人工皮肤基质)或形成基质的材料。该试剂盒还可以包含用于转染真皮成纤维细胞以分泌目的治疗性蛋白质的材料。在一些实施方案中，试剂盒中的真皮成纤维细胞是经遗传改造的以表达目的治疗性蛋白质。
除非另外限定，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然可以在本发明的实践或测试中使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料，但本文描述了一些优选的方法和材料。
本文使用的短语“基本上由...组成”意指方法或组合物包括特定的步骤或成分以及对其基本特征没有实质影响的那些步骤或成分。
本文使用的“约”意指在规定的浓度范围、密度、温度或时间框架的5％内。
在考虑以下非限制性实施例之后将可以更充分地理解本发明。特别考虑到的是，所公开的方法普遍适用于多能干细胞。所提到的每篇出版物都通过引用并入，如同其在本文中整体阐述一样。
实施例
实施例1-用于使小鼠多能干细胞定向分化为外胚层和中胚层及皮肤类器官的方 案
在研究内耳类器官的诱导时，我们注意到表皮角质形成细胞的存在。参见Koehler，K.R.，Mikosz，A.M.，Molosh，A.I.，Patel，D.，&Hashino，E.(2013)，Generation ofinner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture.Nature，500(7461)，217-221。向第3天培养物中加入骨形态发生蛋白-4(BMP4)和转化生长因子β(TGF-β)抑制剂SB-431542(“SB”)，以促进上皮中的非神经诱导。观察到BMP4/SB处理还在每个聚集体的核心内诱导中胚层细胞层(图2A)。在第4至5天时，用FGF-2(“FGF”)和BMP抑制剂(LDN-193189；“LDN”)对聚集体进行处理。令人惊讶的是，在约8至10天的培养之后，中胚层细胞迁移到聚集体的表面并形成在特定的条件下可以在其内发育内耳类器官的组织层。我们确定，增加BMP4的浓度和暴露于BMP4的持续时间可以将聚集体的发育轨迹从内耳感觉组织转变到皮肤(图2A)。此外，一些小鼠多能干细胞(mPSC)系显示倾向于皮肤产生。由此产生的皮肤类器官包含表皮的内层和含有毛囊起始真皮乳头细胞的真皮组织的外层(图2B至2C)。截止培养25至30天，毛囊产生向内生长的毛干，反映组织层的相反取向(图2D至2E)。
出生后毛囊和真皮的许多关键特征在皮肤类器官中表现，例如SOX2+真皮乳头细胞、aSMA+立毛肌和油红O+皮下脂肪细胞(图2F至2I)。重要的是，不存在例如在内耳类器官培养期间出现的软骨细胞和神经元的非真皮细胞。由此，皮肤类器官仅包含表皮和真皮(n＝42个皮肤类器官；3个实验)。使用多种多能干细胞系重复该方案，并且产生相当的结果(图5A至5I)。这些数据被认为是第一次证明在限定条件下由纯多能干细胞群在体外产生毛发生成皮肤。
实施例2-由人多能干细胞体外产生角质形成细胞
我们寻求开发可以产生皮肤类器官的新型人非神经诱导方案。将WA25细胞系的人多能干细胞在Essential 8(E8)培养基中解离为单细胞。将约5000个细胞平板接种在96孔V形底板的每个孔中。在培养24小时后，将形成的多能细胞聚集体转移到96孔U形底板上，并在存在Matrigel的情况下在分化培养基中培养。这被认为是分化的“第0天”(参见图1)。
在比较我们的小鼠多能干细胞(mPSC)系统与我们的人(hPSC)系统中，观察到hPSC显示产生不同的内源性信号传导分子，其对于mPSC培养物而言必须作为外源因子加入。进行测定以确定支配非神经外胚层在hPSC聚集体中的诱导的关键因子。确定，在含有或不含低浓度BMP4(<5ng/ml)的化学成分确定的培养基(CDM；表1)中用TGF信号传导抑制剂SB-431542处理hPSC聚集体产生TFAP2+(AP2)非神经外胚层细胞的表面上皮(图3A至3F)。在10至12天的孵育之后，将聚集体转移到类器官成熟培养基(OMM；参见表2)中低细胞附着板上的漂浮培养物中。非神经诱导性聚集体最终产生包含TFAP2+KRT5+角质形成细胞的3D球体(图3A、3D和3G)，从而产生皮肤的表皮成分。这一现象高度稳健，发生在用SB或SB和BMP4的组合处理的100％WA25hESC和mND2-0-hiPSC聚集体中(4个实验中n＝40个聚集体/细胞系)。
我们发现在表皮诱导过程期间，即使使用低浓度的BMP-4来诱导非神经外胚层上皮时，也不诱导中胚层细胞(Brachyury+细胞)(图4A至4C)。
表1.化学成分确定的分化培养基(CDM)
Figure BDA0001635828630000221
hPSC培养：根据已确定的方案12，13，将人PSC(WA25 hESC，第22-50代；mND 2-0iPSC，第28-46代)在重组人玻连蛋白-N(Invitrogen)包被的6孔板上补充有100μg/mLNormocin(Invivogen)的Essential 8(E8)培养基或Essential 8 Flex培养基(E8f)(Invitrogen)中培养。在80％汇合时或每4至5天，使用EDTA溶液以1∶10至1∶20的分离比对细胞进行传代。这两种细胞系都是从WiCell研究所获得的，并且在到达时附有验证和真实性声明。另外的验证和测试信息可以见于细胞系网页上，可在万维网上的wicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/wa25.cmsx和wicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/mirjt7i-mnd2-0.cmsx获得。使用MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza)确定细胞系不含支原体污染。
hPSC分化：为了开始分化，将hPSC细胞用StemPro Accutase(Invitrogen)解离，并以每孔5,000个细胞分布到96孔V形底板中含有20μM Y-27632(Stemgent)和Normocin的E8培养基中。在48小时的孵育之后，将聚集体转移到96孔U形底板中含有4ng ml-1 FGF-2(Peprotech)、10μM SB-431542(Stemgent)和(对于一些实验)2.5ng ml-1 BMP4(Stemgent)，以及2％生长因子减少(Growth Factor Reduced，GFR)Matrigel(Corning)的100μl化学成分确定的培养基(CDM)中以启动非神经诱导-即分化第0天。CDM含有具有GlutaMAX的F-12营养混合物(Gibco)和具有GlutaMAX的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM；Gibco)的50∶50混合物，另外补充有0.5％的牛血清白蛋白(BSA)、1X化学成分确定的脂质浓缩物(Invitrogen)、7μg ml-1胰岛素(Sigma)、15μg ml-1转铁蛋白(Sigma)、450μM单硫代甘油和Normocin(详细配方参见表1)。在分化第12天，将聚集体合并在一起并用新鲜制备的类器官成熟培养基(OMM)清洗，所述类器官成熟培养基包含高级DMEM:F12(Gibco)和神经基础培养基(Gibco)的50∶50混合物，补充有0.5X N2补充剂(Gibco)、0.5X不含维生索A的B27(Gibco)、1X GlutaMAX(Gibco)、0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco)和Normocin(详细配方参见表2)。
培养基组分的选择：我们使用了两种由于缺乏限定或与人细胞的相容性差而可能导致结果变异的培养基组分：GFR Matrigel和BSA。GFR Matrigel含有＜0.1pg ml-1 FGF-2、＜0.5ng ml-1 EGF、5ng ml-1 IGF-1、＜5pg ml-1 PDGF、＜0.2ng ml-1 NGF和1.7ng ml-1 TGFβ。特别地，GFR Matrigel中的TGFβ可能在第12天或稍后影响细胞命运特化，因为在该培养阶段期间我们没有在培养基中包含TGFβ制剂。选择GFR Matrigel是因为其已被表明是3D培养中由多能干细胞自组织上皮的可靠诱导剂26。经纯化的层粘连蛋白/巢蛋白复合体(Corning)可以是合适的、完全化学成分确定的替代品27。在CDM中，选择BSA分别作为人血清白蛋白和聚乙烯醇(PVA)的有成本效益且易于溶解的替代品。PVA已被表明是CDM中BSA的一种合适的化学成分确定的替代品28。或者，可以使用现成的GMP级培养基，例如E6培养基(Life Technologies)来代替CDM。
表2 类器官成熟培养基(OMM)
Figure BDA0001635828630000241
表3中所示的配方是提供50ml培养基，其应使用＜2周。OMM是以前被用于产生脑和胃类器官的两种培养基的定制混合物6，7。使用不含维生素A的B27来限制内源产生的视黄酸的影响。
实施例3-表皮角质形成细胞和CNCC来源的真皮成纤维细胞的体外产生
实施例3建立在实施例2中的表皮诱导方法的基础上。颅皮肤不同于身体其他部位的皮肤在发育期间由表面外胚层与颅神经嵴细胞(CNCC)之间的相互作用产生。在我们的3DhPSC培养物中，我们谨慎控制培养的细胞暴露于小分子和重组蛋白处理的时间，以调节TGFβ、BMP、FGF和WNT途径，并且因此模拟颅表面外胚层的发育(图3a至3f)。为了诱导皮肤类器官，我们在分化的第4天用FGF-2和BMP抑制剂处理非神经诱导性聚集体(来自于实施例2)(图5A至5D)。这种处理诱导类似于发育中头部的颅后区的PAX8+ ECAD+上皮(图5C)。未处理的非神经诱导性聚集体具有指示颅前表面上皮的PAX6+ ECAD+ PAX8-上皮(图5B)。因此，调节FGF/LDN处理浓度可以是用于沿颅前/颅后轴产生不同组织类型的表面上皮的有效策略(图5D)。
由于先前已表明FGF/LDN处理从表面外胚层/神经板边界产生组织衍生物(例如听泡)，我们将第12天聚集体转移到OMM的
Figure BDA0001635828630000242
液滴中。值得注意的是，在这种培养模式下，聚集体产生径向迁移的表达TFAP2和PDGFRa的颅神经嵴样细胞(图6A至6D)。TFAP2+ECAD+上皮保持位于聚集体的中心(图6A至6D)。
我们将液滴包埋的聚集体从板上分离，并将其置于OMM中的旋转或摇动漂浮培养物中长达60天。截止培养30至55天，皮肤类器官由KRT5+基底角质形成细胞和PDGFRa+真皮成纤维细胞组成(图7A至7C)。皮肤类器官发育为具有表皮内层和真皮外层的囊。接下来，我们想知道是什么机理控制皮肤类器官的诱导，并在分化的第0至12天期间测试了在CDM中含有或不含胰岛素的不同处理方案(图8A至8B)。12天后，如前所述，将聚集体转移至OMM中的Matrigel。我们发现，无论胰岛素水平如何，只有通过FGF/LDN处理诱导的类器官产生毛囊(图8A至8B)。未接受另外处理(在最初10μM SB+4ng/ml FGF处理后)或接受单独LDN处理的聚集体主要形成角质形成细胞囊(图8A至8B)。令人感兴趣的是，在没有胰岛素的情况下，皮肤类器官平均是经胰岛素处理的聚集体的2.5至3.5倍大。我们选择继续对经FGF/LDN和FGF/LDN/CHIR(没有胰岛素)处理的聚集体进行我们的分析。值得注意的是，在培养超过60天的皮肤类器官中观察到胚胎毛发发育阶段。胚胎毛发发育的第1、2和3阶段(基板、毛芽和毛钉)发生在第60至85天期间(图9A至9H；在两种条件下观察到相当的结果；示出了FGF/LDN/CHIR条件)。
在第90至140天之间观察到毛球和毛干的明显色素沉着(图10A至10C和11A至11B)。我们发现，由FGF/LDN聚集体来源的毛囊没有色素，而由FGF/LDN/CHIR聚集体来源的毛囊是色素沉着的。一般来说，Wnt激活对神经嵴诱导至关重要；因此，其可能在特异性促进黑素发生性CNCC中发挥作用(图10A至10C)。我们确定，产生黑色素(gp100+MITF+)的黑素细胞存在于毛球和表皮中(图11A至11E)。
我们想知道是否整个毛囊皮脂腺单位都存在(图12A)。在培养约100天时，我们可以在类器官毛囊的漏斗部附近检测到皮脂腺样结构(图12B至12C)。用LipidTOX(LifeTechnologies)免疫染色冷冻切割的样品确定存在富含脂质的皮脂腺细胞(图12D)。从第90天左右开始，具有长形核的ITGA8+ aSMA+立毛肌样细胞和大的珍珠状脂肪细胞出现在毛囊周围，模拟乳头状/网状和皮下真皮的发育(图12A至12G)。还存在KRT15+毛囊隆起干细胞(图12F和12G)。作为基底角质形成细胞分化的指示，丝聚蛋白+鳞在皮肤类器官核心层中形成角质层样层(图12G)。参见Driskell等，Experimental Dermatology 23，629-631(2014)；Driskell等，Nature 504，277-281(2013)；和Driskell&Watt，Trends in cell biology(2014).doi:10.1016/j.tcb.2014.10.001。
除上述基本毛囊皮脂腺特征外，我们还发现感觉神经元与皮肤类器官共发育，并形成错综的多轴突突出(束)，使人联想到颅感觉神经元(例如面神经)。神经元突起(神经丝-H/L+ TUJ1+)围绕第60天和第140天皮肤类器官的表皮(图13A至13D)。在第35天，我们观察到SOX10+ P75+CNCC来源的神经祖细胞样细胞在皮肤类器官真皮层的表面上的聚集体。这些聚集的细胞使人联想到在发育期间形成的颅神经神经节。截止第140天，神经元突起显示与皮肤类器官上皮接触并在毛囊周围缠绕，很像天然的人毛囊(图13D)。
称为梅克尔细胞的表皮来源的机械感受性细胞是皮肤中感觉神经元的主要靶标(图14A)。针对梅克尔细胞的存在，我们使用IHC和活细胞成像的组合使用新ATOH1-2A-eGFP报道hESC细胞系(WA25遗传背景；与Eri Hashino和Jing Nie博士合作开发)对皮肤类器官进行检测。在发育期间，转录因子ATOH1在梅克尔祖细胞中高度表达。参见Narisawa，Y.，Hashimoto，K.，&Kohda，H.(1994).Merkel Cells of the Terminal Hair Follicle ofthe Adult Human Scalp.Journal of Investigative Dermatology，102(4)，506-510和Wright，M.C.，Reed-Geaghan，E.G.，Bolock，A.M.，Fujiyama，T.，Hoshino，M.，&Maricich，S.M.(2015).Unipotent，Atoh1+progenitors maintain the Merkel cell population inembryonic and adult mice.The Journal of Cell Biology，208(3)，367-379。我们发现，ATOH1-2eGFP+细胞均匀地分布于整个表皮并集中在发育中毛囊的隆起区(图14B至14D)。ATOH1-2A-eGPF+梅克尔细胞样细胞也是Islet1+ SOX2+(图14C至14G)。值得注意的是，对ISL1(梅克尔细胞)和神经丝-L(梅克尔细胞和感觉神经元)的共免疫染色显示，截止分化第140天，感觉神经元使突起延伸到表皮中并显示与梅克尔细胞突触接触(图14F至14G)。
据我们所知，这种类器官系统产生已描述的任何基于PSC的模型的皮肤细胞类型的最综合阵列。使用人胚胎干细胞系(WA25，WiCellInstitute)，我们在7个单独的实验中重复这些发现，其中类器官产生HF的成功率为96.4％(27/28)，表明该方法具有较高的可重现性。最近，我们确定，该方法在hiPSC系(mND2-0，WiCell Institute)中以类似效率(91.7％，11/12)工作。平均每个类器官的毛囊数量不同，其中hESC为22±11个毛囊，hiPSC为14±9个毛囊。
对实施例2中描述的分化方法的改进：在孵育4天后，向每个孔中预先存在的100μL培养基加入25μL含有250ng ml-1 FGF-2(终浓度50ng/mL)和1μM LDN-193189(终浓度200nM)的CDM。在另外4天(总共8天)之后，向培养基中加入25μL CDM。对于一些实验，向每个孔中预先存在的125μL培养基中加入含有18μM CHIR99021(终浓度3μM；Stemgent)的CDM。在第12天转移到OMM期间，将聚集体重悬在冰冷的未经稀释GFR Matrigel中，并以约25μL液滴放置在100mm细菌培养板的表面上。在37℃下孵育至少30分钟后，将液滴浸入在10mL的OMM中。为了避免Matrigel液滴的诱导，可以将聚集体洗涤并单独平板接种在24孔低细胞附着板的每个孔中含有1％GFR Matrigel的OMM中。在分化18天后，通过洗涤从培养基中去除CHIR，并将液滴聚集体转移到漂浮培养物中。使用宽口1000P尖端小心地移出液滴，并转移到125ml一次性旋转瓶(Corning)中的75ml新鲜OMM中。使旋转瓶以65RPM在培养箱内搅拌板(ThermoScientific)上维持多至180天的分化。在一些实验中，将聚集体在培养箱内定轨振动器(Thermo Scientific)上24孔低细胞附着板的单个孔中的1ml OMM中维持多至140天。
实施例4-解离的小鼠皮肤类器官在气-液界面3D培养物中重组织为表皮层和真皮 层
为了测试皮肤类器官是否可以重组成双层，我们将毛囊发育前的小鼠皮肤类器官解离，并将类器官细胞平板接种在气-液界面培养物中。重要的是，我们并没有如通常所需的那样分离表皮和真皮群。解离的时机很可能很关键，因为类器官细胞自组织的能力会随着时间的推移而降低。我们选择使第9天皮肤类器官分离，就在表皮中KRT5表达开始后。简言之，使用AccuMax(EMD Millipore，Darmstadt，Germany)将45个第9天类器官(每个条件)完全解离为单个细胞。将解离的细胞平板接种在transwell多孔膜培养插入物(MilliCell，PTFE，0.4μm孔；条件1)中Matrigel层的顶部，或作为细胞和Matrigel混合物的液滴直接平板接种在transwell膜上(条件2)，并在存在含有ROCK抑制剂的类器官培养基的情况下进行培养(图15A至15B)。在第12天，补充消耗的培养基，并除去transwell内的培养基以提供气-液界面培养环境，期望细胞重新排列并组织成不同的皮肤层。截止第23天，在条件1和2二者下都形成约1mm厚的细胞层，将其固定并处理用于免疫组织化学。在条件1下形成的层由KRT5+角质形成细胞层和PDGFRa+(CD140a+)成纤维细胞层并列构成。在条件2下形成的层充满具有PDGFRa+成纤维细胞的KRT5+角质形成细胞囊。重要的是，类器官细胞在这些条件下存活并能够自组织。综合起来，这种方法-使第9天类器官完全解离并将解离的细胞以层重新平板接种-显示出产生具有不同层并且可能具有皮肤附件的全厚度皮肤的潜力。
实施例5-在多能干细胞来源的类器官中重现颅面发育
颅面发育是生存和社会交流的基础；然而，数百万的个体由于基因突变、皮肤肿瘤移除或严重烧伤而遭受发育不当或通过外科手术重建的面部特征。为了更好地限定面部发育和鉴定用于面部缺陷的新细胞治疗，我们将从对颅面复合体在胚胎中产生的机理进行建模的体外系统中受益。人的面部和口由外胚层、内胚层、中胚层和颅神经嵴细胞(CNCC)的混合而形成。具体来说，我们感兴趣的是支配CNCC自组织成面部特征例如面部真皮和软骨的机理。我们开发了使用多能干细胞(PSC)来获得内耳类器官以及多样性间充质组织组群(例如软骨、皮肤和肌肉)的三维(3D)培养系统。在此，我们显示，颅面复合体的两种关键组分(表面外胚层和CNCC)可以在3D培养中由人PSC(hPSC)共诱导。我们使用小分子和重组蛋白来控制正分化hPSC聚集体中的BMP、TGF-β和FGF信号传导。如图16所示，截止分化3至6天，TGFβ抑制和内源性BMP信号传导促进TFAP2+ ECAD+表面外胚层的形成。这些聚集体缺乏中胚层，而中胚层是通过单独BMP处理的聚集体中的诱导性(BRA+)细胞。如图17所示，FGF的时间处理和BMP的抑制促进CNCC与表面外胚层的共诱导。BMP信号传导的抑制与FGF处理一起共诱导TFAP2+和PDGFRa+ CNCC与TFAP2+和ECAD+表面外胚层。最终，这样的共诱导诱导CNCC来源的组织类型，包括软骨和皮肤类器官。
在指导分化两周后，出现含有KRT5+表面上皮的内层和AP2+ PDGFRa+ CNCC样细胞的外层的类器官，使人联想到颅外胚层间质。值得注意的是，这些组织自组织成分层的表皮和真皮，以及软骨团，模拟胚胎颅发育。因此，我们基于人PSC的体外系统为深入研究颅面发育的潜在机理、对神经性嵴病建模和确定新的再生治疗提供机会。

Claims (26)

1.获得三维多层人皮肤组合物的方法，所述方法模拟颅表面外胚层的发育，所述方法包括：
(a)在包含FGF-2和转化生长因子βTGFβ信号传导的抑制剂的化学成分确定的培养基中培养人多能干细胞聚集体4天，由此在所述聚集体中形成非神经上皮；
(b)将(a)的培养的聚集体用FGF和骨形态发生蛋白BMP信号传导的抑制剂培养8天；
(c)将(b)的培养的聚集体包埋在包含细胞外基质组分的多孔基底中；以及
(d)在以下条件下在漂浮培养物中培养(c)的包埋的聚集体至少48天，所述条件促进所述包埋的聚集体中的细胞自组装成三维多层人皮肤组合物，所述三维多层人皮肤组合物包含表皮层、真皮层和多种细胞，所述多种细胞形成毛囊基板、毛囊毛芽、毛囊毛钉、毛囊、皮脂腺细胞和感觉神经元中的一种或更多种。
2.权利要求1所述的方法，其中所述多孔基底是半固体培养基。
3.权利要求1所述的方法，其中所述多孔基底是三维多孔生物材料。
4.权利要求3所述的方法，其中所述三维多孔生物材料是化学成分确定的水凝胶。
5.权利要求1所述的方法，其中TGFβ1介导的信号传导的所述抑制剂选自SB431542和A-83-01。
6.权利要求1所述的方法，其中所述细胞外基质是基底膜提取物BME。
7.权利要求1所述的方法，其中所述表皮层与所述真皮层直接接触。
8.权利要求1所述的方法，其中所述表皮层包含P63+KRT5+表皮角质形成细胞。
9.权利要求1所述的方法，其中所述真皮层包含毛囊起始真皮乳头细胞。
10.权利要求1所述的方法，其中所述多种细胞包含选自以下的细胞：间充质干细胞、真皮乳头细胞、真皮鞘细胞和毛囊表皮干细胞。
11.权利要求1所述的方法，其还包括向所述多孔基底接种选自以下的一种或更多种细胞类型：表皮免疫细胞、中胚层来源的细胞和内皮细胞。
12.权利要求11所述的方法，其中所述表皮免疫细胞是朗格汉斯细胞。
13.根据权利要求1所述的方法，其中BMP的所述抑制剂包含LDN-193189。
14.根据权利要求1所述的方法，其中TGFβ介导的信号传导的所述抑制剂选自SB431542和A-83-01，并且其中BMP的所述抑制剂包含LDN-193189。
15.根据权利要求1所述的方法，其中TGFβ介导的信号传导的所述抑制剂包含SB431542，并且其中BMP的所述抑制剂包含LDN-193189。
16.通过权利要求1至15中任一项所述的方法获得的三维多层工程化人皮肤组合物，其包含：含有人多能干细胞来源的表皮角质形成细胞的表皮层、含有人多能干细胞来源的真皮成纤维细胞的真皮层、和多种人多能干细胞来源的细胞，所述人多能干细胞来源的细胞形成以下的一种或更多种：功能性毛囊的毛囊基板、毛囊毛芽、毛囊毛钉、毛囊、皮脂腺细胞和感觉神经元，其中所述表皮层和所述真皮层直接接触。
17.权利要求16所述的三维多层工程化人皮肤组合物，其包含以下的一种或更多种：多能干细胞来源的间充质干细胞、真皮乳头细胞、真皮鞘细胞和毛囊表皮干细胞。
18.权利要求16所述的三维多层工程化人皮肤组合物，其还包含至少一个功能性毛囊、功能性皮脂腺或感觉神经元。
19.权利要求16所述的三维多层工程化人皮肤组合物，其还包含支架。
20.权利要求19所述的三维多层工程化人皮肤组合物，其中所述支架是生物可降解的或生物可吸收的。
21.权利要求19所述的三维多层工程化人皮肤组合物，其中所述支架是合成基质。
22.权利要求16所述的三维多层工程化人皮肤组合物，其中所述组合物能够被活体移植和植入到人对象中。
23.测试化合物对毛发生长的作用的方法，所述方法包括：
(a)使受试化合物与根据权利要求1所述的方法获得的三维多层人皮肤组合物接触；以及
(b)检测试剂对所接触皮肤组合物中一种或更多种细胞类型的作用。
24.权利要求23所述的方法，其中检测包括进行选自以下的方法：RNA测序、基因表达谱绘制、转录组分析和蛋白质表达分析。
25.权利要求23所述的方法，其中针对对基因表达的作用筛选所述试剂并且其中检测包括测定相对于未接触的皮肤组合物的差异基因表达。
26.根据权利要求1所述的方法获得的三维多层人皮肤组合物在药物发现筛选中的用途。
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