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CN108359009B - 布鲁氏菌单链抗体及其用途 - Google Patents

布鲁氏菌单链抗体及其用途 Download PDF

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CN108359009B
CN108359009B CN201711457652.8A CN201711457652A CN108359009B CN 108359009 B CN108359009 B CN 108359009B CN 201711457652 A CN201711457652 A CN 201711457652A CN 108359009 B CN108359009 B CN 108359009B
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Abstract

本发明涉及生物制品检测技术领域，公开了一种布鲁氏菌单链抗体及其用途，该单链抗体包括轻链可变区、重链可变区以及连接所述轻链可变区与所述重链可变区的接头，其中，所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第1‑114位氨基酸所示，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第130‑252位氨基酸所示。本发明制备了能和布鲁氏菌抗原特异性结合的单链抗体。

Description

布鲁氏菌单链抗体及其用途
技术领域
本发明涉及生物制品检测技术领域，具体涉及布鲁氏菌单链抗体及其用途。
背景技术
布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌感染导致的一种人兽共患病，其基本特征是患病个体的发热和流产，给人和猪、牛、羊等多种动物的生命健康造成严重的威胁。因此，快速准确诊断布病并治疗消除布病，一直是布鲁氏菌流行国家和地区最为重要的公共卫生目标之一。
布病诊断相关研究历时已久，在诊断的技术方法，特别是血清学诊断方面取得了重要的进展，从早期的凝集试验、补体结合试验到后来的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，以及近年来报道的荧光偏振试验(fluorescencepolarization assay，FPA)均有较好的应用。凝集试验是早期常用的一种血清学诊断方法，其中较为经典的是标准试管凝集试验(standard tube agglutination test，STAT或SAT)和平板凝集试验(plate agglutination test)。这两种试验后来逐渐被灵敏度高、成本低廉、检测快速、操作简便和适合高通量筛选的虎红平板凝集试验(rose-bengal palteagglutination test，RPBT)取代。由于RPBT特异性相对较低，只能用作初筛试验。补体结合试验(complement fixation test，CFT)特异性较高，但操作步骤繁琐、耗时，应用较少。近年来发展成熟的ELISA方法逐渐得到业内人员的认可。具体而言，用于布病抗体检测的ELISA有间接ELISA(indirect enzyme-linked immunosorbent assay，iELISA)和竞争ELISA(competitive enzyme-linked immunosorbent assay，cELISA)之分。这两种方法都是世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)标准规定的试验方法，后者也是国际贸易中动物布病检验的指定试验方法。iELISA法通过布鲁氏菌LPS包被-血清样本中抗体特异性结合-HRP标记二抗结合-显色步骤完成检测，操作简单，灵敏度高，便于高通量检测，是筛选方法。cELISA同样具备高通量的特点，通过标准化的布鲁氏菌抗原特异性抗体与血清样本中可能存在的抗体竞争与包被抗原的结合，根据显色反应来判断结果，能有效避免交叉反应导致的假阳性结果，具有更高的检测特异性，一般用作确诊性方法。用于布病抗体检测的cELISA试剂和研发越来越受到业内人士的关注和重视。
用于布病检测的cELISA试剂中，最为核心的成分是布鲁氏菌抗原特异性抗体(竞争抗体)。该抗体需要与布鲁氏菌抗原特异性地以高亲和力结合，以便在检测体系中与血清样本中的相应抗体形成竞争。目前商品化试剂盒和文献报道的都是针对布鲁氏菌抗原的单克隆抗体。相比多克隆抗体，单克隆抗体在特异性、稳定性等性能参数上有明显的提升，也就导致了相应的cELISA试剂盒的检测性能有了一定程度的保障。但是在单克隆抗体的制备过程中，存在杂交瘤筛选比较复杂、杂交瘤细胞保存成本较高、需要喂养实验小鼠等情况。目前应用较多的小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体存在不同程度的批间差异，从而给产品的质量控制带来更大的工作量。就此而言，基于基因工程技术制备的单链抗体相比于单克隆抗体更具优势，一旦获得相应的DNA序列和表达质粒，就可以通过原核生物—大肠杆菌来进行大批量生产，从而实现抗体的低成本、高效率、高质量的大量制备，因此，制备单链抗体具有更为重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种布鲁氏菌单链抗体及其用途。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种单链抗体，该单链抗体包括轻链可变区、重链可变区以及连接所述轻链可变区与所述重链可变区的接头，其中，所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第1-114位氨基酸所示，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第130-252位氨基酸所示。
本发明第二方面提供了编码第一方面所述的单链抗体的基因。
本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体包括第二方面所述的基因。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，该宿主细胞转化有第三方面所述的表达载体。
本发明第五方面提供了一种布鲁氏菌抗体检测用试剂盒，该试剂盒包括：第一方面所述的单链抗体。
本发明第六方面提供了一种(非诊断目的)的检测样本中布鲁氏菌抗体的方法，该方法包括使用第一方面所述的单链抗体对样本进行竞争ELISA检测。
本发明中，应用布鲁氏菌抗原免疫小鼠，收集小鼠脾细胞，提取RNA，构建免疫抗体库，通过噬菌体展示和淘选技术，制备了能和布鲁氏菌抗原特异性结合的单链抗体。应用制备的原核表达质粒转化大肠杆菌，就可以实现抗体的低成本、高效率、高质量的大量制备，为制备更加质优价廉的布病cELISA试剂盒奠定核心原料基础。
附图说明
图1为竞争ELISA法检测布鲁氏菌抗体的结果(抗体相对含量与405nm处的吸光度)；
图2为竞争ELISA法检测布鲁氏菌抗体的结果(抗体相对含量与405nm处吸光度的抑制率)。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供的单链抗体包括轻链可变区、重链可变区以及连接所述轻链可变区与所述重链可变区的接头，其特征在于，所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第1-114位氨基酸所示，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第130-252位氨基酸所示。
本发明的优选实施方式中，所述接头序列如SEQ ID NO：1的第115-129位氨基酸所示。
本发明提供的单链抗体的序列如SEQ ID NO：1所示：
EIVLTQSPVTLSVSPGERATLSCRASQSVIGNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASARAAGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLKSEDFAVYYCQQYNNWPPYTFGQGTKVEIKRSGGSTGGGGSGGGGSGGGGSVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLNLRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIGASDGNVYYADSVKGRFIISRDNSKDTLDLQMNSLRVEDTAVYYCTKDHWLASWTDEMDVWGQGTLVTVSSAS(SEQ ID NO：1)。
根据本发明的一种优选实施方式，所述单链抗体的序列由SEQ ID NO：1以及依次连接于SEQ ID NO：1的C段的V5标签和His标签组成(如SEQ ID NO：3所示)。
本发明还提供了编码上述单链抗体的基因。
根据本发明的一种优选实施方式，所述基因的序列可以如SEQ ID NO：2的第1-756位碱基所示，也可以如SEQ ID NO：2(含V5标签编码序列和His标签编码序列)所示。该优选实施方式中，SEQ ID NO：2的第1-342位示出的是轻链可变区编码序列，SEQ ID NO：2第343-387位(或SEQ ID NO：5)示出的是接头编码序列，SEQ ID NO：2第388-756位示出的是重链可变区编码序列。
gaaattgtgttgacacagtctccagtcaccctgtctgtgtctccaggggagagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttatcggcaacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccgccagggccgccggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctgaagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtataataactggcctccgtacacttttggccaggggaccaaggtggaaatcaaacgttccggagggtcgaccggtggaggcggttcaggcggaggtggctct ggcggtggcggatcggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagtctctggactcaaccttagaagatatgccatgagttgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcggtaataggtgccagtgatggaaatgtctactacgctgactccgtgaagggccgattcatcatctcaagagacaattccaaggacacgttggatctgcaaatgaacagcctgagagtcgaggacacggccgtatattactgtacgaaagatcattggctcgccagttggaccgacgagatggacgtctggggccagggcaccctggtcactgtctcctcagctagcggcaaaccaatcccaaacccactgctgggcctggatagtactcaccatcaccatcaccat(SEQ ID NO：2)
本发明提供的表达载体包括如上所述的基因。所述表达载体可以为插入有上述基因的pET32a。
本发明提供的宿主细胞转化有如上所述的表达载体。所述宿主细胞可以重组菌。所述重组菌可以为含有本发明的表达载体的菌株，例如，可以通过将本发明的表达载体转入感受态菌株(如大肠杆菌感受态菌株BL21(DE3))中而获得。
本发明提供的布鲁氏菌抗体检测用试剂盒包括：如上所述的单链抗体。所述试剂盒为基于竞争ELISA原理的布鲁氏菌抗体的检测用试剂盒，因此可以含有实施竞争ELISA所需的各种试剂，例如，所述试剂盒还可以包括洗液、稀释液、辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗V5单克隆抗体、HRP的显色底物、反应终止液等。
本发明提供的(非诊断目的地)检测样本中布鲁氏菌抗体的方法包括使用如上所述的单链抗体对样本进行竞争ELISA检测。
根据更具体的实施方式，上述检测方法包括：从布鲁氏菌培养物中分离布鲁氏菌抗原脂多糖(LPS)，包被酶标板孔；将待测样本适当稀释后与单链抗体混合，静置后加入孔中；孵育后洗涤，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗V5单克隆抗体；孵育后洗涤，加入HRP的显色底物(ABTS)；孵育后终止反应，酶标仪405nm比色，吸光度的大小与样本中的布鲁氏菌抗体浓度负相关。
一般地，本发明提供的制备单链抗体的方法包括：
(1)使用源自布鲁氏菌的脂多糖免疫小鼠，分离小鼠脾细胞并提取总RNA，应用反转录技术制备cDNA；
(2)以cDNA为模板，分别合成小鼠IgG重链编码序列和轻链编码序列，应用重叠延伸PCR技术连接重链编码序列和轻链编码序列；
(3)将步骤(2)连接后获得的编码序列插入噬菌粒载体中，构建免疫抗体库；通过噬菌体展示和抗原特异性淘选，筛选得到特异性结合源自布鲁氏菌的脂多糖的单链抗体；
(4)任选地，将编码上述单链抗体的DNA片段亚克隆入原核表达载体中，构建重组质粒，将重组质粒转化入大肠杆菌中，诱导表达，亲和纯化即可得到单链抗体。步骤(4)为选择性进行的步骤，为了获得大量的单链抗体，优选进行步骤(4)。
根据更具体的实施方式，上述制备方法包括：从布鲁氏菌培养物中分离布鲁氏菌抗原脂多糖(LPS)，免疫Balb/c小鼠；分离小鼠脾细胞，提取总RNA，应用PCR和分子克隆技术将免疫球蛋白重链编码片段和轻链编码片段连接起来，并插入噬菌粒载体中，构建免疫抗体库；通过噬菌体展示和抗原特异性淘选，获得能特异性结合布鲁氏菌抗原LPS的单链抗体；将编码该抗体的DNA片段亚克隆入原核表达载体pET32a中，构建质粒pET32a-Bru-ScFv；将质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并亲和纯化，得到单链抗体。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，室温指“25℃”。
实施例1
该实施例用来说明布鲁氏菌抗原特异性ScFv的制备
(1)布鲁氏菌抗原LPS的制备
①称取牛种布鲁氏菌S99灭活菌(购自IDEXX公司，货号P00120)湿重约2.5g，加入17mL双蒸水重悬，转入100mL蓝盖丝口瓶中，加热到66℃；将菌液缓慢加入到19mL预热至66℃的90％(V/V)苯酚(分析纯)溶液中，在66℃摇20分钟(每30秒摇5秒)。
②从水浴锅中取出反应瓶，放置于4℃冰箱冷却30分钟；将冷却的溶液转入圆底离心管中，4℃，10 000g，离心2.5小时；用玻璃注射器吸取第三层酚相至圆底离心管中，于4℃，10 000g，离心3分钟。
③将酚相转入100mL蓝盖丝口瓶中，加入50mL含0.5mL饱和醋酸钠(分析纯)的冷甲醇(分析纯)溶液，4℃静置2.5小时；4℃，10 000g，离心15分钟，弃上清。
④沉淀重悬于8mL灭菌双蒸水中，室温避光搅拌2.5小时，4℃，10 000g，离心15分钟，取上清；沉淀再次重悬于8mL灭菌双蒸水中，室温避光搅拌1小时，4℃，10 000g，离心15分钟，取上清。
⑤将两次上清混匀，加入0.8g三氯乙酸(分析纯)，室温搅拌10分钟；4℃，10 000g离心15分钟，取上清并转入到3.5kDa透析袋(北京索莱宝公司)中，用1L双蒸水避光4℃透析4天，每12小时换液一次，得到布鲁氏菌抗原—LPS。
⑥用制备的LPS包被酶标板孔，通过间接ELISA(iELISA)法，采用商业化布鲁氏菌抗体(Abcam公司)进行鉴定，同时设置阴性对照和阳性对照，判断所制备的LPS是否具有被相应的抗体识别和结合，即是否具有免疫原性。
⑦将鉴定合格的产品分装至棕色青霉瓶中，1mL/瓶，冻干室温避光保存备用。
(2)免疫抗体库的制备
①将从牛种布鲁氏菌S99中纯化的LPS与等量的弗氏完全佐剂(Sigma公司)通过双注射器互推法乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对2只8周龄左右的Balb/c小鼠进行基础免疫(100μg/mL)；2周后，将LPS与等量的弗氏不完全佐剂(Sigma公司)乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对小鼠进行追加免疫(100μg/ml)；1周后处死小鼠取出小鼠脾脏，研磨法分离脾细胞，Trizol(碧云天生物)法制备小鼠脾细胞总RNA。
②应用反转录(RT)技术，制备cDNA；以cDNA为模板，分别应用小鼠IgG轻链特异性引物和重链特异性引物(序列参见文献：Antibody Engineering,R.Kontermann andS.Dubel,Springer Verlag,Heidelberg,Germany(2010)pp.21-44)，PCR分别合成小鼠IgG重链编码序列和轻链编码序列(RT和PCR试剂盒购自NEB公司)；应用重叠延伸PCR技术(splicing by overlap extension PCR，简称SOE PCR)，将二者连接起来，中间带上接头(linker)，两端分别带上sfiI和NotI酶切位点，最终形成的PCR产物序列模式如下：sfiI酶切位点(ggcccagccggcc，SEQ ID NO：4)-VL编码片段(SEQ ID NO：2第1-342位碱基所示)-接头编码片段(ggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcg，SEQ ID NO：5)-VH编码片段(SEQ ID NO：2第388-756位碱基所示)-NotI酶切位点(gcggccgc，SEQ ID NO：6)。
③将PCR产物用sfiI和NotI(NEB公司)双酶切，回收后，与同样双酶切的噬菌粒载体pCANTAB5E(优宝生物)进行连接反应，并将连接反应的产物电转入感受态大肠杆菌TG1(NEB公司)，过夜培养，此为原始抗体库。在该细菌培养体系中加入辅助噬菌体M13K07(NEB公司)共培养，收集培养上清，过滤除菌后即为噬菌体抗体库。
④应用布鲁氏菌抗原LPS包被酶标板孔，加入噬菌体，孵育后洗涤除去未结合成分，加入HRP标记的噬菌体特异性抗体(Abcam公司)，孵育后洗涤除去未结合成分，加入HRP底物(Sigma公司)显色(此为噬菌体ELISA)；收集阳性孔中的噬菌体，进入下一轮淘选；收集经过4轮淘选后阳性中的噬菌体，转入大肠杆菌TG1，铺入琼脂平板，过夜培养；挑取细菌克隆液体培养，提取质粒，进行DNA测序(上海英骏生物技术有限公司)鉴定，选择正确的噬菌粒保存。
(3)布鲁氏菌抗原特异性ScFv表达载体的制备
通过PCR技术和DNA连接反应将噬菌粒中的ScFv编码片段亚克隆入原核表达载体pET32a(淼灵生物)，并带上V5标签，制备原核表达质粒pET32a-Bru-ScFv，经DNA双酶切和DNA测序鉴定，选取正确的克隆。该质粒中蛋白编码片段模式为：ScFv编码片段-V5标签编码片段-His标签编码片段，DNA序列(5’-3’)如SEQ ID NO：2所示。翻译后的蛋白氨基酸序列模式为ScFv-V5Tag-His Tag，其氨基酸序列(N端-C端)如SEQ ID NO：3所示：
EIVLTQSPVTLSVSPGERATLSCRASQSVIGNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASARAAGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLKSEDFAVYYCQQYNNWPPYTFGQGTKVEIKRSGGSTGGGGSGGGGSGGGGSVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLNLRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIGASDGNVYYADSVKGRFIISRDNSKDTLDLQMNSLRVEDTAVYYCTKDHWLASWTDEMDVWGQGTLVTVSSASGKPIPNPLLGLDSTHHHHHH(SEQ ID NO：3)
(4)布鲁氏菌抗原特异性ScFv的表达、纯化与鉴定
将原核表达质粒pET32a-Bru-ScFv转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)培养，800mg/mLIPTG，28℃震荡培养，诱导蛋白表达；收集细菌培养上清，镍柱亲和层析纯化得到单链抗体Bru-ScFv，纯化过程如下：
①转化重组质粒pET32a-Bru-ScFv的BL21(DE3)(NEB公司)经800mg/mL IPTG(Sigma公司)诱导表达后，6000rpm离心，收集菌体沉淀。
②使用阳离子层析柱HiTrap SP.F.F的结合缓冲液(20mmol/L磷酸二氢钠，pH5.8，分析纯)重悬菌体沉淀后冰浴中超声破菌(功率300W，工作10s，间隙10s，重复15次，总体循环3轮)。
③收集超声破碎产物，4℃，10 000rpm，离心15分钟，收集上清以0.45μm微孔滤膜过滤，收集滤液。
④将滤液上柱AKTAprime(Amersham公司)，结合缓冲液平衡后用洗脱液(20mmol/L磷酸二氢钠，1M NaCl，pH 5.8，分析纯)线性洗脱，收集主洗脱峰。
⑤将含目的蛋白的洗脱峰用His-结合缓冲液(20mmol/L磷酸二氢钠，0.5M NaCl，pH 7.4，分析纯)按1:9的体积比稀释后上HisTrap HP柱再次纯化，His-结合缓冲液平衡后用His-洗脱液(20mmol/L磷酸二氢钠，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH 7.4，分析纯)先用10％B缓冲液洗脱去除非特异性结合的杂蛋白，平衡后用100％B缓冲液将目的蛋白洗下。
⑥用BCA(碧云天生物)法进行蛋白定量测定，SDS-PAGE法鉴定产品的纯度。
⑦间接ELISA法鉴定LPS特异性单链抗体：将纯化的布鲁氏菌LPS包被稀释液稀释，往酶标板每孔加入100μl，4℃包被过夜。次日取出酶标板，弃抗原，洗板。将待鉴定单链抗体作1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000等稀释，按100μl/孔加入对应条孔中，另作空白及阴性、阳性对照孔。37℃孵育1小时，洗板，加入小鼠抗V5单克隆抗体(1:2000，购自Invitrogen，货号为MA5-15253)，37℃孵育1小时，洗板，加入HRP标记山羊抗小鼠IgG(1:3000，购自Invitrogen，货号为31430)，按100μl/孔加入对应条孔中，37℃孵育40分钟。弃液，洗板，拍干，加入ABTS底物显色液(Sigma公司)100μl/孔，避光显色10分钟，加入终止液(2M H2SO4，分析纯)50μl/孔。在405nm处测定吸光度值，判断单链抗体的滴度(呈现阳性结果的最大稀释倍数)。
实施例2
本实施例用来说明竞争ELISA法检测样本中布鲁氏菌抗体的方法
(1)布鲁氏菌LPS包被酶标板
①每块酶标板准备24mL包被液(NaHCO3 2.93g，Na2CO3 1.59g，双蒸水溶解，总体积1L，pH 9.6，分析纯)，取LPS抗原(根据LPS的ELISA定量结果和方阵滴定数据确定LPS的包被浓度)加入到24mL抗原包被液中，向每孔中加入200μL稀释好的抗原。贴上封条，4℃包被约20小时。
②甩掉抗原，干净自来水清洗酶标板5次，洗涤完成后在吸水纸上轻敲数下至无明显液体残留，然后避光风干18小时。
③不同批次包被酶标板要用高值阳性样本、中值阳性样本、阴性样本鉴定。
④包被酶标板可以立即使用，或者室温避光、密闭保存12个月。
(2)HRP标记山羊抗小鼠IgG
以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与抗体蛋白的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，具体步骤如下：
①HRP酶的准备：称取10mg HRP酶(Sigma公司)，加2mL纯水配置为5mg/ml的HRP液体，按照每mg HRP酶加入34μL计算，加340μLNaIO4(Sigma公司)，4℃避光放置，1小时后，按照每mg HRP酶加入250μL的量加入乙二醇(分析纯)250μL，避光放置4℃，30分钟后转入透析袋中，用1mM醋酸缓冲液(pH 4.0-4.4)透析过夜，期间换液2次，均要求避光。
②抗体的准备：购买商品化山羊抗小鼠IgG(中山生物)，0.01M的PBS缓冲液(碧云天生物)进行4℃透析过夜，并测定其浓度。
③标记：抗体与HRP酶按1:1(质量比)混合，加入1M Na2CO3缓冲液(1:80，体积比，分析纯)，调节反应体系的pH为9.5，25℃反应2.5小时。
④终止：新鲜配制0.1M NaH4B(4mg/mL，分析纯)，按照每mg HRP酶加入47μL。4℃放置2小时后，转入透析袋。用0.01M PBS缓冲液(pH 7.0-7.2)透析过夜，期间换液两次，避光。
⑤分装保存：标记好的抗体用棕色EP管分装，并测定抗体效价，-20℃避光保存。
(3)基于竞争ELISA原理的布鲁氏菌抗体的检测
①取包被有布鲁氏菌LPS的酶标板，平衡至室温备用。
②将100μL适当稀释的待测动物血清样本、阳性对照样本、阴性对照样本与100μL本发明中制备的布鲁氏菌抗原特异性单链抗体混合，室温孵育15分钟。
③将样本-ScFv混合物加入包被有LPS的酶标板孔中，室温孵育1小时。
④用洗液(Na2HPO4 0.14g，Tween-20 1mL，双蒸水定容至1L，分析纯)洗板5次，拍干，每孔加入小鼠抗V5单克隆抗体(1:2000，Invitrogen公司)200μL，室温孵育1小时。
⑤用洗液洗板5次，拍干，每孔加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1:3000)，室温孵育40分钟。
⑥用洗液洗板5次，拍干，每孔加入ABTS显色剂混合物100μL，室温避光孵育10分钟；每孔加入反应终止液(2M H2SO4，分析纯)50μL。
⑦405nm处，酶标仪读取并记录各孔的吸光度值。
⑧结果计算：抑制率(percentage of inhibition，PI)＝(未抑制对照空吸光度Ac-样本检测孔吸光度As)/未抑制对照空吸光度×100％，PI≥20％为阳性，呈现阳性结果的最大稀释倍数为样本中布鲁氏菌抗体的效价。
其中，取布鲁氏菌抗体阳性的混合牛血清(经虎红平板凝集试验鉴定为阳性)按照1:100稀释后，作为基础标本，分别取0μL、50μL、100μL、150μL、200μL、250μL和300μL基础标本，用标本稀释液(Na2HPO4 1.4g,NaCl 7g,KCl 0.2g,KH2PO4 0.2g,Tween-20 0.5mL,1％酚红1mL，双蒸水定容至1L，分析纯)稀释成总体积600μL，各稀释样本的布鲁氏菌抗体相对含量分别为0、50、100、150、200、250和300，按照上述步骤①-⑦测定各标本在405nm处的吸光度，结果如图1所示，进一步按照步骤⑧所记载的计算方法计算得到抑制率，结果如图2所示。从图1和图2可以看出，吸光度和抑制率与检测对象的浓度之间存在数量关系，说明本发明得到的单链抗体能够用于布病抗体的检测。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林医药学院 重庆探生科技有限公司
<120> 布鲁氏菌单链抗体及其用途
<141> 2017-12-27
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 252
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Gly Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ala Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Lys Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Gly Gly
100 105 110
Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Asn Leu Arg Arg Tyr
145 150 155 160
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Val Ile Gly Ala Ser Asp Gly Asn Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Asp
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Thr Lys Asp His Trp Leu Ala Ser Trp Thr Asp Glu Met Asp Val Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
245 250
<210> 2
<211> 816
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gaaattgtgt tgacacagtc tccagtcacc ctgtctgtgt ctccagggga gagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttatc ggcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccgcca gggccgccgg catcccagac 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctgaagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcctccgta cacttttggc 300
caggggacca aggtggaaat caaacgttcc ggagggtcga ccggtggagg cggttcaggc 360
ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggtg cagctgttgg agtctggggg aggcttggta 420
cagcctgggg ggtccctgag actctcctgt gcagtctctg gactcaacct tagaagatat 480
gccatgagtt gggtccgcca ggctccaggg aaggggctgg agtgggtctc ggtaataggt 540
gccagtgatg gaaatgtcta ctacgctgac tccgtgaagg gccgattcat catctcaaga 600
gacaattcca aggacacgtt ggatctgcaa atgaacagcc tgagagtcga ggacacggcc 660
gtatattact gtacgaaaga tcattggctc gccagttgga ccgacgagat ggacgtctgg 720
ggccagggca ccctggtcac tgtctcctca gctagcggca aaccaatccc aaacccactg 780
ctgggcctgg atagtactca ccatcaccat caccat 816
<210> 3
<211> 272
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Gly Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ala Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Lys Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Gly Gly
100 105 110
Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Asn Leu Arg Arg Tyr
145 150 155 160
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Val Ile Gly Ala Ser Asp Gly Asn Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Asp
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Thr Lys Asp His Trp Leu Ala Ser Trp Thr Asp Glu Met Asp Val Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Lys Pro Ile
245 250 255
Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr His His His His His His
260 265 270
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggcccagccg gcc 13
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 45
<210> 6
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gcggccgc 8

Claims (9)

1.一种布鲁氏菌单链抗体，该单链抗体包括轻链可变区、重链可变区以及连接所述轻链可变区与所述重链可变区的接头，其特征在于，所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第1-114位氨基酸所示，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第130-252位氨基酸所示。
2.根据权利要求1所述的单链抗体，其中，该单链抗体的序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1或2所述的单链抗体，其中，所述单链抗体的序列由SEQ ID NO：1以及依次连接于SEQ ID NO：1的C端的V5标签和His标签组成，其序列如SEQ ID NO：3所示。
4.编码权利要求1-3中任意一项所述的单链抗体的基因。
5.根据权利要求4所述的基因，其中，所述基因的序列如SEQ ID NO：2所示。
6.一种表达载体，其特征在于，该表达载体包括权利要求4或5所述的基因。
7.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞转化有权利要求6所述的表达载体。
8.一种布鲁氏菌抗体检测用试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：权利要求1-3中任意一项所述的单链抗体。
9.一种非诊断目的的检测样本中布鲁氏菌抗体的方法，其特征在于，该方法包括使用权利要求1-3中任意一项所述的单链抗体对样本进行竞争ELISA检测。
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