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CN119306838A - 一种抗人pd-1的鲨鱼纳米抗体及其应用 - Google Patents

一种抗人pd-1的鲨鱼纳米抗体及其应用 Download PDF

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CN119306838A
CN119306838A CN202411582891.6A CN202411582891A CN119306838A CN 119306838 A CN119306838 A CN 119306838A CN 202411582891 A CN202411582891 A CN 202411582891A CN 119306838 A CN119306838 A CN 119306838A
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seq
heavy chain
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张迎娜
丁丽
王玉芳
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Jiangsu Baiying Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种抗人PD‑1的鲨鱼纳米抗体及其应用，属于生物技术领域。本发明的抗人PD‑1的鲨鱼纳米抗体，仅由重链构成，所述的重链包括重链可变区，所述抗体重链可变区vNAR包括CDR1以及CDR3；CDR1即SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的氨基酸残基25‑32；CDR3即SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的氨基酸残基84‑102。本发明还提供了一种抗人PD‑1的鲨鱼纳米抗体的编码核酸、表达载体和宿主细胞等，还提供了本发明纳米抗体的生产方法及其应用。本发明的纳米抗体具备高亲和力、高特异性等优势，可有效阻断PD‑1/PD‑L1通路，具有应用于肿瘤的治疗与诊断领域的潜力。

Description

一种抗人PD-1的鲨鱼纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗人PD-1的鲨鱼纳米抗体及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
程序性死亡受体-1(PD-1)，是一种重要的免疫抑制分子，可在B细胞和成熟的T细胞表面表达，而PD-1和PD-L1结合会产生共抑制信号，使得T细胞失去攻击癌细胞的能力，肿瘤细胞中，肿瘤细胞能够调节PD-L1的表达，表达的PD-L1和T细胞表面的PD-1结合，导致T细胞失去杀伤功能，使得肿瘤细胞的生长不受限制。所以需要一种能够与PD-1特异性结合从而阻断PD-1和PD-L1相互作用的抗体，例如利用抗PD-1抗体与PD-1特异性结合，进而阻断PD-1与PD-L1相互作用。
20世纪90年代，国外学者在护士鲨体内发现了天然缺失抗体轻链部分仅含有重链部分的抗体，其特异性结合抗原的重链可变区被称为vNAR。因其分子量仅为12-15kDa，亦被称为纳米抗体。与传统单克隆抗体相比，鲨鱼纳米抗体具有相对分子质量小、稳定性高、成药性强，复杂修饰少，制备工艺简单等优势，在药物开发、体外诊断以及免疫检测等领域展现出良好的发展前景。
从结构上看，vNAR结构紧凑是自然界中分子量最小(<11kDa)的抗原结合单位，从稳定性上，vNAR具有较高的热稳定性和耐酸碱性，在不同的温度和pH条件下保持较好的稳定性，另外，vNAR较长的CDR3区域使其表现出与抗原结合的高亲和力和特异性。
基于此，本发明提出一种新型的、具有阻断PD-1与PD-L1结合功能的鲨鱼纳米抗体，具有应用于肿瘤的治疗与诊断领域的潜力。
发明内容
本发明的主要内容是：提供一种抗人PD-1的鲨鱼纳米抗体及其应用，其能特异性识别PD-1并阻断PD-1与PD-L1的结合。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
在本发明的第一方面，提供了一种抗人PD-1的鲨鱼纳米抗体，所述鲨鱼纳米抗体仅由重链构成，所述的重链包括重链可变区，所述重链可变区vNAR含有CDR1及CDR3；CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，SEQ ID NO：3序列即SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的氨基酸残基25-32；SEQ ID NO：4序列即SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的氨基酸残基84-102。
优选地，所述抗体重链可变区vNAR的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在本发明的第二方面，提供了编码如第一方面所述抗人PD-1的鲨鱼纳米抗体的核苷酸序列。
优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在本发明的第三方面，提供了具有如第二方面所述的核苷酸序列的载体。
优选地，所述载体为pcDNA3.4。
在本发明的第四方面，提供了含有如第三方面所述载体的宿主细胞。
优选地，所述宿主细胞为CHO-K1。
在本发明的第五方面，提供了如第一方面所述抗人PD-1的鲨鱼纳米抗体在制备PD-1检测试剂中的应用。
在本发明的第六方面，提供了如第一方面所述抗人PD-1的鲨鱼纳米抗体在制备PD-1与PD-L1结合阻断剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
1)本发明选择条纹斑竹鲨作为抗体制备的模式动物来进行vNAR的制备，其不属于濒危鲨鱼种类，且体型小、易于人工繁养，适合用于抗体开发。
2)本发明通过噬菌体展示技术获得了靶向PD-1的鲨鱼纳米抗体，该抗体能够特异性识别PD-1并阻断与PD-L1结合，具有肿瘤治疗药物制备和肿瘤检测的应用前景。
附图说明
图1为实施例2中鲨鱼脾脏RNA和巢氏PCR的琼脂糖凝胶电泳。A为RNA，B为第一轮PCR，C为第二轮PCR。
图2为实施例3中单克隆筛选结果，A为第一轮淘选，B为第二轮淘选，C为第三轮淘选。
图3为实施例3中阳性克隆测序统计结果。
图4为实施例4中抗体哺乳系统表达载体图谱。
图5为实施例4中纯化抗体的SDS-PAGE结果，其中R为还原条件，NR为非还原条件，M为marker。
图6为实施例4中纯化抗体的SEC-HPLC结果，其中A为214nM，B为280nM。
图7为实施例5中纯化抗体与hPD-1/His重组蛋白的结合。
图8为实施例6中纯化抗体的SPR亲和力检测结果，其中A为ANb-17-CD28-3LP-3、B为阳性对照抗体Sintilimab、C为阴性对照抗体Anti-HEL IgG1 hFc。
图9为实施例7中纯化抗体阻断PD-1与PD-L1结合的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂和材料如无特别说明均为市售品。
本发明中，抗体的制备方法步骤如下：本发明首先用hPD-1/His重组蛋白对条纹斑竹鲨进行6次免疫，免疫结束后取条纹斑竹鲨的脾脏；对脾脏细胞进行RNA的抽提并反转录，通过巢氏PCR的方法获得重链抗体可变区vNAR基因片段，对噬菌粒载体和基因片段进行酶切连接转入大肠杆菌进行扩增，构建噬菌体文库，通过液相淘选的方式筛选与靶抗原特异性结合的抗体，再构建哺乳系统表达载体，然后通过哺乳动物细胞表达系统进行抗体的表达与纯化，最后获得了具有高灵敏度和特异性的抗人PD-1的鲨鱼纳米抗体。
实施例1：条纹斑竹鲨的免疫
按照10L水中加入500μL麻醉剂的比例配置麻醉用海水，将鲨鱼放入其中待其反应迟钝或静止不动时取出并用湿润的纱布包裹其腮部，免疫部位为左右腹鳍，每15天免疫一次，共免疫6次，每次100μg hPD-1/His重组蛋白(Biointron，B2097)混合100μL双相佐剂，第六次免疫后间隔两周采集全血并取脾脏。
实施例2：鲨鱼纳米抗体免疫库的构建
通过TRIZOL(thermofisher，15596018)法提取脾脏RNA，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并采用逆转录试剂盒(TaKaRa，2690A)反转录为cDNA，根据条纹斑竹鲨vNAR保守序列设计引物，引物两端带有克隆进噬菌粒载体的SfiI酶切位点，巢氏PCR法扩增获得vNAR区编码基因，结果见图1。将构建好的质粒转化入大肠杆菌SS320，辅助噬菌体M13K07系统扩增包装，将vNAR展示在噬菌体的表面，成为鲨鱼纳米抗体库。
实施例3：筛选抗PD-1的鲨鱼纳米抗体
采用液相淘选的方法，吸取三份30μL的DynabeadsTM M-280链霉亲和素磁珠(Thermo FisherScientific，11206D)于1.5mL EP管中，用1mL 0.05％PBST清洗一遍后加入1mL的5％NON-fat Powdered Milk(Sangon Biotech，A600669-0250)，25℃封闭1小时。取2E+12C.F.U.的噬菌体，加入1mL 5％NON-fat Powdered Milk，25℃封闭1小时。取另外一份250μL磁珠于1.5mL EP管中，加入1mLPBS，15μg生物素标记的hPD-1/His重组蛋白，25℃，孵育1小时，1mL 0.05％PBST清洗5遍，加入1mL 5％NON-fat Powdered Milk，25℃封闭1小时。去除30μL磁珠中的封闭液，将封闭好的噬菌体依次与3份30μL空白磁珠分别孵育0.5小时以去除背景干扰。将去除过背景的噬菌体上清加到封闭好的250μL磁珠中，25℃孵育1小时。去掉未与磁珠结合的噬菌体上清，剩下的磁珠用1mL 0.05％PBST清洗15遍，重悬后加入到SS320的对数期菌液中扩增，用于下一轮淘选。
经过三轮加压淘选后，每轮各挑1板，共挑3板264个单克隆进行筛选，样品准备过程如下：在96孔深孔板中加600μL 2×YT含四环素和羧苄青霉素的双抗培养基，接种单克隆，220rpm，37℃培养3h，每孔吸出100μL菌液至新的96孔板中保存备用，再向原96孔板中补充100μL 2×YT双抗培养基和IPTG，30℃诱导表达过夜。次日离心弃上清，菌体用TESbuffer(30mM Tris-HCl，0.5M蔗糖，0.5mM EDTA，pH＝8.0)破碎以释放周质空间的待测融合蛋白。
单克隆的检测过程如下：将1μg/mLhPD-1/His重组蛋白和1μg/mLBSA分别包被在酶标板上(Corning，3590)，4℃过夜，次日，用0.1％PBST清洗3遍，3％BSA(Sangon，A500023)封闭1小时，0.1％PBST清洗3遍，加入提前准备好的样品，100μL/well，25℃孵育1小时，0.1％PBST清洗5遍，加入Mouse anti-flag，HRP，mAb(Sigma，A8592)，1：10000稀释使用，25℃孵育1小时。10μg/mLAnti-PD1/hFc抗体Sintilimab(Biointron，B682101)做阳性对照，Anti-HELIgG1 hFc(Biointron，B117901)做阴性对照，对照抗体二抗使用GoatAnti-Human IgG-Fc,HRP(Sigma，A0170)，1：10000稀释。0.1％PBST清洗5遍后加TMB(Makewonderbio，1001)室温避光显色，最后用终止液终止显色(Beyotime，P0215)，酶标仪读取450nm波长下的吸光值，我们将3×blank(PD-1)＜OD450＜2×blank(BSA)的克隆定义为阳性克隆。检测结果如图2所示。
结果表明264个单克隆中有118个识别PD-1的阳性克隆。对这118个阳性克隆进行测序分析，得到5个Unique sequence，其中Unique 1为优势富集克隆，如图3所示。
Unique1对应的优势单克隆为Shark-PD1-6M-3LP-72，其重链可变区DNA序列为SEQID NO：1，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
在氨基酸序列中，氨基酸残基25-32(即SEQ ID NO：3)为vNAR CDR1，氨基酸残基84-102(即SEQ ID NO：4)为vNAR CDR3。
实施例4：抗PD-1的鲨鱼纳米抗体(vNAR-hFc)的哺乳系统表达和纯化
构建实施例3中Shark-PD1-6M-3LP-72纳米抗体的哺乳系统表达载体pcDNA3.4，如图4，然后以此制备质粒。抗体的表达宿主细胞选择CHO-K1细胞，表达体积为40mL，表达后的上清液使用ProteinA亲和层析柱进行纯化，具体操作如下：取5.5mL密度为7.2E+6cells/mL已传4代的CHO-K1细胞，在1000rpm离心5min，弃上清液；向离心管中加入1.4mL电转液，混匀后再加入质粒；取1.0mL上一步的混合液加到电击杯中，然后放入电转仪中540V-580V进行电转；提前准备好两个摇瓶，每个摇瓶各装有20mL DMEM培养基，将电击好的细胞均分到这两个摇瓶中，室温静置30min；将摇瓶放入CO2培养箱内37℃、转速为250rpm和控制5.0％CO2浓度进行培养，24h后添加2mL补料后继续培养4天；用1×PBS平衡ProteinA亲和层析柱，平衡结束后准备上样(即细胞培养上清)，上样流速设定为1.0mL/min，上样结束后用1×PBS洗涤杂质，再用pH＝3.4的醋酸钠缓冲液洗脱与亲和柱结合的抗体，最后将高浓度蛋白吸至透析袋放入装有1×PBS的烧杯中透析，即可获得高纯度的表达抗体。
通过SDS-PAGE和SEC-HPLC测其纯度，结果分别如图5和图6所示，抗体纯度均达到95％以上，纯度较高。
实施例5抗体与hPD-1/His重组蛋白的结合
将1μg/mLhPD-1/His重组蛋白包被到酶标板上，4℃过夜，0.1％PBST洗板3次，3％BSA封闭1小时，0.1％PBST洗板3次，将Shark-PD1-6M-3LP-72纳米抗体和对照抗体稀释至100nM作为首孔浓度，4倍梯度稀释，末孔为空白，25℃孵育1小时，0.1％PBST洗板5次，二抗用HRP标记的Goat anti-human IgG-Fc，1:10000稀释，25℃孵育0.5小时，0.1％PBST洗板5次。每孔加100μLTMB室温避光反应3-5分钟后终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值。其中阳性对照为Anti-Human PD-1(Sintilimab)，阴性对照为Anti-HEL,human IgG1Fc。
ELISA结果如图7所示：Shark-PD1-6M-3LP-72可与hPD-1/His结合，其EC50为0.30nM。
实施例6：抗体与hPD-1/His的SPR亲和力检测
将1μg/mL的纯化抗体以10μL/min的流速分别注入到实验通道，捕获量约为257-510RU。将hPD-1/His重组蛋白用HBS-EP+Buffer运行缓冲液从200nM开始，进行2倍稀释。将稀释后的hPD-1/His重组蛋白以30μL/min的流速注入到实验通道与参比通道，结合解离步骤均在运行缓冲液中进行。ProteinA Chip(Cytiva，29127556)需要用10mM pH＝1.5的Gly-HCl以30μL/min的流速再生30s，洗掉未解离的分析物。使用Biacore 8K分析软件计算样品的KD值。参比通道用于背景的扣减，Fitting model 1：1。
结果如图8所示：Shark-PD1-6M-3LP-72的亲和力为4.80E-08M。
实施例7：抗体阻断功能检测
将1μg/mLhPD-1/His重组蛋白包被到酶标板，4℃过夜，0.1％PBST洗板3次，3％BSA封闭1小时，0.1％PBST洗板3次，将Shark-PD1-6M-3LP-72纳米抗体和对照抗体稀释至200nM作为首孔浓度，3倍梯度稀释，末孔为空白，50μL/well加到酶标板上，再加入终浓度为0.13μg/mL的hPD-L1/mFc(Biointron，B1576)，50μL/well，混匀后25℃孵育1小时，0.1％PBST洗板5次，二抗用HRP标记的GoatAnti-Mouse IgG(Jackson，115-035-164)，1:10000稀释使用，25℃孵育1小时，0.1％PBST洗板5次。每孔加100μLTMB室温避光反应3-5分钟后终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值。
结果如图9所示，Shark-PD1-6M-3LP-72可以阻断PD-1与PD-L1的结合。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种抗人PD-1的鲨鱼纳米抗体，其特征在于，所述鲨鱼纳米抗体仅由重链构成，所述的重链包括重链可变区，所述重链可变区vNAR含有CDR1及CDR3；CDR1的氨基酸序列如SEQID NO：3所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，SEQ ID NO：3序列即SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的氨基酸残基25-32；SEQ ID NO：4序列即SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的氨基酸残基84-102。
2.根据权利要求1所述的抗人PD-1的鲨鱼纳米抗体，其特征在于，所述重链可变区vNAR的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.编码如权利要求1或2所述抗人PD-1的鲨鱼纳米抗体的核苷酸序列。
4.含有如权利要求3所述核苷酸序列的载体。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为pcDNA3.4。
6.含有如权利要求4所述载体的宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，宿主细胞为CHO-K1。
8.如权利要求1或2所述抗人PD-1的鲨鱼纳米抗体在制备PD-1检测试剂中的应用。
9.如权利要求1或2所述抗人PD-1的鲨鱼纳米抗体在制备PD-1与PD-L1结合阻断剂中的应用。
10.如权利要求1或2所述抗人PD-1的鲨鱼纳米抗体在制备肿瘤的治疗药物或诊断试剂方面的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119708237A (zh) * 2025-02-27 2025-03-28 百吉生物医药(广州)股份有限公司 一种抗程序性死亡受体1抗体g09及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108017712A (zh) * 2017-11-23 2018-05-11 弘业新创抗体技术股份有限公司 一种鲨鱼抗体来源的蛋白骨架及其应用
CN113502309A (zh) * 2021-06-21 2021-10-15 中国科学院海洋研究所 一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法
CN113683702A (zh) * 2021-09-27 2021-11-23 闽江学院 条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体的制备方法及其应用
CN118475603A (zh) * 2021-11-03 2024-08-09 香港城市大学深圳研究院 高亲和力抗EGFP和抗SARS-CoV-2 vNAR单域抗体及其用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108017712A (zh) * 2017-11-23 2018-05-11 弘业新创抗体技术股份有限公司 一种鲨鱼抗体来源的蛋白骨架及其应用
CN113502309A (zh) * 2021-06-21 2021-10-15 中国科学院海洋研究所 一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法
CN113683702A (zh) * 2021-09-27 2021-11-23 闽江学院 条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体的制备方法及其应用
CN118475603A (zh) * 2021-11-03 2024-08-09 香港城市大学深圳研究院 高亲和力抗EGFP和抗SARS-CoV-2 vNAR单域抗体及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
胡智奕: "鲨鱼源抗PD-1单域抗体的制备与抗肿瘤活性初步研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》, 15 March 2022 (2022-03-15), pages 072 - 63 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119708237A (zh) * 2025-02-27 2025-03-28 百吉生物医药(广州)股份有限公司 一种抗程序性死亡受体1抗体g09及其应用

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