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CN108350483A - 在用户定义的切片组织区域中同时定量多种蛋白质 - Google Patents

在用户定义的切片组织区域中同时定量多种蛋白质 Download PDF

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CN108350483A
CN108350483A CN201680054079.3A CN201680054079A CN108350483A CN 108350483 A CN108350483 A CN 108350483A CN 201680054079 A CN201680054079 A CN 201680054079A CN 108350483 A CN108350483 A CN 108350483A
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target
sample
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CN201680054079.3A
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J.M.贝彻姆
G.米尔斯
C.沃伦
C.梅里特
J.姜
D.L.杜纳维
S.克劳德
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Brook Space Biology Co
University of Texas System
Original Assignee
TAXAS SYSTEM, University of, Regents of
Nano Wire Scientific & Technical Corp
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Abstract

本发明尤其涉及用于在用户定义的组织区域、用户定义的细胞和/或用户定义的细胞内亚细胞结构中同时、多路复用检测和定量蛋白质表达的探针、组合物、方法和试剂盒。

Description

在用户定义的切片组织区域中同时定量多种蛋白质
相关申请的交叉参考
该申请要求2015年7月17日递交的美国临时申请第62/193819号、2015年12月1日递交的美国临时申请第62/261654号、2016年1月11日递交的美国临时申请第62/277283号和2016年4月15日递交的美国临时申请第62/323018号的优先权。以上提及的申请中的每一个通过参照以其全部结合于此。
发明背景
标准免疫组织化学方法允许同时检测至多6-10种蛋白质靶标，典型的是3-4种靶标。存在对以下的需要：用于在用户定义的组织区域、用户定义的细胞和/或用户定义的细胞内亚细胞结构中同时、多路复用(multiplex)检测和定量蛋白质表达的探针、组合物、方法和试剂盒。
发明概述
本发明涉及用于在用户定义的组织区域、用户定义的细胞和/或用户定义的细胞内亚细胞结构中同时、多路复用检测和定量蛋白质表达的探针、组合物、方法和试剂盒。
本发明的一个方面涉及一种包括以下步骤的方法：(1) 使在或来自组织样本中至少一个细胞的至少一种蛋白质靶标与至少一种包含靶标结合结构域和信号寡核苷酸的探针接触；(2) 向组织样本的位置提供足以释放信号寡核苷酸的力；和(3) 收集并鉴定释放的信号寡核苷酸，从而检测在或来自被提供力的组织样本的特定位置的至少一种蛋白质靶标。特定位置为用户定义的组织区域、用户定义的细胞和/或用户定义的细胞内亚细胞结构。靶标结合结构域包含蛋白质结合分子，例如抗体、肽、适体(aptamer)和类肽(peptoid)。在实施方案中，检测到两种或更多种蛋白质靶标。在实施方案中，检测到3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多种靶标及其间的任何数目，例如可检测到800或更多种不同靶标。在实施方案中，检测包括定量每种靶标的丰度。
在实施方案中，方法还包括在组织样本的至少第二特定位置重复至少步骤(2)和(3)，第二特定位置至少包含第二细胞。在实施方案中，检测包括比较在或来自第一特定位置与在或来自至少第二特定位置的至少一种蛋白质靶标的丰度。该至少一个细胞与至少第二细胞可为相同细胞类型或不同细胞类型。在一些实施方案中，检测包括定量在或来自第一细胞类型与在或来自至少第二细胞类型的至少一种蛋白质靶标的丰度。在实施方案中，第一和第二细胞类型独立地选自正常细胞和异常细胞，例如患病和癌性细胞。
在实施方案中，该至少一个细胞直接固定于表面或经至少一个其他细胞间接固定于表面。组织样本可为2-1000 μm厚的组织切片，例如得自福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)样本或得自未固定样本。该至少一个细胞可为固定或未固定的。该至少一个细胞可在步骤(2)之前染色或标记，使得染色或标记细胞中的亚细胞或细胞结构能够可视化。或者，对于组织切片，与同探针接触的切片相邻的切片可在步骤(2)之前染色或标记，从而使得能够评价与探针接触的切片中相应细胞或附近细胞中的亚细胞、细胞或组织相关结构。这种染色或标记技术为本领域熟知的。
在以上方面，至少一种探针还包括位于靶标结合结构域与信号寡核苷酸之间的接头(例如可裂解接头)。可裂解接头可为可光裂解的，其通过合适的相干光源(例如激光和UV光源)或合适的非相干光源(例如弧光灯和发光二极管(LED))提供的光裂解。光源可照射至少一个细胞的至少一个亚细胞结构，并且可检测在或来自至少一个细胞的至少一个亚细胞结构的至少一种蛋白质靶标的丰度。而且，光源可首先照射至少一个细胞中的至少一个亚细胞结构并且随后照射至少第二细胞中的至少一个亚细胞结构，使得能够比较在或来自至少一个细胞中的至少一个亚细胞结构与至少第二细胞中的至少一个亚细胞结构的至少一种蛋白质靶标的丰度。
在实施方案中，信号寡核苷酸为单链核酸或部分双链核酸。
在实施方案中，样本可为已固定于载玻片上的培养细胞或解离细胞(固定或未固定的)。样本可包含细胞(包括原代细胞和培养的细胞系两者)和/或组织(包括培养的或移植的)。样本可包含培养细胞、原代细胞或来自外植体的解离细胞。
在实施方案中，照射小于视野(filed of view)的目标区域(例如单细胞或细胞内的亚细胞结构)包括使用激光扫描装置(例如共焦的)或数字镜装置(DMD)来引导光。
在实施方案中，探针通过半胱氨酸生物缀合方法制备，所述方法稳定，优选地对抗体的铰链区重链为位点特异性的。在实施方案中，探针可包含多种(即多于一种，例如2、3、4、5或更多种)标记的寡核苷酸/种抗体。
检测包括聚合酶反应、逆转录酶反应、与寡核苷酸微阵列杂交、质谱法、与荧光分子信标(beacon)杂交、测序反应或nCounter®分子条形码(Molecular Barcodes)。在优选的实施方案中，使用来自NanoString Technologies®的nCounter®系统和方法。
在实施方案中，信号寡核苷酸经液体层流、湍流或过渡流自组织收集。流动可经由例如在组织与置于组织上方的流体装置或不渗透性屏障之间具有25-500 μm深度的通道。
在实施方案中，信号寡核苷酸自邻近(例如至少紧接位于上方)至少一个细胞的溶液收集。邻近溶液可通过例如经吸液管、毛细管、微阵列针、含孔流动池(flow cell)或本领域已知的另一种合适的抽吸系统或其任何组合抽吸来收集。毛细管可包含能够将光力(例如UV光)传输到至少一个细胞的光学装置。吸液管或微阵列针可连接于包含多个吸液管或微阵列针的阵列。邻近溶液可包含阴离子聚合物(例如硫酸葡聚糖)和/或鲑鱼精子DNA，和/或可将收集的信号寡核苷酸加入到包含阴离子聚合物例如硫酸葡聚糖和/或鲑鱼精子DNA的溶液中。除鲑鱼精子DNA以外或代替之，可使用本领域已知的其他非特异性阻断剂。
在实施方案中，方法提供同时进行组织样本的空间分辨蛋白质检测。
在实施方案中，数字读数包括大于或等于5 log的线性动态范围。
在实施方案中，探针以一般地低于用于免疫组织化学(IHC)或用于原位杂交(ISH)的浓度提供给样本。或者，浓度可显著低于用于IHC或ISH的浓度。例如，探针浓度可低至1/2、1/5、1/10、1/20、1/25、1/30、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/2000或更低及其间的任何数目。在实施方案中，探针以100 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.9 nM、0.8 nM、0.7 nM、0.6 nM、0.5 nM、0.4 nM、0.3 nM、0.2nM、0.1 nM、0.09 nM、0.08 nM、0.07 nM、0.06 nM、0.05 nM、0.04 nM、0.03 nM、0.02 nM、0.01 nM和更低的浓度及其间的任何浓度提供。
在实施方案中，将组织样本附着于载玻片上，并首先使用荧光(例如荧光标记的抗体和荧光染料(例如DAPI))成像，然后自样本进行蛋白质表达的数字计数。
在实施方案中，负向纯化用于自释放的信号寡核苷酸去除完整探针分子，负向纯化例如包括亲和纯化方法，包括使完整探针分子与同完整探针的一部分互补的固定化寡核苷酸或固定化抗体或识别并同完整探针的一部分结合的蛋白质结合基序接触。在实施方案中，完整探针的靶标结合结构域包含通用纯化标签或与固定化寡核苷酸部分互补或能够被固定化抗体或蛋白质结合基序识别或结合的序列。本领域熟知的任何这种标签或序列可用于这些实施法案。
本文描述的任何方面或实施方案可与本文公开的任何其他方面或实施方案组合。尽管本公开已连同其详述一起进行描述，但是前述描述旨在说明而不是限制由附加权利要求的范围定义的本公开的范围。其他方面、优点和修改处于以下权利要求的范围内。
本文提及的专利和科学文献建立本领域技术人员可用的知识。本文引用的所有美国专利和公开或未公开的美国专利申请通过参照结合。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请特此通过参照结合。本文引用的所有其他公开的参考文献、文件、手稿和科学文献特此通过参照结合。
附图简述
专利或申请文件含有至少一张以彩色作成的绘图。本专利或专利申请公开的附有彩色绘图的副本将由国际局根据请求并支付必要的费用后提供。
图1：显示两种示例性的探针。核酸骨架(单链DNA或单链RNA)显示为黑色直线。探针各自包括以红色显示的靶标结合结构域。上部探针包括与核酸骨架杂交的标记的RNA片段，而下部探针包括与核酸骨架杂交的标记的DNA寡核苷酸。可裂解基序(例如可裂解接头，未显示)可位于骨架与靶标结合结构域之间或位于骨架内。可裂解基序使得能够自结合的靶核酸或靶蛋白释放信号寡核苷酸，然后信号寡核苷酸被收集并检测。
图2：显示可与靶核酸直接结合的第一类型探针(上部)。在下图中，探针已与显示为蓝色曲线的靶核酸结合。在该图和后面的图中，报告探针包括与标记的寡核苷酸杂交的6个位置(由彩色圆圈确定)。因为探针包含可与标记的寡核苷酸杂交的位置，因此探针还可称为报告探针。
图3：显示本发明第一类型的双探针组合物。这里，第一类型探针与靶核酸直接结合，和第一类型捕获探针与靶核酸直接结合。捕获探针可包括至少一种亲和试剂，其显示为星号。样本中的靶核酸显示为蓝色曲线。
图4：显示可与样本中的靶核酸间接结合的第二类型探针(或报告探针) (上部)。这里，探针的靶标为以绿色显示的中间寡核苷酸，后者继而与样本中的靶核酸(显示为下图中的蓝色曲线)结合。可以说中间寡核苷酸为本文定义的探针，因为其包含核酸骨架并能够结合靶核酸。
图5：显示本发明第二类型的双探针组合物。这里，第二类型探针与样本中的靶核酸间接结合(经以绿色显示的中间寡核苷酸)，并且第二类型捕获探针与样本中的靶核酸间接结合(经以橙色显示的另一种中间寡核苷酸)。捕获探针可包括至少一种亲和试剂，其显示为星号。
图6：显示信号寡核苷酸自与样本中的靶核酸间接结合的第二类型探针(在图4中说明)的释放。探针内(或报告探针中)可裂解基序的位置影响释放的信号寡核苷酸包含哪种材料。
图7：显示用于检测蛋白质的3种类型探针。在上部构型中，探针包含连接于蛋白质结合结构域的核酸，在该构型中，可在核酸与蛋白质结合结构域之间或在核酸本身内包括可裂解基序(例如可裂解接头，未显示)。在中间构型中，蛋白质结合结构域连接于核酸并且探针与核酸杂交。在靶标结合结构域结合蛋白质靶标之前或之后，探针(包含靶标结合结构域和连接于蛋白质结合结构域的核酸(以绿色显示))可被探针结合(如在图8中显示的那样)。可裂解基序可包括在骨架或连接于蛋白质结合结构域的核酸的任何一种或两者中。图2和4中显示的第一或第二类型探针可用于这种构型以检测蛋白质。在下部构型中，将蛋白质结合结构域连接于核酸，并且中间寡核苷酸(以红色显示)与探针和连接于蛋白质结合结构域的核酸两者杂交。图2和4中显示的第一或第二类型探针可用于这种构型以检测蛋白质。
图8：显示图7的中部和下部探针。上面两个图像显示结合蛋白质前后的探针。下一个图像显示其可裂解基序已被裂解之后的探针，在该图像中，可裂解基序位于核酸与靶标结合结构域之间。一旦核酸已被释放，其可被认为是信号寡核苷酸。在下部图像中，信号寡核苷酸(探针的释放核酸)被报告探针结合(例如在图2和4中显示的那样)。
图9：显示信号寡核苷酸自图7中显示的中间构型的探针和图8探针的释放。探针内(或报告探针中)可裂解基序的位置影响释放的信号寡核苷酸包含哪种材料。
图10：显示检测一个目标区域(ROI)的信号寡核苷酸的本发明方法中的步骤。
图11：显示本发明方法中的步骤，其中目标区域位于组织样本的第一连续切片上并将探针应用于组织样本的第二连续切片。信号寡核苷酸自与第二连续切片的第一目标区域中的靶标结合的探针释放并收集。然后，信号寡核苷酸自与第二连续切片的第二(直至第n)目标区域中的靶标结合的探针释放并收集。
图12：显示来自第一目标区域的多种靶核酸和/或蛋白的多路复用检测，随后为来自第二目标区域的多种靶核酸和/或蛋白的多路复用检测。
图13：说明本发明方法中的步骤。所显示的方法本文可称为“nCounter® DigitalMultiplexed Immunohistochemistry (IHC) (nCounter®数字多路复用免疫组织化学)”。
图14：为当与基于标准TSA的多路复用 IHC (下部)相比时，证实用nCounter®Digital Multiplexed IHC (上部)能够简化工作流程和具有更多多路复用的流程图。
图15：为显示连接于Ti-E显微镜的数字镜装置(DMD)的照片(上部)和FFPE组织切片的明视场图像(下部)。FFPE组织(明视场图像)上的光照射(白点)显示约~10-20 μm大小(即单细胞大小)的多个ROI。
图16：说明当方法包括使用数字镜装置(DMD)时与本发明有关的组件和光路。用DMD的宽视场照射聚焦于样本上。LED提供足够的照射以立即激发整个视野，并用单细胞照射使得~80-600个DMD像素照射10 μm直径的细胞。正常级别的DMD将提供足够的单细胞分辨率。DS：分色镜，FW：滤光轮，和DMD：数字镜装置。
图17：说明当方法包括使用激光扫描装置(例如共焦扫描装置)时与本发明有关的组件和光路。在共焦扫描结构中，振动反射镜(galvo-mirror)引导光。该方法需要便宜的405 nm激光器。DS：分色镜，FW：滤光轮，和MM：电动镜(Motorized mirror)。
图18：显示建立扁桃体样本的总体组织形态学的显微照片，其最初使用Ki-67 (细胞增殖标志物，以绿色显示)和CD3 (免疫细胞标志物，以红色显示)的双色荧光成像。12个区域(包括图19中放大的4个区域)用白色方框确定。
图19：为图18中显示的4个区域的Ki-67和CD3的nCounter®数据计数的图表。图像得自连续切片(以使得能够检查各种另外的对照)。通常，样本可用荧光抗体成像，并然后使用相同的载玻片进行数字计数(经UV曝光)。在12个区域(包括这里显示的4个区域)分析的多种靶标显示Ki-67和CD 3的不同定位概况。图表下方为4个区域的放大。
图20：显示来自图18中显示的扁桃体样本的12个目标区域(ROI)上的30路复用寡抗体混合物的示例性计数。数据得自连续切片(以使得能够检查各种另外的对照)。
图21：显示建立淋巴结黑素瘤样本中的T细胞总体组织形态学的显微照片，其最初使用CD3 (以红色显示)、CD8 (以绿色显示)和DAPI (以蓝色显示)的三色荧光成像。白色圆圈的直径为25 µm并包围3个细胞。
图22：显示作为UV照射面积(直径100 μm-1 mm)的函数，来自FFPE淋巴结组织切(5μm厚)的CD3缀合物释放的nCounter®数据。视场光阑大小显示在图表下方。
图23：显示作为UV照射面积(直径100 μm-1 mm)的函数，来自FFPE淋巴结组织切片(5 μm厚)和来自与在图21和22中显示的相同实验的CD45缀合物释放的nCounter®数据。
图24：显示作为UV照射面积(直径100 μm-1 mm)的函数，来自FFPE淋巴结组织切片(5 μm厚)和来自与在图21和23中显示的相同实验的PD1缀合物释放的nCounter®数据。
图25：显示含有不同水平Her2蛋白的乳腺肿瘤组织的组织微阵列(TMA，左图)，如在显微照片(中图)显示的那样，其通过IHC染色鉴定Her2荧光。右图显示中图单个区域的放大。
图26：显示48个代表性区域的nCounter®计数数据与Her2状态(ASCO-CAP准则)的关系。
图27：绘制关于图26提及的48个区域的nCounter®计数与像素强度总和(x 103)的关系。
图28：为建立黑素瘤样本的总体组织形态学的显微照片，其最初使用CD3 (以红色显示)和DAPI (以蓝色显示)的双色荧光成像。10个示例性区域用白色方框确定。
图29：显示来自图28中显示的样本的10个目标区域(ROI)上的30-plex寡抗体混合物的示例性计数。
图30A和图30B：为显示使用数字镜装置(DMD)UV照射扁桃体组织样本(以绿色显示)中的单细胞(以蓝色显示)的显微照片。
图31A-31D：为显示使用数字镜装置(DMD)UV照射扁桃体组织样本中的单细胞(以亮白色显示)的显微照片。图31B突出显示图31A中标出的单细胞，图31D突出显示图31C中标出的单细胞。
图32：显示空间分辨FFPE组织蛋白测定中的步骤。除了在核酸检测测定中样本与包含核酸靶标结合结构域而非抗体的探针结合以外，这些步骤与核酸检测测定的那些步骤类似。
图33：显示空间分辨FFPE组织蛋白测定中的步骤。
图34：显示来自一个实施方案的数据，其中整个组织或整个样本例如用标准UV胶盒(gel box)照射以释放先前连接于探针的信号寡核苷酸。
图35：显示一个实施方案，其中组织或样本的一部分例如用显微镜照射，即在显微镜下进行UV裂解(时间滴定实验)。
图36：显示一个实施方案，其中组织或样本的一部分例如用显微镜照射，即在显微镜下进行UV裂解(照射面积滴定实验)。
图37：显示一个实施方案，其中组织或样本的一部分例如用显微镜照射，即在显微镜下进行UV裂解(照射面积滴定实验-多种靶标)。
图38：显示一个实施方案，其中首先鉴定组织(例如乳腺癌样本)中的目标区域的标志物表达，并然后照射(例如用UV)该目标区域以自探针释放信号寡核苷酸。
图39：显示一个实施方案，其中将组织包埋入流动池中。显示多个级分的数据。如同图38的数据一样，这里预先鉴定目标区域的荧光标记的标志物表达。还显示了照片和示意图，其显示设备结构。
图40：显示一个实施方案，其中将组织包埋入具有小孔的流动池中。还显示了照片和示意图，其显示设备结构。
图41A-41C：显示使用具有小孔的流动池的实施方案比自组织的整个表面收集洗脱液具有显著的信噪比改善。还显示了照片和示意图，其显示设备结构。
图42A-图42C：显示在使用具有小孔的流动池(12或96孔样式)的实施方案中的数据。
图43A和B：显示比较来自其中实施整个组织洗脱的流动池的背景信号(图43A)与来自其中洗脱发生在目标区域的正上方的流动池的背景信号(图43B)的数据。
图44：为显示具有开放表面用于多目标区域抽吸实施方案的洗脱液收集的示意图。这里显示用旋转阀选择用于抽吸/分配洗脱液的多管阵列。
图45：包括显示一个实施方案的照片和示意图，其中洗脱液收集为通过毛细管(微型抽吸器)。
图46A和B：显示来自图45的实施方案的数据，其中洗脱液收集为通过毛细管(微型抽吸器)。
图47：为显示具有开放表面用于多目标区域抽吸实施方案或用于单目标区域的洗脱液收集的示意图。这里显示使用吸液与毛细作用进行抽吸/分配的多管阵列以及具有固定位置的单个管/吸液管。
图48：为显示通过组合毛细管和透镜照射和收集流体的示意图。
图49：为显示包含96孔格子的空间分辨FFPE组织测定的实施方案中的步骤的示意图。
图50：显示使用本文描述的方法和设备得自单细胞或两个细胞的蛋白质表达数据。
图51：鉴定位于单个肿瘤样本的连续切片上的目标区域。
图52：显示对实施例16的测定中包括的9种RNA探针中的6种获得的计数。
图53：显示图52中显示的计数的平均值和标准偏差。
图54：显示同时与nCounter®分子条形码杂交并通过来自NanoStringTechnologies®的nCounter®系统进行数字计数的探针的RNA表达数据和蛋白质数据。
图55：显示得自单链DNA探针和部分双链DNA探针的RNA表达数据。
图56：显示得自在存在鲑鱼精子DNA的情况下杂交的探针的RNA表达数据。
图57：显示来自对PSA (前列腺特异性抗原)特异性的探针的RNA表达数据。
图58：显示在非标准亚nM浓度下增加的探针特异性。
发明详述
本发明部分基于用于在用户定义的组织区域、用户定义的细胞和/或用户定义的细胞内亚细胞结构中同时、多路复用检测和定量蛋白质和/或核酸表达的探针、组合物、方法和试剂盒。
本发明提供存在于第一目标区域(例如组织类型、细胞(包括正常和异常细胞)和细胞内的亚细胞结构)的靶蛋白和/或靶核酸的身份(identity)和丰度与存在于第二目标区域的靶蛋白和/或靶核酸的身份和丰度的比较。对目标区域的数目和可进行的比较没有预先定义的上限，上限与相对于样本大小的目标区域的大小有关。作为实例，当单细胞代表目标区域时，那么切片可具有数百至数千个目标区域，然而，如果组织切片仅包括两种细胞类型，那么切片可仅有两个目标区域(各仅包括一种细胞类型)。
本发明提供比用标准免疫组织化学或原位杂交方法可为更高程度的多路复用。标准免疫组织化学方法允许最多同时检测6-10种蛋白质靶标，更典型的是3-4种蛋白质靶标。类似地，原位杂交方法限于同时检测少于10种核酸靶标。本发明提供自定义的样品区域检测核酸靶标和/或蛋白质靶标的大组合。本发明通过数字定量提供目标测量的增加及可靠性和一致性的增加，从而使得能够比较多个中心之间的结果。
本发明的探针可具有核酸骨架(单链DNA或RNA)，所述核酸骨架具有能够与至少一种标记的寡核苷酸杂交(非共价结合)的定义位置。参见图1。这样的探针(其具有能够与至少一种标记的寡核苷酸杂交的定义位置)本文也称为报告探针。报告探针骨架上的位置数目范围在1-100或者更多。在实施方案中，位置的数目范围在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15、20、30、40或50或者其间的任何范围。确实，骨架上的位置(用于检测靶核酸和/或用于检测靶蛋白)数目没有限制，因为工程改造这种骨架完全处于技术人员的能力范围内。可用探针组检测的靶核酸和/或蛋白的数目取决于探针骨架中包括的位置数目。
本文使用的标记的寡核苷酸涉及包括可检测标记的RNA片段或包括可检测标记的DNA寡核苷酸。
核酸骨架的位置可与至少一种标记的寡核苷酸杂交(非共价结合)。或者，位置可与至少一种缺乏可检测标记的寡核苷酸杂交。每个位置可与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21-100种标记(或未标记)的寡核苷酸或者更多杂交。与每个位置杂交的标记的寡核苷酸的数目取决于位置长度和寡核苷酸的大小。位置的长度可在约300-约1500个核苷酸之间。标记(或未标记)的寡核苷酸长度在约20-约1500个核苷酸的长度内变化。在实施方案中，标记(或未标记)的寡核苷酸长度自约800-约1300个核糖核苷酸变化。在其他的实施方案中，标记(或未标记)的寡核苷酸长度自约20-约55个脱氧核糖核苷酸变化，这种寡核苷酸被设计成具有约65-约85℃，例如约80℃的解链/杂交温度。例如，长度约1100个核苷酸的位置可与约25-约45种之间的寡核苷酸杂交，每种寡核苷酸长度为约45-约25个脱氧核糖核苷酸。在实施方案中，每个位置与长度约33个脱氧核糖核苷酸的约34种标记的寡核苷酸杂交。标记的寡核苷酸优选地为单链DNA。
每种标记的寡核苷酸可用一种或多种可检测标记单体标记。标记可位于寡核苷酸的末端、寡核苷酸内的位点或其组合。寡核苷酸可包含具有胺修饰的核苷酸，其使得可检测标记能够与核苷酸偶联。
本发明的标记的寡核苷酸可用多种标记单体中的任何一种标记，比如荧色物(fulorochrome)、量子点、染料、酶、纳米粒子、化学发光标志物、生物素或本领域已知的可直接(例如通过光发射)或间接(例如通过结合荧光标记的抗体)检测的其他单体。可由本发明采用的标记的优选实例为荧光团。几种荧光团可用作标记核苷酸的标记单体，包括但不限于GFP相关蛋白、花青染料、荧光素、罗丹明、ALEXA FlourTM、德克萨斯红、FAM、JOE、TAMRA和ROX。几种不同的荧光团为已知的，并且更多的荧光团继续被生产出来，涵盖整个光谱。
与每个位置缔合的标记(经位置与标记的寡核苷酸的杂交)可与在前位置或在后位置的标记进行空间分离和光谱分辨。探针的一系列有序的可空间分离和可光谱分辨的标记在本文称为条形码或标记码。条形码或标记码使得能够鉴定已被特定探针结合的靶核酸或靶蛋白。
标记的寡核苷酸在标准杂交反应例如65℃，5 x SSPE下与其位置杂交，这允许自组装报告探针或探针。使用较长的RNA分子作为标记的寡核苷酸(例如在US2003/0013091中描述的那样)的探针必须在制造地点而不是由最终用户在较高温度下预组装，以避免经较长RNA分子交联多个骨架，在预组装步骤之后进行纯化以去除过量的未杂交的RNA分子，其增加背景。短的单链标记的寡核苷酸(例如包含脱氧核糖核苷酸)的使用极大地简化探针的制造并降低与其制造相关的成本。
在实施方案中，探针以一般地低于用于免疫组织化学(IHC)或用于原位杂交(ISH)的浓度提供给样本。或者，浓度可显著低于用于IHC或ISH的浓度。例如，探针浓度可低至1/2、1/5、1/10、1/20、1/25、1/30、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/2000或更低及其间的任何数目。在实施方案中，探针以100 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.9 nM、0.8 nM、0.7 nM、0.6 nM、0.5 nM、0.4 nM、0.3 nM、0.2nM、0.1 nM、0.09 nM、0.08 nM、0.07 nM、0.06 nM、0.05 nM、0.04 nM、0.03 nM、0.02 nM、0.01 nM和更低的浓度及其间的任何浓度提供。
探针可使用市售可得到的柱、软件、系统(例如使用nCounter® Cartridge的nCounter®系统)来检测和定量。
背景噪音在蛋白质检测期间可通过对完整探针分子实施负向纯化来降低。这可通过在自目标区域收集洗脱液后实施抗体或可光裂解接头的亲和纯化来进行。通常，释放的信号寡核苷酸不会自溶液中脱离。吸液管头、管或板中的蛋白质-G或-O机制可用于该步骤。这种装置和试剂可市售得到。
背景噪音在核酸检测期间可通过对完整探针分子实施负向纯化来降低。这可通过在自目标区域收集洗脱液后实施靶标结合结构域或可光裂解接头的亲和纯化来进行。正常地，释放的信号寡核苷酸不会自溶液中脱离。为了助于负向纯化，通用纯化序列可包括在探针中，例如在靶标结合结构域中。
图1显示包括单链核酸骨架和以红色显示的靶标结合结构域的两种示例性的探针。上部探针包括与骨架中位置杂交的标记的RNA片段，而下部探针包括与核酸骨架中位置杂交的标记的DNA寡核苷酸。图1中及本公开中别处显示的颜色为非限制性的，本领域已知的其他彩色标记和其他可检测标记可用于本发明的探针。
本发明的探针可用于检测靶核酸。图2和4说明该方面。这种探针至少包括骨架和靶核酸结合区域。靶核酸结合区域的长度优选地为至少15个核苷酸，和长度更优选地为至少20个核苷酸。在具体的实施方案中，靶核酸结合区域的长度为约10-500、20-400、25、30-300、35、40-200或50-100个核苷酸。用于结合和鉴定靶核酸的探针和方法已描述于例如US2003/0013091、US2007/0166708、US2010/0015607、US2010/0261026、US2010/0262374、US2010/0112710、US2010/0047924和US2014/0371088中，其每一个通过参照以其全部结合于此。
蛋白质靶标可为完整蛋白质、多种多肽、多肽或肽。
本发明的探针可用于直接与靶核酸杂交。图2图解说明该实施方案的探针(或组合物)。探针包括以红色显示的靶核酸结合结构域。靶核酸显示为蓝色曲线。图3图解说明包括图2的探针和捕获探针的双探针组合物。捕获探针包含至少一种亲和试剂，其显示为星号。至少一个亲和部分可通过共价或非共价手段连接于捕获探针。适合于纯化和/或固定化的各种亲和部分为本领域已知的。优选地，亲和部分为生物素、亲合素或链霉亲和素。其他亲和标签被特异性结合配偶体识别，并因此促进通过与结合配偶体的亲和结合进行分离和固定，所述结合配偶体可固定于固体支持物上。在这些图中，每个探针包括与标记的寡核苷酸杂交的6个位置，每个位置由彩色圆圈确定。
本发明的任何探针可包含亲和部分。
本发明的探针可用于间接与存在于样本中的靶核酸杂交(经中间寡核苷酸)。图4说明该实施方案的探针(或组合物)。探针包括以红色显示的靶核酸结合结构域，其与合成寡核苷酸(中间寡核苷酸，以绿色显示)结合，后者继而与生物样本中的靶核酸结合。可以说中间寡核苷酸为本文定义的探针，因为其包含核酸骨架并能够结合靶核酸。存在于生物样本中的靶核酸显示为蓝色曲线。图5说明包括图4的探针和捕获探针的双探针组合物。在这些实施方案中，探针的靶核酸结合区域与不同于样本中存在的靶核酸的中间寡核苷酸(即合成寡核苷酸)的区域杂交。因此，探针的靶结合区域与样本中的最终靶核酸无关。这使得在测定设计中能够具有经济性和快速的灵活性，因为测定的靶标(存在于样本中)特异性组分包括在廉价且广泛可用的合成DNA寡核苷酸而不是更昂贵的探针中。这样的合成寡核苷酸通过包括与存在于样本中靶核酸杂交的区域和与探针杂交的区域而简单设计。因此，简单地通过代替测定的靶标特异性(合成)寡核苷酸部分，单组间接结合探针可用于在不同实验中检测无限种类的靶核酸(存在于样本中)。
本发明的探针或探针可包括允许在施加合适的力后释放信号寡核苷酸的区域。在一个非限制性实例中，区域为可裂解基序(例如限制性酶切位点或可裂解接头)。可裂解基序使得能够自结合的靶核酸或靶蛋白释放信号寡核苷酸，然后收集并检测信号寡核苷酸。本文使用的信号寡核苷酸为目前具有与至少一种标记的寡核苷酸杂交的位置的探针区域，或者为可自探针的靶标结合结构域释放的探针(例如核酸分子)区域。据说信号寡核苷酸在其可与探针的其余部分分离(即裂解并释放)时是可释放的。可裂解的动机(motive)的实例包括但不限于可光裂解接头。
在本发明的探针中(如本文描述的那样)，可裂解基序可位于核酸与靶标结合结构域之间、骨架与靶标结合结构域之间或位于骨架内。在图6中，可裂解基序的位置的非限制性选项可自探针内的缺口或中间寡核苷酸内的缺口推断。
本发明的探针可用于检测靶蛋白。图7图解说明该实施方案的探针(或组合物)。这种探针至少包括骨架和靶蛋白结合区域。在本发明的蛋白质靶向探针中，信号寡核苷酸可为连接于蛋白质结合结构域的核酸。在这些探针中，信号寡核苷酸被包含用于与标记的寡核苷酸杂交的位置的探针靶向并结合。这种探针显示在图7中(中图)。在那里，信号寡核苷酸作为绿线被观察到。探针可在探针(经其蛋白质结合结构域)结合蛋白质之前被探针结合，或者之后其结合蛋白质。信号寡核苷酸不需要被探针结合，直至其已自靶标结合结构域释放(该实施方案未显示)。
能够与靶蛋白结合的探针区域包括被设计成与至少一种蛋白质靶蛋白、至少一种蛋白质靶蛋白代用物或两者结合，并可在合适的条件下形成包含蛋白质探针和靶蛋白的分子复合物的分子或组装体。能够与靶蛋白结合的区域包括抗体、肽、适体或类肽。抗体可得自多种来源，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、重组表达的抗体、人源化抗体、植物抗体等。术语蛋白质、多肽、肽和氨基酸序列在本文可互换使用，以指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可为线性或分支的，其可包含修饰的氨基酸，并且其可被非氨基酸或合成氨基酸中断。术语还包括例如通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作(比如与标记组分缀合)修饰的氨基酸聚合物。本文使用的术语氨基酸指的是天然和/或非天然或合成氨基酸，包括但不限于甘氨酸及D或L光学异构体两者，以及氨基酸类似物和肽模拟物。用于结合和鉴定靶蛋白的探针和方法已描述于例如US2011/0086774中，其内容通过参照以其全部结合于此。
在实施方案中，探针通过半胱氨酸生物缀合方法制备，所述方法稳定，优选地对抗体的铰链区重链为位点特异性的。该制备方法提供相对可控的标记的寡核苷酸与抗体化学计量比率。探针可包含多种(即多于一种，例如2、3、4、5或更多种)标记的寡核苷酸/种抗体。通常，包含3或4种标记的寡核苷酸/种抗体的“较重”探针比缺乏标记的寡核苷酸的抗体或“较轻”探针(其包含1或2种标记的寡核苷酸/种抗体)明显敏感性低。
只要条件允许结合蛋白质靶标和核酸靶标两者，蛋白质靶向探针和核酸靶向探针就可同时应用。或者，当允许结合蛋白质靶标和核酸靶标两者的条件不可能时，可依序应用蛋白质靶向探针和核酸靶向探针。
探针组与探针组合物同义。探针组包括至少一种探针，即针对一种靶标。探针组优选地包括至少两种，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多种探针。探针组可包括每种探针的一个或多个拷贝。
仅第一组探针可应用于样本。或者，第二组(或更多数目)的探针可稍后应用于样本。第一组和第二组(或更多数目)可仅靶向核酸、仅靶向蛋白质或其组合。
在本发明中，检测两种或更多种靶标(即蛋白质、核酸或其组合)，检测3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多种靶标及其间的任何数目。
可基于待靶向的细胞类型或组织类型预先定义探针组。例如，如果组织为乳腺癌，那么该组探针将包括针对与乳腺癌细胞相关的蛋白质(例如Her2、EGFR和PR)的探针和/或针对与正常乳腺组织相关的蛋白质的探针。另外，该组探针可基于待靶向的细胞或组织的发育状态而预先定义。或者，该组探针可基于目标的亚细胞定位例如细胞核、细胞质和膜而预先定义。例如，针对Foxp3、组蛋白H3或P-S6的抗体标记细胞核，针对CD3、CD4、PD-1或CD45RO的抗体标记细胞质，以及针对PD-L1的抗体标记膜。
探针可为化学合成的，或者可使用其中克隆了编码探针的核酸的载体生物产生。
本文描述的任何探针或探针组可用于本发明的方法和试剂盒。
对于本文描述的探针，标记码与靶核酸或靶蛋白的缔合不固定。
本发明的探针可用于检测存在于任何样本例如生物样本中的靶核酸或靶蛋白。如本领域人员将意识到的那样，样本可包含任何数目的物质，包括但不限于：细胞(包括原代细胞和培养的细胞系两者)和组织(包括培养的或移植的)。在实施方案中，将组织样本(固定或未固定的)包埋入、连续切片并固定于显微镜载玻片上。如所熟知的那样，一对连续切片将包括存在于两个连续切片中的至少一个细胞。位于第一连续切片上的结构和细胞类型在相邻的连续切片上具有类似的位置。样本可为已固定于载玻片上的培养细胞或解离细胞(固定或未固定的)。
在实施方案中，组织样本为活检肿瘤或其一部分，即临床相关组织样本。例如，肿瘤可来自乳腺癌。样本可为切除的淋巴结。
样本可得自几乎任何生物体，包括多细胞生物体，例如植物、真菌和动物界，优选地，样本得自动物例如哺乳动物。人样本为特别优选的。
在一些实施方案中，本文描述的探针、组合物、方法和试剂盒用于诊断病症。本文使用的术语诊断或病症的诊断包括预测或诊断病症、确定病症的易感性、监测病症的治疗、诊断疾病的治疗反应及病症的预后、病症进展以及对病症特定治疗的反应。例如，组织样本可根据本文描述的任何探针、方法或试剂盒测定，以确定样本中疾病或恶性细胞类型的标志物的存在和/或数量(相对于无病状态)，从而诊断或者将疾病或癌症分期。
通常，可首先使用荧光(例如荧光抗体或荧光染料(例如DAPI))使附着于载玻片的样本成像，以鉴定形态学、目标区域、目标的细胞类型和单细胞，然后蛋白质和/或核酸的表达可自相同载玻片上的样本进行数字计数。
本发明的组合物和试剂盒可包括探针和其他试剂，例如本领域已知的缓冲剂和其他试剂以促进样本中蛋白质和/或核酸的结合，即用于实施杂交反应。
试剂盒还将包括用于使用试剂盒组分的说明书，包括但不限于使标记的寡核苷酸与探针杂交、使探针与靶标特异性寡核苷酸杂交、使靶标特异性寡核苷酸与靶核酸杂交和/或使探针与靶蛋白杂交必要的信息。
如下描述用于检测靶核酸和/或靶蛋白的示例性方案，并且如在图10-14 (上部)显示的那样。
制备与多路复用免疫组织化学方法和/或核酸原位杂交方法一致制备的细胞(活的或固定的)或组织切片(例如福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE))，并固定于载玻片或合适的固体支持物上。保留向细胞或组织切片表面的入口，允许流体交换，这可通过使用流体室试剂交换系统(例如GraceTM Bio-Labs，Bend OR)来实现。在待提供探针的连续切片上或在相邻的连续切片上确定目标区域(ROI)。在第一种情况下，对目标细胞/组织实施完整“宏观特征”成像方法，例如DAPI染色、膜染色、线粒体染色、特异性表位染色和特异性转录物染色，以确定目标细胞/组织的总体宏观特征。或者，在与待提供探针的连续切片相邻的连续切片上确定目标区域(ROI)，这里，对第一连续切片(图11和12中的切片＃1)实施完整“宏观特征”成像(如以上描述的那样)。该成像通常将鉴定相邻连续切片上的目标区域(图10中图B中的红线和图11和12中切片＃2中的绿色椭圆形和绿色三角形)，其中在施加合适的和定向力时信号寡核苷酸将自探针释放。连续切片可为彼此约5 μm-15 μm。
图13和图14 (上部)还图解说明本发明的步骤。图13中显示的步骤包括以下内容。(1) 过程：将FFPE载玻片封固的组织同经可光裂解接头与DNA寡聚物缀合的一次抗体混合物以及有限数目的可见波长成像试剂一起温育。(2) 观察：以低路复用方式用基于可见光的成像试剂确定目标区域(ROI)，以建立肿瘤切片的总体“结构”(例如图像核心(imagenuclei)和/或使用一种或两种关键的肿瘤生物标志物)。(3) 概况：选择ROI用于高分辨率多路复用概况分析，并且选定区域的寡聚物在暴露于UV光后释放。(4) 铺板：然后例如经基于微毛细管的“吸管”收集游离的光裂解寡聚物，并储存于微孔板孔中用于随后的定量。(5)数字计数：在数字计数步骤期间，使来自微孔板中空间分辨ROI的光裂解寡聚物与4色6点光学条形码杂交，使得能够使用标准NanoStringn Counter®读数仪表(例如SPRINT、Flex和MAX)在单个ROI具有高达~100万个数字计数的蛋白质靶标(分布在多达800路复用的标志物)。
目标区域可为存在于样本中的组织类型、细胞类型、细胞或细胞内的亚细胞结构。
包含探针组的组合物被应用于连续切片，每个探针包含可释放信号寡核苷酸。该组探针或可包括靶向蛋白质、靶向核酸或两者的探针。组合物可包括捕获探针。当探针间接与靶标(蛋白质和/或核酸)结合时，所应用的组合物包括中间寡核苷酸。组合物将包括本领域已知的其他试剂以促进样本中蛋白质和/或核酸的结合。
在应用组合物之前和/或之后实施阻断步骤。
对于包括可光裂解接头的探针，将固体支持物(例如显微镜载玻片)置于能够提供能够裂解可光裂解接头的波长的激发光的显微镜中。用光激发第一目标区域(图10中图B中的红线和图11和12中的ROIi)，从而裂解可光裂解接头并释放信号寡核苷酸。如在图6和9中图解说明的那样，信号寡核苷酸至少包括目前具有与至少一种标记的寡核苷酸结合的位置的探针区域，或来自被报告探针结合或可结合的探针的核酸。通过仅将激发光引导至ROIi，仅信号寡核苷酸自ROIi内的探针释放，而不是自位于ROIi外面的探针释放，这保留其信号寡核苷酸。因此，仅收集与ROIi内靶标结合的探针的信号寡核苷酸，从而允许检测位于ROIi内的靶标(蛋白质和/或核酸)的身份和数量。
将切片的表面用少量缓冲液(~5-30 μl)洗涤，并将洗脱液(含有释放的信号寡核苷酸)收集到第一样品容器中(在图12中显示为样品“i”)。还冲洗切片的表面以去除洗脱液中遗漏的任何释放的信号寡核苷酸。
用光激发第二目标区域(图11和12中的ROIj)，从而裂解可光裂解接头并自第二目标区域释放信号寡核苷酸。再次，通过仅将激发光引导至ROIj，信号寡核苷酸仅自ROIj内的探针释放，而不是自位于ROIj外面的探针释放，这些探针保留其信号寡核苷酸。因此，仅收集与ROIj内靶标结合的探针的信号寡核苷酸，从而允许检测位于ROIj内的靶标(蛋白质和/或核酸)的身份和数量。
将切片的表面用少量缓冲液(~5-30 μl)洗涤，并将洗脱液(含有释放的信号寡核苷酸)收集到第一样品管中(在图12中显示为样品“j”)。还冲洗切片的表面以去除洗脱液中遗漏的任何释放的信号寡核苷酸。
重复激发步骤、洗涤步骤和冲洗步骤，直至收集到来自所有目标区域(多达ROIn)的信号寡核苷酸。
本发明的另外优点、特征和实施方案在随文递交的附录中说明。作为实例，显示用于收集信号寡核苷酸的各种方法和装置以及提供力的各种方式。此外，附录提供得自本发明某些实施方案的超过其他实施方案的意想不到的改善结果。显示的数据证实信噪比改善约7倍-约200倍。
检测可使用本领域已知的任何显微镜类型装置或系统。装置或系统可包括与数字镜装置(DMD，参见图15和16)一起的宽视场照射，其优点包括降低成本，因为DMD和控制器还可驱动LED (其光裂解探针)并且基本上不增加另外的成本，提供易于实施，允许小至~1 mm的特征尺寸(这将包括10-40 mm细胞)，并调节可用的消费电子产品(像投影仪)。装置或系统可包括激光扫描装置，例如共焦的，参见图16。其优点是较小的形态学特征可被照射和成像，然而这些装置涉及另外的成本。
使用聚合酶反应、逆转录酶反应、与寡核苷酸微阵列杂交、质谱法、与荧光分子信标杂交、测序反应或nCounter®分子条形码，在每个洗脱液样本中鉴定存在于样本中每个目标区域中的多种靶蛋白和/或靶核酸。如在US2003/0013091、US2007/0166708、US2010/0015607、US2010/0261026、US2010/0262374、US2010/0112710、US2010/0047924、US2014/0371088和US2011/0086774中描述的来自NanoString Technologies®的nCounter®系统和方法，为用于鉴定靶蛋白和/或靶核酸的优选手段。来自NanoString Technologies®的nCounter®系统和方法使得能够同时多路复用鉴定多种(800种或者更多)不同靶蛋白和/或靶核酸。
可一起进行比较存在于第一目标区域(例如组织类型、细胞类型(包括正常和异常细胞)和细胞内的亚细胞结构)的靶蛋白和/或靶核酸的身份和丰度与存在于第二目标区域或更多目标区域的靶蛋白和/或靶核酸的身份和丰度。
本发明提供来自肿瘤(例如)内离散区域及其相邻正常组织的多达800种目标蛋白质的多路复用检测和比较，因此使得系统性探询肿瘤及其微环境。
本发明可用于正在进行的临床研究以阐明对免疫疗法和其他靶向疗法的新反应。
本发明还使得能够发现肿瘤(例如)中的免疫生物标志物，其可用于开发伴随式诊断(companion diagnostics)。
免疫组织化学为用于分析FFPE组织切片中的蛋白质表达和定位的强大技术。然而，其面临着许多挑战，包括缺乏动态范围、难以定量以及多路复用非常有限的劳动密集型工作流程。这里公开一种基于nCounter®条形码技术的新平台，其使得能够在高度多路复用(高达800路复用)测定(即nCounter® Digital Multiplexed Immunohistochemistry(IHC)测定)中进行蛋白质的空间分辨数字表征。该测定依赖于与使用聚焦通过物镜的UV(例如~365 nm)曝光自组织的离散区域释放的可光裂解寡核苷酸标签偶联的抗体。裂解的标签在nCounter®测定中定量，并将计数映射回组织位置，得到蛋白质丰度的空间分辨数字概况。蛋白质检测可与使用包含可光裂解寡核苷酸标签的核酸探针的核酸检测测定一起或分开实施。因此，本发明可提供蛋白质丰度的空间分辨数字概况、蛋白质和核酸丰度的空间分辨数字概况或核酸丰度的空间分辨数字概况。
测定的优点包括但不限于：灵敏度高(例如~1-4个细胞)、全数字计数、动态范围大(>105)、高度多路复用(例如30种靶标并在仪器无变化的情况下可扩展至800种靶标)、工作流程简单、与FFPE的相容性、无二次抗体(对于蛋白质检测)或扩增试剂、以及临床测定的潜力。
如在本说明书和附加权利要求中使用的单数形式“一种”，“一个”和“该”包括复数指涉，除非上下文另外明确规定。
除非具体规定或自上下文显而易见，本文使用的术语“或”应理解为包含性的并且涵盖“或”和“和”两者。
除非具体规定或自上下文显而易见，本文使用的术语“约”应理解为在本领域的正常容许范围内，例如在平均值的2个标准偏差范围内。约可理解为规定数值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%范围内。除非上下文另外明确说明，本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的其他探针、组合物、方法和试剂盒可用于实践本发明，但本文描述优选的材料和方法。应该理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而不旨在为限制性的。
实施例
实施例1：本发明提供“条形码潜力”以定量FFPE组织切片中的多路复用靶标
肿瘤内异质性已成为实施靶向疗法的关键挑战。历史上，免疫组织化学(IHC)已用于评价蛋白质的空间异质性，然而，很难以高度多路复用和宽动态范围定量蛋白质丰度。
在该实施例中，福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)组织切片中的蛋白质用包括可光裂解接头和荧光条形码的包含抗体的探针进行标记。随后将探针(在FFPE组织切片的用户定义的ROI中)暴露于聚焦的UV光，从而自ROI释放信号寡核苷酸(包含荧光条形码)。释放的信号寡核苷酸自FFPE样本中洗去并收集。然后来自释放的信号寡核苷酸的荧光条码通过来自NanoString Technologies®的nCounter®系统识别并进行数字计数，从而定量组织切片的用户定义的空间区域中每种靶向蛋白质的丰度。在释放并收集来自第一ROI的信号寡核苷酸后，将聚焦的UV光暴露于FFPE组织切片的第二用户定义的ROI，从而自第二ROI释放信号寡核苷酸。在该非限制性实施例中，观察到所观察计数的数目与UV照射面积呈高度线性度(0.97<R2<0.99)，并且具有约100 μm x 100 μm或约100个细胞的检测空间分辨率。意想不到地，本发明提供“条形码潜力”，以在单个FFPE组织切片中以5.5 log(底数10)的动态范围定量多达800种靶标。
实施例2：本发明提供实用且可行的方法，用于在无信号放大的情况下定量蛋白质表达和用于在FFPE组织切片实现更高阶的靶抗原多路复用
定量的多路复用免疫组织化学已成为肿瘤学中非常引人关注的领域，因为其具有独特的能力鉴定时空组织和相互依赖性，其进一步确定检查点阻断如何影响肿瘤微环境。该实施例描述使用在FFPE组织切片内与靶抗原相互作用的可光裂解寡聚物标记的一次抗体的一步无放大染色方法。应用紫外(UV)光照射，自抗体释放寡聚物，随后进行洗脱液收集、定量和进行数字计数，其与抗原丰度相对应。
首先研究了多种缀合方法，这建立了半胱氨酸生物缀合方法，所述方法稳定，主要对铰链区重链为位点特异性的，并且就寡核苷酸与抗体化学计量比率而言相对可控。
接下来实施线性回归分析以确定UV诱导的裂解面积与测量的数字蛋白质计数之间的关系，由此观察到高度线性度(0.97<R2<0.99)，证实与FFPE组织上的这种多路复用蛋白质计数方法相关的基本机制/前提。
为了确定存在缀合寡核苷酸对抗体-抗原相互作用的影响，就灵敏度、特异性和信号强度而言比较标记的寡核苷酸缀合抗体与未修饰抗体在FFPE组织切片中于相同条件下的性能。选择靶向位于细胞核、细胞质或膜的抗原的抗体以确定抗体性能与靶抗原的亚细胞位置之间的关系。选定的抗体靶向Foxp3、组蛋白H3、P-S6 (核抗原)、CD3、CD4、PD-1、CD45RO (细胞质抗原)和PD-L1 (膜抗原)。就灵敏度而言，通常发现当与未缀合抗体或“较轻”寡核苷酸缀合抗体(具有1或2种标记的寡核苷酸/种抗体)相比，“较重”寡核苷酸缀合抗体(具有3或4种标记的寡核苷酸/种抗体)明显敏感性低。就跨越核、细胞质和膜靶抗原的灵敏度、特异性或强度而言，在未缀合或“较轻”寡核苷酸缀合抗体之间未观察到显著差异。
本发明提供高度多路复用的蛋白质概况分析，其使用实用且可行的方法来测量绝对蛋白质表达水平，以在免疫治疗干预之前和期间全面定义肿瘤的免疫景观。
实施例3：本发明提供FFPE组织的空间分辨多路复用蛋白质检测
方法
抗体-用于本实施例和实施例4-6的抗体可包括：“靶标(克隆ID，供应商)”：H3 (D1H2,CST)、CD8 (OTI3H6, Origene)、CD4 (SP35, Spring Bio)、FOXP3 (D2W8E, CST)、B7-H3(D9M2L, CST)、S6 (54D2, CST)、B7-H4 (D1M8I, CST)、颗粒酶B (OTI4E4, Origene)、Ki67(8D5, CST)、PD-1 (Nat105, Cell Marque)、CD3 (MRQ-39, Cell Marque)、Vista (D1L2G,CST)、Her2 (29D8, CST)、PR (D8Q2J, CST)、ER (SP1, Spring Bio)、EGFR (D38B1, CST)、CD56 (MRQ-42, Cell Marque)、PD-L1 (E1L3N, CST)、CD45 (2B11&PD7/26, CellMarque)、TIM-3 (D5D5R, CST)和广谱角蛋白(Pan Keratin) (C11, CST)、CD45RO (UCHL1,Cell Marque)。
扁桃体显微镜检查-将扁桃体FFPE块(Amsbio)的5 μm切片封固于载玻片上。IHC使用标准方案实施。用压力锅实施抗原取回(retrieval)。用CD3一次抗体MRQ-39 (兔mAb，Cell Marque)和Ki-67一次抗体8D5 (小鼠mAb，CST)实施扁桃体切片的染色。用Alexa 594标记的山羊α兔(Life Tech)和Alexa 488标记的山羊α小鼠(Life Tech)实施二次温育。
这里，首先使用荧光抗体使附着于载玻片的样本成像，并然后自样本进行蛋白质表达的数字计数。
使用的步骤与图10-图14 (上部)中图解说明的那些类似。对选定的ROI进行UV裂解使得能够进行完整30路复用数字概况分析(nCounter®计数)。
结果
图18显示建立扁桃体样本的总体组织形态学的显微照片，其最初使用Ki-67 (细胞增殖标志物，以绿色显示)和CD3 (免疫细胞标志物，以红色显示)的双色荧光成像。在12个区域(包括图19中放大的4个区域)分析的多种靶标显示Ki-67和CD3定位的3种不同概况。图19显示图18中显示的4个区域的Ki-67和CD3的nCounter®计数。图20显示来自图18中显示的扁桃体样本的12个目标区域(ROI)上的30路复用寡抗体混合物的示例性计数。数据得自连续切片(以使得能够检查各种另外的对照)。如所显示的那样，组织样本的区域可基于所表达标志物的强度和身份来分类。显示示例性分类：“富含CD3”、“富含Ki67”、“混合”和“结缔组织”。
这些数据显示本发明提供了多种(这里至少30种)蛋白标志物的空间分辨检测。通过扩大使用的蛋白质探针(抗体)的数目，可检测到多达800种不同蛋白标志物并具有类似的分辨率。
实施例4：本发明提供来自FFPE组织并接近单细胞分辨率的多路复用蛋白质检测
方法
黑素瘤显微镜检查-将黑素瘤(淋巴结来源的) FFPE块(Asterand)的5 μm切片封固于载玻片上。IHC使用标准方案实施。用压力锅实施抗原取回。
这里，首先使用荧光使样本成像，并然后自样本进行蛋白质表达的数字计数。
使用的步骤与图10-图14 (上部)中图解说明的那些相似。
结果
图21显示建立淋巴结黑素瘤样本中的T细胞总体组织形态学的显微照片，其最初使用CD3 (以红色显示)、CD8 (以绿色显示)和DAPI (以蓝色显示)的三色荧光成像。白色圆圈的直径为25 µm并包围3个细胞。
图22显示作为UV照射面积(直径100 μm-1 mm)的函数，来自FFPE淋巴结组织切片(厚度5 μm)的CD3缀合物释放的nCounter®数据。计数的检测限(LOD =背景计数+ 2 x标准偏差)对应于直径26 μm的空间分辨率。视场光阑大小显示在图表下方。图23和图24显示CD45和PD1 (分别来自相同实验)的数据。
数据显示本发明对应于约1-4个细胞的空间检测能力。
实施例5：本发明提供临床相关测定中的定量性能
方法
使用的步骤与图10-图14 (上部)中图解说明的那些类似。
乳腺癌组织微阵列(TMA)：TMA BR1504a得自US Biomax, Inc., H&E染色图像得自US Biomax网站(万维网(www) biomax.us/tissue-arrays/Breast/BR1504a)。来自与图25的左图中显示的切片相同块的切片用Her2一次抗体29D8 (兔mAb, CST)和Alexa594标记的山羊α兔(Life Tech)染色。还对组蛋白H3、核糖体蛋白S6、雌激素受体、孕酮受体、小鼠IgG同种型对照和兔IgG同种型对照获得计数(数据未显示)。TMA BR1504a的Her2病理学家评分由US Biomax, Inc. (万维网(www) biomax.us/tissue-arrays/Breast/BR1504a)提供。用Her2一次抗体29D8 (兔mAb, CST)和Alexa594标记的山羊α兔(Life Tech)实施染色。尽管在一次混合物中使用了其他兔一次抗体，但与Her2荧光相比，来自这些抗体的荧光可以忽略不计。像素强度总和(在λ=594处)使用ImageJ软件获得。为此，将背景值设置为强度= 0，并将最高强度设置为强度= 255。显示每个ROI的所有像素强度的总和。
这里，首先使用荧光使样本成像，然后自样本进行蛋白质表达的数字计数。
结果
图25 (左图)显示含有不同水平Her2蛋白的乳腺肿瘤组织的组织微阵列(TMA)，如在显微照片(中图)显示的那样，其通过IHC染色鉴定Her2荧光。右图显示中图单个区域的放大，这种区域用多路复用抗体混合物染色。
图26显示48个代表性区域的nCounter®计数数据与Her2状态(ASCO-CAP准则)的关系。图27绘制以上提及的48个区域的nCounter®计数与像素强度总和(x 103)的关系。
这些数字计数数据显示与经ASCO-CAP准则的视觉Her2状态评分(R2=0.51，图26)相比，与荧光强度高度相关(R2=0.92，图27)。
实施例6：本发明揭示组织样本中特定细胞类型的丰度
使用的步骤与图10-图14 (上部)中图解说明的那些类似，首先使用荧光使附着于载玻片的黑素瘤样本成像，然后自样本进行蛋白质表达的数字计数。
图28显示使用CD3 (免疫细胞标志物，以红色显示)和DAPI (细胞核，以蓝色显示)的双色荧光建立黑素瘤样本的总体组织形态学的显微照片。使用30种抗体混合物的表达数据得自用白色方框确定的10个区域。图29显示来自图28中显示的黑素瘤样本的10个目标区域(ROI)上的30路复用寡抗体混合物的示例性nCounter®计数。显示13种标志物的计数，每种都具有高于背景的表达计数。鉴定为“富含免疫浸润物”的区域5、6、7具有表达最高的T细胞标志物和T细胞调节标志物。
这些数据显示本发明提供了多种(这里至少30种)蛋白标志物的空间分辨检测。通过扩大使用的蛋白质探针(抗体)的数目，可检测到多达800种不同蛋白标志物并具有类似的分辨率。
实施例7：数字镜装置(DMD)能够照射单细胞
图30和31为显示如果照射扁桃体组织样本中的单细胞则可使用数字镜装置(DMD)进行UV照射的显微照片。
这些数据表明，当使用DMD时本发明能够进行单细胞分辨。
实施例8：胶盒能够照射整个样本并自与整个样本结合的探针释放信号寡核苷酸
图34：显示一个实施方案，其中整个组织或样本例如用标准实验室UV胶盒照射。这里，将FFPE组织载玻片置于光板上，使用蜡笔保持覆盖FFPE组织的缓冲溶液(TBS)，并将UV光暴露(276-362 nm，例如302 nm，~5 mW/cm2)通过载玻片(厚度1 mm)施加于组织。数据显示在约1分钟的UV暴露内，大多数信号寡核苷酸自FFPE结合的抗体释放。计数被标准化为阳性对照。
实施例9：来自显微镜的照射能够照射样本中的目标区域并自与目标区域结合的探针释放信号寡核苷酸
图35显示一个实施方案，其中组织或样本的一部分例如用显微镜照射，即在显微镜下进行UV裂解(时间滴定实验)。这与其中整个样本被照射的实施例8的实验形成对比。这里，UV LED (在365 nm处)在约~150 mW/cm2下以20 x物镜施加。UV照射扫描由先前荧光(~590nm激发)明视场成像鉴定的整个组织区域。在每个视野(FOV)约1秒UV暴露内，大多数信号寡核苷酸自FFPE结合的探针释放。实施例8的胶盒实验用作非空间分辨的100%释放对照。计数为相对于阳性对照的标准化比率。蓝色：可变曝光时间长度的显微镜数据；红色：胶盒2.5分钟曝光数据。还显示了照片和示意图，其显示显微镜设备结构。
图36显示信号寡核苷酸自与肺组织样本结合的均匀分布的抗组蛋白(H3)抗体释放。将组织暴露于1秒UV (365 nm，~150 mW/cm2，20 x物镜)/个视野(FOV)，其为约450 μm x330 μm = 0.15 mm2。用于收集流出物的“宏量(Macro-Volume)”为约70 μl。这可将检测限降低到(FOV/5) ~99 μm X 99 μm，收集流出物约5 μl。因此，在该实施例中，检测限为约10个细胞X 10个细胞小生境(niche)。这些数据显示抗体信号与空间分辨照射面积FOV成比例，并且评价“宏流控(macro-fluidics)”检测限(LOD)。
图37显示一个实施方案，其中组织或样本的一部分例如用显微镜照射，即在显微镜下进行UV裂解(照射面积滴定实验)，并用于多种靶标。显示组织中多种靶标的UV裂解：两种阳性靶标(组蛋白H3和核糖体S6)和8种阴性靶标。仅1种阴性靶标(Ox40)显示高背景。显示了0、1、4、9和16个视野的数据。
实施例10：目标区域可通过标记技术预先鉴定，然后目标区域被照射，信号寡核苷酸自与预先鉴定的目标区域结合的探针释放
图38显示一个实施方案，其中首先鉴定组织(例如乳腺癌样本)中的目标区域用于表达标志物(这里为Her2)，并然后照射(例如用UV)该目标区域以自结合的探针释放信号寡核苷酸。所显示的数据比较了自两个位置释放的两种靶标(这里是Her2和组蛋白H3)的信号寡核苷酸的量：一个预先鉴定为Her2+的目标区域和一个预先鉴定为Her2-的目标区域。
实施例11：包埋入流动池的样本提供来自整个样本的洗脱收集，不仅来自被照射的目标区域，而且来自释放信号寡核苷酸的区域
图39显示一个实施方案，其中组织被包埋入流动池中。这里，通过注射泵控制嵌入微流控流动池(9 mm圆形室，容积为100 μm高度，具有约25 μl容积[当流动池具有300 μm高度时，容积为约75 μl]的FFPE组织。在流动池内进行UV裂解，显示照射一个区域(9个FOV)并洗脱，然后照射另一个区域(9个FOV)并洗脱的洗脱概况。显示多个级分的数据。如同实施例10的数据一样，这里预先鉴定目标区域的荧光标记的标志物表达。
实施例12：在目标区域包埋入包含小孔的流动池中的样本提供来自被照射和其中释放信号寡核苷酸的目标区域而不是来自整个样本的洗脱的有效收集
图40：显示一个实施方案，其中将组织包埋入具有小孔的流动池中。这里，洗脱发生在目标区域的正上方。流体室上方0.4-1 mm直径的孔使得能够收集洗脱液(例如5 μl收集体积)。测试了9孔、96孔样式和12孔样式(对于组织微阵列(TMA))。荧光图像是通过组合多个视野而创建的。还显示了照片和示意图，其显示设备结构。
图41A-41C显示使用具有小孔的流动池的实施方案比自组织的整个表面收集洗脱液具有显著的信噪比改善。数据显示通过目标区域上方的孔收集洗脱液使信噪比增加至约7倍。在该实施方案中，流体流动池(25 μl室)上方1 mm直径的孔用于收集洗脱液(5 μl级分)。显示多个级分的数据。
图42A-42C显示使用具有小孔的流动池(12或96孔样式)的数据。数据显示通过目标区域上方的孔收集洗脱液使信噪比增加至约7倍。在该实施方案中，视野照射聚焦于孔的中心，每孔洗脱5 μl体积。
图43A和B显示比较来自其中实施整个组织洗脱的流动池的背景信号(图43A，如在实施例11中那样)与来自其中洗脱发生在目标区域的正上方的流动池的背景信号(图43B)的数据。如在图43A所见的那样，相对于图43B中所见的背景，整个组织洗脱的背景更高。另外，图43B显示在流动池与非流动池温育之间没有差异。
实施例13：释放的信号寡核苷酸可经单个管/吸液管、多个管/吸液管或多管/吸液管阵列选择
图44为显示具有开放表面用于多个目标区域抽吸实施方案的洗脱液收集的示意图。这里显示用旋转阀选择用于抽吸/分配洗脱液的多管阵列。另见图47。
图45包括显示一个实施方案的照片和示意图，其中洗脱液收集为通过毛细管(微型抽吸器)。另见图47。图46A和B显示来自图45的实施方案的数据，其中洗脱液收集为通过毛细管(微型抽吸器)。该实施方案在信噪比方面具有显著的改善：与通过孔洗脱的流动池相比信噪比增加至约10倍，和与整个组织洗脱相比信噪比增加至约200倍。这里，LOD面积为约60 μm x 60 μm。
实施例14：包含照射和洗脱能力两者的装置可自定义的目标区域有效和准确地获得核酸和/或蛋白质表达数据
图48为显示通过组合毛细管和透镜照射和收集流体的示意图。
实施例15：蛋白质表达可自单细胞检测和定量
图50显示使用本文描述的方法和设备得自单细胞或两个细胞的蛋白质表达数据。在上图中，自至少一个细胞检测和定量S6蛋白，和在下图中自至少一个细胞检测和定量CD45蛋白。
实施例16：本文描述的方法和设备提供空间分辨多路复用RNA靶标和/或蛋白质靶标表达的准确和有效检测和定量
实施原位杂交(ISH)以使各自包含靶标结合结构域、信号寡核苷酸和可光裂解接头的基于DNA寡聚物的探针(“RNA探针”)与内源性RNA杂交。将5 μm FFPE HER2 3+乳腺组织切片在二甲苯中脱蜡，在分级乙醇(graded ethanol)中部分再水化，并于室温下在70%乙醇中温育1小时。然后切片于37℃下，在40 μg/ml蛋白酶K中温育25分钟。然后将组织于室温下，在50%甲酰胺/2 X SSC中温育15分钟，和于37℃下，在1 nM探针、40%甲酰胺、1 mg/ml酵母tRNA、10%硫酸葡聚糖和0.2% BSA的2 X SSC溶液中杂交过夜。在杂交后，于37℃下以50%甲酰胺/2X SSC实施两次严格洗涤，每次25分钟。切片用TO-PRO®-3 (Thermo FisherScientific)荧光核酸染料染色以使组织形态学可视化。然后由数字微镜装置引导的聚焦UV光用于在用户定义的目标区域(ROI)自探针裂解DNA信号寡核苷酸。对于每个组织切片，两个ROI包含肿瘤组织，两个ROI包含正常组织，和两个ROI根本不包含组织(组织学载玻片本身)。在裂解后，收集信号寡核苷酸，与nCounter®分子条形码杂交，并通过来自NanoString Technologies®的nCounter®系统进行数字计数。对组织切片实施H＆E以验证肿瘤和正常组织ROI。
在连续切片上，使用“蛋白质探针”实施标准免疫组织化学(IHC)，每种蛋白质探针包含作为靶标结合结构域的抗体、DNA信号寡核苷酸和可光裂解接头。然后将切片用抗兔Alexa 594二次抗体和TO-PRO®-3 (Thermo Fisher Scientific)荧光核酸染料染色以使组织形态学可视化。然后由数字微镜装置(DMD)引导的聚焦UV光用于在用户定义的ROI自探针裂解DNA信号寡核苷酸。对于每个组织切片，两个ROI包含肿瘤组织，一个ROI包含正常组织，和两个ROI根本不包含组织(组织学载玻片本身)。ROI与选择用于ISH探针裂解的ROI匹配。在裂解后，将来自蛋白质靶标的信号寡核苷酸与来自RNA靶标的信号寡核苷酸混合，并如以上描述的那样全部进行定量。对组织切片实施H＆E以验证肿瘤和正常组织ROI和验证ROI在ISH与IHC组织之间正确匹配。
图51显示自相同肿瘤样本的连续切片取样的ROI。区域1-4在该图像中未显示，而是取自不含组织的组织部分(阴性对照-“无组织”)。区域5-8含有少量肿瘤细胞(“正常组织”)。区域9-12含有大量肿瘤细胞(“肿瘤”)。
图52显示对该测定中包括的9种RNA探针中的6种获得的计数。对于每个ROI，在应用UV照射之前(“-UV”数据集)和在自相同区域收集正UV样本之前(“+UV”数据集)收集样本。当UV未应用于样本时获得计数的背景水平，因此显示获得的信号的UV依赖性。为+UV但不针对组织的ROI (即ROI 1-4 -“无组织”)给出背景计数。主要为正常组织的区域(即ROI 5-8-“正常组织”)给出低HER2探针计数(图表上的橙色条)。主要为肿瘤组织的区域(即ROI 9-12-“肿瘤”)给出较高的HER2计数。对核糖体S6探针可见类似但不太显著的增加(图表中的绿色条)。在该组织类型中预期不会高度表达的另外的对照探针靶向的RNA给出一致的计数，其在正常与肿瘤组织之间没有显示水平差异。这些对照探针被设计成靶向CD45、PSA(前列腺特异性抗原)和两种独特的ERCC序列。为了清楚起见，图53显示图52中显示的数据的平均值和标准偏差。
这些RNA探针样本还与分析肿瘤样本的样本区域的蛋白质探针同时运行。为此，RNA和蛋白质探针同时与nCounter®分子条形码杂交，并通过来自NanoStringTechnologies®的nCounter®系统进行数字计数。该测定的计数显示在图54中。与正常区域相比，HER2 RNA探针计数(上图中的红色条)和蛋白质探针计数(下图中的红色和橙色条)增加见于肿瘤区域。仅显示+UV样本。如以上描述的，-UV对照样本未显示于该图中，因为其给出背景计数(类似于“无组织”计数)。ROI6和ROI8自该分析中删除，因为未获得匹配的蛋白质探针样本。因此，来自蛋白质探针的信号寡核苷酸和来自RNA探针的信号寡核苷酸可一起检测和定量。
实施例17：与单链探针相比，部分双链探针具有更高的信噪比
使DNA探针(其识别并与mRNA结合)如在实施例16中描述的那样与5 μm FFPE组织中的RNA原位杂交。使用UV灯箱(胶盒)，在2X SSC + 0.1% Tween 20中对整个组织切片(封固于分开的载玻片上)实施UV裂解3分钟。在信号寡核苷酸的裂解和释放后，通过吸液管收集信号寡核苷酸并如实施例16中那样检测。HER2 3+乳腺组织和扁桃体组织的单链DNA探针、部分双链DNA探针和无探针对照计数显示在图55 (上图)中。信噪比通过将计数除以平均背景计数(平均ERCC计数)来确定，参见图55下图。
实施例18：添加鲑鱼精子DNA改善探针杂交
使DNA探针(其识别并与mRNA结合)如以上描述的那样与5 μm FFPE组织中的RNA原位杂交。在杂交期间使用1 mg/ml超声处理的变性鲑鱼精子DNA代替酵母tRNA。将载玻片用1 nM探针、40%甲酰胺、1 mg/ml超声处理的变性鲑鱼精子DNA、10%硫酸葡聚糖和0.2% BSA的2XSSC溶液杂交。如实施例17中描述的那样实施UV裂解及信号寡核苷酸收集和检测。HER2 3+乳腺和扁桃体中显示单链DNA探针(图56)。信噪比通过将计数除以平均背景计数(平均ERCC计数)来确定。
实施例19：PSA (前列腺特异性抗原) RNA探针为高度特异性的
使DNA探针(其识别并与mRNA结合)如以上描述的那样与5 μm FFPE前列腺切片中的RNA原位杂交。使用于97℃下在MES中温育10分钟代替1小时乙醇温育。如实施例17中描述的那样实施UV裂解、信号寡核苷酸收集和检测及信噪比计算。计数和比率显示在图57中。
实施例20：在非标准亚nM浓度下增加的探针特异性
一般地，用于识别RNA的原位杂交(ISH)探针在5-200 nM下杂交。令人惊讶的是，本发明的核酸识别探针在等于或低于0.2 nM下表现最好，该浓度低至标准ISH探针浓度的1/25-1/1000。
使DNA探针如以上描述的那样与FFPE HER2 3+乳腺样本的5 μm切片中的RNA原位杂交。探针以5、1、0.2和0.4 nM使用。如实施例17中描述的那样实施UV裂解、信号寡核苷酸收集和检测及倍数变化计算。
图58显示计数随着探针浓度的降低而降低(上图)。然而，意想不到地，当探针以亚nM浓度杂交时，当阳性探针计数与阴性对照探针相比时，信噪比显著增加。

Claims (51)

1.一种包括以下的方法：
(1) 使在或来自样本中至少一个细胞的至少一种蛋白质靶标与至少一种包含靶标结合结构域和信号寡核苷酸的探针接触；
(2) 向所述样本的位置提供足以释放所述信号寡核苷酸的力；和
(3) 收集并鉴定释放的信号寡核苷酸，从而检测在或来自被提供力的样本的特定位置的所述至少一种蛋白质靶标。
2.权利要求1的方法，其中检测包括确定所述至少一种蛋白质靶标的身份和丰度。
3.权利要求2的方法，其中所述至少一种蛋白质靶标包含至少两种不同蛋白质靶标或相同蛋白质靶标的至少两个拷贝。
4.权利要求3的方法，其中检测包括比较每种不同蛋白质靶标的丰度。
5.权利要求1的方法，所述方法还包括在所述样本的至少第二特定位置重复至少步骤(2)和(3)，所述第二特定位置至少包含第二细胞。
6.权利要求5的方法，其中检测包括比较在或来自所述特定位置与在或来自至少第二特定位置的所述至少一种蛋白质靶标的丰度。
7.权利要求6的方法，其中所述至少一个细胞与所述至少第二细胞为相同细胞类型。
8.权利要求6的方法，其中所述至少一个细胞与所述至少第二细胞为不同细胞类型。
9.权利要求8的方法，其中检测包括比较在或来自第一细胞类型与在或来自所述至少第二细胞类型的所述至少一种蛋白质靶标的丰度。
10.权利要求9的方法，其中所述第一细胞类型与所述至少第二细胞类型独立地选自正常细胞和异常细胞。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述至少一个细胞直接固定于表面或经至少一个其他细胞间接固定于表面。
12. 权利要求11的方法，其中所述样本为2-1000 μm厚的组织切片。
13.权利要求12的方法，其中所述组织切片得自福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)样本。
14.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述至少一个细胞为培养细胞、原代细胞或来自外植体的解离细胞。
15.权利要求12或14的方法，其中所述至少一个细胞为固定或未固定的。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述至少一个细胞在步骤(2)之前染色或标记，从而使得染色或标记细胞中的亚细胞、细胞或组织相关结构能够可视化。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述至少一种探针还包含位于所述靶标结合结构域与所述信号寡核苷酸之间的接头。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述信号寡核苷酸为单链核酸或部分双链核酸。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中负向纯化用于自释放的信号寡核苷酸去除完整探针分子。
20.权利要求19的方法，其中所述负向纯化包括亲和纯化，其包括使完整探针与同所述完整探针的一部分互补的固定化寡核苷酸或固定化抗体或识别并同所述完整探针的一部分结合的蛋白质结合基序接触。
21.权利要求20的方法，其中所述完整探针的靶标结合结构域包含通用纯化标签或与所述固定化寡核苷酸部分互补或能够被所述固定化抗体或蛋白质结合基序识别或结合的序列。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述接头包含可裂解接头。
23.权利要求22的方法，其中所述可裂解接头为可光裂解的。
24.权利要求23的方法，其中被提供的力为光。
25.权利要求24的方法，其中所述光通过选自弧光灯、激光、聚焦UV光源和发光二极管(LED)的光源提供。
26.权利要求25的方法，其中所述光照射所述至少一个细胞的至少一个亚细胞结构。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中检测包括确定在或来自所述至少一个细胞的所述至少一个亚细胞结构的所述至少一种蛋白质靶标的丰度。
28.权利要求5的方法，其中所述力为由选自弧光灯、激光、聚焦UV光源和发光二极管(LED)的光源提供的光，并且所述光源照射所述至少一个细胞中的至少一个亚细胞结构和所述至少第二细胞中的至少一个亚细胞结构。
29.权利要求28的方法，其中检测包括比较在或来自所述至少一个细胞中的至少一个亚细胞结构与所述至少第二细胞中的至少一个亚细胞结构中的所述至少一种蛋白质靶标的丰度。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中所述靶标结合结构域选自抗体、肽、适体和类肽。
31.权利要求1-30中任一项的方法，其中检测包括聚合酶反应、逆转录酶反应、与寡核苷酸微阵列杂交、质谱法、与荧光分子信标杂交、测序反应或nCounter®分子条形码。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中所述蛋白质靶标为完整蛋白质、多种多肽、多肽或肽。
33. 权利要求1-32中任一项的方法，其中所述信号寡核苷酸经在样本与置于样本上的流体装置或不渗透性屏障之间具有25-500 μm深度的通道中的液体层流、湍流或过渡流自所述样本收集。
34.权利要求1-33中任一项的方法，其中释放的信号寡核苷酸自邻近所述至少一个细胞的溶液收集。
35.权利要求34的方法，其中邻近溶液至少紧接位于所述至少一个细胞上方。
36.权利要求35的方法，其中所述邻近溶液通过抽吸来收集。
37.权利要求36的方法，其中所述抽吸为通过吸液管、毛细管、微阵列针和/或含孔流动池。
38.权利要求37的方法，其中所述毛细管包含能够将光力传输到所述至少一个细胞的光学装置。
39.权利要求38的方法，其中所述光力为UV光。
40.权利要求39的方法，其中所述吸液管或微阵列针可连接于包含多种吸液管或微阵列针的阵列。
41.权利要求1-40中任一项的方法，其中邻近溶液包含阴离子聚合物，优选地为硫酸葡聚糖，和/或鲑鱼精子DNA。
42.权利要求1-41中任一项的方法，其中将收集的信号寡核苷酸加入到溶液中，该溶液包含阴离子聚合物，优选地为硫酸葡聚糖，和/或鲑鱼精子DNA。
43.权利要求1-42中任一项的方法，其中所述方法还包括使用激光扫描装置照射目标区域。
44.权利要求1-42中任一项的方法，其中所述方法还包括使用数字镜装置(DMD)照射目标区域。
45.权利要求1-44中任一项的方法，其中所述方法提供同时进行样本的空间分辨蛋白质检测。
46.权利要求1-45中任一项的方法，其中数字读数包含>5log的线性动态范围。
47.权利要求1-46中任一项的方法，其中将所述样本附着于载玻片上，并首先使用荧光成像，然后自所述样本进行蛋白质表达的数字计数。
48. 权利要求1-47中任一项的方法，其中所述探针以5 nM或更低的浓度提供。
49. 权利要求48的方法，其中所述探针以1 nM或更低的浓度提供。
50. 权利要求49的方法，其中所述探针以0.4 nM或更低的浓度提供。
51. 权利要求50的方法，其中所述探针以0.2 nM或更低的浓度提供。
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