CN108339121A - 蛋白激酶a抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于血小板药物领域，公开了蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途。本发明首次通过实验探讨了蛋白激酶A在调控血小板凋亡过程中的作用。研究证明蛋白激酶A活性的抑制可导致内源性血小板凋亡的发生，提示蛋白激酶A抑制剂具有促进血小板凋亡的作用，蛋白激酶A通过调控BAD 155位点丝氨酸的磷酸化调控血小板凋亡。蛋白激酶A的抑制剂在体外实验中可导致血小板凋亡，在体内实验中，可导致实验动物体内血小板数量减少。蛋白激酶A基因敲除的小鼠体内循环血小板数量减少。因此，蛋白激酶A的抑制剂具有开发成新型治疗血小板增多性疾病药物的潜力，极具科研和经济价值。

Description

蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物 中的用途

技术领域

本发明属于血小板相关药物领域，具体涉及蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途。

背景技术

血小板是循环系统中调节血栓形成与病理性出血的关键因素，同时也在机体的免疫反应、感染、动脉粥样硬化形成以及肿瘤转移等病理生理过程中发挥重要作用。对血小板的生命周期的精细调节是维持正常人体内血小板数量的关键，血小板数量增多见于多种疾病，如原发性血小板增多症，真性红细胞增多症，而有些病理过程中外周血血小板数量增多，增加了出血或血栓形成的风险，如慢性粒细胞性白血病、大出血后及慢性炎症、肿瘤等。因此，探讨调控血小板寿命和生存的机制，通过缩短血小板寿命来减少外周血中血小板数量，对治疗血小板增多性疾病具有重要的病理生理学意义。

近年来涌现的大量血小板凋亡的相关实验研究揭示了调控血小板生存周期的奥秘。越来越多的实验研究表明，在病理生理状态下血小板破坏主要由其内在的凋亡程序所介导，Bak和Bax是介导真核细胞凋亡的主要分子，同时在血小板的凋亡过程中也发挥着重要作用。然而经证实，只有Bcl-2抗凋亡家族中的Bcl-xL蛋白能与Bak相结合参与无核血小板的抗凋亡，突变Bcl-xL剂量依赖性降低体内血小板生存，而这个过程可以通过敲除BAK和BAX被抑制，P53通过抑制Bcl-xL活性被证明可能参与调节血小板凋亡过程。而且目前发现，Bcl-2家族的促凋亡蛋白中只有Bad参与调节血小板的寿命，这些研究揭示了血小板凋亡蛋白在调节血小板寿命和血小板生存中具有重要作用。然而，生理或病理条件下，如何诱导血小板凋亡、降低血小板数量的机制目前尚不清楚。

蛋白激酶A(PKA)是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是由两个催化亚基和两个调控亚基组成的异四聚体。环磷酸腺苷（cAMP）结合到调控亚基后，释放活化的催化亚基，进而调控细胞的代谢、生长分化、基因表达以及凋亡等生物学行为。有文献报道，在有核细胞中PKA既有促凋亡作用又有抗凋亡作用，而在血小板中PKA表达水平较高且其表达受到精细调控，对血小板的功能调节具有重要的作用。但是 PKA是否对储存或病理刺激诱导的血小板凋亡有较大的影响，仍未可知。

发明内容

要解决的技术问题：针对上述的技术问题，本发明解决的技术问题是进一步研究蛋白激酶A抑制剂对促进血小板凋亡的具体机制，进而公开蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物。

技术方案：针对上述问题，本发明公开了蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途。

优选的，所述的蛋白激酶A抑制剂为无机物抑制剂、有机物抑制剂中的一种或几种。

优选的，所述的无机物抑制剂为氢化物、氧化物、酸、碱、盐中的一种或几种。

优选的，所述的有机物抑制剂为烃类、烃的衍生物、糖类、蛋白质、脂肪、核酸、合成高分子材料中的一种或几种。

优选的，所述的烃类为烯烃、烷烃、炔烃、芳香烃中的一种或几种；所述的烃的衍生物为卤代烃、醇、酚、醛、酸、酯中的一种或几种；所述的糖类为单糖、二糖、低聚糖、多糖中的一种或几种；所述的蛋白质为氨基酸、多肽中的一种或几种；所述的核酸为脱氧核糖核酸、核糖核酸中的一种或几种。

优选的，所述的蛋白激酶A抑制剂为法舒地尔、氮-[2-（磷酸化溴硝基精氨酸酰氨基）乙基]-5-异喹啉磺酰胺、C₉₄H₁₄₈N₃₂O₃₁、C₈₀H₁₃₀N₂₈O₂₄、C₂₇H₂₁N₃O₅、C₂₆H₁₉N₃O₅、C₂₀H₁₃N₃O、C₃₂H₃₁N₃O₅、C₂₂H₂₂N₄O、C₁₄H₁₇N₃O₂S·2HCl、C₁₄H₁₇N₃O₂S、C₁₁H₁₃N₃O₂S·HCl、C₁₂H₁₃C_lN₂O₂SHCl、C₁₂H₁₅N₅O₂S₂HCl、C₅₃H₁₀₀N₂₀O₁₂、1-（5-喹啉磺酰基）哌嗪、4-氰基-3-甲基异喹啉、乙酰氨基-4-氰基-3-甲基异喹啉、8-溴代-2-单酰腺苷-3，5-环单硫代磷酸酯、腺苷酸3,5-环单硫代磷酸酯、2-0-单丁-环磷腺苷、8-氯代-环磷腺苷、N-[2-(肉桂酰氨基酸)]-5-异琳喹酮、反相-8-己基氨基腺苷酸3,5-单硫代磷酸酯、反相-8-哌啶基腺苷-环磷腺苷、反相-腺苷酸3,5-环单硫代磷酸酯、5-碘代结核菌素、8-羟基腺苷酸-3,5-单硫代磷酸酯、钙磷酸蛋白C、瑞香素、反相-8-氯苯-环磷腺苷、反相-环磷腺苷、反相-8-Br-环磷腺苷、 9-腺苷酸环化酶、1-(5-异喹啉磺酰)-2-甲基哌啶、8-羟基腺苷酸-3',5'-单磷酸、8-己基氨基腺苷酸-3',5'-单磷酸、反相-腺苷酸3',5'-环单磷酸中的一种或几种。

优选的，所述的血小板数量增多相关疾病包括原发性血小板增多疾病或继发性血小板增多疾病。

优选的，所述的原发性血小板增多疾病包括原发性血小板增多症、慢性粒细胞白血病、骨髓纤维化和真性红细胞增多症、骨髓增生异常综合症或骨髓增殖性肿瘤。

优选的，所述的继发性血小板增多疾病包括切脾后血小板增多、细菌或病毒引起的感染、肿瘤或免疫系统疾病。

优选的，所述的药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、缓释制剂、控释制剂、口服液或贴剂。

优选的，所述的药物包含药学上有效剂量的蛋白激酶A抑制剂和药学上可接受的载体。

优选的，所述的药物通过口服、喷雾吸入、注射或经胃肠道进行给药。

蛋白激酶A抑制剂在制备促血小板凋亡药物中的用途。

有益效果：本发明首次通过实验探究了PKA在调控血小板凋亡过程中的作用，发现在ITP，感染和糖尿病病人的血小板中PKA活性下降，而且PKA通过调控BAD 155位点丝氨酸的磷酸化进而调控血小板凋亡。抑制PKA活性不仅可以诱导体外血小板凋亡，而且可以降低体内循环血小板的数量，表明PKA抑制剂可以参与血小板增多性疾病的治疗过程，减少外周循环血中血小板数量，具有开发成新型治疗血小板增多性疾病药物的潜力，极具科研和经济价值。

附图说明

图1为PKA通过调节Bad 155位点丝氨酸磷酸化调控血小板凋亡相关实验结果图；

图2为蛋白激酶A抑制剂导致血小板凋亡线粒体跨膜电位去极化的血小板所占的百分比测试结果；

图3为蛋白激酶A抑制剂导致血小板凋亡western blot检测caspase-3、gelsolin蛋白表达和血小板中caspase-3活性测定结果；

图4为洗涤血小板与不同浓度的蛋白激酶A抑制剂H89孵育后PS外翻测试结果；

图5为FSC-FL1收集的蛋白激酶A抑制剂导致血小板凋亡的血小板散点图；

图6为不同浓度梯度的H89于22 ℃作用于洗涤血小板160分钟后导致血小板凋亡的扫描电镜结果；

图7为PKA抑制引起体内急性血小板减少相关实验结果；

图8为条件性基因敲除小鼠构建过程及相关测试结果；

图9为PKA敲除小鼠血小板清除比率增加相关结果；

图10为洗涤血小板与不同Fasudil（法舒地尔）或者阴性对照孵育后血小板 Δψm及PS外翻测试结果；

图11为老鼠采血后对照组和试验组分别注射DMSO和Fasudil（法舒地尔）（1.6μmol/L）后在不同时间采血计数测试结果。

具体实施方式

1、试剂与材料：

抗GpIIb/IIIa的单克隆抗体SZ21由江苏省血液研究所所长阮长耿教授提供，二甲基亚砜（DMSO）、抗Actin一抗购自 美国Sigma公司，EDTA-K2抗凝管购自美国BD公司，异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）-Annexin V购自北京嘉美生物科技有限公司，FITC-羊抗鼠抗体购自美国Bioworld Technology公司，（Horse Radish Peroxidase，HRP）-羊抗鼠、HRP-羊抗兔、兔和鼠IgG、抗BAX、抗BAK、抗Bcl-xL、抗Bcl-2、抗Caspase-3、抗BAD155磷酸化抗体购自美国Santa Cruz生物科技公司，抗PKA Cα抗体购自美国CST公司，N-[2-((p-Bromocinnamyl) amino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide (H89)、Forsklin、抗GAPDH、抗P53抗体、JC-1、ECL、PMSF购自中国碧云天生物科技有限公司，E64购自美国Roche生物科技有限公司，A23187购自美国Calbiochem公司。RNA寡核苷酸由吉玛公司设计合成。脂质体Lipofectamine™ 2000 和培养基Opti-Mem I 购自美国Invitrogen生物公司。

2、实验用小鼠：

PKA基因敲除小鼠（B6;129X1-Prkacatm1Gsm/Mmnc）以C57BL/6J为背景，购自美国MMRRCUNC。全部动物实验均经苏州大学附属第一医院伦理委员会批准。

3、洗涤血小板：

健康成人志愿者自肘正中静脉采血，献血者均知情同意并签署协议书。实验方案经苏州大学附属第一医院伦理委员会批准，符合赫尔辛基宣言。

制备洗涤血小板时，取健康自愿者静脉血与ACD（2.5 % 柠檬酸钠，2.0 % 葡萄糖，1.5 % 柠檬酸）按1：7抗凝，1300 rpm离心20 min 得到富血小板血浆（PRP），将PRP以1500 g离心2 min，弃上清。用CGS缓冲液（0.123 M 氯化钠，0.033 M 葡萄糖，0.013 M 柠檬酸钠，pH 6.5）悬浮并离心、洗涤沉淀的血小板，再用修改的Tyrode’s缓冲液（2.5 mM两性离子缓冲液Hepes，150 mM 氯化钠，2.5 mM 氯化钾，1 mM 氯化钙，1 mM 氯化镁，12 mM 碳酸氢钠，5.5 mM 葡萄糖，pH 7.4）重悬血小板，得到洗涤血小板悬液，用计数仪对血小板进行计数，调整血小板悬液至浓度为3 × 108 /mL，室温静置60 min。

4、电镜：

洗涤血小板以2.5%戊二醛于4℃固定过夜。送扫描电镜样品室制样。扫描电镜（日本日立公司，S-4700）对血小板进行形貌分析。各选择5个不同视野进行观察并拍照。

5、全身照射及骨髓移植：

雄性WT小鼠（6周龄）接受Co60来源的9.5 Gy剂量的全身照射。收集来自PKA基因杂合子孕鼠（怀孕15天左右）胎儿肝细胞，并按照1胎鼠肝细胞对应一只辐照雄鼠比例给予注射（接受照射后6h内完成），放入IVC专用动物房，给予酸化水、Co60辐照饲料及垫料，每日观察生存情况；4周后存活小鼠测定全血细胞计数，若恢复正常即可用于下一步实验。移植是否成功通过Western Blotting检测受体小鼠血小板中PKA蛋白的表达来确定。

6、线粒体膜电位（Δψm）检测

洗涤血小板（3 × 108 /mL）与不同浓度H89 (12.5 μM，25 μM，37.5 μM和50μM)或者阴性对照（DMSO）室温10 min，之后血小板 Δψm 使用亲脂性阳离子染料JC-1测定。终浓度为2μg/ml的JC-1加入处理后的血小板中，37 ℃避光孵育20 min，流式细胞仪检测。红色荧光表示线粒体膜电位依赖性的JC-1聚合物，绿色荧光表示线粒体膜电位去极化之后未结合膜电位的JC-1单体。JC-1单体（λex 514 nm，λem 529 nm）以及聚合物（λex 585 nm，λem 590 nm）通过计算流式红色荧光（JC-1聚合物）或者绿色荧光（JC-1单体）比例来测定。

7、 PS外翻

洗涤血小板与不同浓度的H89 (12.5 μM，25 μM，37.5 μM和50μM)或者阴性对照（DMSO）于室温孵育10 min。之后将Annexin V缓冲液、H89处理后的血小板、Annexin V-FITC按照50: 10: 1的比例室温下避光孵育15 min，流式细胞仪检测。

8、血小板皱缩实验

洗涤血小板与不同浓度的H89 (12.5 μM，25 μM，37.5 μM和50μM)或者阴性对照（DMSO）于室温孵育10 min。然后将血小板与SZ21抗体室温共孵育30 min。离心，用含有FITC标记的羊抗鼠抗体重悬血小板，室温避光孵育30 min。流式细胞仪收集血小板，FSC-FL1收集的血小板散点图用于分析血小板。血小板的皱缩通过分析FSC的变化，评价GPIIb/IIIa阳性细胞的FSC降低程度来评价皱缩程度。A23187作为阳性对照。DMSO作为阴性对照。

9、Western Blotting：

洗涤血小板与不同浓度的H89 (25 μM，50 μM，100 μM)或者阴性对照（DMSO）于室温孵育10 min。加入2X细胞裂解液（含2 mM PMSF、2 mM NaF、2 mM Na3VO4以及蛋白酶抑制剂）终止反应，冰上裂解，制样。样本以免疫印迹法检测相应蛋白的表达。

10、RNA干扰实验

靶目标PRKACA的双链siRNA寡核苷酸（正义: 5-GCUCCCUUCAUACCAAAGUTT-3， 反义: 5-ACUUUGGUAUGAAGGGAGCTT-3）和阴性对照 siRNA （正义:5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3， 反义:5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3）由吉玛公司设计并合成。

Hela细胞转染时，转染前一天，将2× 105个hela细胞接种于培养板中，每孔中加入约500 µL无抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30～50％；取1 μL/孔Lipofectamine 2000（使用前轻轻摇匀），用50μL Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀释。轻轻混和后在室温孵育5 min；取2µL FAM-siRNA，用50μL Opti-MEM I Reduced SerumMedium 稀释，轻轻混和均匀; 稀释的Lipofectamine 2000 经过5 min 的孵育后，与稀释FAM-siRNA轻轻混和，室温静置20 min；将FAM-siRNA-转染试剂混和液加入含有细胞及培养液（约含400 µL）的孔中，轻轻摇晃孔板，使混和。

血小板转染实验时，无菌准备洗涤血小板6 × 108 /mL ，静置后。将100 µLsiRNA寡核苷酸加入100 µL无血清M199培养基悬浮的血小板中。

在37 ℃的CO₂ 培养箱中培养，6小时后可将培养基换为含血清的完全培养基培养48 h；转染6小时后即可通过流式细胞仪检测转染效率。培养结束时，收集并裂解hela细胞和血小板。样品通过蛋白质印迹方法检测PKA Cα的表达程度，Actin用于内参检测。

11、统计学分析：

全部数据均来源于至少3次相互独立的实验，数据以均数±标准误表示，应用PrismVersion 5.0对数据进行统计学分析，对数据进行非配对T检验，p<0.05作为差异性显著界值。

12、实验结果：

（1）PKA通过调节BAD 155位点磷酸化调控血小板凋亡

我们探索了PKA抑制诱导血小板凋亡的机制。常温下，3×10⁸ /mL的洗涤血小板与不同浓度梯度的H89或DMSO内参共孵育160分钟，用等体积裂解液冰上裂解30分钟，产物经SDS-PAGE电泳分离得到不同大小的蛋白片段，脱脂奶粉封闭一小时后加入一抗孵育，最终ECL发光显示目的蛋白条带（图1a）。 洗涤血小板分别用37.5 uM的H89、10 uM的forskin以及DMSO内参常温下预处理160分钟，分别提取血小板的胞浆蛋白和线粒体蛋白，western blot 检测目的蛋白，Image J软件分析目的蛋白的量，统计四次实验以均数±标准差显示结果（图1b）。预处理的血小板裂解后，17,000 g 4°C离心10分钟，将得到的上清与相应抗体孵育沉淀过夜，与protein A/G +琼脂糖珠4°C孵育2小时后，将珠子洗脱后用于蛋白杂交（图1c），统计分析四次实验以均数±标准差显示结果，*P < 0.05, **P < 0.01。

结果发现，PKA抑制剂量依赖减少血小板GPIbβ 166位点丝氨酸的磷酸化程度，进而证明降低PKA活性。然而，我们研究发现，凋亡血小板中凋亡执行蛋BAK、BAX和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表达量，均未出现明显的变化。有报道显示，在S49淋巴瘤细胞中，PKA通过调控增加Bim的表达，使肿瘤细胞避免发生凋亡现象。而我们研究发现，在PKA参与调控的血小板凋亡过程中，Bim蛋白水平未出现明显变化，排除了Bim的调控作用。

在有核细胞中，PKA通过调节BAD 155位点丝氨酸的磷酸化，并调控14-3-3蛋白与抗凋亡蛋白Bcl-xL的绑定，进而调控细胞凋亡。在BAD 155位点去磷酸化的条件下，BAD与Bcl-xL形成二聚体，释放凋亡执行者BAK和BAX，进而导致线粒体膜渗透性增强，发生细胞凋亡。我们发现BAD 155位点丝氨酸在PKA抑制剂H89的作用下出现磷酸化程度减少的现象，最重要的是，免疫共沉淀结果显示H89作用下，Bcl-xL 与BAD明显减少，提示H89通过调控BAD与Bcl-xL的相互作用调控抗凋亡蛋白Bcl-xL的活性。因此，这些数据表明PKA通过调控BAD155位点丝氨酸磷酸化调控血小板的凋亡。

（2）抑制PKA活性诱导血小板内源性凋亡

分别以不同浓度的H89 (0、12.5、25、37.5和50 µM) 于22 ℃作用于洗涤血小板160分钟，流式细胞仪检测血小板的线粒体跨膜电位去极化和PS暴露。实验结果重复四次。结果如图2至图6所示。将洗涤血小板用不同浓度梯度的H89 在22 ℃预处理30分钟，同时设立DMSO和A23187处理的阴性对照组和阳性对照组血小板，western blot检测caspase-3、gelsolin蛋白表达和血小板中caspase-3活性。将FITC标记的抗CD41抗体与预处理的血小板以1:10的比例混匀，常温下避光孵育10分钟，分析血小板大小散点图CD41阳性数量下降表示血小板数量减少。不同浓度梯度的H89于22 ℃作用于洗涤血小板160分钟，同时设立DMSO阴性对照组血小板。血小板经1%戊二醛固定30分钟后，扫描电镜成像观察结果，实验结果来自三次独立实验，标尺=1μm。结果用均数±标准差表示，与对照组相比*P< 0.05，结果重复三次以上。

接下来我们探讨了PKA在调控血小板凋亡中的作用。将血小板与PKA抑制剂H89共孵育，流式细胞仪检测血小板内JC-1染料标记变化，发现H89剂量依赖性诱导血小板发现线粒体膜电位（ΔΨm）去极化。而且，H89也可以时间依赖的诱导血小板发生△ψm去极化。ΔΨm去极化位于caspase-3信号通路上游，而caspase-3是半胱天冬酶家族刽子手之一，可导致细胞的解体和崩溃。我们研究发现，H89剂量依赖性的方式诱导caspase-3的活化和caspase-3底物gelsolin的酶切。磷脂酰丝氨酸（PS）外翻是内途径依赖细胞凋亡的另一个明显标记分子，我们研究发现，H89可以剂量依赖性诱导血小板表面PS外翻。

在凋亡过程中，线粒体功能障碍引发生物能量学破坏，最终引起质膜完整性破坏并导致形态学改变。实验结果显示H89可诱导GPIIb/IIIa阳性的血小板，出现向前散射（FSC）减少现象，表明抑制PKA活性后血小板形态上发生收缩。此外， H89剂量依赖的诱导的血小板出现典型的凋亡形态学改变，包括细胞膜囊泡，伪足，皱缩，脱颗粒现象等。总之，这些结果表明，PKA抑制可以诱导血小板发生的内途径依赖的细胞凋亡。

为了进一步证明PKA抑制可以诱导血小板凋亡的特异性，排除PKA抑制剂可能存在的非特异性，我们使用siRNA方法敲除血小板内PKA的产生。PKA催化亚基由Cα或Cβ组成，但PKA Cα被认为是PKA活性的主要来源。所以siRNA选择性抑制PKA Cα的产生而设计并合成。与对照组Hela细胞相比，PKA siRNA能够有效去除血小板PKA Cα亚基的表达。而且正如预期的那样，敲除PKA Cα的血小板出现PS外翻和ΔΨm去极化，即表明去除PKA能够促进血小板发生凋亡。

（3）PKA抑制引起体内急性血小板减少

接下来我们进一步探讨了PKA在体内血小板寿命中的作用。雄性ICR小鼠经尾静脉注射单剂量的Rp-cAMPS (50 mg/kg)，检测不同时间点小鼠体内血小板和网状血小板的数量。雄性ICR小鼠腹腔注射单剂量的抗血小板抗体R300, 0.15 mg/kg，清除血小板能够引起严重的血小板减少症，网织血小板数量增加将新合成的血小板释放到外周循环中，大约3天后，体内血小板数量恢复正常。雄性ICR小鼠腹腔注射单剂量的抗血小板抗体R300, 0.15mg/kg，两天和7天后尾静脉注射Rp-cAMPS (50 mg/kg)，分别计数Rp-cAMPS注射前和注射8小时后的血小板和网织血小板。雄性ICR小鼠每24小时经尾静脉注射PKA激动剂 8-Br-cAMP(2.5 mg/mL)，同时设立PBS组做为阴性对照，8天后计数小鼠体内的血小板和网织血小板，实验组和对照组分别设立5-6只小鼠*P < 0.05, **P < 0.01（图7）。

将PKA抑制剂反相-环磷腺苷（Rp-cAM7PS）（非试剂对照）通过尾静脉注射到ICR小鼠体内。结果发现，2小时检测，血小板计数下降了正常血小板计数的30%。8小时检测，血小板计数下降至最低值。而且，Rp-cAMPS 注射后的血小板出现ΔΨm去极化现象，表明血小板发生凋亡。

衰老或储存血小板会出现细胞凋亡，而且PKA活性相应的下降。与这些结果一致，我们发现，Rp-cAMPS 注射小鼠诱发体内血小板计数减少的同时，促进了网织血小板数量的增加，提示年轻血小板对Rp-cAMPS诱发的细胞凋亡有抵抗作用，同时也提示，在体内PKA抑制剂更容易诱导衰老的血小板发生凋亡。为了验证这个可能性，我们将抗血小板单克隆混合抗体R300，腹腔内注射方式打入小鼠体内，促进小鼠体内血小板清除，人为同步血小板产生速率。正如预期结果一样，注射后6小时小鼠体内检测不到循环的血小板，血小板数量在7天内恢复正常。在此期间，网织血小板的比例变化显著。注射Rp-cAMPS 会破坏R300抗体注射过7天后小鼠体内70%的循环血小板，然而只有30%的血小板在第二天被破坏。这些结果证实，衰老的血小板更容易受到PKA抑制剂刺激，进而诱发血小板凋亡和清除。而且，降低血小板的PKA活性会缩短循环血小板寿命。

（4）PKA敲除小鼠血小板清除比率增加

首先是条件性基因敲除小鼠构建（图8a）。Western blot 检测血小板中PKA、 Bad、GBIbb、磷酸化Bad Ser-155和磷酸化GBIbb Ser-166 的表达，每实验组至少设5只小鼠（图8b）。Sysmex XP-100血液分析仪计数血小板，结果统计分析了7 只WT小鼠、7只 PKA+/- 小鼠和5 PKA-/- 小鼠（图8c）。 全血用噻唑橙（0.5µg/mL）和抗CD41 (20 µg/mL)抗体标记后，在室温下孵育15 min，流式细胞仪检测网织血小板的数量。数据来自于7 只WT小鼠、7只PKA+/- 小鼠和5 PKA-/- 小鼠（图8d）。 抗血小板抗体R300 (0.15 μg/kg) 经腹腔注射入WT 和PKA+/- 小鼠体内，眼眶采血收集全血，Sysmex XP-100血液分析仪计数血小板数量，结果分别统计分析了6 只WT和 6 只PKA+/-小鼠（图8e）。洗涤血小板与JC-1 (2 µg/mL) 避光孵育10分钟，流式细胞仪检测线粒体跨膜电位去极化水平（图9f）。FITC标记的抗CD41抗体与血小板以1:10的比例混合，轻轻混匀后室温孵育10分钟（图9g）。分析血小板大小散点图，CD41阳性细胞数量下降代表血小板数量减少（图9h）。 1%戊二醛固定洗涤血小板30分钟后，扫描电镜成像观察结果，标尺=2μm（图9h）。*P < 0.05, **P < 0.01，实验结果来自三次独立实验，该图代表了每个基因型的至少五只小鼠。

大多数PKA Cα基因敲除小鼠在围产期就会死亡，因此我们建立了PKA Cα基因敲除小鼠胎儿的肝脏细胞移植给辐照过野生小鼠的骨髓移植方法。移植的胎鼠胎肝基因型通过PCR检测鉴定。小鼠移植4个月后得到稳定的移植结果，移植后带有PKA缺陷的血小板通过蛋白质印迹验证。在红细胞，白细胞计数和血红蛋白浓度上，移植的PKA-/-，PKA+/-，和WT老鼠没有显著的差异。而PKA +/-与WT老鼠相比，血小板的数量明显减少。PKA +/-与WT的网状血小板比较没有差异，这表明血小板数量的减少并不是由于血小板产生减少，而是由于血小板清除的加速。而且，我们发现注射抗血小板抗体R300，可诱导血小板发生凋亡，同时可迅速诱导PKA +/-比WT更快的血小板清除。有趣的是，PKA -/-小鼠血小板明显减少，且PKA-/-小鼠的血小板呈现典型的凋亡变化。

为了避免骨髓移植对PKA Cα基因敲除小鼠存在可能的干扰，我们构造PKA Cα条件敲除小鼠，这个小鼠与PF4 Cre老鼠共繁殖可得到血小板内PKA条件敲除的小鼠。条件敲除的C-PKA -/-，C-PKA +/-，和C-PKA+/+老鼠在红细胞，白细胞计数、血红蛋白浓度变化上没有显著的差异。而且PKA+/-和RIP3-/-老鼠相比，没有任何自发出血或血栓倾向。杂合子和纯合子小鼠PKA活性呈现剂量依赖性变化。在循坏血小板数量上，不同类型的老鼠无明显异常。然而，PKA敲除小鼠的PS外翻明显升高。在体内追踪生物素标记的血小板发现，PKA敲除可以剂量依赖性的降低血小板寿命。为了确认血小板寿命的缩短来自血小板内在因素，我们将PKA敲除小鼠的血小板移植到野生型小鼠体内。PKA-/-，PKA+/-小鼠血小板明显表现出比WT小鼠血小板缩短的寿命。

（5）法舒地尔能够促进血小板的凋亡

线粒体膜电位检测：

洗涤血小板（3 × 10⁸ /mL）与不同Fasudil（法舒地尔）或者阴性对照（生理盐水）室温10 min，之后除阴性对照外每组加入凝血酶0.1U/ml，37 ℃孵育30min。血小板 Δψm 使用亲脂性阳离子染料JC-1测定。终浓度为2 μg/ml的JC-1加入处理后的血小板中，37 ℃避光孵育5 min，流式细胞仪检测。红色荧光表示线粒体膜电位依赖性的JC-1聚合物，绿色荧光表示线粒体膜电位去极化之后未结合膜电位的JC-1单体。JC-1单体（λex 514 nm，λem 529nm）以及聚合物（λex 585 nm，λem 590 nm）通过计算流式红色荧光（JC-1聚合物）或者绿色荧光（JC-1单体）比例来测定（图10）。

PS外翻：

洗涤血小板（3 × 10⁸ /mL）与不同Fasudil（法舒地尔）或者阴性对照（生理盐水）室温10 min，之后除阴性对照外每组加入凝血酶0.1U/ml，37 ℃孵育30min。之后将Annexin V缓冲液、处理后的血小板、Annexin V-FITC按照50: 10: 1的比例室温下避光孵育15 min，流式细胞仪检测（图10）。

首先给予老鼠采血，作为基准值，然后对照组和试验组分别注射DMSO和Fasudil（法舒地尔）（1.6μmol/L）,然后在30min, 2h, 4h, 6h, 24h时间点采血计数（图11）。

总之，这些结果表明PKA通过调控凋亡决定血小板的寿命和生存，PKA抑制剂可以参与血小板增多性疾病的治疗过程，减少外周循环血中血小板数量，我们的研究为血小板增多症的临床治疗提供了新的思路，抑制PKA活性有可能成为临床治疗血小板增多症的新手段，PKA抑制剂具有开发成新型治疗血小板增多性疾病药物的潜力，极具科研和经济价值。

Claims (13)

1.蛋蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途，其特征在于，所述的蛋白激酶A抑制剂为无机物抑制剂、有机物抑制剂中的一种或几种。

3.根据权利要求2所述的蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途，其特征在于，所述的无机物抑制剂为氢化物、氧化物、酸、碱、盐中的一种或几种。

4.根据权利要求2所述的蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途，其特征在于，所述的有机物抑制剂为烃类、烃的衍生物、糖类、蛋白质、脂肪、核酸、合成高分子材料中的一种或几种。

5.根据权利要求4所述的蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途，其特征在于，所述的烃类为烯烃、烷烃、炔烃、芳香烃中的一种或几种；所述的烃的衍生物为卤代烃、醇、酚、醛、酸、酯中的一种或几种；所述的糖类为单糖、二糖、低聚糖、多糖中的一种或几种；所述的蛋白质为氨基酸、多肽中的一种或几种；所述的核酸为脱氧核糖核酸、核糖核酸中的一种或几种。

6. 根据权利要求1所述的蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途，其特征在于，所述的蛋白激酶A抑制剂为法舒地尔、氮-[2-（磷酸化溴硝基精氨酸酰氨基）乙基]-5-异喹啉磺酰胺、C₉₄H₁₄₈N₃₂O₃₁、C₈₀H₁₃₀N₂₈O₂₄、C₂₇H₂₁N₃O₅、C₂₆H₁₉N₃O₅、C₂₀H₁₃N₃O、C₃₂H₃₁N₃O₅、C₂₂H₂₂N₄O、C₁₄H₁₇N₃O₂S·2HCl、C₁₄H₁₇N₃O₂S、C₁₁H₁₃N₃O₂S·HCl、C₁₂H₁₃C_lN₂O₂SHCl、C₁₂H₁₅N₅O₂S₂HCl、C₅₃H₁₀₀N₂₀O₁₂、1-（5-喹啉磺酰基）哌嗪、4-氰基-3-甲基异喹啉、乙酰氨基-4-氰基-3-甲基异喹啉、8-溴代-2-单酰腺苷-3，5-环单硫代磷酸酯、腺苷酸3,5-环单硫代磷酸酯、2-0-单丁-环磷腺苷、8-氯代-环磷腺苷、N-[2-(肉桂酰氨基酸)]-5-异琳喹酮、反相-8-己基氨基腺苷酸3,5-单硫代磷酸酯、反相-8-哌啶基腺苷-环磷腺苷、反相-腺苷酸3,5-环单硫代磷酸酯、5-碘代结核菌素、8-羟基腺苷酸-3,5-单硫代磷酸酯、钙磷酸蛋白C、瑞香素、反相-8-氯苯-环磷腺苷、反相-环磷腺苷、反相-8-Br-环磷腺苷、 9-腺苷酸环化酶、1-(5-异喹啉磺酰)-2-甲基哌啶、8-羟基腺苷酸-3',5'-单磷酸、8-己基氨基腺苷酸-3',5'-单磷酸、反相-腺苷酸3',5'-环单磷酸中的一种或几种。

7.根据权利要求1所述的蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途，其特征在于，所述的血小板数量增多相关疾病包括原发性血小板增多疾病或继发性血小板增多疾病。

8.根据权利要求7所述的蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途，其特征在于，所述的原发性血小板增多疾病包括原发性血小板增多症、慢性粒细胞白血病、骨髓纤维化和真性红细胞增多症、骨髓增生异常综合症或骨髓增殖性肿瘤。

9.根据权利要求7所述的蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途，其特征在于，所述的继发性血小板增多疾病包括切脾后血小板增多、细菌或病毒引起的感染、肿瘤或免疫系统疾病。

10.根据权利要求1至6任一所述的蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途，其特征在于，所述的药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、缓释制剂、控释制剂、口服液或贴剂。

11.根据权利要求1至6任一所述的蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途，其特征在于，所述的药物包含药学上有效剂量的蛋白激酶A抑制剂和药学上可接受的载体。

12.根据权利要求1至6任一所述的蛋白激酶A抑制剂在制备治疗血小板数量增多相关疾病药物中的用途，其特征在于，所述的药物通过口服、喷雾吸入、注射或经胃肠道进行给药。

13.蛋白激酶A抑制剂在制备促血小板凋亡药物中的用途。