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CN101969955A - 治疗血栓栓塞疾病的方法 - Google Patents

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CN101969955A CN2009801062568A CN200980106256A CN101969955A CN 101969955 A CN101969955 A CN 101969955A CN 2009801062568 A CN2009801062568 A CN 2009801062568A CN 200980106256 A CN200980106256 A CN 200980106256A CN 101969955 A CN101969955 A CN 101969955A
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S·舍恩韦尔德
A·奥诺
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Abstract

本发明的领域涉及使用血小板收缩性抑制剂溶解血栓的方法。更特别地，本发明涉及血小板收缩性抑制剂联合一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂在抑制发展中的血栓的血小板收缩和凝固中的用途。

Description

治疗血栓栓塞疾病的方法
技术领域
本发明涉及使用血小板收缩性抑制剂溶解血栓的方法。更特别地，本发明涉及血小板收缩性抑制剂联合一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂在抑制发展中的血栓的血小板收缩和凝固中的用途。
背景技术
血栓形成可以分为两个时间上(temporally)不同的时期。第一个时期是形成初级止血栓子，其由聚集的血小板组成，不依赖纤维蛋白的产生而形成。然后当纤维蛋白聚合物被包裹在发展中的血栓中而物理性地稳定血小板栓子时，所述初级血小板栓子(或血栓)在次级止血时期凝固。在止血栓子发展的过程中，血小板经历了一系列复杂的形态的和功能的反应，其需要广泛地重塑肌动蛋白细胞骨架。这些细胞骨架的改变对于正常的血小板止血功能是必不可少的并且受控于复杂的信号蛋白、结构蛋白和调控蛋白的网络。
基于肌动蛋白的血小板的细胞骨架可以分为两个不同的功能性结构：(i)富含血影蛋白的膜骨架；衬于内层原生质膜内，和(ii)细胞骨架；由细胞中心至表面膜辐射的长肌动蛋白丝构成。所述膜骨架主要用于维持表面膜的结构和完整性，而细胞骨架，通过其连接至肌球蛋白，主要产生细胞内的收缩力。收缩力的内部产生在调节血小板形状改变1和促进颗粒分泌2中起作用，而收缩力的外部传送对于发生在次级止血时期过程中的纤维蛋白凝块回缩3是重要的。
血小板的收缩性需要肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化，所述磷酸化在肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和肌球蛋白磷酸酶(mPP)的双重控制下。在血小板中，钙似乎是收缩力产生的主要调节剂，因为已经发现Rho激酶的抑制对纤维蛋白凝块回缩时期的影响极小4并且只在限制细胞溶质钙流的实验条件下抑制血小板形状的改变。
在血栓形成的第二个阶段，血小板-纤维蛋白复合物经历回缩(称为“纤维蛋白凝块回缩”时期)，其用于帮助稳定血栓。Rho激酶在血栓的最初发展过程中起调节血小板-血小板粘附接触稳定性的作用，因为抑制Rho激酶破坏剪切场中的血小板-基质的稳定性和血小板-血小板相互作用5，造成血栓生长中的主要缺陷6。
对具有靶向去除血小板中的肌球蛋白IIA的小鼠的研究已经证实了支持血小板止血功能的血小板收缩机制的重要性，导致尾部出血时间的较长延长和血栓生长的严重缺陷。完全缺失肌球蛋白IIa去除了血小板形状的改变和凝块的回缩，但是血小板聚集和颗粒的释放大部分保持未受损害。
然而，尚未明了不依赖血液凝固和纤维蛋白凝块回缩的收缩性对调节初级止血栓子的有多重要。
发明内容
本发明提供了溶解受试者的血栓的方法，包括向受试者联合给予血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂。
本发明还提供一种抑制受试者的血栓收缩的方法，包括向受试者联合给予血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂。
本发明还提供一种增强血栓溶解剂效力的方法，包括在当血栓正在或已经从聚集的血小板形成时的时间向受试者给予血小板收缩性抑制剂以及血栓溶解剂。
本发明还提供血小板收缩性抑制剂与一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂联合用于抑制受试者的血栓收缩的用途。
在本发明的一个具体实施方式中，在血栓已经形成的位点局部给予血栓收缩性抑制剂。
在本发明的另一个具体实施方式中，直接在血栓中给予血小板收缩性抑制剂。
在本发明的另一个具体实施方式中，以丸的形式给予血小板收缩性抑制剂。
在本发明的另一个具体实施方式中，以口服或静脉推注或丸加输注的形式给予血小板收缩性抑制剂而将抑制维持在稳定状态的水平。
在本发明的一个具体实施方式中，根据本发明，在首次鉴定血栓栓塞疾病后12小时内将血小板收缩性抑制剂给予受试者。
在本发明的另一个具体实施方式中，根据本发明，在首次鉴定血栓栓塞疾病后3小时内将血小板收缩性抑制剂给予受试者。
在本发明的另一个具体实施方式中，根据本发明，在中风的3小时内将血小板收缩性抑制剂给予受试者。
在本发明的另一个具体实施方式中，在中风后立即根据本发明的方法将血小板收缩性抑制剂给予受试者。
在本发明的另一个具体实施方式中，根据本发明，在心脏病发作的3小时内将血小板收缩性抑制剂给予受试者。
在本发明的一个具体实施方式中，血小板收缩性抑制剂是Rho激酶抑制剂。在本发明的另一个具体实施方式中，血小板收缩性抑制剂是II型肌球蛋白抑制剂(blebbistatin)。在本发明的另一个具体实施方式中，血小板收缩性抑制剂是Rho抑制剂。
Rho激酶抑制剂优选选自：
(i)异喹啉磺胺类如(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)硫酰基]高哌嗪(二甲基法舒地尔)或1-(5-异喹啉硫酰基)高哌嗪(法舒地尔)或其盐；
(ii)(+)-(R)-反式-4-(1-氨乙基)-N-(4-吡啶基)环己甲酰胺或其盐；
(iii)(+)-(R)-反式-4-(1-氨乙基)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)环己甲酰胺]或其盐；或
(iv)具有Rho激酶抑制活性的衍生物。
在一个具体实施方式中，盐是盐酸化物。
根据本发明的Rho抑制剂优选是Rho GTP酶的抑制剂。优选，Rho抑制剂选自以下抑制剂：Cdc42、Rac1或RhoA。在一个具体实施方式中，Rho抑制剂是C3转移酶。
血小板收缩性抑制剂可以与一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂顺序或同时给予。
根据本发明的合适的血栓溶解剂的例子包括链激酶(法激酶(kabikinase)，)、阿尼普酶
Figure BPA00001207371500032
尿激酶(雅激酶)、替奈普酶(TNKase，
Figure BPA00001207371500033
)、瑞替普酶
Figure BPA00001207371500034
或组织纤溶酶原激活剂(t-PA，阿替普酶，
Figure BPA00001207371500035
)。但是本发明的本领域技术人员应该理解其它上面未提及的血栓溶解剂也适用于本发明。
本发明还提供了当与血小板收缩性抑制剂和可选地抗凝剂联合使用时的血栓溶解剂的剂量，其为根据核准的说明书规定的剂量或比其低。
例如，在一个具体实施方式中，将血小板收缩性抑制剂与血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂联合给药，其中血栓溶解剂的总剂量在人类受试者中为90mg以下。优选，血栓溶解剂的总剂量在70mg以下，更优选在50mg以下，还更优选在35mg以下，还更优选在20mg以下，甚至更优选在10mg以下。
在另一个具体实施方式中，将血小板收缩性抑制剂与t-PA和可选地一种或多种抗凝剂联合给药，其中t-PA的总剂量在90mg以下，优选在70mg以下，更优选在50mg以下，还更优选在35mg以下，还更优选在20mg以下，甚至更优选在10mg以下。
在另一个具体实施方式中，将血小板收缩性抑制剂与链激酶和可选地一种或多种抗凝剂联合给药，其中链激酶的剂量在1,500,000IU以下。
在另一个具体实施方式中，将血小板收缩性抑制剂与尿激酶和可选地一种或多种抗凝剂联合给药，其中尿激酶的总剂量在500,000IU以下。
本发明还提供一种治疗血栓栓塞疾病的方法，包括向受试者联合给予血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂。
根据本发明的血栓栓塞疾病的例子包括缺血性中风、急性心肌梗塞、深静脉血栓(DVT)、肺栓塞、凝结的AV瘘和分流(shunt)。但是应该理解这不是可以治疗的血栓栓塞疾病的详尽名单。
本发明还提供一种治疗中风的方法，包括向受试者联合给予血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂。
本发明还提供一种治疗心脏病发作的方法，包括向受试者联合给予血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂。
本发明还提供了血小板收缩性抑制剂与一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂的联合在制备用于治疗血栓栓塞疾病的药物中的用途。
本发明还提供了血小板收缩性抑制剂与一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂的联合在制备用于治疗中风的药物中的用途。
本发明还提供了血小板收缩性抑制剂与一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂的联合在制备用于治疗心脏病发作的药物中的用途。
本发明还提供了一种用于溶解血栓的组合物，所述组合物含有血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂。
本发明还提供了一种用于溶解血栓的组合物，所述组合物含有血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和一种或多种抗凝剂。
贯穿本说明书的单词“包括(comprise)”或变体如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”将被理解为意味着包括所述的元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组，但不排除任何其它的元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组。
附图说明
图1.不依赖纤维蛋白的血栓收缩。
当存在纤维蛋白聚合抑制剂GPRP(GPRP-280μM)(A)时，或当存在来匹卢定(Lepirudin)(800U/ml)(A，B)时，在无抗凝剂(天然)存在时收集人全血(A)，然后在1800s-1通过I型胶原包被的玻璃显微镜载玻片灌注多达5分钟。(A)为了观看纤维蛋白形成，在存在俄勒冈绿(Oregon-green)标记的纤维蛋白原(20μg/ml)时进行全血的灌注。使用Leica倒置显微镜(63X mag)实时捕捉DIC和荧光图像。从4个独立实验中的一个代表中获得图像。(B)使用DIC显微镜实时记录用来匹卢定(lepirudin)抗凝的全血的灌注过程中血栓的形成和凝固，离线获得指定时间点上的各个血栓的快照。从12个独立实验中的一个代表获得这些图像。收缩前的血栓的原始轮廓用虚线突出显示。
图2.体外鉴定血栓凝固
在1,800s-1通过胶原包被的显微镜载玻片灌注用来匹卢定抗凝的人全血。A.为了定量血栓的体积，在灌注前用DiIC12预先孵育全血，使用倒置的Leica DMIRB共聚焦显微镜实时捕获3-D图像，然后通过离线分析而定量血栓的体积，如“三维体积血栓分析”中所述的。所述图片描述了从4个独立实验获得的4个单个血栓随时间变化的血栓体积。B.通过在灌注前在全血中‘掺加’DiIC12标记的血小板，接着实时捕获连续的DIC和荧光图像进行血栓凝固的定量。(i)从12个独立流中的一个代表流中获得图像。(ii)按如在“二维血栓凝固定量”下所述的方法进行离线分析，结果表示为在流之前1分钟置于血栓的2个荧光标记的血小板之间的距离的百分比减小，将1分钟时血小板之间的距离取为100％。结果表示为来自12个独立实验(n＝12)的36个单个血栓的平均值±SD(实线)。
图3.钙在调节血栓收缩中的作用。
在1,800s-1通过胶原包被的显微镜载玻片灌注掺加了DiIC12标记的血小板的用来匹卢定抗凝的人全血。坚固粘附的血小板之间距离的减小按如“二维血栓凝胶定量”中所述的方法定量，并用作血栓收缩的间接标记。(A)在存在EGTA/Mg2+(2mM/1mM)时灌注全血。(B)为了用2-APB研究，在无抑制剂时初始灌注全血30秒从而允许起始形成非收缩的血栓(参考“二维血栓凝固定量”)，接着在存在2-APB(200μM)时灌注全血。(A，B)结果代表平均值±SEM(n＝5)(*p＜0.05；**p＜0.005；***p＜0.001)并代表在相对于1分钟时的100％的血小板间距离的％减小。(C)为了检查钙流对纤维蛋白凝块回缩的重要性，用2-APB(200μM)、c7E3(50μg/ml)或EGTA/Mg2+(2mM/1mM)预先孵育PRP，接着加入凝血酶(1U/ml)。凝块回缩按如在“血小板介导的纤维蛋白凝块回缩”下所述的方法进行评估。结果代表平均值±SEM(n＝3)(ns＝p＞0.05；**p＜0.005)。
图4.Rho激酶在调节血栓收缩中的作用。
(A)在1,800s-1通过胶原包被的显微镜载玻片灌注前，用载体(DMSO)、H1152(40μM)或HA1077(80μM)预先孵育掺加了DiIC12标记的血小板的用来匹卢定抗凝的人全血。将坚固粘附的血小板之间的距离进行定量并作为血栓收缩的间接标记。结果代表平均值±SEM(n＝4)(*p＜0.05；**p＜0.005；***p＜0.001)并代表在相对于1分钟时的100％的血小板间距离的％减小。(B)实时记录在存在载体(DMSO)或H1152(40μM)时血栓的形成，离线获得指定时间的单个血栓的快照。血栓的原始大小用实线描绘，而2分钟流之后获得的血栓大小用虚线描绘。这些图像从4个独立实验中的一个代表获得。(C)为了检查Rho激酶抑制剂对依赖纤维蛋白的凝块回缩的影响，用载体(DMSO)、H1152(40μM)、HA1077(80μM)或c7E3(100μg/ml)预先孵育PRP柠檬酸盐，接着加入凝血酶(1.0U/ml)。30分钟后评估凝块回缩的程度，按如在“血小板介导的纤维蛋白凝块回缩”下所述的方法进行。结果代表平均值±SEM(n＝3)。
图5.肌球蛋白II抑制剂(Blebbistatin)在体外对血栓凝固的影响。
在1,800s-1通过胶原包被的显微镜载玻片灌注前，用II型肌球蛋白抑制剂(Blebbistatin[-])或II型肌球蛋白抑制剂的非活性对映体(Blebbistatin[+])预先孵育用来匹卢定抗凝的人全血，按如在“二维血栓凝固定量”中所述的方法进行。(A)离线获得在1.5分钟时期内单个血栓的快照。从3个独立实验中的一个代表中获得这些图像。(B)在1,800s-1通过胶原包被的显微镜载玻片灌注掺加了DiIC12标记的血小板的全血，定量坚固粘附的血小板之间的距离，按如在“二维血栓凝固定量”中所述的方法进行。结果代表平均值±SEM(n＝3)(ns p＞0.05；**p＜0.005；***p＜0.001)并代表在相对于1分钟时的100％的血小板间距离的％减小。
图6.肌球蛋白IIa和Rho激酶在体外调节血栓稳定性中的作用。
通过针刺在麻醉的C57/Bl6小鼠的肠系膜的毛细血管后微静脉中诱导血管损伤，按如在“活体显微镜检查”中所述的方法记录血栓发展。在指示的实验中，在间断注射后评估II型肌球蛋白抑制剂的非活性对映体(Blebbistatin[+])、载体(DMSO)、H1152或II型肌球蛋白抑制剂(Blebbistatin[-])对血栓稳定性的影响(用实体柱表示)，所述物质的浓度和体积如“活体显微镜检查”中所述。(A)离线确定给定血栓随时间而变的表面积的相对改变，相对于注射前血栓的初始表面积而表示。这些结果描绘了从4个独立实验的1个获得的数据，(B)中描述了来自一个这样实验的代表性图像。注射后血栓表面积的百分比减小按如在“活体显微镜检查”中所述的方法进行定量，并表达为原始血栓的百分比(％)。这些结果代表平均值±SEM(n＝4)，其中***为p＜0.0001。
图7.肌球蛋白IIa和Rho激酶在调节初级止血栓子的稳定性中的作用。
在存在来匹卢定(50mg/kg，损伤前静脉内注射给予)时，通过针刺在麻醉的C57/Bl6小鼠的肠系膜的毛细血管后微静脉中诱导血管损伤。在指示的实验中，在重复注射后评估II型肌球蛋白抑制剂的非活性对映体(Blebbistatin[+])、载体(DMSO)、H1152或II型肌球蛋白抑制剂(Blebbistatin[-])对血栓稳定性的影响(用实体柱表示)，所述物质的浓度和体积如“活体显微镜检查”中所述。(A)离线确定给定血栓随时间而变的表面积的相对改变，相对于注射前血栓的初始表面积而表示。这些结果描绘了从4个独立实验中的1个获得的数据，(B)中描述了来自一个这样实验的代表性图像。(C)按如在“活体显微镜检查”中所述的方法定量每次灌注载体/抑制剂后血栓大小的最大百分比减小，并表示为灌注前原始血栓的百分比(％)。这些结果代表平均值±SEM(n＝4)，其中***为p＜0.0001。
图8.Rho激酶抑制剂与t-PA或尿激酶±抗凝剂的联合对血管再灌注的影响
柱形图(i)到(vi)证明了Rho激酶抑制剂(HA1077和Y27632)与t-PA或尿激酶的联合在有抗凝剂或无抗凝剂时对麻醉小鼠颈动脉中的血管灌注的影响。多种治疗方案如下：A：盐水，B：HA1077(8mg/kg)，C：t-PA(2mg/kg)丸+18mg/kg/30分钟灌注，D：t-PA(2mg/kg)和肝素(71U/kg)丸+t-PA(18mg/kg/30分钟)和肝素28.6U/kg/30分钟灌注，E：t-PA(2mg/kg)和肝素(142U/kg)丸+t-PA(18mg/kg/30分钟)肝素(57.2U/kg/30分钟)灌注，F：Y27632(8mg/kg)和t-PA(2mg/kg)和肝素(142U/kg)丸+t-PA(18mg/kg/30分钟)和肝素(57.2U/kg/30分钟)灌注，G：HA-1077(8mg/kg)和尿激酶(4,400IU/kg)和肝素(142U/kg)丸+尿激酶(4,400IU/kg/30分钟)和肝素(57.2U/kg/30分钟)灌注，H：HA1077(8mg/kg)和t-PA(2mg/kg)和水蛭素(10mg/kg)丸+t-PA 18mg/kg/30分钟)灌注。实体黑柱＝无再灌注，斑纹柱＝不稳定的再灌注-称为间断流扰乱，特征为被再阻塞时期分散的正常流的时期，实体灰柱＝中度稳定再灌注-称为间断流扰乱，特征为被减小的流分散的正常流的时期，无任何再阻塞，白柱＝稳定的再灌注-称为贯穿60分钟时期的血流的重新建立，在这一时期内无阻塞的再发展。
图9.Rho激酶抑制剂与t-PA或尿激酶±抗凝剂的联合对血管灌注所需时间的影响。
柱状图(i)到(vi)证明了在堵塞的血管中(其中血流＝0ml/分钟)建立再灌注所需的时间，其中再灌注如血流的重建立中所述(其中血流＞0ml/分钟)。多种治疗方案如下：A：盐水，B：HA1077(8mg/kg)，C：t-PA(2mg/kg)丸+18mg/kg/30分钟灌注，D：t-PA(2mg/kg)和肝素(71U/kg)丸+t-PA(18mg/kg/30分钟)和肝素28.6U/kg/30分钟灌注，E：t-PA(2mg/kg)和肝素(142U/kg)丸+t-PA(18mg/kg/30分钟)肝素(57.2U/kg/30分钟)灌注，F：Y27632(8mg/kg)和肝素(2mg/kg)和肝素(142U/kg)丸+t-PA(18mg/kg/30分钟)和肝素(57.2U/kg/30分钟)灌注，G：HA-1077(8mg/kg)和尿激酶(4,400IU/kg)和肝素(142U/kg)丸+尿激酶(4,400IU/kg/30分钟)和肝素(57.2U/kg/30分钟)灌注，H：HA1077(8mg/kg)和t-PA(2mg/kg)和水蛭素(10mg/kg)丸+t-PA 18mg/kg/30分钟)灌注。
具体实施方式
血栓形成描述了血管中血凝块(血栓)的发展。动脉血栓形成是最经常以冠状动脉血栓形成形式显示的主要临床问题，造成冠状动脉阻塞和急性心肌梗塞的发展(心脏病发作)。下肢深静脉内血栓的形成被鉴定为深静脉血栓(DVT)。成因包括固定和静脉阻塞、遗传性的和获得性的血栓前状态、雌二醇治疗和怀孕。某些手术过程还与手术后静脉凝块形成强烈相关。这些手术过程包括髋骨或全膝关节置换术、选择的神经外科和急性脊索损伤修复。
致病性血栓的治疗性溶解通过给予血栓溶解剂如组织纤溶酶原激活剂(t-PA)实现。血栓溶解疗法的益处包括具有血流恢复(重灌注)的快速血栓溶解。但是并发症包括由于生理性凝块的溶解形成的内部和外部出血，造成出血性中风。现在可用的血栓溶解剂除了t-PA还包括瑞替普酶、链激酶、阿尼普酶、尿激酶和替奈普酶。急性心肌梗塞的血栓溶解疗法估计可以挽救每1000个受治疗患者中的30个的生命；尽管如此，该疾病的30天死亡率仍然很高。
血栓溶解疗法在心肌梗塞治疗中的效果已经在过去的十年中通过使用上述的一种或多种试剂被证明了。不幸的是，这些试剂有副作用。例如，重组t-PA(在多种商品名ACTIVASE、CATHFLO ACTIVASE、ACTIVASE rt-PA、ACTILYSE下推向市场)与次级毒性如低纤维蛋白原血症和出血相关。与t-PA治疗相关的不良反应包括心率失常、心力衰竭、心搏聚停、复发缺血、心肌再梗塞、心包炎、血栓栓塞、肺水肿和低血压。另外，纤溶物如t-PA诱导血栓溶解的速率是高度可变的，25％的患者具有抗溶解的血栓。研究已经报道血栓组成作为溶解敏感性中的关键决定因素，富含血小板的血栓被证明对t-PA介导的溶解有较大的抗性13。由于冠状动脉血栓通常是富含血小板的，血小板在抑制凝块溶解中的作用可能在调节冠状动脉血栓溶解中起重要作用。在这一假设的支持中，临床试验已经证明了通过联合血栓溶解剂和抗血小板治疗剂可以增加再灌注的发生率、降低死亡率和次级并发症14，15，16。
本发明的一个重要发现是与无血小板收缩性抑制剂相比，向血栓溶解剂和抗凝剂中加入血小板收缩性抑制剂显著增加再灌注的时程。再灌注的时间是处理具有急性血栓形成事件的患者中的关键问题，具有单独用血栓溶解疗法观察到的30分钟或更长的再灌注时间。血栓形成再堵塞也是对血栓溶解疗法的限制，造成具有急性心肌梗塞的患者中约25％的再阻塞率。血小板收缩性抑制剂与血栓溶解剂±抗凝剂的联合显著降低再灌注后动脉阻塞的几率。这在治疗和处理中风和心肌梗塞中有明显的益处。
血栓溶解疗法在治疗肺栓塞中的用途是有争议的。虽然溶栓有理论上优于标准治疗的优点，很少有数据支持其优标准的抗凝治疗的广泛用途，除非在真正指征的情况下，即带有低血压或系统血流灌注过少的大块的肺栓塞17。但是没有已有证据显示对于再发性肺栓塞、死亡率或慢性并发症，血栓溶解疗法具有优于标准的抗凝治疗的益处。因为大多数具有低血压的大块肺栓塞的患者在症状起始后的两个小时内死亡，在这种情况下使用Rho激酶抑制剂可以允许通过较低剂量的血栓溶解剂的较有效的溶栓和更长的治疗处理窗口。
通过在胶原底物上进行血小板粘附和聚集的实时分析，本发明人揭示了不依赖凝血酶产生和纤维蛋白聚合而发生的不同的血栓发展收缩时期(称为“血小板血栓收缩”时期)。
降低血小板收缩功能的能力不只破坏形成中的血栓的稳定性，还可以增强血栓溶解剂如组织纤溶酶原激活剂(t-PA)或尿激酶溶解已形成的血栓的能力。血小板收缩性抑制剂如Rho激酶或肌球蛋白II的抑制剂(II型肌球蛋白抑制剂)先前还未用于促进血栓分解，因为Rho激酶或肌球蛋白II在促进初级血栓收缩中的作用还未被认识到。
根据本文所述的本发明的一个具体实施方式，本发明人已经发现Rho激酶抑制剂与t-PA或尿激酶血栓溶解剂和抗凝剂的联合协同地作用从而促进血栓的溶解。事实上，发现使用Rho激酶抑制剂和抗凝剂获得协同作用所需的尿激酶的浓度比在啮齿类动物肺栓塞模型中诱导溶栓所需的浓度低达100倍7。因此，有可能使用比规定的0.9mg/kg的剂量低的t-PA剂量来治疗急性缺血性中风并因此降低给予t-PA时可见的副作用的频率。
现在，血栓溶解疗法只可以给予症状起始3小时内的中风患者。但是如果血小板收缩性抑制剂允许使用较低剂量的t-PA的更有效的溶栓，治疗的时间框可以被相当大地拓宽。
血栓溶解剂
组织纤溶酶原激活剂
t-PA是当前唯一被批准的用于处理急性缺血性中风的药物。给予成人受试者的t-PA的剂量取决于需要治疗的情况。详述批准的剂量和适应症的产品信息从制药来源如MIMS可以公开获得。例如，推荐的用于治疗成人急性缺血性中风的剂量为0.9mg/kg(最大90mg)剂量的静脉内(IV)给药，在60分钟内灌注，在1分钟内将10％的总剂量作为最初的IV丸进行给药。对于肺栓塞，推荐的成人剂量为在2小时内静脉内给药100mg，当部分促凝血酶原时间或凝血酶时间回到正常的两倍或更短时，在t-TPA灌注的末尾或紧接着t-TPA灌注起始或恢复肝素治疗。对于急性心肌梗塞，推荐的剂量取决于患者的体重，并不应超过100mg。
链激酶
已经显示链激酶(链激酶(streptase))可以用于治疗急性心肌梗塞、肺栓塞和深静脉血栓。推荐的用于成人急性MI的剂量为在60分钟内静脉内灌注总剂量1,500,000单位。对于治疗肺栓塞、DVT、动脉血栓或栓塞，推荐的成人治疗是静脉内给药，优选在7天内将150,000单位的加载剂量在30分钟内灌注到外周静脉。
替奈普酶
显示替奈普酶可以用于急性心肌梗塞的血栓溶解治疗。推荐的剂量取决于体重并且给药是通过IV弹丸注射5-10秒。最大的剂量是10,000单位(50mg)。替奈普酶对于心肌梗塞后的溶栓具有与阿替普酶(rt-PA)相似的临床效果。
瑞替普酶
显示瑞替普酶可以用于急性心肌梗塞的血栓溶解疗法并作为10+10单位的双弹丸注射给药。10单位的瑞替普酶对应于17.4mg的瑞替普酶蛋白质质量。
阿尼普酶
显示阿尼普酶可以用于急性心肌梗塞的血栓溶解疗法。推荐的剂量是2至5分钟内静脉内给药30单位。
尿激酶
已经显示尿激酶可以用于治疗肺栓塞以及凝结的AV瘘和分流和深静脉血栓。推荐用于成人肺栓塞的剂量是10分钟内的4,400IU/kg的加载剂量，接着是12小时内的4,400IU/kg/hr的维持剂量。
因为这些血栓溶解剂的使用与许多不良事件相关(但是最显著的是出血的风险，特别是当与抗凝剂或改变血小板功能的试剂如阿司匹林一起给药时)，高度需要引起使用显著低剂量的血栓溶解剂的方法。
血小板收缩性抑制剂
Rho激酶抑制剂
Rho激酶是蛋白质激酶的营养不良性肌强直家族的成员，在氨末端含有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，在中心区域含有卷曲螺旋结构域，在羧末端含有Rho相互作用结构域。当结合到结合了GTP的RhoA时其激酶活性被增强，并且当被引入细胞时，它能再现激活的RhoA的许多活性。在平滑肌细胞中，Rho激酶介导钙致敏和平滑肌收缩并且Rho激酶的抑制阻断5-HT和苯肾上腺素激动剂诱导的肌肉收缩。当被引入非平滑肌细胞时，Rho激酶诱导张力丝形成并且是RhoA介导的细胞转化需要的。Rho激酶通过磷酸化调节许多下游蛋白质，包括肌球蛋白轻链、肌球蛋白轻链磷酸酯酶结合亚基和LIM激酶2。
已经发现Rho激酶抑制剂可以用于治疗血管疾病，包括肺性高血压、稳定的心绞痛和动脉粥样硬化。另外，已经发现Rho激酶抑制剂在抑制肿瘤细胞迁移和非停泊性生长中起作用。
已经描述了多种Rho激酶(ROCK)抑制剂，包括Y-27632([(+)-(R)-反式-4-(1-氨乙基)-N-(4-吡啶基)环己甲酰胺二盐酸盐]和Y-30141([(+)-(R)-反式-4-(1-氨乙基)-N-(1H-吡咯[2，3-b]吡啶-4-基)环己甲酰胺二盐酸盐]，其有选择性地针对p160ROCK(ROCK-I)和ROKα/Rho激酶(ROCK-II)(Ishizaki T等人，2000，Molecular Pharmacology 57：976-983)。
其它Rho激酶抑制剂包括H1152(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]高哌嗪二盐酸盐，也称为二甲基法舒地尔，或HA-10771-(5-异喹啉磺酰基)-高哌嗪盐酸盐，也称为盐酸法舒地尔(Asano T等人，1989，Br.J.Pharmacol.98：1091-1100)。
Figure BPA00001207371500111
法舒地尔是当前唯一被批准用于临床的Rho激酶抑制剂。法舒地尔的静脉内制剂于1995年在日本被批准，用于预防具有蛛网膜下出血的患者的脑血管痉挛。
正在开发法舒地尔的口服和吸入制剂以用于治疗肺动脉高压。
已经描述了法舒地尔的多种制剂。例如，WO 2005/117896公开了含有聚乙烯吡咯烷酮和聚醋酸乙烯酯的基质体和外壳的法舒地尔制剂。WO 2005/087237公开了改进的法舒地尔稳定制剂，WO 2000/009133公开了盐酸法舒地尔的口服制剂。含有这样的法舒地尔的制剂被认为适用于本发明的方法。
在一个具体实施方式中，根据本发明的Rho激酶抑制剂是1-(5-异喹啉磺酰基)-高哌嗪盐酸盐(HA1077)。
术语“具有Rho激酶抑制活性的衍生物”旨在包含Rho激酶抑制剂的活性代谢产物，如1-(羟基-5-异喹啉磺酰基-高哌嗪(羟基法舒地尔)。
还描述了其它的Rho激酶抑制剂，包括异喹啉磺胺类衍生物，如那些在US4634770中公开的和在US 6943172、US 6924290、US 6451825、US 6906061、US6218410中公开的化合物。
这样的衍生物包括在本发明的权利要求的范围内。
将Rho激酶抑制剂与一种或多种血栓溶解剂，如那些上述的血栓溶解剂联合给药。可以将Rho激酶抑制剂和血栓溶解剂顺序或同时给药。
因为本发明的方法被设计为促进血栓在早期溶解(在血栓栓塞事件症状起始的12小时内)，可以与Rho激酶联合使用的血栓溶解剂的剂量比一般使用的低。例如，预期用于人类受试者急性缺血性中风的t-PA治疗的总剂量范围将是5-90mg的级别。
II型肌球蛋白抑制剂
II型肌球蛋白抑制剂(这样命名是由于其阻断细胞起泡的能力)是非肌肉肌球蛋白II的选择性和高亲和力(IC50约为4μM)的抑制剂。在细胞分裂过程中，II型肌球蛋白抑制剂抑制分裂沟的收缩而不干扰有丝分裂。
GTP酶的Rho家族
GTP酶的Rho家族是小信号G蛋白(GTP酶)的家族并且是Ras超家族的亚族。已经显示Rho GTP酶家族的成员调节细胞内肌动蛋白动力学的许多方面，并在所有的真核生物包括酵母和一些植物中发现了它们。Rho蛋白涉及到广泛的细胞功能，如细胞极性、膜泡运输、细胞周期和转录体动力学(transcriptomal dynamics)。
抗凝剂
本发明的方法还包括(在适当的情况下)一种或多种另外的选自华法林、水蛭素或肝素的抗凝剂的用途。
本领域技术人员将理解另外的没有在上面列出的抗凝剂也适用于本发明。
另外的试剂
还可以用于本发明的方法中的另外的试剂包括一种或多种试剂，选自阿司匹林、非甾体抗炎药物(NSAIDs)、阿昔单抗、潘生丁或氯吡格雷。
血小板收缩性抑制剂的给药
向受试者给予有效量的本发明方法中使用的血小板收缩性抑制剂。通常，有效量是有效引起正在形成的血栓溶解而不显著增加出血风险的量，如通过正常皮肤出血时间测定的。
给药的剂量取决于受试者的年龄、健康和体重。通常，给予受试者的剂量将根据对于Rho激酶抑制剂法舒地尔的情况下规定的信息。
给药优选通过弹丸注射或通过静脉内灌注发生，优选在鉴定血栓栓塞事件后尽快发生。为了有效地溶解正在形成的血栓，应该在首次鉴定血栓栓塞事件后约0-12小时给予Rho激酶抑制剂。
可以通过任何适当的方法，包括例如肠胃外或局部给药(如静脉内注射或直接注射进入血栓)、通过口服给药或通过吸入给予Rho激酶抑制剂。在优选的形式中，Rho激酶抑制剂作为静脉内弹丸注射或作为静脉内灌注的形式给予。Rho激酶的弹丸注射优选在血栓形成后不久即收入医院之前进行。
给予血小板收缩性抑制剂和血栓溶解剂和可选地抗凝剂的时间将取决于待治疗的血栓栓塞事件。例如对于心肌梗塞，优选向受试者同时给予所述试剂。对于中风事件，优选的过程是与血栓溶解剂一起给予血小板收缩性抑制剂。对于在动脉血栓堵塞位点上的局部给药，同时给予血小板收缩性抑制剂、血栓溶解剂和抗凝剂是优选的。
本文使用的术语“受试者”旨在指人类受试者。但是，所述受试者还可以是灵长类动物或家养动物如狗、猫或马。
实施例1材料和方法
材料
Rho激酶抑制剂H1152从Toronto Research Chemicals(加拿大)获得。IP3受体拮抗剂2-氨乙氧基联二苯硼酸盐(2-APB)来自Cayman Chemicals(Michigan，美国)，HA1077，即肌球蛋白II抑制剂Blebbistatin[-]和其无活性的对映体Blebbistatin[+]从Chemicon(美国)获得。DiIC12来自BD Biosciences(NSW，澳大利亚)。重组水蛭素(来匹卢定)购自Pharmion(澳大利亚)。
小鼠品系
所有涉及使用C57Bl6和PAR4-/-小鼠的过程由阿尔弗莱德医学研究和教育区(Alfred Medical Research and Education Precinct)(AMREP)动物伦理委员会(AEC)(Melbourne，澳大利亚)批准，项目号为E/0569/2007/M、E/0621/2007/M和E/0464/2006/M。
血液的收集、PRP和经洗涤的血小板的制备
所有涉及收集人和小鼠血的过程分别由莫纳什大学涉人研究伦理常务委员会(Monash University Standing Committee on Ethics in Research involving Humans)(SCERH)(项目号CF07/0125-2007/0005)和阿尔弗莱德医学研究和教育区(the Alfred Medical Research and Education Precinct)(AMREP)动物伦理委员会(AEC)(Melbourne，澳大利亚)(SOP19-收集小鼠全血)批准。为了分离富含血小板的人血浆(PRP)，将知情的健康志愿者的全血收集入柠檬酸三钠(0.38％的最终浓度)溶液并在37℃以300xg离心16分钟。从以柠檬酸葡萄糖(ACD)抗凝的全血中制备经洗涤的血小板，在血小板洗涤缓冲液中加入来匹卢定(800U/ml)，在Tyrode氏缓冲液中加入腺苷三磷酸双磷酸酶(0.02U/ml)。
流动下体外血栓凝固的显像和定量
在37℃无纤维蛋白存在下进行对牛纤维状I型胶原基质的基于流的血小板形成的分析。简而言之，在1800s-1通过纤维状I型胶原包被的微毛细管(2.0mg/ml)灌注5分钟之前，将抗凝的(800U/ml来匹卢定)人全血与载体(DMSO)、Blebbistatin(+)(200μM)、Blebbistatin(-)(200μM)、EGTA/Mg2+(2mM/1mM)、HA1077(80μM)、H1152(40μM)或2-APB(200μM)(10分钟，37℃)预先进行孵育。血栓形成使用带有63X的水物镜(1.2数值孔径(NA))的倒置Leica DMIRB显微镜(Leica Microsystems，Wetzlar，德国)进行观察，并使用Dage-MTI电荷耦合器件(CCD)照相机300ETRCX(Dage-MTI，Michigan City，IN)进行实时记录。
血栓凝固的二维定量-血栓收缩的定量通过在灌注前在全血中‘掺加’3％的DiIC12标记的血小板进行。然后在胶原基质上灌注被掺加的全血，如上述，并且实时记录DIC/荧光图像，如上述，以便离线分析。检查2-APB对凝固影响的研究通过在显微镜载玻片上灌注未处理的全血30秒以建立有核的血栓，接着灌注抑制剂处理的血。这一抑制剂前灌注是必要的，因为2-APB的存在防止血栓的形成，妨碍凝固的分析。在5分钟内以mm每30秒测定给定的血栓中2个荧光标记的血小板之间的距离。结果表示为1分钟流之前进入血栓的2个血小板之间距离的百分比减小，将1分钟时血小板之间的距离取为100％。
3D体积血栓分析-为了分析血栓体积，在灌注前用DiIC12(1μM)标记全血。血栓按上述方法形成，图像用倒置Leica DMIRB共聚焦显微镜实时捕获，1μM切片在4-5分钟内每30秒获得。血栓体积的分析使用Metamorph 6软件进行。
活体显微镜检查
应对血管损伤的血栓的发展和凝固使用活体显微镜监测。C57BL6或PAR4缺陷(15g-18g)小鼠使用戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉，通过腹部中线切口将肠系膜外置。在操作过程中使用红外线加热灯维持体温，使用温盐水湿润暴露的肠系膜血管(50-160μm直径)。血管损伤通过使用与显微操作器(Eppendorf)连接的微注射针(20-30μm尖端直径)刺伤血管或通过应用6％FeCl3浸泡的滤纸(8sec)进行。实时记录血小板在损伤区域的增长，按如体外流分析中所述方法进行(上述)。在一些实验中，将H1152(5mM储存溶液，每个循环为2.5μl注射体积)、HA1077(10mM储存溶液，每个循环为2.5μl注射体积)、2-APB(25mM储存溶液，每个循环为2.5μl注射体积)、Blebbistatin[-]或其非活性对映体Blebbistatin[+](25mM储存溶液，2.5μl总注射体积)或等体积的载体(DMSO)通过显微注射针局部注入发展中的血栓中(释放速率为2-3μl/分钟，3个循环)。为了防止纤维蛋白的产生，在一些实验中，将来匹卢定(50mg/kg)在诱导损伤和随后注射抑制剂前通过静脉内注射给药。在这一来匹卢定浓度下纤维蛋白形成的完全去除通过使用Carstair氏染色的组织学确认。体内血栓表面积使用Image J确定，在4-5分钟内分析每第五个框架(1个框架/秒)。表面积的改变表示为相对于原始表面积(＝1)的增加或减少的倍数。
血小板介导的纤维蛋白凝块的回缩
血小板介导的依赖纤维蛋白的凝块回缩使用柠檬酸化的PRP9，10测定。结果表示为减去c7E3(阴性对照)样品获得的体积后，去除凝块后保留在管中的血清的百分比。
统计学分析
多个治疗组之间的统计学显著性使用具有Dunnett氏多重比较检验的1-wayANOVA进行分析。随时间而变的多个治疗组之间的统计学显著性使用具有邦费罗尼后检验(bonferroni post-tests)的2-way ANOVA进行。2个治疗组之间的统计学显著性使用具有2尾(2-tailed)的p值的不成对的student t检验(Prism软件，GraphPAD Software for Science，San Diego，CA)分析(ns[不显著]；p＞0.05；*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001)。数据表示为平均值±SEM或SD(在指示的地方)，其中n＝进行的独立实验的数目。
实施例2鉴定血栓发展过程中的收缩时期
血小板在将细胞骨架的收缩性力量传送至纤维蛋白聚合物以造成凝块回缩中的重要性已经被很好地确定。但是这些收缩机制在调节血栓生长(特别是在生理性血流条件下)的多个阶段中的重要性还未被清楚地确定。为了研究这一点，本发明人使用了允许实时分析在固定的I型纤维蛋白胶原底物上的血小板粘附和血栓生长的体外灌注系统。以小动脉剪切速率(1800s-1)灌注天然(非抗凝的)全血引起快速血小板粘附和聚集物的形成，在2分钟流内形成大的稳定的聚集物。通过共同灌注荧光标记的纤维蛋白原分析沉积的纤维蛋白(原)显示了发展中的血栓内纤维蛋白(原)的广泛并入，单个的厚纤维蛋白在血栓基底周围和胶原表面上显著滞留(strand)(图1A)。伴随着血栓的形成，观察到依赖时间的血栓收缩。血栓的收缩在第一个60秒流内明显，并在5分钟的灌注过程中持续。高分辨率的血栓成像显示血栓收缩与聚集的血小板的逐步紧密堆积相关，以至在发展中的血栓内不再能够区分单个血小板的边缘。值得注意的是，血小板回缩入发展中的血栓中是在发生厚的纤维蛋白聚合物发展之前发生的，提出这样的可能：该过程独立于纤维蛋白聚合作用而发生。为了研究这一点，本发明人在存在Gly-Pro-Arg-Pro肽(GPRP)，即纤维蛋白聚合作用的抑制剂，时进行灌注研究。将GPRP加入天然全血中抑制了单个纤维蛋白聚合物的形成，但是对于血小板血栓的生长没有抑制影响(图1A)。另外，血小板血栓的收缩不被GPRP改变。相似地，使用水蛭素抗凝的全血形成的血栓也经历了显著的收缩时期，造成形成中的血栓的显著凝固(图1B)。为了排除痕量的血栓造成这一收缩过程的可能性，本发明人在完全对凝血酶刺激无反应的小鼠((PAR4-/-小鼠)血小板上进行研究。PAR4缺陷对血栓收缩或对形成中的血栓的凝固没有抑制性影响。另外，用极高浓度的来匹卢定(1600U/ml)联合低分子量肝素、依诺肝素(enoxaparine)(400U/ml)处理全血也不能防止血栓的收缩，这证实这一现象的发生不依赖凝血酶的产生和纤维蛋白的聚合作用。
为了确定收缩对形成中的血栓体积的影响，进行了血栓的3-D体积分析。将用荧光膜染料DiIC12预先孵育的用水蛭素处理的全血以1800s-1在I型胶原上进行灌注，在5分钟的时期内以30秒间隔获得发展中的血栓的共聚焦切片。在3维中重建血栓和定量体积，按如材料和方法中所述方法进行。如图2A中展示的，单个血栓的体积以依赖时间的方式增大(单个血栓的体积范围为从～5,000mm3直至15,000mm3)，在3-3.5分钟流后最大的血栓大小变得明显。收缩在贯穿血栓发展中持续发生，但是直到3.5分钟流后血栓体积的净减少才变得明显，总的减少在23.9-48.2％之间(平均值为38.2+/-16.1％S.D.n＝10)。血栓收缩通常涉及将单个血小板回缩入发展中的血栓体内，最快速的收缩发生在发展中的血栓的下游尾部(图1B)。为了定量血栓收缩过程中单个血小板之间的距离改变，本发明人建立了能够分析稳定进入血栓后单个血小板运动的分析的基于荧光的示踪方法(图2Bi，见“材料和方法”)。这些研究显示了单个血小板之间距离的依赖时间的减小，所述距离的范围从12.5-62.5％(平均值为37.7+/-12.8％S.D.n＝36)(图2Bii)。
实施例3Rho激酶对血栓收缩的重要性
基于激动球蛋白(Actinomyosin)的收缩性通过依赖钙/钙调蛋白的肌球蛋白轻链激酶的激活和依赖Rho激酶的肌球蛋白磷酸酶(phosphatise)的失活与肌球蛋白轻链激酶的磷酸化紧密相连。在血小板中，肌球蛋白轻链激酶的钙激活似乎是调节血小板形状改变和纤维蛋白凝块回缩的主要收缩机制4。为了研究细胞溶质钙流在调节血栓收缩中的作用，全血灌注研究在防止钙流入(EGTA/MgCl2)或从内部储存动员钙(IP3受体拮抗剂-2-APB)的实验条件下进行。用EGTA螯合细胞外的钙显著降低血栓收缩率(在5分钟灌注时达52％，p＜0.001，图3A)。在相似的实验条件下，钙动员的抑制(2-APB)对于血栓收缩有较不明显的作用，降低收缩32％(图3B)。这与纤维蛋白凝块回缩明显不同，在纤维蛋白凝块回缩中EGTA/MgCl2没有显著的抑制影响(图3C)，而APB在所有检查的时间点上去除了凝块的回缩(图3C)。
为了检查Rho激酶对血栓收缩的贡献，检查了Rho激酶抑制剂H115211的影响。H1152对血栓收缩过程有显著的影响，在5分钟的灌注后引起88％的降低(p＜0.001，图4A，B)。这一收缩的缺乏与血小板紧密堆积入发展中的血栓中的减少相关，从而引起较不稳定的血栓的形成(图4B)。用另一种Rho激酶抑制剂HA1077获得相似的发现(图4A)。这些影响对于血栓收缩是选择性的，因为两种抑制剂对于纤维蛋白凝块回缩的速率和程度都没有显著的作用(图4C)。
实施例4抑制血小板的收缩性破坏了血小板血栓的稳定性
血小板收缩器(contractile apparatus)促进血小板在发展中的血栓内的紧密堆积的能力显示了在维持血栓稳定性中收缩性的潜在重要作用。为了研究血小板收缩性在该过程中的重要性，我们检查了肌球蛋白IIa抑制剂、II型肌球蛋白抑制剂对于血栓生长和稳定性的影响。如图5中证明的，用II型肌球蛋白抑制剂处理的血小板能够在I型纤维蛋白胶原底物上粘附和形成大的聚集物，但是随后的血小板紧密堆积没有发生，这造成高度不稳定的血小板血栓的发展。这一血栓凝固的缺乏引起来源于血栓表面的血小板的持续栓塞形成，从而破坏了形成中的血栓的生长(图5)。为了确定血小板收缩性对于维持体内血小板稳定性是否重要，本发明人建立了能够实时动态分析血栓生长和稳定性的小鼠微循环内的活体血栓模型。在这一模型中，通过用显微注射器的针显微穿刺血管在毛细血管后微静脉中诱导血小板血栓。在损伤的位点快速形成非堵塞的血栓，高放大倍数的成像显示在这些条件下形成的血栓主要由血小板组成。与此一致，用血小板GPIb受体拮抗剂(alboaggregin)或GPIIb-IIIa拮抗剂(GPI-162)预处理小鼠完全消除了血栓的形成。形成中的血栓的高放大倍数成像显示了单个血小板在发展中的血栓(与血栓收缩相关)核心内逐步的紧密堆积。FeCl3诱导血管损伤后形成的血栓的相似发现是显然的，这显示血栓收缩代表了体内血栓生长的一般特征。血栓形成后局部给予II型肌球蛋白抑制剂入微循环引起单个血小板(特别是在已形成的血栓的外层中)之间紧密堆积的缺失，从而造成来自血栓表面的血小板聚集物的逐步栓塞形成(图6A)和血栓大小平均减小38％(图6B)。在对照研究中，单独显微注射载体或非活性的II型肌球蛋白对映体没有影响(图6A和B)。另外，停止II型肌球蛋白抑制剂给药后，血栓在损伤位点快速再形成以至用II型肌球蛋白抑制剂给药的规律循环可以获得血小板生长和栓塞的重复循环(图6A)。
为了研究Rho激酶在调节血栓稳定性中的作用，在血栓发展后局部给予H1152至微循环中。与使用II型肌球蛋白抑制剂获得的发现一样，抑制Rho激酶破坏了聚集的血小板的持续紧密堆积，特别是在血栓的表面层中，从而造成来自于血栓表面的血小板的栓塞(图6A)和血小板大小平均减小34％(图6B)。在对照研究中，局部给予载体(DMSO)对照没有影响(图6A和B)。Rho激酶在这一过程中似乎起主要作用，因为H1152在诱导血栓不稳定性和栓塞中比IP3受体拮抗剂APB更有效。这些研究确定了Rho激酶和血小板收缩机制在维持体内血栓稳定性中的主要作用。
实施例5血小板收缩性对于初级止血栓子的稳定性是重要的
为了研究体内血小板收缩是否需要血小板的凝血酶刺激，在PAR4-/-小鼠上进行了活体显微镜检查研究。这些血小板的起始血小板粘附和聚集反应在毛细血管后微静脉的显微穿刺后是正常的，但是已形成的血栓比PAR4+/+对照更不稳定，从而造成血栓形成和栓塞的重复循环，特别是在形成中的血栓的表面层中。这些发现证实了以前的报道：血小板的凝血酶刺激在稳定形成中的血栓中起关键的作用12。尽管在PAR4-/-小鼠中已形成的血栓不稳定，但其经历了引起血栓凝固(特别是在形成中的血栓核心中)的显著的收缩时期。
为了去除凝血酶和因此排除纤维蛋白凝块回缩可能涉及这一过程，在血管损伤前用高剂量的来匹卢定(50mg/kg)预处理野生型小鼠。在毛细血管后微静脉针刺后附壁血栓形成快速发生，但是在没有凝血酶时，血栓更不稳定，从而引起来源于血栓表面的血小板聚集物的持续栓塞。但是，尽管有持续的表面栓塞，足够稳定而在15分钟的观察时期内抵抗快速血流的剥离效应的稳定的血栓核心最终还是发展了(通常在损伤后3-4分钟)。局部注入II型肌球蛋白抑制剂的活性对映体引起初级止血栓子的快速去稳定，几乎完全栓塞了形成的血栓(图7A)。相似地，抑制Rho激酶产生了相似的初级止血栓子稳定性的缺陷，栓塞在药物注入的10-15秒内发生(图7A-C)。在对照研究中，注射载体(DMSO)或非活性的II型肌球蛋白抑制剂对映体对于初级止血栓子的稳定性没有不良的影响(图7A，C)。总之，这些发现显示了依赖Rho激酶的血小板收缩性在维持初级止血栓子的完整性中的主要作用，不依赖凝血酶和纤维蛋白聚合物。
实施例6Rho激酶抑制剂与t-PA(或尿激酶)联合并有抗凝剂或无抗凝剂时 对血管灌注的影响
将小鼠麻醉，进行小手术从而暴露颈动脉和颈静脉。将多普勒流量探测器置于颈动脉周围以便通过该血管监测血流，将导管置于颈静脉中以便给药。血凝块通过小电流(4mA 1.25min8)的递送在小鼠的颈动脉中形成，从而引起经过该血管的血流的完全阻塞(血流＝0ml/min)，如通过流量探测器测定的。在建立血管阻塞后，使用指示的浓度和方案(图8和9中的A-H)给予多种t-PA、尿激酶、肝素、水蛭素、HA1077和Y27632的联合，并检查其溶解血凝块和恢复血流的效果。在接受了每种药物联合的小鼠中另外监测血流60分钟，使用计算机软件记录血流的测定值。
呈现在图8和9中的数据证明了血栓溶解剂t-PA的溶解堵塞性血凝块的能力相对中等(指治疗组C)。这显示t-PA只能够部分影响血凝块的溶解，不能有效地防止凝块的重新堵塞。当单独使用时，Rho激酶抑制剂HA1077不能溶解血凝块和重新建立血流(指治疗组B)。还发现抗凝剂肝素与t-PA的联合引起依赖剂量的凝块溶解的增加，这与凝血酶抑制剂防止纤维蛋白血凝块的再形成的能力一致。
重要的是发现Rho激酶抑制剂与t-PA的联合以协同的方式增加凝块的溶解(指治疗组B+C)。
另外，发现联合给予Rho激酶抑制剂以及t-PA或尿激酶和肝素或水蛭素以协同的方式进一步增强凝块的溶解，超过和高于使用Rho激酶抑制剂和血栓溶解剂的联合所观察到的结果。通过使用这一联合治疗，恢复了所有测试动物中的血流(指治疗组B+D、B+E、F、G和H)。
另外，也重要的是发现：当与单独的t-PA或t-PA和肝素相比时，联合给予Rho激酶抑制剂以及t-PA或尿激酶和肝素/水蛭素显著减少了建立重灌注所需的时间(指治疗组B+D、B+E、F、G和H)。
因此，将Rho激酶抑制剂加入标准凝块击碎治疗(clot busting therapy)中以协同的方式增加了这些药物的效力。
结论
这些研究显示收缩力的细胞外传送在促进血栓收缩中起重要的作用，不依赖凝血酶和纤维蛋白的形成。与纤维蛋白凝块回缩相反，血小板血栓收缩主要是通过依赖Rho激酶的信号机制进行调节。另外，证明用II型肌球蛋白抑制剂或Rho激酶拮抗剂抑制血栓收缩显著破坏了形成中的血栓的稳定性，从而引起初级止血栓子的快速栓塞。这些研究显示在止血血小板的过程中中使用了两个阶段的收缩机制：(i)最初涉及依赖Rho激酶的收缩和初级止血栓子的维持；(ii)接着纤维蛋白的产生和次级止血栓子依赖钙的回缩。
依赖Rho激酶的收缩性似乎对于肌动蛋白丝的成束是关键的，所述成束是将张力应用于整联蛋白键从而诱导受体成簇和将整联蛋白募集进入局部粘附位点的过程。少量的依赖Rho的局部粘附样复合物在散在的血小板中发生，但是这些结构似乎对于将收缩力传送至纤维蛋白聚合物是不重要的。可能的是依赖Rho的整联蛋白键的成簇在增强细胞-细胞粘附接触中起重要作用，对于发展可以抵抗高剪切的剥离影响的稳定的血小板聚集物是必要的。这样的高亲和力的粘连相互作用似乎对于凝块的回缩较为不关键，特别是当在非剪切条件下进行研究时，这提供了在该过程中缺少Rho激酶参与的可能的解释。
在所述体内模型中的显著影响是迅速，其中血小板血栓在暴露于血小板收缩性抑制剂后栓塞，特别是在限制凝血酶产生和纤维蛋白形成的实验条件下。在初级止血栓子内的血小板粘附接触本质上是不稳定的，需要纤维蛋白的产生来稳定形成的聚集物从而保证止血。本文呈现的体内结果显示在无收缩性时，初级止血栓子极其不稳定，变得在暴露于收缩性抑制剂的数秒内从损伤位点剥离。这提示有两个不同的稳定初级止血栓子的时期；第一个是快速时期，与血小板收缩性和血小板-血小板粘附接触的物理紧固相关；第二个是慢时期，与凝血酶的产生和纤维蛋白的聚合作用相关。这样的两个阶段的稳定过程提供了以时间控制血栓生长和稳定性的动力学机制。
本领域技术人员应该理解，可以对本发明做出许多变更和/或修改，如在特异性的具体实施方式中显示的，而不脱离广泛公开的本发明的范围。因此这些具体实施方式在所有的方面都被认为是举例性的和非限制性的。
所有的本文讨论的和/或参考的出版物以其整体并入本文。
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Claims (21)

1.一种溶解受试者的血栓的方法，包括向受试者联合给予血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂。
2.一种抑制受试者的血栓收缩的方法，包括向受试者联合给予血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂。
3.一种增加血栓溶解剂效力的方法，包括当血栓正在从聚集的血小板形成或已经从聚集的血小板形成时，向受试者给予血小板收缩性抑制剂以及血栓溶解剂。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中在血栓已经形成的位点上局部给予血小板收缩性抑制剂。
5.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中将血小板收缩性抑制剂直接给予到血栓中。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中在首次鉴定血栓栓塞疾病后的12小时内向受试者给予血小板收缩性抑制剂。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中在首次鉴定中风后的3小时内向受试者给予血小板收缩性抑制剂。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中将血小板收缩性抑制剂与一种或多种血栓溶解剂和/或一种或多种抗凝剂顺序或同时给予。
9.一种治疗血栓栓塞疾病的方法，包括向受试者联合给予血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂。
10.根据权利要求6或9所述的方法，其中血栓栓塞疾病选自但不限于缺血性中风、急性心肌梗塞、深静脉血栓(DVT)、肺栓塞、凝块的AV瘘或分流。
11.一种治疗中风的方法，包括向受试者联合给予血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂。
12.一种治疗心脏病发作的方法，包括向受试者联合给予血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂。
13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中血小板收缩性抑制剂选自Rho激酶抑制剂、II型肌球蛋白抑制剂或Rho抑制剂。
14.根据权利要求13所述的方法，其中Rho激酶抑制剂选自：
(i)异喹啉磺胺类，如(S)-(+)-2-甲基1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]高哌嗪(二甲基法舒地尔)或1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪(法舒地尔)或其盐；
(ii)(+)-(R)-反式-4-(1-氨乙基)-N-(4-吡啶基)环己甲酰胺或其盐；
(iii)(+)-(R)-反式-4-(1-氨乙基)-N-(1H-吡咯[2，3-b]吡啶4-基)环己甲酰胺]或其盐；或
(iv)具有Rho激酶抑制活性的衍生物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中Rho激酶抑制剂是1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪盐酸化物(盐酸法舒地尔)。
16.一种血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂的联合在抑制受试者血栓收缩中的用途。
17.一种血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂的联合在制备用于治疗血栓栓塞疾病的药物中的用途。
18.一种血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂的联合在制备用于治疗中风的药物中的用途。
19.一种血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和可选地一种或多种抗凝剂的联合在制备用于治疗心脏病发作的药物中的用途。
20.一种用于溶解血栓的组合物，所述组合物包含血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂。
21.一种用于溶解血栓的组合物，所述组合物包含血小板收缩性抑制剂和一种或多种血栓溶解剂和一种或多种抗凝剂。
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