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CN108314738B - 一种共表达细胞因子il-21的双特异性嵌合抗原受体、质粒、cik细胞及mm病应用 - Google Patents

一种共表达细胞因子il-21的双特异性嵌合抗原受体、质粒、cik细胞及mm病应用 Download PDF

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CN108314738B CN201810081993.8A CN201810081993A CN108314738B CN 108314738 B CN108314738 B CN 108314738B CN 201810081993 A CN201810081993 A CN 201810081993A CN 108314738 B CN108314738 B CN 108314738B
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Abstract

本发明公开了一种共表达细胞因子IL‑21的双特异性嵌合抗原受体、质粒、CIK细胞及应用，共表达细胞因子IL‑21的双特异性嵌合抗原受体(MmCAR)，由CD8leader、BCMAscFv、CD8的铰链区和跨膜区、4‑1BB共刺激信号区、CD3ζ胞内信号区、T2A自剪切区、IL‑21表达区、T2A自剪切区、CD8leader、CD138scFv、CD8的铰链区和跨膜区、4‑1BB共刺激信号区、CD3ζ胞内信号区依次串联构成。本发明可以识别更多类型的肿瘤细胞，且IL‑21的分泌增加CIK细胞的增殖和效应。因此，本发明的MmCAR清除肿瘤群体更彻底，疗效更持久，降低复发及抗原标记转阴的几率。

Description

一种共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体、质粒、 CIK细胞及MM病应用
技术领域
本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体、含有该受体的质粒、CIK细胞及MM病应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是以恶性浆细胞聚集骨髓并在血液或尿液中出现单克隆蛋白(M蛋白)为特征的一种恶性疾病，临床特点包括易发感染、肾功能受损、贫血、高钙血症及溶骨性病变。其发病率约占血液恶性肿瘤的13％，多发于老年人，随着我国人口老龄化，MM发病人数有增加的趋势。目前的治疗方案，已使得大多数病人的预后有了明显的改善，但患者最终仍不能幸免于难，更有部分患者对现有的治疗方案没有反应，因此仍需更有效更安全的治疗方法出现。
细胞过继免疫治疗的发展，为治疗MM带来了新的治疗策略，特别是嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞免疫治疗(CAR-T)技术的发展，为临床带来了新的治疗希望。CAR-T是一种结合T细胞免疫治疗和抗体靶向治疗的治疗手段，具有特异性识别并杀伤肿瘤细胞的能力，其突出优点是可以克服MHC限制性。其中，CAR由CD8引导肽、抗原识别区(配体或单链抗体或Fab片段)、跨膜区、以及T细胞的一系列信号转导区(CD28，CD3，CD137胞内信号传导结构域)依次连接而成。
目前治疗MM的CAR主要有Anti-CD138CAR(中国专利：CN105924529A、CN105384821A和CN105820254A)和Anti-BCMA CAR(中国专利：CN106795217A、CN107207598A、CN104379179A和CN105837693A)。临床试验表明：上述CAR-T具有强的肿瘤细胞杀伤能力，大多数患者出现了部分缓解，只有极少数患者出现了完全缓解。这提示CAR-T治疗的疗效不高，其影响因素有很多其中包括CAR的转染效率低、靶向分子的选择不合适、CAR修饰的T细胞增殖率低和肿瘤微环境的抑制等。除此之外，患者完全缓解后也出现了复发及抗原标记转阴等问题。这提示CAR-T治疗的疗效不能长期持续，可能的原因有两个，一是有些肿瘤干细胞可能不表达靶向靶点，所以不能完全根治而再次复发；二是CAR-T作用压力下，可诱导肿瘤细胞发生部分或完全的免疫表型改变，引起靶向靶点表达降低或者沉默，从而耐受CAR-T治疗。
因此，开发一种新的靶向MM病共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和医疗应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。
发明内容
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供靶向MM病共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体、质粒、CIK细胞及应用，以提高对MM病的治疗效果。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
第一方面，本发明提供了一种共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体(MmCAR)，由CD8leader、BCMAscFv、CD8的铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激信号区、CD3ζ胞内信号区、T2A自剪切区、IL-21表达区、T2A自剪切区、CD8leader、CD138scFv、CD8的铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激信号区、CD3ζ胞内信号区、依次串联构成。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述
CD8leader核酸人工序列为SEQ ID NO.2；
BCMA scFv核酸人工序列为SEQ ID NO.3；
CD8铰链区核酸人工序列为SEQ ID NO.4；
CD8跨膜区核酸人工序列为SEQ ID NO.5；
CD137共刺激区核酸人工序列为SEQ ID NO.6；
CD3ζ信号传导区核酸人工序列为SEQ ID NO.7；
T2A核酸人工序列为SEQ ID NO.8；
IL-21核酸人工序列为SEQ ID NO.9；
CD138scFv核酸人工序列为SEQ ID NO.10。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述嵌合抗原受体的核酸序列为SEQ IDNO.1。
一种共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体采用包括如下步骤的制备方法得到：
(1)分别按CD8leader核酸人工序列、BCMA scFv核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、CD137共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A核酸人工序列、IL-21核酸人工序列、T2A核酸人工序列、CD8leader核酸人工序列、CD138scFv核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、CD137共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC57上得到pUC-MmCAR；
(2)将pUC-MmCAR进行双酶切，利用琼胶电泳将含有MmCAR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的MmCAR DNA片段，即本发明所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体。
第二方面，本发明提供了一种质粒，所述质粒包含如上所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述质粒是将融合基因片段MmCAR DNA片段插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述质粒采用如下制备方法制备得到：将上述纯化的MmCAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段，在连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；MmCAR DNA片段：4μl；线性化的pLent-C-GFP DNA：4μl的条件下过夜连接形成pLent-MmCAR-CAR质粒。
第三方面，本发明提供了CIK细胞，所述CIK细胞包含如上所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述CIK细胞采用如下制备方法制备得到：首先将上述的pLent-MmCAR-CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染CIK细胞。
第四方面，本发明提供了该基因的应用，是指该基因在制备治疗MM病的药物中能够得以应用。所述药物形式包括但不限于试剂盒。
MmCAR-CIK细胞的试剂盒，包括
(1)获得如上所述的稳定表达MmCAR的载体；
(2)载体稀释液。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
本发明共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体MmCAR可特异性识别MM病细胞表面CD138和BCMA两种肿瘤相关抗原。将MmCAR分子重组到病毒载体上并转染CIK(多种细胞因子诱导的杀伤T细胞)细胞，表达双特异性嵌合抗原受体，可特异性识别杀伤更多肿瘤细胞(CD138+BCMA+双阳性MM肿瘤细胞，CD138-BCMA+单阳性MM肿瘤细胞或者CD138+BCMA-单阳性MM)，因而MmCAR-CIK清除肿瘤群体更彻底，疗效更持久，降低复发及抗原标记转阴的几率。
本发明进行共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体的构建。IL-21参与调控B细胞、T细胞、树突状细胞以及NK细胞的增殖和效应。共表达IL-21可明显提高CAR-CIK细胞的杀伤能力，且CAR分子及IL-21细胞因子的表达对IFN-γ的表达水平影响不大仍然维持在极低的水平，说明MmCAR-CIK细胞在未接受靶细胞刺激时，处于相对静息、安全的状态，不会引起细胞因子风暴等副作用。因而MmCAR-CIK既疗效高又安全。
本发明提高CAR-T治疗的效率，减少CAR-T细胞的有效使用量，从而减小发生副作用的风险，降低治疗成本，在CAR-T治疗的研究和应用方面，具有重要意义。因此本发明的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体可在MM病治疗中得到应用，清除患者体内肿瘤，延长患者生存期。
附图说明
图1为本发明所述嵌合抗原受体MmCAR模块示意图
图2为本发明中MmCAR DNA片段(右)和线性化的pLent-C-GFP DNA(左)片段电泳图。
图3为本发明所述的慢病毒pLent-MmCAR表达质粒的示意图。
图4为本发明MmCAR-CIK细胞的表达MmCAR的效率为71.30％(左为流式峰图，右为散点图)。
图5为本发明MmCAR-CIK细胞体外杀伤结果图。MmCAR-CIK细胞对BCMA抗原表达细胞株K562、CD138抗原表达细胞株K562、CD138和BCMA抗原共表达细胞株K562的杀伤效率都大90％以上，并明显高于未改造CIK细胞。说明本发明MmCAR-CIK不但识别MM肿瘤细胞多，而且杀伤率高。
图6为激活前MmCAR-CIK细胞IFN-γ表达情况分析图。在CIK细胞正常的生长过程中，其自身IFN-γ表达维持在极低的水平，且第二代CAR分子及IL-21细胞因子的表达对IFN-γ的表达水平影响不大，仍然维持在极低的水平，说明MmCAR-CIK细胞在未接受靶细胞刺激时，处于相对静息、安全的状态，不会引起细胞因子风暴等副作用。
图7为本发明MmCAR-CIK细胞体内杀伤结果图。注射MmCAR-CIK组，最早出现肿瘤缩小的现象且21天后该组裸鼠的肿瘤全部消失；注射Anti-BCMA/CD138-CAR-CIK组抑制了裸鼠肿瘤的生长与注射MmCAR-CIK组一致，但21天后该组仅有60％裸鼠的肿瘤全部消失。Anti-BCMA-CAR-CIK组和Anti-CD138-CAR-CIK组与注射CIK组裸鼠肿瘤的生长趋势一致，与对照组相比只是减缓了裸鼠肿瘤的生长速度，不具备清除肿瘤的能力。说明共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体修饰的CIK可以彻底清除肿瘤群体，且共表达IL-21也可明显提高CAR-CIK细胞的杀伤能力。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1
一种共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体(MmCAR)，由CD8leader、BCMAscFv、CD8的铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激信号区、CD3ζ胞内信号区、T2A自剪切区、IL-21表达区、T2A自剪切区、CD8leader、CD138scFv、CD8的铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激信号区、CD3ζ胞内信号区依次串联构成。
在制备时，分别按CD8leader核酸人工序列、BCMA scFv核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、CD137共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A核酸人工序列、IL-21核酸人工序列、T2A核酸人工序列、CD8leader核酸人工序列、CD138scFv核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、CD137共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框(MmCAR模块示意见图1(完整核酸序列见附录SEQ ID NO.1))并插入标准载体pUC57上，因此命名为pUC-MmCAR，将pUC-MmCAR进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将把含有MmCAR DNA片段的琼胶部位切下，放在离心管中。采用DNAextraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500ml DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500ml Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μlElution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的MmCAR DNA片段。
实施例2
质粒，所述质粒包含如上所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体。所述质粒是将融合基因片段MmCAR DNA片段插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到。所述质粒采用如下制备方法制备得到：将上述纯化的MmCAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段，在连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；MmCAR DNA片段：4μl；线性化的pLent-C-GFP DNA：4μl的条件下过夜连接形成pLent-MmCAR-CAR质粒。
更详细的说，制备步骤如下：
分别按CD8leader核酸人工序列、BCMA scFv核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、CD137共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A核酸人工序列、IL-21核酸人工序列、T2A核酸人工序列、CD8leader核酸人工序列、CD138scFv核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、CD137共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC57上，因此命名为pUC-MmCAR，同时将pUC-MmCAR和pLent-C-GFP载体进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有MmCAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNAextraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500ml DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500ml Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μlElution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的MmCAR DNA片段(见图2)和线性化的pLent-C-GFP DNA(见图2)片段。
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-MmCAR(见图3)质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；MmCAR DNA：6μl；线性化的pLent-C-GFP DNA：2μl。
将上述pLent-MmCAR转化到E.coli(DH5α)。具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen公司)提取pLent-MmCAR质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl Buffer HBC，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，收集质粒DNA。(11)和预知浓度DNA样品(Marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出pLent-MmCAR质粒浓度为273ng/μl。
将上述的pLent-MmCAR质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。
实施例3
CIK细胞，所述CIK细胞包含如上所述的靶向IL-21的双特异性嵌合抗原受体。所述CIK细胞采用如下制备方法制备得到：首先将上述的pLent-MmCAR-CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染CIK细胞。
更详细的说，步骤如下：
A、慢病毒包装，滴度检测
采用Lentiviral Packaging Kit慢病毒包装试剂盒，具体方法如下：将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染。取无菌的1.5ml EP管或15ml离心管，按下列组分配制反应体系：无血清DMEM：4ml；pLent-MmCAR质粒：10μg；GM easyTM Lentiviral Mix：10μl(10μg)；HGTransgeneTM Reagent：60μl。混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养。转染24后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有10％血清新鲜的培养基继续培养。换液48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。此时上清液中的病毒颗粒可以直接去检测滴度。
将上述病毒采用TCID50测定滴度，将处于对数生长期的293细胞以1×104Cells/孔的量接种于96孔细胞培养板，样品用5％FBS DMEM按10倍倍比稀释系列浓度，加样于96孔细胞中，每个浓度加样10孔，设2孔空白对照。于37℃、5％CO2培养，逐日观察细胞出现毒斑情况，一般需要观察5-7天，据出现毒斑的浓度和孔数计算样品的TCID50结果。结果表明，重组慢病毒的滴度4.25×106TCID50/ml。
B、PBMC细胞的制备
取75ml健康捐赠者的新鲜外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞PBMC方法如下：
(1)将外周血75ml与生理盐水按1:1的比例稀释。将稀释后的血液小心地加在同等体积淋巴细胞分离液上，形成明显分层，室温水平离心800rpm/min，20min。此时离心管中自上而下形成4层；血清、由PBMC构成的白膜层，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞沉淀层。
(2)用吸管小心吸取白膜层，尽量全部吸出PBMC。加2倍量生理盐水，洗涤细胞2次，每次混匀后离心、800rpm/min，10min。低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板和淋巴细胞分离液，离心后弃去上清。
C、CIK的制备及其慢病毒感染CIK细胞
分离获得PBMC，在88-551-CM培养基(购自CORNING公司)中培养。
(1)初次刺激：完成于分离后，加入1000IU/ml的重组干扰素α培养。
(2)再次刺激：24h后，加入CD3单克隆抗体(OKT3，30ng/ml)(购自R&D公司)、300IU/ml IL-2(购自沈阳三生制药)完成刺激。
(3)维持培养：每3天半量换液。将细胞液用巴氏吸管移入50ml离心管，封口后离心1500rpm 5min。先计算好要去除的旧培养液的量并吸去，重悬后补加新培养液。如密度超过2×106/ml,则无须离心，可直接补加需要量的新培养液。补加IL-2(终浓度为50IU/ml)。
(4)刺激13天后，按MOI＝8的比例将重组慢病毒感染PBMC，感染24h后换新鲜培养基，继续扩大培养至足够的用量。通过FC500流式细胞仪(购自BECKMAN公司)FL1通道检测嵌合抗原受体表达(图4)。以未感染的PBMC细胞作为阴性对照，重组慢病毒感染CIK其阳性率71.3％。
实施例4
MmCAR-CIK细胞的杀伤活性分析
MmCAR-CIK、和未改造CIK细胞作为效应细胞。靶细胞分别为BCMA抗原表达细胞株K562、CD138抗原表达细胞株K562、CD138和BCMA抗原共表达细胞株K562和细胞株K562。
按E：T(效应细胞和靶细胞比)为1：5，加入5×106个靶细胞待细胞完全贴壁后，收集MmCAR-CIK细胞和未改造CIK细胞，分别调整细胞浓度为1×107/ml，每孔加入100μL，37℃，5％的CO2条件下培养12h。弃上清加入20μL稀释的CCK8(购自MCE公司)，孵育4～6小时，酶标仪检测OD450的吸光值。杀伤率＝[1-(效应细胞+靶细胞孔OD值-单独效应细胞的OD值)/单独靶细胞的OD值]×100％。MmCAR-CIK细胞对BCMA抗原表达细胞株K562、CD138抗原表达细胞株K562、CD138和BCMA抗原共表达细胞株K562的杀伤效率都大90％以上，并明显高于未改造CIK细胞(图5)。结论说明：本发明MmCAR-CIK不但识别MM肿瘤细胞多，而且杀伤率高。
实施例5
MmCAR-CIK细胞IFN-γ表达情况检测
在CAR-T治疗法中，IFN-γ是介导患者体内细胞因子风暴的主要细胞因子之一。根据NCBI数据库中人GAPDH、IFN-γ设计PCR引物，调整产物大小为300-500bp；分别以CIK、Anti-BCMA/CD138-CAR-CIK、MmCAR-CIK细胞cDNA为模板进行PCR反应，经2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物；PCR反应体系为：cDNA：0.5μl；2×PrimeSTAR MAXprimix：5μl；上游引物(F)：0.8μl；下游引物(R)：0.8μl；ddH2O：2.9μl。反应程序为：第一步预变性95℃：3mim；第二步，变性95℃：30s，退活58℃：30s，延伸72℃：20s，并进行30个循环；第三步最终延伸72℃：5min。GAPDH、IFN-γ的PCR引物设计如下：
GAPDH-F：CAAGGTCATCCATGACAACTTTG；
GAPDH-R：GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG；
IFN-γ-F：ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCT；
IFN-γ-R：TTACTGGGATGCTGTTGCAC；
由图6可知，在CIK细胞正常的生长过程中，其自身IFN-γ表达维持在极低的水平，且第二代CAR分子及IL-21细胞因子的表达对IFN-γ的表达水平影响不大，仍然维持在极低的水平，说明MmCAR-CIK细胞在未接受靶细胞刺激时，处于相对静息、安全的状态，不会引起细胞因子风暴等副作用。
实施例6
MmCAR-CIK细胞对裸鼠肿瘤生长抑制作用
6周龄裸鼠雌性(购自广州中医药大学)于动物房饲养(室温23±2℃，湿度50％±10％)，收集对数期的BCMA抗原表达细胞株K562、CD138抗原表达细胞株K562、CD138和BCMA抗原共表达细胞株K562和细胞株K562，按1：1：1混合均匀，并用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至2×105个/mL。无菌条件下，裸鼠左腋下接种0.2mL细胞悬浮液，观察3-5d，待腋下出现米粒大小较硬的结节作为建模成功的标准。
肿瘤模型裸鼠(游标卡尺量取皮下肿瘤组织块的大小为90-100mm3)随机分成6组，每组20只，开始注射治疗实验。实验组分别为：
a.对照组，尾部静脉注射同等体积的生理盐水；
b.治疗一组，尾部静脉注射2×106个细胞/只CIK细胞；
c.治疗二组，尾部静脉注射2×106个细胞/只Anti-BCMA-CAR-CIK细胞；
d.治疗三组，尾部静脉注射2×106个细胞/只Anti-CD138-CAR-CIK细胞；
e.治疗四组，尾部静脉注射2×106个细胞/只Anti-BCMA/CD138-CAR-CIK细胞；
f.治疗五组，尾部静脉注射2×106个细胞/只MmCAR-CIK细胞。
首次注射后7天，每组再进行第二次同剂量注射，实验以21天为周期。每3天通过游标卡尺量取各个实验组裸鼠皮下肿瘤组织块大，并记录，用肿块均值绘制肿瘤生长曲线图(结果见图7)。
注射MmCAR-CIK组，最早出现肿瘤缩小的现象且21天后该组裸鼠的肿瘤全部消失；注射Anti-BCMA/CD138-CAR-CIK组抑制了裸鼠肿瘤的生长与注射MmCAR-CIK组一致，但21天后该组仅有60％裸鼠的肿瘤全部消失。Anti-BCMA-CAR-CIK组和Anti-CD138-CAR-CIK组与注射CIK组裸鼠肿瘤的生长趋势一致，与对照组相比只是减缓了裸鼠肿瘤的生长速度，不具备清除肿瘤的能力。说明共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体修饰的CIK可以彻底清除肿瘤群体，且共表达IL-21也可明显提高CAR-CIK细胞的杀伤能力。
由上述结果可知，本发明MmCAR分子，设计合理，安全有效，为治疗MM奠定基础，该基因在制备治疗MM病的药物中能够得以应用。
实施例7
制备MmCAR-CIK细胞的试剂盒，该试剂盒包括：
(1)获得如上所述的稳定表达MmCAR的载体(实施例2制备的pLent-MmCAR-CAR质粒)；
(2)载体稀释液，为常规技术；
(3)使用说明书；
其中，使用说明书包括如上所述实施例3所述的方法。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。
Figure IDA0001561279800000011
Figure IDA0001561279800000021
Figure IDA0001561279800000031

Claims (10)

1.一种共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：由CD8leader、BCMAscFv、CD8的铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激信号区、CD3ζ胞内信号区、T2A自剪切区、IL-21表达区、T2A自剪切区、CD8leader、CD138scFv、CD8的铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激信号区、CD3ζ胞内信号区，依次串联构成；
BCMA scFv核酸人工序列为SEQ ID NO.3；
CD138scFv核酸人工序列为SEQ ID NO.10。
2.如权利要求1所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD8leader核酸人工序列为SEQ ID NO.2；
CD8铰链区核酸人工序列为SEQ ID NO.4；
CD8跨膜区核酸人工序列为SEQ ID NO.5；
4-1BB共刺激区核酸人工序列为SEQ ID NO.6；
CD3ζ信号传导区核酸人工序列为SEQ ID NO.7；
T2A核酸人工序列为SEQ ID NO.8；
IL-21核酸人工序列为SEQ ID NO.9。
3.如权利要求2所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的核酸序列为SEQ ID NO.1。
4.如权利要求1-3任一项所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：采用包括如下步骤的制备方法得到：
(1)分别按CD8leader核酸人工序列、BCMA scFv核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、4-1BB共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A核酸人工序列、IL-21核酸人工序列、T2A核酸人工序列、CD8leader核酸人工序列、CD138scFv核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、4-1BB共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC57上得到pUC-MmCAR；
(2)将pUC-MmCAR进行双酶切，利用琼胶电泳将含有MmCAR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的MmCAR DNA片段，即本发明所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体。
5.一种质粒，其特征在于：所述质粒表达如权利要求1所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体。
6.如权利要求5所述的一种质粒，其特征在于：所述质粒是将SEQ ID NO.1所示的融合基因片段插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到。
7.如权利要求5或6所述的一种质粒，其特征在于：所述质粒采用包括如下步骤的方法制备得到：将纯化的SEQ ID NO.1所示的 DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段，在连接体系为： 10×buffer：1μL；T4连接酶：1μL；SEQ ID NO.1所示的DNA片段：4μL；线性化的pLent-C-GFP DNA：4μL的条件下过夜连接形成包含SEQ ID NO.1所示的DNA片段的慢病毒表达质粒。
8.CIK细胞，其特征在于：所述CIK细胞包含如权利要求1所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体。
9.如权利要求8所述的CIK细胞，其特征在于：所述CIK细胞采用包括如下步骤的方法制备得到：首先将包含SEQ ID NO.1所示的DNA片段的慢病毒表达质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染 CIK细胞。
10.如权利要求1所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体在制备治疗多发性骨髓瘤病的药物中的应用。
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