CN108251384B - 一株鱼类弹状病毒弱毒疫苗株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鱼类弹状病毒弱毒疫苗株及其应用。本发明通过鱼体攻毒实验筛选出一株弱毒株，命名为加州鲈弹状病毒三水株(MSRV‑SS)。经鱼体免疫实验验证该弱毒株对鳜鱼和笋壳鱼均具有免疫保护力。通过噬斑克隆纯化该弱毒株，获得一株纯系克隆株MSRV‑SS‑7，并测定了该克隆株和野毒MSRV‑SS在鳜脑组织(CPB)细胞系上的生长曲线，发现其与野毒MSRV‑SS具有相似的体外生长特性。经验证该克隆株MSRV‑SS‑7也具有良好的免疫原性。本发明弱毒株的筛选及其全基因组的测序为构建MSRV‑SS‑7的反向遗传操作系统和研制载体活疫苗提供技术支持。
Description
技术领域
本发明属于病毒疫苗领域，具体涉及鱼类弹状病毒弱毒疫苗株及其应用。
背景技术
弹状病毒(rhabdovirus)是一类有包膜的负链RNA病毒，其宿主范围广泛，包括哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼类、昆虫以及植物等。其中可引起鱼类致死性和流行性病害的一类弹状病毒称之为鱼类弹状病毒，目前见报道的已有20多种。在2016年ICTV最新发布的病毒分类系统中，弹状病毒科被分为18个属。鱼类弹状病毒主要分布在Perhabdovirus，Novirhadovirus 和Sprivivirus三个属，但仍有一些尚未分类。鱼类弹状病毒的基因组为不分节的单股负链 RNA，大小为11-12kb，编码5种结构蛋白，即核蛋白(N)，磷酸化蛋白(P)，基质蛋白(M)，糖蛋白(G)和RNA依赖的RNA聚合酶(L)。基因组结构为3’Leader-N-P-M-G-L-Trailer 5’， 3’leader为前导区，5’trailer为拖尾区。
免疫接种是防治该病的最有效手段，但目前针对弹状病毒(Rhabdovirus)能发挥有效免疫效果的疫苗株，仍少见。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明通过筛选获得一株鱼类弹状病毒弱毒株MSRV-SS，并通过噬斑克隆纯化出一株纯系克隆株MSRV-SS-7，通过对其生长、基因组等生物学特性研究发现，MSRV-SS-7与其亲本株MSRV-SS无明显差异。免疫保护实验显示该弱毒株对鱼类具有100％免疫保护力，可以用于鱼类弹状病毒病的免疫防治。
本发明的目的在于提供一株鱼类弹状病毒弱毒疫苗株及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
一株鱼类弹状病毒弱毒疫苗株，命名为鲈弹状病毒MsRV-SS-7，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V 201737。
上述所述的鱼类弹状病毒弱毒疫苗株在制备抗鱼类弹状病毒疫苗中的应用。
进一步的，上述所述鱼类为鳜鱼、鲈鱼、乌鳢、笋壳鱼。
上述所述的鱼类弹状病毒弱毒疫苗株在制备防治鱼类弹状病毒病制剂中的应用。
一种抗鱼类弹状病毒疫苗，该疫苗中含有上述所述的鱼类弹状病毒弱毒疫苗株。
一种防治鱼类弹状病毒病制剂，该制剂中含有上述所述的鱼类弹状病毒弱毒疫苗株。
本发明的有益效果是：
本发明通过鱼体攻毒实验筛选出一株弱毒株，命名为加州鲈弹状病毒三水株(MSRV-SS)。经鱼体免疫实验验证该弱毒株对鳜鱼和笋壳鱼均具有免疫保护力。通过噬斑克隆纯化该弱毒株，获得一株纯系克隆株MSRV-SS-7，并测定了该克隆株和野毒MSRV-SS在鳜脑组织(CPB) 细胞系上的生长曲线，发现其与野毒MSRV-SS具有相似的体外生长特性。经验证该克隆株 MSRV-SS-7也具有良好的免疫原性。本发明弱毒株的筛选及其全基因组的测序为构建 MSRV-SS-7的反向遗传操作系统和研制载体活疫苗提供技术支持。
附图说明
图1.MSRV-SS克隆策略及推导基因组结构。图中显示了五个结构基因(N：核蛋白；P：磷酸化蛋白；M：基质蛋白；G：糖蛋白；L：RNA依赖的RNA聚合酶蛋白)的位置和大小。下面的短线表示两轮PCR扩增的用于组成完整基因组的片段，短线对应的字母和数字组合表示引物名称。
图2.感染不同病毒的各实验组累计死亡曲线。
图3.各实验组平均病毒载量图。A-E为不同实验组的日平均病毒载量图。F为各实验组的平均病毒载量图。图4.感染SCRV-GM的免疫MSRV-SS组和对照组累计死亡率。
图5.11株克隆株G蛋白基因的PCR扩增。
图6.11株克隆株和野毒株MSRV-SS的G基因核酸序列系统发育树。
图7.野毒株MSRV-SS和克隆株MSRV-SS-7在CPB细胞上的生长动力学曲线。A：野毒株MSRV-SS；B：克隆株MSRV-SS-7。
图8.两种免疫方法中免疫组和对照组在攻毒SCRV-QY后的累积死亡率曲线。A：腹腔注射免疫，免疫组1和2分别通过腹腔注射104.75和103.75TCID50MSRV-SS-7进行免疫。B：浸泡免疫，免疫组鱼通过浸泡在104.75TCID50MSRV-SS-7中半小时进行免疫。
图9.MSRV-SS纯化株两轮扩增PCR结果。A为第一轮扩增PCR结果：M(DL10000)，S1(339bp)，S2(1229bp)，S3(989bp)，S4(1297bp)，S5(1557bp)，S6(1565bp)，S7(1378bp)， S8(1407bp)，S9(1462bp)，S10(1159bp)；B为第二轮扩增PCR结果：M(DL10000)，M1(1255bp)，M2(1205bp)，M3(1313)，M4(1411)，M5(1482)，M6(1841)，M7(1528)，M8(1459)。注：S3 泳道出现两条带，其中较亮带为目的条带。
图10.MSRV-SS-7两末端精确序列阳性克隆菌液PCR结果(A、B)和野毒株两末端精确序列PCR结果(C)。A：基因组3’端目的片段转化后，挑12个菌落后进行PCR，5为阳性克隆；B：基因组5’端目的片段转化后，挑取10个菌落进行PCR，将2、4、5、6、8送测序，结果表明2、4、6为阳性克隆。
图11.MSRV-SS-7的非转录区序列及各基因的起始和终止密码子。下划线部分表示转录起始信号，加粗部分表示转录终止信号，加框部分是基因间隔区(IGR)。斜体表示各基因的翻译起始和终止密码子。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
1、材料和方法
1.1细胞系和病毒株
鳜脑组织细胞系(CPB)在含有10％胎牛血清(FBS)的L-15培养基(GIBCO,USA)中增殖，并在28℃培养。本实验室初步分离到六株鱼类弹状病毒，分别是鳜弹状病毒三水株(SCRV-SS)、鳜弹状病毒清远株(SCRV-QY)、鳜弹状病毒高明株(SCRV-GM)、加州鲈弹状病毒三水株(MSRV-SS)、乌鳢弹状病毒佛山株(CMRV-FS)和笋壳弹状病毒江门株 (OMBRV-JM)，六株病毒均可在28℃条件下感染CPB。病毒保存于-80℃。
1.2总RNA提取、反转录和荧光定量PCR
感染细胞的病毒上清中的总RNA使用TRIzol法(Invitrogen,USA)提取，死鱼肝脾肾总 RNA使用Direct-zol RNA Miniprep(ZYMO RESEARCH,USA)试剂盒提取。使用
ⅢFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen,USA)将总RNA反转录成cDNA，使用特异引物RevF(表1)进行反转。
荧光定量PCR按如下操作进行，特异引物RevF、R、F、和探针(Probe)见表1。用获得的cDNA在荧光定量PCR仪(ABI7500)上进行循环扩增，每个病毒3个重复。反应体系： PremixEx TaqTM(2×)10μl，vRNAtag、SCRV87R(10μmol/L)各0.4μl，SCRV probe(10μmol/L) 0.4μl，ROXTM Reference Dye II(50×)0.4μl，cDNA模板2μl，去离子水6.4μl，总体系20μl。阴性对照组以去离子水代替待测病毒，2个重复。反应条件：95℃10s，1个循环；95℃5 s、60℃30s，40个循环，于60℃时采集荧光信号。
表1用于反转录及荧光定量PCR的引物及引物序列。
1.3弱毒株的筛选
1.3.1病毒滴度测定
把上述-80℃保存的六株鱼类弹状病毒复苏，之后用TCID50试验测定病毒的滴度。TCID50试验是根据Reed和Muench于1938年建立的方法进行的。简单地说就是取对数生长期的CPB 接种96孔板，100μl/孔，待细胞贴壁并形成均匀单层后弃掉培养基，将病毒用L-15梯度稀释至10-1-10-11，每个稀释度8个重复；接毒完成后把培养板放28℃培养箱孵育1h，然后补加含 5％FBS的L-15；补加后放回培养箱，每天显微镜下观察细胞病变情况并记录，连续记录10d，以Reed-Muench法计算病毒滴度，结果以每毫升细胞培养半数感染量(TCID50/ml)表示。 1.3.2鱼体实验
70尾健康乌鳢被随机分为7组，包括6个实验组和1个对照组。鱼被养在充分曝气的循环水水槽内，每日投喂饲料，适应2周后开始实验。水温维持在27～30℃。6个实验组分别腹腔注射六株病毒，每尾攻毒剂量为2×106.33TCID50，阴性对照组注射等量生理盐水。每日早晚观察鱼体死亡情况，并记录死亡率，观察20天。收集死鱼并称取肝脾肾混合组织50mg，用于荧光定量PCR试验以检测死亡鱼体组织内病毒载量。
1.3.3筛选出的弱毒株的免疫保护力验证
20尾健康鳜鱼(siniperca chuatsi)被分为两组：免疫组和对照组。免疫组每尾鱼腹腔注射0.1ml MSRV-SS，攻毒剂量为107.41TCID50。对照组注射等量生理盐水。逐日观察鱼体死亡情况，每日观察两次，观察20天。在第21天，用强毒株SCRV-GM对实验组和对照组进行攻毒实验，每尾攻毒剂量为106.9TCID50。每日观察两次，记录鱼体死亡率。收集死鱼并称取肝脾肾混合组织50mg，用于荧光定量PCR检测。相对存活率用RPS＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％计算。
1.4弱毒株MSRV-SS的纯化
用蚀斑法对MSRV-SS进行纯化。方法如下：将CPB接种6孔板(Corning,NY,USA)，待细胞贴壁并形成均匀单层后接毒；将病毒梯度稀释至10-5.5、10-6、10-6.5，每个稀释度2个重复，同时设两个空白对照；28℃培养箱孵育1h后，吸出病毒液，然后将高压灭菌的2％低熔点琼脂糖(AMRESCO,USA)同含5％FBS和4mM谷氨酰胺(GIBCO,USA)的无酚红DMEM (2×)等比混匀，待温度降至30℃左右时将混合液沿侧壁注入6个孔内，待凝固后用封口膜封好，置于28℃、5％CO2培养箱培养；每日于显微镜下观察，看是否有空斑形成。待形成直径在2-3mm大小的空斑时，用0.1％的中性红(MP Biomedicals,USA)贮存液稀释液(终浓度为1/10000-1/5000)进行染色，在暗处染色1-3h。然后选择性的挑取单个空斑，将挑取的空斑加入培养基进行稀释，然后接种到CPB细胞中进行扩增。收集产生病变的细胞，反复冻融两次，按相同方法进行下一轮的感染和空斑分离。最终进行三轮蚀斑纯化。
1.5克隆株的生物学特性研究
1.51不同克隆株滴度的比较
经过三轮蚀斑纯化最终获得了11个蚀斑，然后进行传代保存进行下一步分析。11株克隆株均以0.01拷贝/细胞的感染剂量接种至CPB细胞。然后使用荧光定量PCR法对病毒上清进行滴度测定，同时病毒上清保存在-80℃.
1.5.2G蛋白基因的测序和进化分析
提取11株克隆株的基因组总RNA，cDNA根据1.2部分的方法获得。引物S5F和S5R(表2)用于G蛋白基因的扩增。PCR扩增体系：10×Dream Taq Green Buffer 5μl，dNTP Mix(2mMeach)5μl，S5F、S5R各1μl，cDNA 2μl，Dream Taq DNA Polymerase 1μl，和35μl无RNA 酶的水。反应条件：95℃3min；95℃30s，48℃30s和72℃2min 35个循环；最后72℃延伸10min。PCR经1％琼脂糖分析后送广州艾基生物公司测序。获得的cDNA序列使用 CLUSTAL X 1.81进行比对，然后用MEGA6.0绘制最终的系统树，其程序使用最大似然算法。，并采用自引分析法((Bootstrap n＝1 000)进行检验。
1.5.3野毒株MSRV-SS和克隆株MSRV-SS-7生长动力学曲线的测定
为测定两株病毒生长动力学曲线，两病毒分别以0.01MOI(multipicity ofinfection)感染准备好的单层CPB，分别在接种后12h、24h、36h、48h和60h取细胞培养液上清，用TCID50试验测各时间点病毒滴度，并绘制病毒生长动力学曲线。
1.5.4克隆株MSRV-SS-7抵抗强毒SCRV的免疫保护效果分析
1.5.4.1腹腔注射免疫
将三十尾健康的鳜鱼随机分为三组，包括两个免疫组和一个对照组。两个免疫组分别腹腔注射0.1ml 10倍、100倍稀释的MSRV-SS-7(106.75TCID50/ml)，对照组注射等量生理盐水。免疫后第21天，三组鳜鱼每尾腹腔注射0.1ml SCRV-QY，攻毒剂量为105.29TCID50/ml。每日观察两次并记录死亡率，收集死鱼并称取肝脾肾的混合组织50mg，用于荧光定量PCR检测。最后计算相对存活率。
1.5.4.2浸泡免疫
除了接种方法和鳜鱼尺寸外，该免疫实验同上述腹腔注射免疫实验相同。接种方法为将鳜鱼鱼苗浸泡在10L的100倍稀释的MSRV-SS-7(106.75TCID50/ml)中半小时。接种后第21 天，免疫组和对照组均腹腔注射0.1ml SCRV-QY，攻毒剂量为每尾105.29TCID50/ml。每日观察两次并记录死亡率。收集死鱼并称取肝脾肾的混合组织50mg，用于荧光定量PCR检测。最后计算相对存活率。
1.6MSRV-SS野毒株和克隆株的测序及序列比对分析
1.6.1核心序列测序
使用马冬梅(Dongmei Ma et al.,2013)设计的扩增鳜弹状病毒(SCRV，Sinipercachuatsi rhabdovirus)的10对基因组分段测序引物(表2)对MSRV-SS野毒株和克隆株进行第一轮扩增，表2中引物设计依据的弹状病毒基因组序列见GenBank收录(GenBankaccession： NC_008514)。图1为克隆策略图，展示了10对引物所扩增的片段在基因组中的对应位置。根据第一轮MSRV-SS野毒株的测序结果，利用引物设计软件Primer PremierV5.0设计8对基因组分段测序引物(表3)对两株病毒进行第二轮测序。所设计的测序引物确保PCR扩增得到8 个相互重叠的片段(图1)。所有PCR产物经0.1％琼脂糖电泳分析后送广州艾基生物公司测序。
表2.引物及引物序列。引物设计依据的弹状病毒基因组序列(见GenBank收录)。
表3.引物及引物序列
1.6.2精确末端序列测序
以反义基因组RNA为模板设计基因特异性引物GSP，使用SMARTerTM RACE cDNAAmplification Kit(Takara,Japan)中的5’RACE法对MSRV-SS-7基因组3’端进行扩增。以基因组RNA(gRNA)为模板设计一套内外引物，同样使用5’RACE法对MSRV-SS-7基因组5’端进行扩增，其中外引物代替试剂盒中的5’-CDS，对病毒RNA进行反转录。所有PCR产物均按说明书进行胶回收、连接转化，最后挑取阳性克隆送公司测序。待克隆株末端序列测通后根据两末端序列分别设计两对引物YD3和YD5对野毒株MSRV-SS两末端进行扩增。PCR产物送公司测序。引物序列见表4。
表4.末端测序引物及序列。
1.6.3序列比对分析
通过两轮扩增得到的10片段和8片段，进行拼接获得MSRV-SS-7和MSRV-SS的核心序列。为确保序列的准确性，所有测序结果均进行了至少两次测序。测序完成后所有序列使用 Vector NTI 8进行对比分析。
2、结果
2.1弱毒株的筛选及其免疫保护率检测
根据六株弹状病毒的滴度(表5)，其余5株病毒的滴度都稀释到与OMBRV-JM相同的107.33TCID50/ml。然后将稀释好的病毒对分好组的鳜鱼进行攻毒，攻毒剂量为2×106.33TCID50。 SCRV-GM，SCRV-SS，SCRV-QY，CMRV-FS，OMBRV-JM和MSRV-SS组的死亡率分别为100％，90％，70％，60％，10％和0(图2)。病鱼的肝脾肾混合组织中的病毒载量采用荧光定量PCR检测，图3为各实验组的平均病毒载量图。图3A-E表明五个实验组的日平均病毒载量均逐日下降。由图3F可看出在六组中，感染SCRV-GM组的平均病毒载量最高。因感染 MSRV-SS的鳜鱼无死亡，且抽检后未检测到病毒，所以该组的平均病毒载量图在图3中并未显示。因此SCRV-GM，SCRV-SS，SCRV-QY和CMRV-FS为强毒株，OMBRV-JM毒力较低，而MSRV-SS为弱毒株。如图4所示，用MSRV-SS免疫过的鳜鱼再感染SCRV-GM后其RPS 为100％。总的来说，MSRV-SS株不仅是弱毒株，而且可保护鳜鱼抵抗强毒SCRV的感染。所以MSRV-SS被用于接下来的研究。
表5.六株病毒的滴度。
2.2弱毒株MSRV-SS的纯化和克隆株的生物学特性研究
经过三轮蚀斑实验，纯化出11株MSRV-SS克隆株，编号为1-11。将11株MSRV-SS克隆株以0.01拷贝/cell感染CPB，逐日观察，待病变完全后测每株病毒的滴度。结果表明 MSRV-SS-7的滴度最高(表6)。11株克隆株G蛋白基因扩增片段见图5。根据野毒株MSRV-SS 及11株克隆株G蛋白基因核酸序列进行簇分析。据图5可看出，11株克隆株和野毒株被分为两个亚簇。系统进化树表明MSRV-SS-7，MSRV-SS-8，MSRV-SS-9，MSRV-SS-10同野毒株形成一个单源世系。因此选择MSRV-SS-7用于接下来的研究。
表6.以同一拷贝数感染CPB后收获的11株MSRV-SS克隆株的滴度.
2.3克隆株MSRV-SS-7的生物学特性研究
2.3.1MSRV-SS野毒株和克隆株MSRV-SS-7的体外生长特性
MSRV-SS野毒株和MSRV-SS-7的体外生长特性用两者在CPB上的生长曲线来测定。两株病毒的生长动力学曲线通过TCID50试验测定。如图7所示，克隆株的生长趋势与野毒的基本一致，但其达到最高生长滴度的时间点在接种后24h，而野毒在接种后36h才达到最高生长滴度，之后病毒滴度都下降。
2.3.2克隆株MSRV-SS-7抵抗强毒SCRV-QY的免疫保护效果分析
图8A显示了免疫103.75和104.75TCID50MSRV-SS-7的鳜鱼分别腹腔注射105.29TCID50SCRV-QY后的累计死亡率。对照组从攻毒后的第1天到第4天均有死亡，累积死亡率为50％。但分别接种两种剂量强毒的两个免疫组在攻毒后20天内均无死亡，所以两免疫组的RPS都是100％。图8B显示了浸泡免疫的鳜鱼鱼苗攻105.57TCID50SCRV-QY后的累计死亡率。对照组鱼苗从攻毒后第1天开始死亡，持续到第8天，累积死亡率为40％。而免疫组无死亡，所以其RPS为100％。结果表明MSRV-SS-7对鳜鱼抵抗强毒鱼类弹状病毒具有良好的免疫原性。
2.4野毒株MSRV-SS和克隆株MSRV-SS-7测序
2.4.1核心序列测序
两株病毒第一轮扩增使用10对引物(见表2)进行PCR，分别得到10个片段，因所用引物相同，故只展示克隆株的PCR结果图(图9A)，所得片段大小与预期目的片段大小一致。第二轮扩增获得8个片段(所用引物见表3)，克隆株8个片段PCR结果见图9B，片段大小与预期目的片段大小一致。第二轮扩增的8个片段在第一轮扩增的10个片段上的对应位置见图1。二轮扩增的8片段分别对应一轮扩增的8个重叠区，从而纠正重叠区不准确的碱基。通过两轮扩增并测序最终获得MSRV-SS野毒株和克隆株除两末端序列外的全部基因组序列。
2.4.2精确末端序列测序
通过设计的GSP，扩增出MSRV-SS克隆株基因组3’端大小为859bp的片段(图10A)；而通过内外引物，获得了MSRV-SS克隆株基因组5’端大小为272bp的片段(图10B)。根据克隆株两末端序列分别设计的两对引物YD3和YD5，扩增出野毒株3’端大小为436bp的片段，5’端大小为496bp的片段(图10C)，所述引物的序列见表4。
2.4.3序列分析
通过核心序列测序和精确末端序列测序，将得到的各片段序列去除重叠部分序列进行拼接，获得了克隆株MSRV-SS-7和野毒株MSRV-SS的全基因组序列。MSRV-SS-7基因组全长为11548核苷酸，基因组结构为3’Leader-N-P-M-G-L-Trailer 5’，N、P、M、G、L基因大小分别为1456nt，971nt，946nt，1661nt和6366nt，3’端和5’端的非编码区分别长71nt和61 nt(图1)，且3’末端前10个碱基与5’末端前10个碱基反向互补(图11)。非编码区序列及基因连接区序列见图11。
申请人将本发明弱毒疫苗株MSRV-SS-7保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏中心于2017年10月17日收到申请人提供的菌株。保藏中心给予该培养物的保藏号为CCTCC NO：V 201737，建议的分类命名为鲈弹状病毒MsRV-SS-7，已于2017年10月28日鉴定保藏的菌株是存活的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 鱼类弹状病毒弱毒疫苗株及其应用
<130>
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
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ataattagca tccgcagaag g 21
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<213> 人工序列
<400> 43
ggctggcagg attgacaaaa ggtgagtg 28
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tccatagcga actctcagca g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
acgagaaaaa caaacccagt c 21
Claims (6)
1.一株鱼类弹状病毒弱毒疫苗株，命名为鲈弹状病毒MsRV-SS-7，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V 201737。
2.权利要求1所述的鱼类弹状病毒弱毒疫苗株在制备抗鱼类弹状病毒疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鱼类为鳜鱼、鲈鱼、乌鳢、笋壳鱼。
4.权利要求1所述的鱼类弹状病毒弱毒疫苗株在制备防治鱼类弹状病毒病制剂中的应用。
5.一种抗鱼类弹状病毒疫苗，其特征在于，该疫苗中含有权利要求1所述的鱼类弹状病毒弱毒疫苗株。
6.一种防治鱼类弹状病毒病制剂，其特征在于，该制剂中含有权利要求1所述的鱼类弹状病毒弱毒疫苗株。
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