CN118185883B - 大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒领域，具体涉及大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株及其应用。提供的大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株，保藏编号为CCTCC NO：V202412。该病毒株具有弱毒性，且具有良好的免疫原性，可用于大口黑鲈弹状病毒弱毒疫苗的开发，对鱼类弹状病毒防治具有重要意义。

Description

大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株及其应用

技术领域

本发明涉及病毒领域，具体涉及大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株及其应用。

背景技术

大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides Rhabdovirus，MsRV)可以引起鳜鱼，鲈鱼等名优鱼类爆发性死亡，从苗种阶段到养殖过程中都极易感染，致死率可高达90％以上，尤其苗种感染致死率几乎100％，无有效的防治方法，且流行范围越来越广，给养殖业带来巨大的经济损失，已成为养殖发展的主要瓶颈之一。

目前，大口黑鲈弹状病毒缺乏商品化的弱毒疫苗，灭活疫苗引起的抗体水平持续时间短，引起机体的不良应激反应等弊端，弱毒疫苗接种后在体内仍能进行生长繁殖，产生免疫力快而强，可激发机体对病原的持久免疫力，而且免疫途径多样化，例如浸泡、滴鼻、点眼等。

前期的疫苗研究免疫途经主要为注射疫苗，操作繁杂，使用成本增加，不利于推广使用；此外，注射疫苗需要鱼体长到5cm左右的时候才可以操作，而对于幼苗和苗种阶段无法使用，而弹状病毒对于幼苗和苗种的危害极大，死亡率极高；因此开发有效的浸泡免疫有重要的应用前景。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种大口黑鲈弹状病毒病毒株，该病毒株是一株弱毒株并具有良好的免疫原性，可以作为弹状病毒弱毒疫苗的候选株。

本发明的目的在于提供一株大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一株大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株，命名为鲈弹状病毒MsRV-0509，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V 202412。

包含上述的大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株的病毒液也属于本发明的保护范围。

上述的大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株在制备抗鱼类弹状病毒疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

进一步地，所述鱼类为鲈鱼、鳜鱼、乌鳢、笋壳鱼中的至少一种。

上述的大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株在制备防治鱼类弹状病毒病制剂中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种抗大口黑鲈弹状病毒疫苗，所述疫苗的活性成分包含上述的大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株。

进一步地，所述疫苗为弱毒疫苗。

进一步地，所述疫苗为浸泡免疫疫苗。

本发明还提供上述的抗大口黑鲈弹状病毒疫苗的制备方法，包括步骤：将权利要求1所述的大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株接种至CPB细胞进行培养，经过5轮蚀斑纯化得到纯化克隆株，然后提取病毒液。

进一步地，所述培养采用的培养基为含2％低熔点琼脂糖、5％ FBS的L15培养基。

本发明还提供一种防治大口黑鲈弹状病毒的制剂，该制剂中含有上述的大口黑鲈弹状病毒病毒株。

本发明提供的大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株已进行了专利保藏，保藏信息如下：

参椐的生物材料(株)：鲈弹状病毒MsRV-0509

分类命名：Rhabdovirus

保藏日期：2024年2月28日

保藏编号：CCTCC NO:V202412

保藏机构：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心

地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(第一附小校校内正门对面)。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过从自然界分离获得一株大口黑鲈弹状病毒株MsRV-0509，通过蚀斑纯化，并进行生物学特性研究证实该MsRV-0509株为一株弱毒株并具有良好的免疫原性，具有免疫持久、效果好、安全可靠等优点；可以作为大口黑鲈弹状病毒弱毒疫苗的候选株。免疫研究结果显示腹腔注射和浸泡免疫都可以起有效的保护作用，浸泡免疫免疫效果更好，攻毒后也可以有效的保护幼苗，为开发有效的弹状病毒浸泡疫苗提供了技术支持。

附图说明

图1为蚀斑纯化示意图；

图2为MsRV-0509的增殖条件的优化结果；

图3为MsRV-0509的生长曲线；

图4为MsRV-0509的毒力返强试验结果；

图5为MsRV-0509在体内的组织分布及消长规律；

图6为MsRV-0509的安全性评价结果；

图7为MsRV-0509腹腔接种免疫结果；

图8为MsRV-0509浸泡免疫结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

生物材料：

MsRV病毒株：即大口黑鲈弹状病毒、由珠江水产研究所鱼病室实验室分离和保存。

CPB细胞：即传染性脾肾坏死病毒，可以实验室分离也可以购买。本实施例为珠江水产研究所鱼病室实验室分离和保存。

鲈鱼采购自广东德权渔业发展有限公司。

试剂：均为市售。

若未特别说明，以下实施例中所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例中所使用的实验方法和条件均为本领域常规实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。

实施例1MsRV-0509病毒株分离、培养与鉴定

1.1分离

取发病鱼的肾、脾脏研磨后，5000rpm/min离心5min,取上清过滤后接种至单层的CPB细胞，孵育1h后，加入含2％ FBS的L15培养基，放置28℃培养箱培养，每日显微镜下观察，90％以上发生病变并细胞脱落，收取后放置低温冰箱备用。

1.2蚀斑纯化

将CPB细胞接种6孔板，过夜培养长至90％的单层，将病毒稀释至10^-4、10^-5、10^-6接入6孔板内，500μl/孔，每个稀释度2个重复，设两个空白对照；28℃培养箱孵育1h后，吸出病毒液，加入含2％低熔点琼脂糖、5％ FBS的L15培养基，1ml/.孔，待凝固后用封口膜封好，置于28℃培养箱培养4天；将0.1％的中性红贮存液稀释至终浓度为1/10000-1/5000，进行染色，在暗处染色1-3h；用200μl枪头选择性的挑取单个空斑，挑出的空斑加入L15中进行稀释，然后接种到CPB上进行扩增；将产生病变的细胞上清冻融两次，按相同方法进行下一轮的感染和空斑分离，反复进行共计五轮蚀斑纯化。

通过5轮蚀斑纯化获得纯化克隆株如图1所示，图1A为病毒蚀斑示例，图1B为各克隆株病毒滴度，并分别测得各毒株滴度，最终选择病毒的滴度较高的MsRV-0509进行后续研究。

1.3毒株测序

将病毒液提取RNA后进行反转录获得cDNA，并分别用一下引物进行PCR扩增，电泳后回收PCR条带，连接T载体后，克隆转化，将获得的阳性菌落送去测序，每个片段最少送3个样品，测序结果比对后获得毒株的全长序列

表1测序引物

实施例2MsRV-0509病毒株的生化和免疫测试

2.1MsRV-0509的增殖条件的优化

将CPB细胞过夜培养长至90％的单层，以不同细胞感染复数(MOI分别为1、0.5、0.1、0.01、0.001、0.0001)接毒，待细胞病变至80％～90％收毒，反复冻融2次后分别测得滴度，荧光定量PCR测得病毒拷贝数。结果如图2所示。

可以看出，MsRV以MOI为0.0001接毒时病毒滴度最高，后续实验可基于该条件。

2.2MsRV-0509的生长曲线

将病毒分别以0.0001MOI(multipicity of infection)感染准备好的单层CPB细胞，分别在接种每隔12h收样，反复冻融两次后分装至-80℃保存，测定病毒滴度，绘制病毒生长曲线，如图3所示。

可以看出，MsRV-0509病毒在接毒后96h时滴度最高，为10^8.571TCID50/mL，之后病毒滴度开始下降，因此在接毒后96h左右为最佳收毒时间。

2.3MsRV-0509的毒力测定

分别将实验室已知强毒株MsRV-SS和MsRV-0509同时10倍梯度稀释腹腔接种鲈鱼，测定病毒的LD₅₀。

强毒株的MsRV-GM株的LD50为10^-6/ml，而MsRV-0509最高浓度10^-1接种后死亡率在10％左右，也未达到半数死亡率，也明显证实MsRV-0509株的毒力较弱，为弱毒株。

2.4MsRV-0509的毒力返强试验

分别将MsRV-0509浸泡和腹腔注射接种鲈鱼，接种48h后，分别浸泡和腹腔注射接种鲈鱼取肝、脾、肾和脑研磨后获得病料F1代，然后将F1离心过滤后制成组织毒用于盲传实验，将获得的组织毒稀释4倍后再分别浸泡和腹腔注射接种鲈鱼，依次传至F5代，将各个代次的组织样品进行检测。结果如图4所示，其中M.DL2000；1-5：感染MsRV的F1到F5加州鲈的组织样品；6:阴性对照；(a)(b)为浸泡感染组qPCR和常规PCR检验结果；(c)(d)为腹腔注射感染组qPCR和常规PCR检验结果。

浸泡及腹腔注射感染病毒的盲传五代的大口黑鲈在观察期内均无死亡；浸泡感染组只在盲传F1的鱼体组织中有病毒检出，而组织毒感染的F2大口黑鲈中已无病毒检出；腹腔注射感染组在F1、F2代有少量病毒检出；说明该疫苗株不会出现毒力返强的现象。

2.5MsRV-0509在体内的组织分布及消长规律

将大口黑鲈进行腹腔注射免疫，剂量为5×10²TCID₅₀/尾，分别于免疫后第1、2、3、4、5、6、7和14天称取3尾大口黑鲈的脑、心脏、肝脏、脾脏、头肾、肠、鳃、胃和肌肉，保存于-80℃，检测组织中病毒含量，结果如图5所示。

在大口黑鲈的脑、心脏、肝脏、脾脏、头肾、肠、鳃、胃和肌肉组织中均检测到MsRV-0509，所有组织的病毒表达量均在第1天达到最高，第2天开始下降，在第7天所有组织均检测不到。

2.6MsRV-0509株的安全性评价

将体重为3±0.5g，体长为5±0.5cm的大口黑鲈分别进行浸泡免疫、腹腔注射免疫，观察14天，记录数据。

结果如图6所示，其中图(a)为浸泡免疫，图(b)为腹腔注射免疫。浸泡免疫组观察期内无死亡，疫苗株通过浸泡免疫，安全性可靠；腹腔注射组，免疫剂量为5×10³TCID50、5×10²TCID50时大口黑鲈存活率分别为93％、96％，疫苗株通过腹腔注射免疫，安全性可靠。

2.7MsRV-0509的超剂量接种鲈鱼安全性评价

将体重为3±0.5g，体长为5±0.5cm的大口黑鲈分别进行浸泡或腹腔注射免疫，3批重复，连续观察10天，记录数据。

结果如表2和表3所示，浸泡一次超剂量免疫观察期内无死亡，说明疫苗株通过浸泡免疫，安全性可靠。腹腔注射一次超剂量免疫观察期内有一批死亡3尾，死亡率是10％，其余两批观察期内未有死亡，说明疫苗株通过注射免疫，安全性可靠。

表2浸泡一次超剂量

表3腹腔注射一次超剂

2.8MsRV-0509腹腔接种免疫

将体重为3±0.5g，体长为5±0.5cm的大口黑鲈进行腹腔注射免疫，免疫21天、28天后再腹腔注射强毒来验证免疫效力，连续观察10天，记录数据，计算相对免疫保护率(RPS)。

结果如图7所示，其中图(a)为免疫21天后腹腔注射强毒的大口黑鲈累计死亡率；(b)免疫28天后腹腔注射强毒的大口黑鲈累计死亡率。

免疫21天后攻毒组显示，免疫剂量为5×10⁴TCID₅₀、5×10³TCID₅₀、5×10²TCID₅₀，大口黑鲈的相对免疫保护率均为100％，免疫剂量为5×10¹TCID₅₀、5TCID₅₀，大口黑鲈的相对免疫保护率分别为79.2％、66.7％；

免疫28天后攻毒组显示，免疫剂量为5×10³TCID₅₀、5×10²TCID₅₀，大口黑鲈的相对免疫保护率均为100％，免疫剂量为5×10¹TCID₅₀、5TCID₅₀，5×10^-1TCID₅₀大口黑鲈的相对免疫保护率分别为83.0％、53.4％、56.5％。

2.9MsRV-0509浸泡免疫

将体重为3±0.5g，体长为5±0.5cm的大口黑鲈进行浸泡免疫，免疫21天、28天后再腹腔注射强毒来验证免疫效力，连续观察10天，记录数据，计算相对免疫保护率(RPS)。

结果如图8所示，其中(a)免疫21天后腹腔注射强毒的大口黑鲈累计死亡率；(b)免疫28天后腹腔注射强毒的大口黑鲈累计死亡率。

免疫21天后攻毒组显示，免疫剂量为106TCID50/mL、105TCID50/mL 104TCID50/mL、103TCID50/mL、102TCID50/mL，大口黑鲈的相对免疫保护率分别为100％，75.0％、52.3％、9.5％、14.3％；

免疫28天后攻毒组显示，免疫剂量为106TCID50/mL、105TCID50/mL 104TCID50/mL、103TCID50/mL，大口黑鲈的相对免疫保护率分别为100％、26.7％、26.0％、0。

2.10MsRV-0509免疫后中和抗体的测定

鲈鱼经MsRV-0509免疫后14天，采血并制备血清，并56℃水浴处理30min后分装，将血清2倍系列稀释后，取100μl的血清再分别加入等体积的病毒液，孵育1h,接种于长至单层的CPB细胞，每个样品重复4孔；并设立病毒对照孔和细胞对照孔；置28℃培养箱培养；10天后观察血清中和效果。

结果显示，鲈鱼经MsRV-0509免疫后14天，采血并制备血清，将该血清2倍系列稀释后测定的中和有效效价为1:2⁸，证实免疫后可引起机体产生有效的保护性抗体。

综上，可以本发明通过从自然界分离获得一株大口黑鲈弹状病毒株MsRV-0509，通过蚀斑纯化，并进行生物学特性研究证实该MsRV-0509株为一株弱毒株并具有良好的免疫原性，具有免疫持久、效果好、安全可靠等优点；可以作为大口黑鲈弹状病毒弱毒疫苗的候选株。进一步免疫研究结果显示腹腔注射和浸泡免疫都可以起有效的保护作用，浸泡免疫免疫效果更好，攻毒后也可以有效的保护幼苗，为开发有效的弹状病毒浸泡疫苗提供了技术支持。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株，其特征在于，命名为鲈弹状病毒MsRV-0509，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202412。

2.权利要求1所述的大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株在制备抗鱼类弹状病毒疫苗中的应用，所述疫苗为弱毒疫苗。

3.根据权利要求2所述的应用，所述鱼类为鲈鱼、鳜鱼、乌鳢、笋壳鱼中的至少一种。

4.权利要求1所述的大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株在制备防治鱼类弹状病毒病制剂中的应用。

5.一种抗大口黑鲈弹状病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗的活性成分包含权利要求1所述的大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株，所述疫苗为弱毒疫苗。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为浸泡免疫疫苗。

7.根据权利要求6所述的疫苗的制备方法，其特征在于，包括步骤：

将权利要求1所述的大口黑鲈弹状病毒弱毒病毒株接种至CPB细胞进行培养，经过5轮蚀斑纯化得到纯化克隆株，然后提取病毒液。

8.根据权利要求7所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述培养采用的培养基为含2%低熔点琼脂糖、5% FBS的L15培养基。

9.一种防治大口黑鲈弹状病毒的制剂，其特征在于，该制剂中含有权利要求1所述的大口黑鲈弹状病毒病毒株。