CN108137696A - 人源化抗人cd19抗体和使用方法 - Google Patents

Abstract

本文报道了特异性结合人CD19的抗体，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR‑H1，(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR‑H2，(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR‑H3，(d)包含SEQ ID NO：20或28的氨基酸序列的HVR‑L1，(e)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR‑L2，和(f)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR‑L3，以及使用其的方法。

Description

人源化抗人CD19抗体和使用方法

技术领域

本发明涉及抗人CD19的人源化抗体(抗人CD19抗体)、其制备方法、含有这些抗体的药物组合物及其用途。

背景技术

人CD19是仅在B细胞和滤泡树突细胞上表达的95kDa跨膜蛋白(B细胞共受体)。发现CD 19与CD21和CD81相关。正常B细胞分化需要CD19和CD21(Carter,R.H.,等人,Immunol.Res.26(2002)45-54)。抗CD19的抗体已用于若干临床试验中(参见例如Hekman,A.,等人,Cancer Immunol.Immunother.32(191)364-372；Vlasfeld,L.T.,等人,CancerImmunol.Immunother.40(1995)37-47；Conry,R.M.,等人,J.Immunother.Emphasis TumorImmunol.18(1995)231-241；Manzke,O.,等人,Int.J.Cancer 91(2001)516-522)。

抗CD19的抗体是例如在WO 2004/106381、WO 2005/012493、WO 2006/089133、WO2007/002223、WO 2006/133450、WO 2006/121852、WO 2003/048209、US 7,109,304、US2006/0233791、US 2006/0280738、US 2006/0263357、US 2006/0257398、EP 1648512、EP1629012、US 2008/0138336、WO 2008/022152和在Bruenke,J.,等人,Br.J.Hematol.130(2005)218-228；Vallera,D.A.,等人,Cancer Biother.Radiopharm.19(2004)11-23；Ghetie,M.A.,等人,Blood 104(2004)178-183；Lang,P.,等人,Blood 103(2004)3982-3985；Loeffler,A.,等人,Blood 95(2000)2098-2103；Le Gall,F.,等人,FEBS Lett.453(1999)164-168；Li,Q.,等人,Cancer Immunol.Immunother.47(1998)121-130；Eberl,G.,等人,Clin.Exp.Immunol.114(1998)173-178；Pietersz,G.A.,等人,CancerImmunol.Immunother.41(1995)53-60；Myers,D.E.,等人,Leuk.Lymphoma.18(1995)93-102；Bejcek,B.E.,等人,Cancer Res.55(1995)2346-2351；Hagen,I.A.等人,Blood 85(1995)3208-3212；Vlasfeld,L.T.,等人,Cancer Immunol.Immunother.40(1995)37-47；Rhodes,E.G.等人,Bone Marrow Transplant.10(1992)485-489；Zola,H.,等人,Immunol.Cell Biol.69(1991)411-422；Watanabe,M.,等人,Cancer Res.50(1990)3245-3248；Uckun,F.M.,等人,Blood 71(1988)13-29；Pezzutto,A.,等人；J Immunol.138(1987)2793-2799中提及了。单克隆抗体SJ25-C1可商购(产品号4737，Sigma-Aldrich Co.USA，SEQID NO：21至24)。WO 2008/022152中提到了对FcγRIIIA具有增加的亲和力的抗体。

抗CD19抗体对B细胞活化具有抑制或刺激作用。CD19抗体与促分裂原刺激的B细胞的结合抑制随后Ca2+的升高和由此产生的这些细胞的活化和增殖以及B细胞增殖和分化可以被CD19抗体抑制或增强，这取决于所使用的促分裂原刺激和抗体交联度。

在WO 2004/106381中报道了包含双特异性抗CD3、抗CD19抗体构建体的药物组合物用于治疗B细胞相关疾患。WO 2005/012493中报道了抗CD19抗体。在WO 2006/089133中报道了抗CD19抗体和在肿瘤学中的用途。在WO 2007/002223中报道了抗CD19抗体及其用途。在WO 2006/133450中报道了用于移植的抗CD19抗体疗法。

在WO2011/147834中报道了抗CD19抗体及其用途。

发明内容

本文提供了抗(人)CD19的抗体，其可用作治疗自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、狼疮、牛皮癣或骨疾病或用于肿瘤治疗的治疗剂。

本发明部分基于以下发现：为了去除人源化抗人CD19抗体中的多个脱酰胺热点，单一突变就足够了。

如本文报道的抗体对患有与B细胞病理性增加相关的疾病的患者具有有益的性质。

如本文报道的一个方面是特异性结合人CD19的抗体，其中所述抗体包含

(a)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H1，

(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H2，

(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3，

(d)包含SEQ ID NO：20或28的氨基酸序列的HVR-L1，

(e)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L2，和

(f)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。

在一个实施方案中，抗体是人、人源化或嵌合抗体。

在一个实施方案中，抗体是特异性结合人CD19的抗体片段。

在一个实施方案中，抗体包含

(a)与SEQ ID NO：09的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列和与SEQ IDNO：19的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列，或

(b)与SEQ ID NO：09的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列和与SEQ IDNO：27的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列，或

(c)如(a)或(b)中的VH序列和VL序列。

在一个实施方案中，抗体是特异性结合人CD19和第二不同抗原的双特异性抗体。

本文报道的一个方面是包含本文报道的抗体和药学上可接受的载体的药物制剂。

本文报道的一个方面是本文报道的抗体用于治疗B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，B细胞恶性肿瘤选自CLL、NHL和DLBCL。

本文报道的一个方面是本文报道的抗体用作药物。

在一个实施方案中，药物用于治疗B细胞癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、狼疮、牛皮癣或骨疾病。在一个实施方案中，药物用于B细胞的消除。

本文报道的一个方面是本文报道的抗体用于治疗B细胞癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、狼疮、牛皮癣或骨疾病。

本文报道的一个方面是本文报道的抗体用于消除B细胞。

本文报道的一个方面是本文报道的抗体在制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗B细胞癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、狼疮、牛皮癣或骨疾病。在一个实施方案中，药物用于B细胞的消除。

本文报道的一个方面是治疗患有B细胞癌症的个体的方法，其包括向个体施用有效量的本文报道的抗体。

本文报道的一个方面是消除个体中B细胞的方法，其包括向个体施用有效量的本文报道的抗体。

本文报道的一个方面是用于制备用于治疗疾病的包含本文报道的抗体的药物的方法。在一个实施方案中，所述疾病是B细胞癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、狼疮、牛皮癣或骨疾病。

本文报道的一个方面是编码本文报道的抗体的分离的核酸。

本文报道的一个方面是包含本文报道的核酸的宿主细胞。

本文报道的一个方面是产生抗体的方法，其包括培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，从而产生抗体，从细胞或培养基中回收抗体并纯化抗体。

本文报道的一个方面是包含本文报道的抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物。

具体实施方式

I.定义

出于本文目的的“受体人框架”是包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如下所述。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者可以含有氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(k_d)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的那些方法。

“亲和力成熟的”抗体是指与不具有此类改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，所述改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。

术语“抗人CD19抗体”和“特异性结合人CD19的抗体”是指能够以足够的亲和力结合人CD19的抗体，使得该抗体可用作靶向人CD19中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，如通过表面等离子体共振测量的，抗人CD19抗体与无关的、非CD19蛋白的结合程度小于抗体与人CD19结合的约10％。在某些实施方案中，特异性结合人CD19的抗体具有10^-8M或更小的解离常数(K_D)。

本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性。

术语“抗体依赖性细胞毒性(ADCC)”是由Fc受体结合介导的功能，指通过本文报道的抗体在效应细胞的存在下裂解靶细胞。在一个实施方案中，通过如下测量ADCC：在效应细胞(如新鲜分离的PBMC(外周血单个核细胞))或从血沉棕黄层纯化的效应细胞(如单核细胞或NK(自然杀伤))的存在下用本文报道的抗体处理表达CD19的红系细胞(例如表达重组人CD19的K562细胞)制备物。靶细胞用⁵¹Cr标记并随后与抗体孵育。将标记的细胞与效应细胞孵育，分析上清液释放的⁵¹Cr。对照包括与效应细胞孵育靶内皮细胞但不含抗体。通过测量它们与表达Fcγ受体的细胞(如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA的细胞或NK细胞(基本上表达FcγRIIIA))的结合研究抗体诱导介导ADCC的初始步骤的能力。在一个优选的实施方案中，测量与NK细胞上FcγR的结合。

“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；双体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种。

抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核酸分解酶；抗生素；毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下面公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。

术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”是指由本文报道的抗体在补体存在下诱导细胞裂解。在一个实施方案中，通过在补体存在下用本文报道的抗体处理表达CD19的人内皮细胞来测量CDC。在一个实施方案中，细胞用钙黄绿素标记。如果在30μg/ml的浓度下抗体诱导20％或更多的靶细胞裂解，则存在CDC。可以在ELISA中测量与补体因子C1q的结合。原则上在这样的测定法中，将ELISA板用浓度范围的抗体包被，加入纯化的人C1q或人血清。用针对C1q的抗体随后用过氧化物酶标记的缀合物检测C1q结合。对结合的检测(最大结合B_max)测量为过氧化物酶底物(2,2'-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐(6)])在405nm处的光密度(OD405)。

“效应功能”是指归因于抗体Fc区的那些生物学活性，其随抗体类别而变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。

Fc受体结合依赖性效应功能可以通过抗体Fc区与Fc受体(FcR)(其是造血细胞上专门的细胞表面受体)的相互作用介导。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，已显示其通过免疫复合物的吞噬作用介导包被抗体的病原体的去除，以及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)裂解包被相应抗体的红细胞和各种其他细胞靶(例如肿瘤细胞)(参见例如Van deWinkel,J.G.and Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。通过它们对免疫球蛋白同种型的特异性来定义FcR：IgG抗体的Fc受体被称为FcγR。Fc受体结合描述于例如Ravetch,J.V.and Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.,等人,Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.,等人,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；和Gessner,J.E.,等人,Ann.Hematol.76(1998)231-248。

IgG抗体Fc区受体(FcγR)的交联触发各种效应功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性和炎性介质的释放，以及免疫复合物清除和抗体产生的调节。在人中，已经表征了三类FcγR，它们是：

-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG并在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。在IgG的Fc区中在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329(根据Kabat的EU索引编号)的至少一个中的修饰降低了与FcγRI的结合。IgG2残基在位置233-236被取代成IgG1和IgG4以10³倍降低了与FcγRI的结合，并消除了人单核细胞对抗体致敏红细胞的应答(Armour,K.L.,等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2613–2624)。

-FcγRII(CD32)以中等至低亲和力结合复合的IgG并被广泛表达。该受体可以分为两个亚型：FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA存在于参与杀伤的许多细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)上并似乎能够活化杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制过程中发挥作用，并存在于B细胞、巨噬细胞和肥大细胞以及嗜酸性粒细胞上。在B细胞上，它似乎起到进一步抑制免疫球蛋白产生和同种型转换成例如IgE类的作用。在巨噬细胞上，FcγRIIB抑制通过FcγRIIA介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，B型可有助于抑制这些细胞通过IgE与其单独的受体结合的活化。发现FcγRIIA对于例如包含在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414(根据Kabat的EU索引编号)的至少一个中具有突变的IgG Fc区的抗体的结合降低。

-FcγRIII(CD16)以中等至低亲和力结合IgG并存在两种类型。Fcγ RIIIA存在于NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和一些单核细胞和T细胞上并介导ADCC。FcγRIIIB在中性粒细胞上高度表达。发现Fcγ RIIIA对于例如包含在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376(根据Kabat的EU索引编号)的至少一个中具有突变的IgG Fc区的抗体的结合降低。

人IgG1上对Fc受体的结合位点的制图、上述突变位点以及用于测量与FcγRI和FcγRIIA结合的方法在Shields,R.L.,等人J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604中描述了。

试剂(例如药物制剂)的“有效量”是指在必需的剂量和时间段内有效实现期望的治疗或预防结果的量。

如本文所用，术语“Fc受体”是指活化的受体，其特征在于存在与受体相关的细胞质ITAM序列(参见例如Ravetch,J.V.and Bolland,S.,Annu.Rev.Immunol.19(2001)275-290)。这样的受体是FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA。术语“不结合FcγR”表示在10μg/ml的抗体浓度下，如本文报道的抗体与NK细胞的结合是抗OX40L抗体LC.001发现的结合(如在WO2006/029879中报道的)的10％或更低。

尽管IgG4显示降低的FcR结合，但其他IgG亚类的抗体显示出强结合。然而Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc碳水化合物缺失)、Pro329和234、235、236和237Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435是如果改变也提供降低的FcR结合的残基(Shields,R.L.,等人J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.,等人,FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.,等人,Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434)。在一个实施方案中，如本文报道的抗体是IgG1或IgG2亚类，并且包含突变PVA236、GLPSS331和/或L234A/L235A。在一个实施方案中，如本文报道的抗体是IgG4亚类并且包含突变L235E。在一个实施方案中，抗体进一步包含突变S228P。

术语“Fc区”在本文用于限定包含至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号根据EU编号系统(也称为EU索引)，如Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIHPublication 91-3242中所述。

如本文报道的抗体包含Fc区，在一个实施方案中，包含源自人的Fc区。在一个实施方案中，Fc区包含人恒定区的所有部分。抗体的Fc区直接参与补体活化、C1q结合、C3活化和Fc受体结合。尽管抗体对补体系统的影响取决于某些条件，但与C1q的结合由Fc区中确定的结合位点引起。这样的结合位点在现有技术中是已知的，并描述于例如Lukas,T.J.,等人,J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.,and Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.,等人,Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.,等人,Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.,等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.,等人,J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.,等人,Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434。这样的结合位点是例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引编号；除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号根据EU编号系统，也被称为EU索引，如Kabat,E.A.等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242中所述)。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常显示补体活化、C1q结合和C3活化，而IgG4不活化补体系统、不结合C1q并且不活化C3。“抗体的Fc区”是本领域技术人员熟知的术语，其基于抗体的木瓜蛋白酶切割来定义。在一个实施方案中，Fc区是人Fc区。在一个实施方案中，Fc区是包含突变S228P和/或L235E(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG4亚类。在一个实施方案中，Fc区是包含突变L234A和L235A(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG1亚类。

“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指其中引入了外源核酸的细胞，包括这样的细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括具有与原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变后代。

“人共有框架”是代表选择的人免疫球蛋白VL或VH框架序列的最常出现的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如在Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Bethesda MD(1991),NIH Publication 91-3242,Vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等人，同上中的亚组κ1。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等人，同上中的亚组III。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些HVR，并且全部或基本上全部的FR对应于人抗体的那些FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个区，其包含序列高度可变的氨基酸残基片段(stretch)(“互补决定区”或“CDR”)的和/或形成结构限定的环(“高变环”)，和/或含有接触抗原的残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含六个HVR；VH中有三个(H1、H2、H3)，VL中有三个(L1、L2、L3)。

HVR包括

(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)中存在的高变环(Chothia,C.and Lesk,A.M.,

J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；

(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)中存在的CDR(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)。

(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)中存在的抗原接触(MacCallum等人J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和

(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。

除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等人，同上编号。

“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如牛、羊、猫、狗和马)，灵长类动物(例如人和非人灵长类动物如猴)、兔子和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

“分离的”抗体是从其天然环境的组分中分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于评估抗体纯度方法的综述，参见例如Flatman,S.等人,J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。

“分离的”核酸是指从其天然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置。

“编码抗人CD19抗体的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括单个载体中或分开的载体中这样的核酸分子，并且这样的核酸分子存在于宿主细胞中的一个或多个位置。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群中获得的抗体，即除了可能的变体抗体，例如含有天然存在的突变或在生产单克隆抗体制剂期间出现的变体抗体(这样的变体通常以少量存在)之外，包含各抗体的群是相同的和/或结合相同的表位。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示从抗体基本上同质的群获得的抗体的特征，并不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的这样的方法和其他示例性方法。

“裸抗体”是指未缀合异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。

“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻链和两条相同的重链由二硫键键合组成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，其中第一和第二恒定结构域之间是铰链区。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体的轻链分配至称为κ(κ)和λ(λ)的两种类型之一。

术语“包装说明书”用于指通常包含在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的警告的信息。

关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并引入间隙(如果需要)以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。可以以本领域技术范围内的各种方式实现为了确定百分比氨基酸序列同一性的目的比对，例如，使用公众可用的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创作，并且源代码已经与用户文件在美国版权局(华盛顿特区，20559)提交，其以美国版权注册号TXU510087注册。ALIGN-2程序可以从Genentech,Inc.(加利福尼亚州南旧金山)获得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应该被编译用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有的序列比较参数都由ALIGN-2程序设置，并且不变。

在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A相对于、与或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以可替代地表述为给定氨基酸序列A具有或包含相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)计算如下：

100乘以X/Y的分数

其中X是在程序的A和B比对中通过序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，其中Y是B中氨基酸残基的总数。可以理解的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的％氨基酸序列同一性不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别说明，否则本文使用的所有％氨基酸序列同一性值使用ALIGN-2计算机程序如前面段落中所述获得。

术语“药物制剂”是指以使其中含有的活性成分的生物学活性有效的形式存在的制剂，并且其不含有对施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。

“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分之外的对个体无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文所用，术语“CD19”是指人B淋巴细胞抗原CD19(可选的名称是：分化抗原CD19、B淋巴细胞表面抗原B4、T细胞表面抗原Leu-12；UniProtKB P15391-1(同种型1；SEQID NO：33)和P15391-2(同种型2；SEQ ID NO：34))。该术语包括“全长”未加工的人CD19以及在细胞中加工产生的任何形式的人CD19，只要本文报道的抗体与其结合即可。

如本文所用，“治疗”(及其语法变体，如“治疗”或“治疗”)是指试图改变被治疗个体的自然病程的临床干预，其可以用于预防或在临床病理病程中进行。治疗期望的效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、减少疾病的任何直接或间接的病理结果、预防转移、降低疾病进展的速率、减弱或缓解疾病状态、缓解或改善预后。在一些实施方案中，本文报道的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindt,T.J.,等人KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用VH或VL结构域从结合抗原的抗体分离结合特定抗原的抗体以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628)。

如本文所用，术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合到其所引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导它们有效连接的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

II.组合物和方法

在一个方面，本发明部分基于以下发现：为了去除人源化抗人CD19抗体中的多个脱酰胺热点，单个突变就足够了。在某些实施方案中，提供了结合人CD19的抗体。如本文报道的抗体可用于例如诊断或治疗。

A.示例性抗人CD19抗体

已经发现野生型人源化抗人CD19抗体在HVR-L1:NSNGNT(SEQ ID NO:36)中具有三个脱酰胺热点。此外，已经发现在HVR-H2中存在另一个脱酰胺热点：KFNG(SEQ ID NO：37)。

在一个方面，本文提供了特异性结合人CD19的分离的人源化抗体，与其他人源化变体相比，其具有改善的稳定性，尤其是在重链和轻链HVR HVR-H2和HVR-L1中的脱酰胺稳定性。在这种改善的人源化抗人CD19抗体中，保留了亲本鼠抗体的人/食蟹猴交叉反应性。

为了解决HVR-H2中的脱酰胺热点，已经在位置64(根据Kabat编号)引入了N(Asn)至Q(Gln)的点突变。因此，本文报道的抗体具有包含氨基酸序列TEKFQG(SEQ ID NO：38)的HVR-H2。在一个优选的实施方案中，人源化抗人CD19抗体包含具有氨基酸序列YINPYNDGSKYTEKFQG(SEQ ID NO:11)的HVR-H2。

为了解决轻链中的脱酰胺热点并获得具有改善的脱酰胺稳定性的人源化抗人CD19抗体，在Kabat位置27d、27e、28和29中引入个别突变和在位置27e和28(根据Kabat编号)中引入双突变。已经产生了野生型人源化抗体(var.0；SEQ ID NO：59和69)的总共9个变体(var.1至var.9；SEQ ID NO：60至68和70)。

已经发现，根据Kabat的位置27e中从S(丝氨酸)到P(脯氨酸)单个突变可以解决HVR-L1中的所有脱酰胺热点。这不是易脱酰胺的N(天冬酰胺)残基的突变，而是邻近残基的突变。

因此，本文报道的抗体具有包含氨基酸序列LENPNGNT(SEQ ID NO：39)的HVR-L1。在一个实施方案中，人源化抗人CD19抗体包含具有氨基酸序列LENPSGNT(SEQ ID NO：40)的HVR-L1。在一个优选的实施方案中，人源化抗人CD19抗体包含具有氨基酸序列RSSQSLENPNGNTYLN(SEQ ID NO:20)的HVR-L1。在一个优选的实施方案中，人源化抗人CD19抗体包含具有氨基酸序列RSSQSLENPS GNTYLN(SEQ ID NO:28)的HVR-L1。

另外，这些抗体保留与食蟹猴CD19的交叉反应性，如下表所示。

EC50[μg/ml]	var.0	var.5	var.9
				huCD19ECD	0.087	0.084	0.089
cyCD19ECD	0.313	0.255	0.435

因此，在一个实施方案中，抗人CD19抗体特异性结合人CD19和食蟹猴CD19。

纯化后野生型人源化抗人CD19抗体(var.0)显示7.5％脱酰胺。在pH7.4下储存两周后，脱酰胺抗体的量增加到约18.5％。具有S27eP突变的变体抗体(var.5)纯化后显示约2％脱酰胺和2％琥珀酰亚胺形成。在pH 7.4下储存两周只存在约7.5％脱酰胺抗体。

在一个方面，本文提供了特异性结合人CD19和食蟹猴CD19的分离的人源化抗体，其包含SEQ ID NO：11的HVR-H2和SEQ ID NO：20或28的HVR-L1。

在一个方面，本文提供了包含至少1、2、3、4、5或6个HVR的抗人CD19抗体，所述HVR选自(a)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个方面，本文提供了包含至少1、2、3、4、5或6个HVR的抗人CD19抗体，所述HVR选自(a)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个方面，本文提供了包含至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列的抗人CD19抗体，所述VH HVR序列选自：(a)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。在进一步的实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H2。在进一步的实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQID NO：11的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3。

另一方面，本文提供了包含至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列的抗体，所述VL HVR序列选自(a)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-L1，(b)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-L1，(b)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。

另一方面，本文提供了包含至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列的抗体，所述VL HVR序列选自(a)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L1，(b)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L1，(b)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。

另一方面，本文报道的抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列的VH结构域，所述VH HVR序列选自：(i)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3，和(b)包含至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列的VL结构域，所述VL HVR序列选自(i)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。

另一方面，本文报道的抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列的VH结构域，所述VH HVR序列选自：(i)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3，和(b)包含至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列的VL结构域，所述VL HVR序列选自：(i)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。

另一方面，本文提供了一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含选自SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。

另一方面，本文提供了一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含选自SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。

如本文报道的抗人CD19抗体是人源化抗体。在一个实施方案中，人源化抗人CD19抗体包含任何上述实施方案中的HVR，并且还包含受体人框架，例如人免疫球蛋白(种系)框架或人共有框架。

另一方面，抗人CD19抗体包含与SEQ ID NO：09的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VH序列相对于参照序列包含取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗人CD19抗体保留结合人CD19的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：09中总共1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR以外的区中(即FR中)。任选地，抗人CD19抗体包含SEQ ID NO：09中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个具体的实施方案中，VH包含一个、两个或三个HVR，所述HVR选自：(a)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3。

另一方面，提供了抗人CD19抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：27的氨基酸序列(SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：27在单个氨基酸位置中不同)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗人CD19抗体保留结合人CD19的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：27中总共1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR以外的区中(即FR中)。任选地，抗人CD19抗体包含SEQ ID NO：19中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。任选地，抗人CD19抗体包含SEQ ID NO：27中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个具体的实施方案中，VL包含一个、两个或三个HVR，所述HVR选自：(a)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-L1，(b)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。在一个具体的实施方案中，VL包含一个、两个或三个HVR，所述HVR选自：(a)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L1，(b)包含SEQID NO：07的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。

另一方面，提供抗人CD19抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任何实施方案中的VH，和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ IDNO：09和SEQ ID NO：19或27中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。

在另一方面，本文提供了与本文报道的抗人CD19抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供了与包含SEQ ID NO：09的VH序列和SEQ ID NO：19的VL序列的抗人CD19抗体结合相同表位的抗体。

在一个实施方案中，根据任何上述实施方案的抗人CD19抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，抗人CD19抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双体或F(ab')₂片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整的IgG1或IgG4抗体或本文定义的其他抗体类别或同种型。

在所有方面的一个实施方案中，抗体包含(所有位置根据Kabat的EU索引)

i)人IgG1亚类的同二聚体Fc区，任选地具有突变P329G、L234A和L235A，或

ii)人IgG4亚类的同二聚体Fc区，任选具有突变P329G、S228P和L235E，或

iii)人IgG1亚类的同二聚体Fc区，具有突变(P329G、L234A、L235A)I253A、H310A和H435A,或具有突变(P329G、L234A、L235A)H310A、H433A和Y436A，或

iv)其异二聚体Fc区域

a)一个Fc区多肽包含突变T366W，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或

b)一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或

c)一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，

或

v)人IgG1亚类的异二聚体Fc区，其中两个Fc区多肽均包含突变P329G、L234A和L235A，和

a)一个Fc区多肽包含突变T366W，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或

b)一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或

c)一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，

或

vi)人IgG4亚类的异二聚体Fc区，其中两个Fc区多肽均包含突变P329G、S228P和L235E，和

a)一个Fc区多肽包含突变T366W，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或

b)一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或

c)一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，

或

vii)iii)之一与vi)、v)和vi)中之一的组合。

本文报道的一个方面是二价双特异性抗体，其包含

a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和

b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此置换，

其中第一抗原或第二抗原是人CD19。

a)中的抗体不包含如b)中所报道的修饰，并且a)中的重链和轻链是分离的链。

在b)的抗体中

在轻链内

可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH置换，

和

在重链内

可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL置换。

在一个实施方案中

i)在a)的第一轻链的恒定结构域CL中，位置124中的氨基酸(根据Kabat编号)被带正电的氨基酸取代，其中在a)的第一重链的恒定结构域CH1中，位置147中的氨基酸或位置213中的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)被带负电的氨基酸取代，

或

ii)在b)的第二轻链的恒定结构域CL中，位置124中的氨基酸(根据Kabat编号)被带正电的氨基酸取代，其中在b)的第二重链的恒定域CH1中位置147中的氨基酸或位置213中的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)被带负电的氨基酸取代。

在一个优选的实施方案中

i)在a)的第一轻链的恒定结构域CL中，位置124中的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)(在一个优选实施方案中独立地被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代)，并且其中在a)的第一重链的恒定结构域CH1中，位置147中的氨基酸或位置213中的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)，

或

ii)在b)的第二轻链的恒定结构域CL中，位置124中的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)(在一个优选的实施方案中独立地被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代)，并且其中在b)的第二重链的恒定结构域CH1中，位置147中的氨基酸或位置213中的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。

在一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123中的氨基酸被K取代(根据Kabat EU索引编号)。

在一个实施方案中，在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213中的氨基酸被E取代(根据Kabat的EU索引编号)。

在一个优选实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123中的氨基酸分别被R和K取代，以及在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213中的氨基酸被E取代(根据Kabat EU索引编号)。

在一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中位置124和123中的氨基酸被K取代，其中在第二轻链的恒定结构域CH1中位置147和213中的氨基酸被E取代，在第一轻链的可变结构域VL中位置38中的氨基酸被K取代，在第一重链的可变结构域VH中位置39中的氨基酸被E取代，在第二重链的可变结构域VL中位置38中的氨基酸被K取代，和在第二轻链的可变结构域VH中位置39中的氨基酸被E取代(根据Kabat EU索引编号)。

本文报道的一个方面是二价、双特异性抗体，其包含

a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和

b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此置换，和其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此置换，

其中第一抗原或第二抗原是人CD19。

a)中的抗体不包含如b)中报道的修饰，并且a)中的重链和轻链是分离的链。

在b)中的抗体中，

在轻链内

可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH置换，恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1置换；

和

在重链内

可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL置换，恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL置换。

本文报道的一个方面是二价、双特异性抗体，其包含

a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和

b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此置换，

其中第一抗原或第二抗原是人CD19。

a)中的抗体不包含如b)中所报道的修饰，并且a)中的重链和轻链是分离的链。

在b)的抗体中，

在轻链内

恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1置换；

在重链内

恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL置换。

本文报道的一个方面是多特异性抗体，其包含

a)特异性结合第一抗原的全长抗体，其由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，和

b)特异性结合一至四种其他抗原(即第二和/或第三和/或第四和/或第五抗原，优选特异性结合一种其他抗原，即第二抗原)的一个、两个、三个或四个单链Fab片段，

其中b)中的所述单链Fab片段通过所述全长抗体的重链或轻链的C-或N-末端的肽接头融合至a)中的所述全长抗体，

其中第一抗原或其他抗原之一是人CD19。

在一个实施方案中，结合第二抗原的一个或两个相同的单链Fab片段通过所述全长抗体的重链或轻链的C-末端的肽接头融合至全长抗体。

在一个实施方案中，结合第二抗原的一个或两个相同的单链Fab片段通过所述全长抗体的重链的C-末端的肽接头融合至全长抗体。

在一个实施方案中，结合第二抗原的一个或两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的轻链的C-末端的肽接头融合至全长抗体。

在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每条重链或轻链的C-末端的肽接头融合至全长抗体。

在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过所述全长抗体的每条重链的C-末端的肽接头融合至全长抗体。

在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过所述全长抗体的每条轻链的C-末端的肽接头融合至全长抗体。

本文报道的一个方面是三价、双特异性抗体，其包含

a)特异性结合第一抗原的全长抗体，其由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，

b)第一多肽，其由以下组成：

ba)抗体重链可变结构域(VH)，

或

bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，

其中所述第一多肽通过肽接头将其VH结构域的N-末端与所述全长抗体的两条重链之一的C-末端融合，

c)第二多肽，其由以下组成：

ca)抗体轻链可变结构域(VL)，

或

cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)，

其中所述第二多肽通过肽接头将VL结构域的N-末端与所述全长抗体的两条重链中另一条的C-末端融合，

和

其中第一多肽的抗体重链可变结构域(VH)和第二多肽的抗体轻链可变结构域(VL)一起形成特异性结合第二抗原的抗原结合位点，

和

其中第一抗原或第二抗原是人CD19。

在一个实施方案中，b)中的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和c)中的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过链间二硫键桥连接并稳定，其中二硫键引入以下位置之间：

i)重链可变结构域位置44至轻链可变结构域位置100，或

ii)重链可变结构域位置105至轻链可变结构域位置43，或

iii)重链可变结构域位置101至轻链可变结构域位置100(总是根据Kabat EU索引编号)。

引入用于稳定的非天然二硫键桥的技术描述在，例如，WO 94/029350,Rajagopal,V.,等人,Prot.Eng.(1997)1453-59；Kobayashi,H.,等人,Nuclear Medicine&Biology,Vol.25,(1998)387-393；或Schmidt,M.,等人,Oncogene(1999)18 1711-1721。在一个实施方案中，b)和c)中多肽的可变结构域之间的任选二硫键位于重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，b)和c)中多肽的可变结构域之间的任选二硫键位于重链可变结构域位置105和轻链可变结构域位置43之间(总是根据Kabat编号)。在一个实施方案中，优选在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间没有所述任选二硫键稳定的三价、双特异性抗体。

如本文报道的一个方面是三特异性或四特异性抗体，其包含

a)特异性结合第一抗原的全长抗体的第一轻链和第一重链，和

b)特异性结合第二抗原的全长抗体的第二(修饰的)轻链和第二(修饰的)重链，其中可变结构域VL和VH彼此置换，和/或其中恒定结构域CL和CH1彼此置换，和

c)其中特异性结合一种或两种其他抗原(即第三和/或第四抗原)的一个至四个抗原结合肽通过肽接头融合至a)和/或b)的轻链或重链的C-或N-末端，

其中第一抗原或第二抗原或其他抗原之一是人CD19。

a)中的抗体不包含如b)中报道的修饰，并且a)中的重链和轻链是分离的链。

在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)中包含特异性结合一种或两种其他抗原的一个或两个抗原结合肽。

在一个实施方案中，抗原结合肽选自scFv片段和scFab片段。

在一个实施方案中，抗原结合肽是scFv片段。

在一个实施方案中，抗原结合肽是scFab片段。

在一个实施方案中，抗原结合肽融合至a)和/或b)的重链的C-末端。

在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)中包含特异性结合一种其他抗原的一个或两个抗原结合肽。

在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)中包含特异性结合第三抗原的两个相同的抗原结合肽。在一个优选的实施方案中，这两个相同的抗原结合肽都通过相同的肽接头融合至a)和b)的重链的C-末端。在一个优选实施方案中，两个相同的抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。

在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)中包含特异性结合第三和第四抗原的两个抗原结合肽。在一个实施方案中，所述两个抗原结合肽都通过相同的肽连接物融合至a)和b)的重链的C-末端。在一个优选实施方案中，所述两个抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。

如本文报道的一个方面是双特异性、四价抗体，其包含

a)特异性结合第一抗原的抗体的两条轻链和两条重链(包含两个Fab片段)，

b)特异性结合第二抗原的抗体的另外两个Fab片段，其中所述另外的Fab片段都通过肽接头融合至a)的重链的C-或N-末端，

和

其中在Fab片段中进行以下修饰

i)在a)的两个Fab片段中或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此置换，和/或恒定结构域CL和CH1彼此置换，

或

ii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此置换，以及恒定结构域CL和CH1彼此置换，

和

在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此置换，或者恒定结构域CL和CH1彼此置换，

或

iii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此置换，或恒定结构域CL和CH1彼此置换，

和

在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此置换，和恒定结构域CL和CH1彼此置换，

或

iv)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此置换，和在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此置换，

或

v)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此置换，和在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此置换，

其中第一抗原或第二抗原是人CD19。

在一个实施方案中，所述另外的Fab片段都通过肽接头融合至a)的重链的C-末端或a)的重链的N-末端。

在一个实施方案中，所述另外的Fab片段都通过肽接头融合至a)的重链的C-末端任一。

在一个实施方案中，所述另外的Fab片段都通过肽连接物融合至a)的重链的N-末端。

在一个实施方案中，在Fab片段中进行以下修饰：

i)在a)的两个Fab片段中或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此置换，

和/或

恒定结构域CL和CH1彼此置换。

在一个实施方案中，在Fab片段中进行以下修饰：

i)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此置换，

和/或

恒定结构域CL和CH1彼此置换。

在一个实施方案中，在Fab片段中进行以下修饰：

i)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此置换。

在一个实施方案中，在Fab片段中进行以下修饰：

i)在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此置换，

和/或

恒定结构域CL和CH1彼此置换。

在一个实施方案中，在Fab片段中进行以下修饰：

i)在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此置换。

如本文报道的一个方面是双特异性、四价抗体，其包含：

a)特异性结合第一抗原的第一抗体的(修饰的)重链，其包含第一VH-CH1结构域对，其中所述第一抗体的第二VH-CH1结构域对的N-末端通过肽接头融合至所述重链的C-末端，

b)a)的所述第一抗体的两条轻链，

c)特异性结合第二抗原的第二抗体的(修饰的)重链，其包含第一VH-CL结构域对，其中所述第二抗体的第二VH-CL结构域对的N-末端通过肽接头融合至所述重链的C-末端，和

d)c)的所述第二抗体的两条(修饰的)轻链，每条包含CL-CH1结构域对，

其中第一抗原或第二抗原是人CD19。

如本文报道的一个方面是双特异性抗体，其包含

a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链，和

b)特异性结合第二抗原的第二全长抗体的重链和轻链，其中重链的N-末端通过肽接头连接至轻链的C-末端，

其中第一抗原或第二抗原是人CD19。

a)中的抗体不包含如b)中所报道的修饰，并且重链和轻链是分离的链。

如本文报道的一个方面是双特异性抗体，其包含

a)特异性结合第一抗原的全长抗体，其由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，和

b)特异性结合第二抗原的Fv片段，其包含VH²结构域和VL²结构域，其中两个结构域通过二硫键桥彼此连接，

其中仅VH²结构域或VL²结构域二者之一通过肽接头融合至特异性结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链，

其中第一抗原或第二抗原是人CD19。

在双特异性抗体中，a)中的重链和轻链是分离的链。

在一个实施方案中，VH²结构域或VL²结构域中的另一个不通过肽接头融合至特异性结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链。

在本文报道的所有方面，第一轻链包含VL结构域和CL结构域，第一重链包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。

如本文报道的一个方面是双特异性三价抗体，其包含

a)特异性结合第一抗原的两个Fab片段，

b)特异性结合第二抗原的一个CrossFab片段，其中CH1和CL结构域彼此交换，

c)一个Fc区，其包含第一Fc区重链和第二Fc区重链，

其中两个Fab片段的CH1结构域的C-末端连接至重链Fc区多肽的N-末端，和

其中CrossFab片段的CL结构域的C-末端连接至Fab片段之一的VH结构域的N-末端，和

其中第一抗原或第二抗原是人CD19。

如本文报道的一个方面是双特异性三价抗体，其包含

a)各自特异性结合第一抗原的第一和第二Fab片段，

b)特异性结合第二抗原的一个CrossFab片段，其中CH1和CL结构域彼此交换，

c)包含第一Fc区重链和第二Fc区重链的一个Fc区，

其中第一Fab片段的CH1结构域的C-末端连接至重链Fc区多肽之一的N-末端，CrossFab片段的CL结构域的C-末端连接至另一条重链Fc区多肽的N-末端，和

其中第二Fab片段的CH1结构域的C-末端连接至第一Fab片段的VH结构域的N-末端或CrossFab片段的VH结构域的N-末端，和

其中第一抗原或第二抗原是人CD19。

如本文报道的一个方面是双特异性三价抗体，其包含

a)各自特异性结合第一抗原的第一和第二Fab片段，

b)特异性结合第二抗原的一个CrossFab片段，其中VH和VL结构域彼此交换，

c)包含第一Fc区重链和第二Fc区重链的一个Fc区，

其中第一Fab片段的CH1结构域的C-末端连接至重链Fc区多肽之一的N-末端，CrossFab片段的CH1结构域的C-末端连接至另一条重链Fc区多肽的N-末端，和

其中第二Fab片段的CH1结构域的C-末端连接至第一Fab片段的VH结构域的N-末端或CrossFab片段的VL结构域的N-末端，和

其中第一抗原或第二抗原是人CD19。

如本文报道的一个方面是双特异性抗体，其包含

a)特异性结合第一抗原的全长抗体，其由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，和

b)特异性结合第二抗原的Fab片段，其包含包含VH²结构域和VL²结构域的重链片段和轻链片段，其中

在轻链片段内

可变轻链结构域VL²被所述抗体的可变重链结构域VH²置换，

和

在重链片段内

可变重链结构域VH²被所述抗体的可变轻链结构域VL²置换

其中重链Fab片段插入全长抗体重链之一的CH1结构域和全长抗体相应的Fc区之间，轻链Fab片段的N-末端缀合至已与全长抗体重链配对的全长抗体轻链的C-末端，在所述全长抗体重链中已经插入重链Fab片段，和

其中第一抗原或第二抗原是人CD19。

如本文报道的一个方面是双特异性抗体，其包含

a)特异性结合第一抗原的全长抗体，其由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，和

b)特异性结合第二抗原的Fab片段，其包含包含VH²结构域和VL²结构域的重链片段和轻链片段，其中

在轻链片段内

可变轻链结构域VL²被所述抗体的可变重链结构域VH²置换，

和

在重链片段内

可变重链结构域VH²被所述抗体的可变轻链结构域VL²置换，

其中Fab片段的重链片段的C-末端缀合至全长抗体重链之一的N-末端，Fab片段的轻链片段的C-末端缀合至与全长抗体重链配对的全长抗体轻链的N-末端，所述全长抗体重链与Fab片段的重链片段缀合，和

其中第一抗原或第二抗原是人CD19。

在所有方面的一个实施方案中，本文报道的抗体是多特异性抗体，其需要至少两个重链多肽的异二聚化，其中该抗体特异性结合人转铁蛋白受体和第二非人转铁蛋白受体抗原。

为了支持异二聚化，已经描述了CH3修饰的几种方法，例如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中，其通过引用包含在本文中。典型地，在本领域已知的方法中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域以互补方式都被工程化，使得包含一个工程化的CH3结构域的重链不能再与另一相同结构的重链同二聚化(例如，CH3工程化的第一重链不能再与另一CH3工程化的第一重链同二聚化；CH3工程化的第二重链不能再与另一CH3工程化的第二重链同二聚化)。因此，包含一个工程化的CH3结构域的重链被迫与包含CH3结构域(其以互补方式被工程化)的另一条重链异二聚化。对于该实施方案，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域通过氨基酸取代以互补方式工程化，使得第一重链和第二重链被迫异二聚化，而第一重链和第二重链不能再同二聚化(例如由于空间原因)。

上文引用和包括的本领域已知的支持重链异二聚化的不同方法被考虑为用于提供本文报道的多特异性抗体的不同替代方案，该多特异性抗体包含特异性结合第一抗原的源自第一抗体的“非交叉Fab区”，以及特异性结合第二抗原的源自第二抗体的“交叉Fab区”，组合上述特定氨基酸取代。

可以通过“杵入臼(knob-into-holes)”技术改变如本文报道的多特异性抗体的CH3结构域,所述技术在例如WO 96/027011,Ridgway,J.B.,等人,Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant,A.M.,等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中通过数个实施例详细描述。在该方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链中的)两个CH3结构域的每一个都可以是“杵”，而另一个是“臼”。二硫键桥的引入进一步稳定异二聚体(Merchant,A.M.,等人,Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.,等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并增加产率。

在一个优选的实施方案中，如本文报道的多特异性抗体包含“杵链”的CH3结构域中的T366W突变和“臼链”的CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变(根据Kabat EU索引编号)。也可以使用CH3结构域之间另外的链间二硫键桥(Merchant,A.M.,等人,NatureBiotech.16(1998)677-681)，例如通过将Y349C突变引入“杵链”的CH3结构域中并将E356C突变或S354C突变引入“臼链”的CH3结构域中。因此，在另一个优选的实施方案中，如本文报道的多特异性抗体包含在两个CH3结构域之一中的Y349C和T366W突变和在两个CH3结构域的另一个中的E356C、T366S、L368A和Y407V突变，或者如本文报道的多特异性抗体包含在两个CH3结构域之一中的Y349C和T366W突变和在两个CH3结构域的另一个中的S354C、T366S、L368A和Y407V突变(一个CH3结构域中额外的Y349C突变和另一个CH3结构域中额外的E356C或S354C突变，形成链间二硫键桥)(根据Kabat EU索引编号)。

但是也可以替代地或附加地使用由EP1870459A1所描述的其他杵入臼技术。在一个实施方案中，如本文报道的多特异性抗体包含“杵链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变和“臼链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引编号)。

在一个实施方案中，如本文报道的多特异性抗体包含“杵链”的CH3结构域中的T366W突变和“臼链”的CH3结构域中的T366S、L368A和Y407V突变，和另外地包含“杵链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变和“臼链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引编号)。

在一个实施方案中，如本文报道的多特异性抗体包含两个CH3结构域之一中的Y349C和T366W突变和两个CH3结构域的另一个中的S354C、T366S、L368A和Y407V突变，或者本文报道的多特异性抗体包含两个CH3结构域之一中的Y349C和T366W突变和两个CH3结构域的另一个中的S354C、T366S、L368A和Y407V突变，以及另外的“杵链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变和“臼链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引编号)。

除了“杵入臼(knob-into-hole)技术”之外，用于修饰多特异性抗体重链的CH3结构域以增强异二聚化的其他技术是本领域已知的。这些技术，特别是在WO 96/27011、WO98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的那些技术在本文中被认为是与本文所报道的多特异性抗体组合的“杵入臼技术”的替代物。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，EP 1870459中描述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。该方法基于在第一和第二重链两者之间的CH3/CH3-结构域-界面的特定氨基酸位置中引入带有相反电荷的带电氨基酸。

因此，该实施方案涉及如本文报道的多特异性抗体，其中在抗体的三级结构中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域形成位于各抗体CH3结构域之间的界面，其中第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域的各氨基酸序列各自包含一组位于抗体三级结构中的所述界面内的氨基酸，其中从位于一条重链CH3结构域界面的一组氨基酸中，第一氨基酸被带正电的氨基酸取代，并且从位于另一条重链的CH3结构域界面中的一组氨基酸中，第二氨基酸被带负电的氨基酸取代。根据本实施方案的多特异性抗体在本文中也称为“CH3(+/-)-工程化的多特异性抗体”(其中缩写“+/-”代表在各CH3结构域中引入的带相反电荷的氨基酸)。

在本文报道的所述CH3(+/-)-工程化的多特异性抗体的一个实施方案中，带正电的氨基酸选自K、R和H，带负电的氨基酸选自E或D。

在本文报道的所述CH3(+/-)-工程化的多特异性抗体的一个实施方案中，带正电的氨基酸选自K和R，带负电的氨基酸选自E或D。

在本文报道的所述CH3(+/-)工程化的多特异性抗体的一个实施方案中，带正电的氨基酸是K，带负电的氨基酸是E。

在本文报道的所述CH3(+/-)工程化的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置409中的氨基酸R被D取代和位置中的氨基酸K被E取代，在另一条重链的CH3结构域中，位置399中的氨基酸D被K取代和位置357中的氨基酸E被K取代(根据Kabat EU索引编号)。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，WO 2013/157953中描述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366中的氨基酸T被K取代，在另一条重链的CH3结构域中，位置351中的氨基酸L被D取代(根据Kabat EU索引编号)。在本文报道的所述多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366中的氨基酸T被K取代，位置351中的氨基酸L被K取代，和在另一条重链的CH3结构域中，位置351中的氨基酸L被D取代(根据Kabat EU索引编号)。

在本文报道的所述多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366中的氨基酸T被K取代，位置351中的氨基酸L被K取代，和在另一条重链的CH3结构域中，位置351中的氨基酸L被D取代(根据Kabat EU索引编号)。此外，以下取代中的至少一个包含在另一条重链的CH3结构域中：位置349中的氨基酸Y被E取代，位置349中的氨基酸Y被D取代，和位置368中的氨基酸L被E取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施方案中，位置368中的氨基酸L被E取代(根据Kabat EU索引编号)。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，WO2012/058768中描述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置351中的氨基酸L被Y取代，位置407中的氨基酸Y被A取代，和在另一条重链的CH3结构域中，位置366中的氨基酸T被A取代，位置409中的氨基酸K被F取代(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施方案中，除了上述取代之外，在另一条重链的CH3结构域中，位置411(最初为T)、399(最初为D)、400(最初为S)、405(最初为F)、390(最初为N)和392(最初为K)的氨基酸中的至少一个被取代(根据Kabat EU索引编号)。优选的取代是：

-用选自N、R、Q、K、D、E和W的氨基酸取代位置411中的氨基酸T(根据Kabat EU索引编号)，

-用选自R、W、Y和K的氨基酸取代位置399中的氨基酸D(根据Kabat EU索引编号)，

-用选自E、D、R和K的氨基酸取代位置400中的氨基酸S(根据Kabat EU索引编号)，

-用选自I、M、T、S、V和W的氨基酸取代位置405中的氨基酸F(根据Kabat EU索引编号)；

-用选自R、K和D的氨基酸取代位置390中的氨基酸N(根据Kabat EU索引编号)；和

-用选自V、M、R、L、F和E的氨基酸取代位置392中的氨基酸K(根据Kabat EU索引编号)。

在本文报道的所述多特异性抗体的另一个实施方案中(根据WO2012/058768工程化)，在一条重链的CH3结构域中，位置351中的氨基酸L被Y取代，位置407中的氨基酸Y被A，和在另一条重链的CH3结构域中，位置366中的氨基酸T被V取代，位置409中的氨基酸K被F取代(根据Kabat EU索引编号)。在本文报道的所述多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置407中的氨基酸Y被A取代，和在另一条重链的CH3结构域中，位置366中的氨基酸T被A取代，位置409中的氨基酸K被F取代(根据Kabat EU索引编号)。在所述最后的上述实施方案中，在所述另一条重链的CH3结构域中，位置392中的氨基酸K被E取代，位置411中的氨基酸T被E取代，位置399中的氨基酸D被R取代，位置400中的氨基酸S被R取代(根据Kabat EU索引编号)。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，WO2011/143545中描述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，两条重链的CH3结构域中的氨基酸修饰在位置368和/或409中引入(根据Kabat EU索引编号)。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，WO2011/090762中描述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。WO2011/090762涉及根据“杵入臼”技术的氨基酸修饰。在本文报道的所述CH 3(KiH)-工程化的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366中的氨基酸T被W取代，和在另一条重链的CH3结构域中，位置407中的氨基酸Y被A取代(根据Kabat EU索引编号)。在本文报道的所述CH3(KiH)-工程化的多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366中的氨基酸T被Y取代，和在另一条重链的CH3结构域中，位置407中的氨基酸Y被T取代(根据Kabat EU索引编号)。

在本文报道的是IgG2同种型的多特异性抗体的一个实施方案中，WO2011/090762中描述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，WO 2009/089004中描述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置392中的氨基酸K或N被带负电的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中，被E或D取代，在一个优选的实施方案中被D取代)，和在另一条重链的CH3结构域中，位置399中的氨基酸D、位置356中的氨基酸E或D或位置357中的氨基酸E被带正电的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代，在一个优选的实施方案中被K取代，在一个优选的实施方案中位置399或356中的氨基酸被K取代)(根据KabatEU索引编号)。在另一个实施方案中，除了上述取代之外，在一条重链的CH3结构域中，位置409中的氨基酸K或R被带负电的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E或D取代，在一个优选的实施方案中被D取代)(根据Kabat EU索引编号)。在一个更进一步的实施方案中，除了上述取代之外或作为其替代，在一条重链的CH3结构域中，位置439中的氨基酸K和/或位置370中的氨基酸K彼此独立地被带负电的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E或D取代，在一个优选的实施方案中被D取代)(根据Kabat EU索引编号)。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，WO 2007/147901中描述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置253中的氨基酸K被E取代，位置282中的氨基酸D被K取代，位置322中的氨基酸K取代被D取代，和在另一条重链的CH3结构域中，位置239中的氨基酸D被K取代，位置240中的氨基酸E被K取代，位置292中的氨基酸K被D取代(根据Kabat EU索引编号)。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，WO 2007/110205中描述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。

在本文报道的所有方面和实施方案的一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。在一个优选实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，抗体是二价或三价抗体。在一个实施方案中，抗体是二价抗体。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人亚类IgG1或具有突变L234A和L235A的人亚类IgG1。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人亚类IgG2。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人亚类IgG3。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人亚类IgG4或具有额外突变S228P的人亚类IgG4。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人亚类IgG1或人亚类IgG4。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)的人亚类IgG1。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)的人亚类IgG1。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变S228P和L235E(根据Kabat EU索引编号)的人亚类IgG4。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变S228P、L235E和P329G(根据Kabat EU索引编号)的人亚类IgG4。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，包含重链(所述重链包含如本文限定的CH3结构域)的抗体包含额外的C-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在本文报道的所有方面的一个实施方案中，包含重链(所述重链包含如本文限定的CH3结构域)的抗体包含额外的C-末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。

在一个实施方案中如本文报道的抗体的特征在于其是具有突变PVA236、L234A/L235A和/或GLPSS331(根据Kabat的EU索引编号)的人亚类IgG1，或亚类IgG4。在另一个实施方案中，抗体的特征在于是任何IgG类别，在一个实施方案中，抗体的特征在于是含有E233、L234、L235、G236、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331和/或P329(根据Kabat的EU索引编号)中至少一个突变的IgG1或IgG4。进一步在一个实施方案中，IgG4亚类的抗体含有突变S228P或突变S228P和L235E(Angal,S.,等人,Mol.Immunol.30(1993)105-108)(根据Kabat的EU索引编号)。

如本文报道的抗体重链的C-末端可以是以氨基酸残基PGK结尾的完整C-末端。重链的C-末端可以是缩短的C-末端，其中一个或两个C-末端氨基酸残基被去除。在一个优选的实施方案中，重链的C-末端是缩短的C-末端PG。

在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知且容易获得的一种或多种血脑屏障穿梭组件(shuttle module)。

血脑屏障穿梭组件的特征在于对血脑屏障受体具有结合特异性。这种结合特异性可以通过将血脑屏障穿梭组件与本文报道的抗人CD19抗体融合来获得，或者可以通过引入针对血脑屏障受体的结合特异性作为特异性结合人CD19的多特异性抗体的结合特异性之一来获得，因此包含本文报道的抗人CD19抗体的结合特异性和对血脑屏障受体的结合特异性。

一种或多种血脑屏障穿梭组件可融合至本文报道的抗人CD19抗体的轻链或重链的任何末端。在一个优选实施方案中，血脑屏障穿梭组件融合至重链的C-末端。

一个或多个血脑屏障穿梭组件可以直接或通过接头肽与各抗体链融合。在一个优选的实施方案中，接头肽具有氨基酸序列GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:41)。

血脑屏障穿梭组件可以是抗体scFv片段。在一个实施方案中，血脑屏障穿梭组件是scFv，其以N-至C-末端顺序包含轻链可变结构域-轻链恒定结构域-接头肽-重链可变结构域-重链恒定结构域1。

在一个优选实施方案中，血脑屏障穿梭组件是具有(G4S)₆接头肽的抗转铁蛋白受体-抗体8D3的scFv片段或其人源化变体。

术语其人源化变体表示通过在人框架上接枝鼠8D3抗体的CDR获得的分子，其中在每个框架区(FR)和/或高变区(HVR)中任选地引入彼此独立的一至三个突变。

在一个方面，本文提供了抗人CD19抗体融合多肽，其包含抗人CD19抗体、两个肽接头和两个结合血脑屏障受体的单价结合实体，其中接头将抗人CD19抗体与结合血脑屏障受体的单价结合实体偶联。

在一个方面，本文提供了抗人CD19抗体融合多肽，其包含抗人CD19抗体、肽接头和一个结合血脑屏障受体的单价结合实体，其中接头将抗人CD19抗体与结合血脑屏障受体的单价结合实体偶联。

在一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体选自蛋白质、多肽和肽。

在一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体包含选自血脑屏障受体配体、scFv、Fv、scFab、VHH(在一个优选实施方案中选自scFv或scFab)的分子。

在一个实施方案中，血脑屏障受体选自转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白8、低密度脂蛋白受体相关蛋白1和肝素结合表皮生长因子样生长因子。在一个优选实施方案中，血脑屏障受体是转铁蛋白受体。

在一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体包含针对转铁蛋白受体的一个scFab或一个scFv，更具体地，识别包含在SEQ ID NO：42、43和44的氨基酸序列中的转铁蛋白受体中表位的scFab或scFv。

在一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体通过接头偶联至抗人CD19抗体重链的C-末端。

在一个实施方案中，肽接头是长度为至少15个氨基酸、更优选长度为18至25个氨基酸的氨基酸序列。

在一个实施方案中，抗人CD19抗体是全长抗体，在一个优选实施方案中是全长IgG。术语全长抗体表示由两个抗体轻链多肽和两个抗体重链多肽组成的抗体，其中在两种抗体重链多肽中，可以存在或不存在C-末端赖氨酸残基(K)。

在一个优选的实施方案中，抗人CD19抗体融合多肽包含作为脑效应实体的全长IgG抗人CD19抗体、序列GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:41)的接头和作为单价结合实体(其结合作为血脑受体的人转铁蛋白受体)的一个scFab，其中scFab通过接头偶联至全长抗人CD19抗体重链之一的(Fc部分的)C-末端，并且其中scFab识别包含在SEQ ID NO：52、53和54的氨基酸序列中的人转铁蛋白受体中的表位。

在一个优选的实施方案中，抗人CD19抗体融合多肽包含作为脑效应实体的全长IgG抗人CD19抗体、序列GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:41)的接头和作为单价结合实体(其结合作为血脑受体的人转铁蛋白受体)的一个scFv，其中scFab通过接头偶联至全长抗人CD19抗体重链之一的(Fc部分的)C-末端，并且其中scFab识别包含在SEQ ID NO：42、43和44的氨基酸序列内的人转铁蛋白受体中的表位。

在一个实施方案中，抗人CD19抗体的第一重链包含第一二聚化组件，抗体的第二重链包含第二二聚化组件以允许两条重链的异二聚化。

在一个实施方案中，抗人CD19抗体的第一重链的第一二聚化组件是杵重链，抗人CD19抗体的第二重链的二聚化组件是臼重链(根据杵入臼策略)。

如本文报道的抗人CD19抗体融合多肽可用于跨血脑屏障转运抗人CD19抗体。

在一个实施方案中，抗人CD19抗体的重链(在其Fc区的C-末端与作为结合人转铁蛋白受体的单价结合实体的scFab偶联)在N-至C-末端方向上具有以下结构：

·IgG重链，

·将IgG重链Fc区的C-末端与scFab的VL结构域的N-末端偶联的肽接头，在一个优选的实施方案中，肽接头具有氨基酸序列GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：41)，

·scFab的可变轻链结构域(VL)和C-κ轻链结构域，

·将scFab的C-κ轻链结构域的C-末端与scFab的VH结构域的N-末端偶联的肽接头，在一个优选实施方案中，肽接头具有氨基酸序列(G₄S)₆GG(SEQ ID NO：45)，

·scFab抗体的可变重链结构域(VH)和IgG CH1重链结构域。

在一个实施方案中，抗人CD19抗体的重链(在其Fc区的C-末端与作为结合人转铁蛋白受体的单价结合实体的scFv偶联)在N-至C-末端方向上具有以下结构：

·IgG重链，

·将IgG重链Fc部分的C-末端与scFv抗体片段的VL结构域的N-末端偶联的肽接头，在一个优选的实施方案中，肽接头是具有氨基酸序列GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:41)的肽，

·可变轻链结构域(VL)，

·将可变轻链结构域的C-末端与scFv的VH结构域的N-末端偶联的肽接头，在一个优选实施方案中，肽接头具有氨基酸序列(G₄S)₆GG(SEQ ID NO：45)，

·scFv抗体片段的可变重链结构域(VH)。

在一个实施方案中，血脑屏障穿梭组件/针对血脑屏障受体的scFab或scFv源自人源化抗转铁蛋白受体抗体8D3(参见例如Boado,R.J.,等人,Biotechnol.Bioeng.102(2009)1251-1258)。鼠重链可变结构域具有氨基酸序列：

SEQ ID NO：46。

鼠轻链可变结构域(变体1)具有氨基酸序列：

SEQ ID NO：47，和

鼠轻链可变结构域(变体2)具有氨基酸序列：

SEQ ID NO：48。

在一个实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体或转铁蛋白受体结合特异性包含(a)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：53、54或55的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体包含至少一对SEQ ID NO：49的重链可变结构域和SEQ ID NO：50的轻链可变结构域，形成转铁蛋白受体的结合位点。

一个血脑屏障穿梭组件

在一个方面，抗人CD19抗体或抗人CD19抗体融合多肽恰好包含一个血脑屏障结合特异性或穿梭组件，因此其至少是双特异性的，其中血脑屏障结合特异性或穿梭组件包含抗人转铁蛋白受体抗体8D3的人源化可变结构域或SEQ ID NO：49的重链可变结构域和SEQID NO：50的轻链可变结构域的对，其中血脑屏障结合特异性或穿梭组件跨血脑屏障转运抗人CD19抗体。

一个或两个血脑屏障穿梭组件

一方面，抗人CD19抗体或抗人CD19抗体融合多肽包含一个或两个血脑屏障结合特异性或穿梭组件，因此其至少是双特异性的，其中血脑屏障穿梭结合位点或组件源自以低亲和力结合血脑屏障受体(BBB-R，BBB-R结合特异性)的抗体，由此源自以低亲和力结合血脑屏障受体的抗体的血脑屏障结合特异性或穿梭组件跨血脑屏障转运抗人CD19抗体。

在一个实施方案中，BBB-R选自转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体(IGF受体)、低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。在另一个这样的方面，BBB-R是人BBB-R。在一个这样的方面，BBB-R是TfR。在另一个这样的方面，BBB-R是TfR并且抗体不抑制TfR活性。在另一个这样的方面，BBB-R是TfR并且抗体不抑制TfR与转铁蛋白的结合。

在一个实施方案中，抗体不损害BBB-R与其一种或多种天然配体的结合。在一个这样的实施方案中，抗体以不抑制hTfR结合人转铁蛋白的方式特异性结合人转铁蛋白受体(hTfR)。

在一个实施方案中，BBB-R结合特异性对于BBB-R具有约1nM至约100μM的IC₅₀。在一个实施方案中，IC₅₀为约5nM至约100μM。在一个实施方案中，IC₅₀为约50nM至约100μM。在一个实施方案中，IC₅₀为约100nM至约100μM。在一个实施方案中，BBB-R结合特异性对于BBB-R具有约5nM至约10μM的亲和力。在一个实施方案中，当缀合至或包含于抗人CD19中时，BBB-R结合特异性对于BBB-R具有约30nM至约1μM的亲和力。在一个实施方案中，当缀合至或包含于抗人CD19中时，BBB-R结合特异性对于BBB-R具有约50nM至约1μM的亲和力。在一个实施方案中，使用scatchard分析来测量BBB-R结合特异性或抗人CD19抗体融合多肽对于BBB-R的亲和力。在一个实施方案中，使用BIACORE分析来测量BBB-R结合特异性或抗人CD19抗体融合多肽对于BBB-R的亲和力。在一个实施方案中，使用竞争性ELISA来测量BBB-R结合特异性或抗人CD19抗体融合多肽对于BBB-R的亲和力。

含有抗体融合多肽的血脑屏障穿梭物的用途

在另一个实施方案中，本文提供了增加CNS暴露于抗人CD19抗体的方法，其中所述抗人CD19抗体偶联至以低亲和力结合BBB-R的抗体或抗体片段，由此增加CNS暴露于抗人CD19抗体。术语“偶联”包括这样的情况，其中抗BBB-R抗体结合特异性作为第二结合特异性被引入至少双特异性抗人CD19/BBB-R抗体中。在一个实施方案中，相对于与对于BBB-R不具有降低的亲和力的典型抗体偶联的抗人CD19抗体的CNS暴露，测量CNS暴露于抗人CD19抗体的增加。在一个实施方案中，CNS暴露于抗人CD19抗体的增加测量为施用后CNS中发现的抗人CD19抗体的量相对于血清中发现的量的比率。在一个实施方案中，CNS暴露的增加导致比率大于0.1％。在一个实施方案中，相对于在不存在偶联的抗BBB-R抗体的情况下抗人CD19抗体的CNS暴露，测量CNS暴露于抗人CD19抗体的增加。在一个实施方案中，通过成像测量CNS暴露于抗人CD19抗体的增加。在一个实施方案中，通过间接读取测量CNS暴露于抗人CD19抗体的增加，如一种或多种生理症状的修改。

一种增加向受试者施用的抗人CD19抗体在CNS中的保留的方法，其中所述抗人CD19抗体偶联至以低亲和力结合BBB-R的抗体或抗体片段，从而增加抗人CD19抗体在CNS中的保留。

在另一个实施方案中，本文提供了优化抗人CD19抗体的药代动力学和/或药效学以在受试者的CNS中有效的方法，其中所述抗人CD19抗体偶联至以低亲和力结合BBB-R的抗体或抗体片段，其中选择抗体或抗体片段，使得其偶联至抗人CD19抗体后对于BBB-R的亲和力导致一定量的偶联抗体或抗体片段的抗人CD19抗体跨BBB转运，其优化了抗人CD19抗体在CNS中的药代动力学和/或药效学。

在另一个实施方案中，本文提供了治疗哺乳动物神经疾患的方法，该方法包括用抗体或抗体片段治疗哺乳动物，所述抗体或抗体片段结合BBB-R并偶联至抗人CD19抗体，其中选择对于BBB-R具有低亲和力抗体，从而改善抗体和偶联的抗人CD19抗体的CNS摄取。在一个实施方案中，治疗导致疾患症状的减轻或消除。另一方面，治疗导致神经疾患的减弱。

在所有前述方面的一个实施方案中，抗BBB-R抗体对于BBB-R具有约1nM至约100μM的IC₅₀。在另一个这样的实施方案中，IC₅₀为约5nM至约100μM。在另一个这样的实施方案中，IC₅₀为约50nM至约100μM。在另一个这样的实施方案中，IC₅₀为约100nM至约100μM。在另一个实施方案中，抗体对于BBB-R具有约5nM至约10μM的亲和力。在另一个实施方案中，当缀合至抗人CD19抗体时，抗体对于BBB-R具有约30nM至约1μM的亲和力。在另一个实施方案中，当缀合至抗人CD19抗体时，抗体对于BBB-R具有约50nM至约1μM的亲和力。在一个实施方案中，使用scatchard分析来测量抗BBB-R抗体或抗人CD19抗体融合多肽对于BBB-R的亲和力。在另一个实施方案中，使用BIACORE分析来测量抗BBB-R抗体或抗人CD19抗体融合多肽对于BBB-R的亲和力。在另一个实施方案中，使用竞争性ELISA来测量抗BBB-R抗体或抗人CD19抗体融合多肽对于BBB-R的亲和力。

在另一个实施方案中，抗人CD19抗体融合多肽是标记的。在另一个实施方案中，抗BBB-R抗体或片段不损害BBB-R与其一种或多种天然配体的结合。在另一个实施方案中，抗BBB-R抗体以不抑制hTfR与人转铁蛋白结合的方式特异性结合hTfR。在另一个实施方案中，将抗人CD19抗体融合多肽施用于哺乳动物。在另一个实施方案中，哺乳动物是人。在另一个实施方案中，哺乳动物患有神经疾患。在另一个实施方案中，神经疾患选自阿尔茨海默氏病(AD)、中风、痴呆、肌营养不良(MD)、多发性硬化症(MS)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、囊性纤维化、Angelman综合征、Liddle综合征、帕金森病、皮克氏病(Pick’s disease)、佩吉特氏病(Paget’s disease)、癌症和创伤性脑损伤。

非共价复合物作为血脑屏障穿梭物

非共价复合物的一部分是血脑屏障穿梭组件(BBB穿梭组件)，其是具有对半抗原的第一结合特异性和对血脑屏障受体(BBBR)的第二结合特异性的双特异性抗体。这样的BBB穿梭组件识别血脑屏障上的可胞转的细胞表面靶标(如TfR、LRP或其他靶标，BBB-R)并同时结合半抗原化的抗人CD19抗体。

更详细地说，特异性结合人CD19的抗体与半抗原缀合并通过血脑屏障穿梭物的半抗原结合位点复合。该复合物被限定并是稳定的并特异性地通过血脑屏障递送特异性结合人CD19的半抗原化抗体。由于特异性结合人CD19的半抗原化抗体通过血脑屏障穿梭物以非共价方式复合，所以特异性结合人CD19的半抗原化抗体一方面在循环中的期间与其递送载体(＝血脑屏障穿梭物＝双特异性抗体)结合，但另一方面也可以在胞转作用后被有效地释放。可以在不干扰特异性结合人CD19的抗体活性的情况下实现与半抗原的缀合。血脑屏障穿梭物不含有不寻常的共价添加物，因此消除了任何免疫原性的风险。特异性结合人CD19的半抗原化抗体与含有半抗原特异性结合位点的双特异性抗体的复合赋予特异性结合人CD19的抗体的良性生物物理学行为。此外，这样的复合物能够将负载物(load)靶向细胞或组织，所述组织或细胞显示被双特异性抗体的第二结合特异性识别的抗原。

尽管特异性结合人CD19的抗体被半抗原化并且被血脑屏障穿梭物(＝双特异性抗体)复合，但其仍保留其功能。此外，双特异性抗体的血脑屏障受体结合位点在特异性结合人CD19的复合半抗原化抗体存在下保留其结合特异性和亲和力。如本文报道的特异性结合人CD19的半抗原化抗体与双特异性抗体的复合可以用于将特异性结合人CD19的抗体特异性地靶向表达血脑屏障受体的细胞。由于特异性结合人CD19的半抗原化抗体以非共价方式偶联至双特异性抗体，所以在内化或胞转作用后特异性结合人CD19的抗体可被释放。

另一方面，根据以上实任一施方案的抗人CD19抗体可以单独或组合地包含以下1-5部分中所述的任何特征：

1.抗体亲和力

在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM或≤10nM(例如10^-8M或更小，例如10^-7M至10^-8M)的K_D值。

例如，可以使用表面等离子体共振测定法来测量K_D。使用-2000或-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)的测定法在25℃下用固定的抗原CM5芯片在约10个反应单位(RU)下进行。根据供应商的说明，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入以获得约10个反应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下以约25μl/分钟的流速将Fab的两倍系列稀释液(0.78nM至500nM)在含有0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST)中注入。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(评估软件版本3.2)计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(K_D)计算为比率k_off/k_on(参见例如Chen,Y.等人,J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、Fv和scFv片段，以及下文所述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，参见例如Plueckthun,A.,In；The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburgand Moore(eds.),Springer-Verlag,New York(1994),第269-315页；也参见WO 93/16185；US 5,571,894和US 5,587,458。关于包含挽救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')₂片段，参见US5,869,046。

双体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448。三体和四体也描述于Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(20039 129-134)中。

单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如US 6,248,516)。

如本文所述，抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)生产。

3.嵌合抗体和人源化抗体

本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如US4,816,567；和Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855)。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

人源化抗体是嵌合抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)源自非人抗体，FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro,J.C.and Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中,还进一步描述于例如,Riechmann,I.等人,Nature332(1988)323-329；Queen,C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US5,821,337,US 7,527,791,US 6,982,321和US 7,087,409；Kashmiri,S.V.等人,Methods36(2005)25-34(描述了特异性决定区(SDR)接枝)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述了“表面重修”)；Dall’Acqua,W.F.等人,Methods 36(2005)43-60(描述了“FR改组”)；和Osbourn,J.等人,Methods 36(2005)61-68和Klimka,A.等人,Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述FR改组的“指导选择”方法)。

可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims,M.J.等人,J.Immunol.151(1993)2296-2308)；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体共有序列的框架区(参见例如Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289；和Presta,L.G.等人,J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和源自筛选的FR文库的框架区(参见例如Baca,M.等人,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等人,J.Biol.Chem.271(1996922611-22618)。

4.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对人CD19，另一个针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合人CD19的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达人CD19的细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。

用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein,C.and Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540,WO 93/08829,和Traunecker,A.等人,EMBO J.10(1991)3655-3659)和“杵入臼”工程化(参见例如US 5,731,168)。还可以通过设计用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电转向效应来制备多特异性抗体(WO2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如US 4,676,980,和Brennan,M.等人,Science 229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber,M等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；和如例如Tutt,A.等人,J.Immunol.147(1991)60-69中所述制备三特异性抗体。

本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“Octopus抗体”(参见例如US 2006/0025576)。

本文中的抗体或片段还包括“双作用Fab”或“DAF”，其包含结合人CD19以及另一种不同抗原的抗原结合位点(参见例如US 2008/0069820)。

本文中的抗体或片段还包括描述于以下的多特异性抗体

WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2010/145793。

5.抗体变体

在某些实施方案中，考虑了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这样的修饰包括，例如，抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可以制备缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，只要最终构建体具有期望的特征，例如抗原结合。

a)取代、插入和缺失变体

在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的感兴趣位点包括HVR和FR。下表中“优选的取代”的标题下显示保守取代。在表1中“示例性取代”的标题下提供了更实质性的变化，如下文关于氨基酸侧链类别进一步描述的。可将氨基酸取代引入感兴趣的抗体中并针对期望的活性筛选产物，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。

氨基酸可根据常见的侧链性质分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代需要将这些类别之一的成员与另一类别交换。

一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将具有某些生物学特性的修饰(例如改善)(例如增加的亲和力、降低的免疫原性)，和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学性质。示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术产生，如本文所述的那些技术。简而言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定的生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。

可以在HVR中进行改变(例如取代)，例如以改善抗体亲和力。这样的改变可以在HVR“热点”中进行，即在体细胞成熟过程中以高频率进行突变的由密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)和/或与抗原接触的残基，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建和从次级文库再选择的亲和力成熟描述于例如Hoogenboom,H.R.等人in Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或者寡核苷酸定向诱变)中的任意将多样性引入选择用于成熟的可变基因。然后创建次级文库。然后筛选文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)被随机化。例如可以使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定参与抗原结合的HVR残基。特别是CDR-H3和CDR-L3经常被靶向。

在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以发生在一个或多个HVR内，只要这些改变基本上不会降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中制备基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，本文提供的保守取代)。例如，这样的改变可以在HVR中的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR或者没有改变、或者含有不超过1、2或3个的氨基酸取代。

鉴定可被靶向用于诱变的抗体的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham,B.C.and Wells,J.A.,Science 244(1989)1081-1085中所述。在该方法中，鉴定残基或靶残基组(例如，带电的残基如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对最初取代显示功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步的取代。可选地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。这样的接触残基和相邻残基可以作为取代的候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否包含期望的性质。

氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的N-或C-末端融合至酶(例如对于ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽。

b)糖基化变体

在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地完成向抗体添加或缺失糖基化位点。

当抗体包含Fc区时，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的双触角寡糖，其通常通过N键附着于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如Wright,A.and Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本文中报道的抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改善性质的抗体变体。

在一个实施方案中，提供具有缺乏(直接或间接)附着于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，这样的抗体中岩藻糖的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。例如，如WO2008/077546中所述，通过计算由MALDI-TOF质谱法测量的相对于附着于Asn297的所有糖结构的总和(例如复合物、杂合物和高甘露糖结构)的糖链内Asn297上的岩藻糖平均量，来确定岩藻糖的量。Asn297是指位于Fc区中约位置297的天冬酰胺残基(根据Kabat的Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中较小的序列变异，Asn297也可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即在位置294和300之间。这样的岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体相关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki,A.等人,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.等人,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；和WO 2004/056312,特别是在实施例11中)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO 2003/085107)。

还提供具有等分寡糖的抗体变体，例如其中附着至抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc等分。这样的抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这样的抗体变体的例子描述于例如WO 2003/011878；US 6,602,684和US 2005/0123546。还提供了在与Fc区附着的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可具有改善的CDC功能。这样的抗体变体描述于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964和WO 1999/22764。

c)Fc区域变体

在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置中包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方案中，本文提供了具有一些但不是全部效应功能的抗体变体，其使得该抗体变体对于某些应用(在该应用中抗体的体内半衰期很重要但某些效应功能(例如补体和ADCC)是不必要的或有害的)是期望的候选。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留了FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch,J.V.and Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的464页的表3中。用于评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例描述于US 5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。或者，可以使用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox 非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于此类测定法的有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选地或另外地，例如可以在动物模型中体内评估感兴趣分子的ADCC活性，如Clynes,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中所公开的。也可以进行C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro,H.等人,J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人,Blood 101(2003)1045-1052；和Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。也可使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等人,Int.Immunol.18(2006:1759-1769)。

具有降低的效应功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个取代的那些抗体(US 6,737,056)。这样的Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个中具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(US 7,332,581)。

描述了对FcR具有改善的或减少的结合的某些抗体变体。(参见例如US 6,737,056；WO 2004/056312,和Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334中的取代(残基的EU编号)。

在一些实施方案中，在Fc区中制备导致改变(即改善或减小)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的改变，例如描述于US 6,194,551、WO 99/51642和Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184。

在US 2005/0014934中描述了具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体，该新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,R.L.等人,J.Immunol.117(1976)587-593,和Kim,J.K.等人,J.Immunol.24(1994)2429-2434)。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，所述取代改善Fc区与FcRn的结合。这样的Fc变体包括在以下Fc区残基的一个或多个中具有取代的那些变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的取代(US7,371,826)。

关于Fc区变体的其他例子还参见Duncan,A.R.and Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821和WO 94/29351。

d)半胱氨酸工程化的抗体变体

在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在具体的实施方案中，取代的残基发生在抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，因此使反应性巯基位于抗体的可接近位点并可用于缀合抗体与其他部分(如药物部分或接头-药物部分)以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，任何一个或多个以下残基可被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。例如，可以如US7,521,541中所述产生半胱氨酸工程化的抗体。

e)抗体衍生物

在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知且容易获得的额外的非蛋白部分。适合衍生抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可能具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分枝或不分枝的。附着至抗体的聚合物的数量可以变化，如果附着多于一种聚合物，其可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物数量和/或类型可以基于以下考虑来确定，所述考虑包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将在限定的条件下用于治疗等。

在另一个实施方案中，提供了可通过暴露于辐射而选择性加热的抗体与非蛋白部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白部分是碳纳米管(Kam,N.W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以是任何波长，包括但不限于不伤害普通细胞但是将非蛋白部分加热至一定温度的波长，在该温度下接近抗体-非蛋白部分的细胞被杀死。

B.重组方法和组合物

可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如如US 4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗人CD19抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如已经转化有)：(1)载体，所述载体包含编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列的核酸，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗人CD19抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含编码如上提供的抗体的核酸的宿主细胞，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。

为了重组生产抗人CD19抗体，分离编码例如如上所述的抗体的核酸并将其插入到一个或多个载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规步骤(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序此类核酸。

用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应功能时。为了在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523(还参见Charlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ(2003),第245-254页，描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。表达后，可以从细菌细胞糊中以可溶性级分形式分离抗体并且可以进一步纯化。

除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母对于编码抗体的载体是合适的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215。

用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多可与昆虫细胞结合使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适合悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1细胞系；人胚肾细胞系(例如，如Graham,

F.L.等人,J.Gen Virol.36(1977)59-74描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(例如，如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，例如，如Mather,J.P.等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^-CHO细胞(Urlaub,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。关于某些适用于抗体产生的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.and Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2004),第255-268页。

C.测定法

可通过本领域已知的各种测定法鉴定、筛选本文提供的抗人CD19抗体或表征其物理/化学性质和/或生物学活性。

1.结合测定法和其他测定法

在一个方面，例如通过已知方法如ELISA、Western印迹等来测试本文报道的抗体的抗原结合活性。

2.活性分析

一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗人CD19抗体的测定法。生物学活性可以包括例如抑制B细胞增殖或杀伤B细胞。还提供了具有体内和/或体外这种生物学活性的抗体。

在某些实施方案中，测试本文报道的抗体的这种生物学活性。

D.免疫缀合物

本文还提供了免疫缀合物，其包含缀合至一种或多种细胞毒性剂(如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素)的本文报道的抗人CD19抗体。

在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至一种或多种药物，包括但不限于美登木素生物碱(参见US 5,208,020、US 5,416,064和EP 0 425235B1)；阿里他汀(auristatin)如单甲基阿里他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见US5,635,483、US 5,780,588和US 7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；刺孢霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见US 5,712,374、US 5,714,586、US 5,739,116、US 5,767,285、US 5,770,701、US 5,770,710、US 5,773,001和US 5,877,296；Hinman,L.M.等人,Cancer Res.53(1993)3336-3342；和Lode,H.N.等人,Cancer Res.58(1998)2925-2928)；蒽环霉素如道诺霉素或阿霉素(参见Kratz,F.等人,Curr.Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey,S.C.等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358-362；Torgov,M.Y.等人,Bioconjug.Chem.16(2005)717-721；Nagy,A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834；Dubowchik,G.M.等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12(2002)1529-1532；King,H.D.等人,J.Med.Chem.45(20029 4336-4343；和US 6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷，如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛、tesetaxel和奥他赛；单端孢霉烯；以及CC1065。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含缀合至酶促活性毒素或其片段的本文所述的抗体，所述酶促活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素、油桐蛋白(Aleurites fordii proteins)、石竹素蛋白、Phytolaca americana proteins(PAPI，PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂(momordicacharantia inhibitor)、麻疯树毒素(curcin)、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素、伊诺霉素和tricothecenes。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含缀合至放射性原子的如本文所述的抗体以形成放射缀合物。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，其可包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如TC^99m或I¹²³，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，再次如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以使用多种双功能蛋白偶联剂制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，所述双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基己二酰亚胺盐酸盐)、活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta,E.S.等人,Science 238(1987)1098-1104中所述制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞内细胞毒性药物释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari,R.V.等人,Cancer Res.52(1992)127-131；US 5,208,020)。

本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用交联剂试剂制备这样的缀合物，所述交联试剂包括但不限于可商业获得的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)(例如来自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.,

U.S.A)。

E.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文提供的任何抗人CD19抗体可用于检测生物样品中人CD19递呈细胞的存在。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织，如，例如，血液、血清或血浆。

在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法中的抗人CD19抗体。另一方面，提供了检测生物样品中人CD19递呈细胞的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括在允许抗人CD19抗体与人CD19结合的条件下使生物样品与本文所述的抗人CD19抗体接触，和检测抗人CD19抗体和人CD19之间是否形成复合物。这样的方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗人CD19抗体来选择适合用抗人CD19抗体治疗的受试者，例如，其中人CD19是用于选择患者的生物标志物。

可以使用本文报道的抗体诊断的示例性疾患包括B细胞癌症，如B细胞淋巴瘤和B细胞白血病(多发性骨髓瘤除外)，例如，非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴母细胞白血病。

在某些实施方案中，提供了标记的抗人CD19抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光、发色团、电子密度、化学发光和放射性标记)以及间接检测(例如通过酶促反应或分子相互作用)的部分如酶或配体。示例性标记包括但不限于放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮、荧光素酶(luceriferases)例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US4,737,456)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与利用过氧化氢的酶偶联以氧化染料前体，如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记、噬菌体标记、稳定自由基等。

F.药物制剂

通过将具有期望纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.(编辑)(1980))混合、以冻干制剂或水性溶液的形式制备本文报道的抗人CD19抗体的药物制剂。药学上可接受的载体通常在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚醇、丁醇或苯甲醇；烷基防腐剂(alkyl parabens)如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中示例性的药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(Baxter International,Inc.)。US 2005/0260186和US2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。

US 6,267,958中描述了示例性的冻干抗体制剂。水性抗体制剂包括在US 6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者的制剂包含组氨酸乙酸盐缓冲剂。

本文中的制剂还可以包含待治疗的具体适应症所需的多于一种的活性成分，优选具有互补活性而不会相互不利地影响的那些活性成分。这些活性成分适合以对预期目的有效的量组合存在。

活性成分可以包埋在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)和粗乳液(macroemulsion)中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.(编辑)(1980)。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质是成型制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。

用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过无菌滤膜过滤容易地完成无菌性。

G.治疗方法和组合物

本文提供的任何抗人CD19抗体可作为单特异性抗体或作为多特异性抗体单独或组合用于治疗方法中。

除干细胞和浆细胞外，CD19在大多数B细胞上表达(泛B细胞标记物)，并且经常在大多数人B细胞恶性肿瘤上表达(肿瘤相关抗原)，如淋巴瘤和白血病(多发性骨髓瘤除外)，例如在非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴母细胞白血病中表达。

识别不同细胞群上的两种细胞表面蛋白的双特异性抗体具有再定向细胞毒性免疫细胞以破坏致病靶细胞的前景。

一方面，提供了用作药物的抗人CD19抗体。在进一步的方面，提供了用于治疗B细胞癌症的抗人CD19抗体。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法中的抗人CD19抗体。在某些实施方案中，本文提供了用于治疗患有B细胞癌症的个体的方法中的抗人CD19抗体，所述方法包括向个体施用有效量的抗人CD19抗体。在一个这样的实施方案中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在进一步的实施方案中，本文提供了用于消除B细胞的抗人CD19抗体。在某些实施方案中，本文提供了用于消除个体中的B细胞的方法中的抗人CD19抗体，所述方法包括向个体施用有效的抗人CD19抗体以消除B细胞。根据任何上述实施方案的“个体”优选是人。在一个实施方案中，B细胞癌症是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。在一个实施方案中，B细胞癌症是非霍奇金淋巴瘤或急性淋巴母细胞白血病。

在进一步的方面，提供了用于癌症免疫治疗的抗人CD19抗体。在某些实施方案中，提供了用于癌症免疫治疗方法中的抗人CD19抗体。根据任何上述实施方案中的“个体”优选是人。

另一方面，本文提供了抗人CD19抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗B细胞癌症。在进一步的实施方案中，药物用于治疗B细胞癌症的方法中，包括向患有B细胞癌症的个体施用有效量的药物。在一个这样的实施方案中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。在另一个实施方案中，药物用于消除B细胞。在另一个实施方案中，药物用于消除个体中的B细胞的方法中，所述方法包括向个体施用有效量的药物以消除B细胞。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。在一个实施方案中，B细胞癌症是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。在一个实施方案中，B细胞癌症是非霍奇金淋巴瘤或急性淋巴母细胞白血病。

另一方面，本文提供了治疗B细胞癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有此类B细胞癌症的个体施用有效量的抗人CD19抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下所述。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。在一个实施方案中，B细胞癌症是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。在一个实施方案中，B细胞癌症是非霍奇金淋巴瘤或急性淋巴母细胞白血病。

另一方面，本文提供了用于消除个体中的B细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括向个体施用有效量的抗人CD19抗体以消除B细胞。在一个实施方案中，“个体”是人。在一个实施方案中，B细胞癌症是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。在一个实施方案中，B细胞癌症是非霍奇金淋巴瘤或急性淋巴母细胞白血病。

另一方面，本文提供了包含本文报道的任何抗人CD19抗体的药物制剂，例如用于任何上述治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文报道的任何抗人CD19抗体和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文报道的任何抗人CD19抗体和至少一种另外的治疗剂。

如本文报道的抗体可以单独或与其他试剂组合使用用于治疗。例如，本文报道的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。

上述组合治疗包括组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在相同或分开的制剂中)和分开施用，在分开施用的情况下，本文报道的抗体的施用可以在另外一种或多种治疗剂施用之前、同时和/或之后。在一个实施方案中，抗人CD19抗体的施用和另外的治疗剂的施用彼此发生在约一个月内，或发生在约一、二或三周内，或发生在约一、二、三、四、五或六天内。

如本文报道的抗体(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，如果期望用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。可以通过任何合适的途径给药，例如通过注射(例如静脉内或皮下注射)，部分取决于施用是短暂的还是慢性的。本文考虑各种给药方案，包括但不限于在各个时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。

如本文报道的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括被治疗的具体疾患、被治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、疾患的原因、试剂递送部位、施用方法、施用时间表以及医师已知的其他因素。该抗体不必是，而是可选地与一种或多种目前用于预防或治疗考虑中的疾患的试剂配制。这样的其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、疾患或治疗的类型以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或者以本文所述剂量的约1％至99％使用，或者以通过经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。

为了预防或治疗疾病，本文报道的抗体的合适剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体类型、疾病的严重程度和病程、抗体是否用于预防或治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应、以及主治医师的判断。抗体一次或经过一系列治疗适当地施用于患者。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于施用于患者的初始候选剂量，例如，无论通过一次或多次分开的施用，或者通过连续输注。取决于上述因素，一种典型的日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于经过几天或更长时间的重复给药，取决于病症，治疗通常将持续至发生期望的疾病症状的抑制。抗体的一个示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一个或多个剂量(或其任何组合)。这样的剂量可以间歇施用，例如，每周或每三周(例如，使患者接受约2至约20次、或例如约6次剂量的抗体)。可以施用初始较高的负载剂量，然后施用一次或多次较低的剂量。但是，其他剂量方案可能是有用的。这种疗法的进展很容易通过常规技术和测定法监测。

本文进一步提供了用于治疗炎性疾病、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、狼疮、牛皮癣和骨疾病的方法，其包括向诊断为患有此类疾病(因此需要这种治疗)的患者施用本文所报道的特异性结合人CD19的抗体。抗体可以单独地、以药物组合物的形式、或者与其他药物组合施用，用于治疗炎性疾病、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、狼疮、牛皮癣或骨疾病。抗体以药物有效量施用。

本文进一步提供了本文报道的抗体用于治疗炎性疾病、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、狼疮、牛皮癣或骨疾病的用途，和用于制备包含本文报道的抗体的药物组合物的用途。此外，本文提供了用于制备包含本文报道的抗体的药物组合物的方法。

本文进一步提供了本文报道的抗体用于治疗炎性疾病、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、狼疮、牛皮癣或骨疾病。

本文进一步提供了本文报道的抗体在制备用于治疗炎性疾病、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、狼疮、牛皮癣或骨疾病的药物组合物中的用途。抗体以药学有效量使用。

本文进一步提供了本文报道的抗体在制备用于治疗炎性疾病、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、狼疮、牛皮癣或骨疾病的药物组合物中的用途。抗体以药学有效量使用。

应当理解，代替抗人CD19抗体或除抗人CD19抗体外，可以使用本文报道的免疫缀合物进行上述任何制剂或治疗方法。

III.制品

另一方面，提供了含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质的制品。该制品包含容器和在容器上或与容器关联的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由各种材料(如玻璃或塑料)制成。该容器容纳组合物，所述组合物本身或与另一组合物组合有效治疗、预防和/或诊断病症，并且容器可以具有无菌入口(例如该容器可以是静脉内溶液袋或具有由皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文报道的抗体。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文报道的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒素或其他治疗剂。该实施方案中的制品可以进一步包含指示组合物可用于治疗具体病症的包装说明书。或者或另外，制品还可以包含第二(或第三)容器，所述容器包含药学上可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户观点来看所需的其他物质，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。

可以理解的是，代替或除抗人CD19抗体之外，上述任何制品可以包括本文报道的免疫缀合物。

IV.序列表说明

SEQ ID NO：1 鼠抗人CD19抗体8B8重链可变结构域

SEQ ID NO：2 鼠抗人CD19抗体8B8轻链可变结构域

SEQ ID NO：3 鼠抗人CD19抗体8B8HVR-H1

SEQ ID NO：4 鼠抗人CD19抗体8B8HVR-H2

SEQ ID NO：5 鼠抗人CD19抗体8B8HVR-H3

SEQ ID NO：6 鼠抗人CD19抗体8B8HVR-L1

SEQ ID NO：7 鼠抗人CD19抗体8B8HVR-L2

SEQ ID NO：8 鼠抗人CD19抗体8B8HVR-L3

SEQ ID NO：9 人源化重链可变结构域

SEQ ID NO：10-28 人源化轻链可变结构域变体和人源化HVR-L1变体的代替序列

V.抗体命名法

VI.实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。应该理解，给定以上提供的一般描述，可以实践各种其他实施方案。

尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明和实例详细描述了前述发明，但是描述和示例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用整体并入。

实施例1

小鼠抗人CD19抗体(杂交瘤)的免疫和产生

用CD19转染的HEK293细胞免疫Balb/c小鼠6次并加强(平均受体密度35,000/细胞)。通过在人CD19转染的NIH-3T3细胞上用CD19-细胞-ELISA测试血清样品来监测免疫应答。具有足够滴度的抗人CD19抗体的小鼠脾细胞通过与小鼠骨髓瘤细胞系P3X63 Ag8.653融合用于永生化。进行三个融合，通过在人CD19转染的NIH-3T3细胞上的细胞-ELISA筛选杂交瘤上清液，使用Daudi(CD19⁺)和CD19^-细胞用于抗人CD19特异性抗体的FACS结合测定法。

实施例2

杂交瘤筛选和抗CD19抗体的细胞生物学功能评估

用于筛选抗hCD19抗体的细胞ELISA

应用细胞ELISA筛选杂交瘤，并鉴定那些分泌抗人CD19抗体的杂交瘤。将用人CD19转染的NIH3T3细胞用作阳性细胞；未转染的NIH3T3细胞用作阴性对照细胞。为了评估阳性杂交瘤，定量转染和未转染的NIH3T3细胞之间的OD比率。

-培养基：DMEM高葡萄糖(4.5mg/ml)、10％FCS、丙酮酸钠、NEAA、谷氨酰胺

-抗体阳性对照：抗CD19单克隆抗体(IgG1)Pharmingen Cat#555409c＝1mg/ml

-检测抗体：山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP缀合物Bio-Rad Cat#170-06516

-在1x ELISA阻断试剂中稀释1：2000

-其他试剂：纤连蛋白Roche Cat#838039c＝1mg/ml

-戊二醛：25％储备液//Grade Agar Scientific#R102终浓度：0.05％PBS

-ELISA阻断试剂：10x储备液//Roche Cat#1112589

-TMB底物：Roche Cat#11432559

-终止溶液：1M H₂SO₄

-BioRad Cat#170-6516在1x ELISA阻断试剂中稀释1：2000

第1天：

-纤连蛋白包被：PBS中5μg/cm2；96孔板＝32cm²；6ml中160μg/板

-PBS，50μl/孔

-在室温孵育45分钟，吸出包被溶液

-在96孔板中的50μl培养基中种植1.25×10⁴个细胞/孔

-在37℃孵育40小时

-^～向板的上半部分加入：表达CD19的NIH3T3细胞

-向板的下半部分加入：未转染的NIH3T3细胞

第3天：

-在50μl培养基中加入阳性对照抗体或样品(上清液或小鼠血清)

-^～在4℃孵育2小时

-移除培养基，用100μl戊二醛(PBS中0.05％)固定细胞

-^～用200μl PBS洗涤两次

-^～加入检测抗体1：2000,50μl/孔

-^～在室温孵育2小时

-用200μl PBS洗涤3次

-加入50μl TMB，在室温下孵育30分钟

-^～加入25μl 1M H₂SO₄终止；在450nm/620nm读取消光度

-结果计算：比率OD NIH3T3CD19：OD未转染的NIH3T3

实施例3

抗CD19抗体的人源化

将鼠抗体的CD19结合特异性转移到人受体框架上以消除人体将识别为外源的序列片段所引起的潜在免疫原性问题。这通过将鼠(供体)抗体的整个互补决定区(CDR)接枝到人(受体)抗体框架上完成，并且被称为CDR接枝或抗体人源化。

将鼠氨基酸序列与一些人种系抗体V基因进行比对，根据序列同一性和同源性进行分类。在选择一个特定的受体序列之前，必须确定供体抗体的所谓规范环结构(Morea,V.,等人,Methods,Vol 20,Issue 3(2000)267-279)。这些规范环结构由所谓规范位置上存在的残基类型决定。这些位置(部分地)位于CDR区之外，并且必须在最终构建体中保持功能等同，以保留亲本(供体)抗体的CDR构象。选择人种系序列VBASE_VH1_1作为重链的受体，选择序列VBASE_VK2_5用于轻链。这导致野生型人源化抗体。

实施例4

CD19结合抗体的表达

通过基因合成产生抗体可变结构域编码序列。

为了引入相应的点突变，进行基于33mer引物的快速改变反应。通过测序验证所有序列(SequiServe,Vaterstetten,Germany)。将所有序列克隆到能够在大肠杆菌中进行选择和繁殖的载体(来自载体pUC18的复制起点，用于氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶)。这些载体另外含有能够在哺乳动物细胞中表达的盒(E-B病毒(EBV)的复制起点oriP，来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子以及聚腺苷酸化序列)。

编码抗体轻链和重链的所有基因区段之前都是编码信号肽(MGWSCIILFLVATATGVHS；SEQ ID NO:29)的DNA序列。通过瞬时转染悬浮液中的人胚肾HEK293细胞表达蛋白质。这些细胞在37℃和8％CO₂下培养。在转染当天，将细胞以1-2×10⁶个活细胞/mL的密度接种在新鲜培养基中。共转染等摩尔量的重链和轻链质粒DNA。转染后7天收获细胞培养上清液，离心(4℃，14,000×g，45分钟)，随后通过0.22μm滤器过滤。在纯化之前这些上清液可以冷冻并保存在-20℃。

实施例5

CD19结合抗体的纯化

一般方法：

将无细胞发酵上清液(HEK 293F)以5分钟的接触时间加载到预平衡的(磷酸盐缓冲盐水，PBS)蛋白A亲和柱(MabSelect^TMSuRe,GE Healthcare,8x100mm)上。洗涤(PBS，5个柱体积)后，用25mM柠檬酸/NaOH(pH 3.0)洗脱抗体。用1M Tris将洗脱液调节至pH 5.5，并在4℃过夜孵育。此后进行最终过滤(0.45μm)：

纯化抗人CD19抗体变体5(S27eP)：

将无细胞发酵上清液(244ml，HEK 293F)以5分钟的接触时间加载到预平衡的(磷酸盐缓冲盐水，PBS)蛋白A亲和柱(MabSelect^TMSuRe，GE Healthcare，8x100mm)上。洗涤(PBS，5个柱体积)后，用25mM柠檬酸/NaOH(pH 3.0)洗脱抗体。用1M Tris将洗脱液调节至pH5.5，并在4℃过夜孵育。最终过滤(0.45μm)回收31.1mg(5.7ml，5.45mg/ml)99.0％(SEC)纯产物。

抗人CD19抗体变体9(S27eP/N28S)的纯化：

将无细胞发酵上清液(260ml，HEK 293F)以5分钟的接触时间加载到预平衡的(PBS)蛋白A亲和柱(MabSelect^TMSuRe，GE Healthcare，8x100mm)上。洗涤后(PBS，5个柱体积)，用25mM柠檬酸/NaOH(pH 3.0)洗脱靶蛋白。用1M Tris(pH9.0)将洗脱液调节至pH 5.5，并在4℃过夜孵育。最终过滤(0.2μm)回收9.1mg(5.2ml，1.75mg/ml)98.0％(SEC)纯产物。

实施例6

提供表达CD19ECD的细胞和抗体与其结合

使用LipofectAmine 2000，用1μg质粒DNA/1.5×10⁶个细胞转染HEK293细胞，然后在37℃孵育48小时。质粒编码人CD19(

SEQ ID NO:30)或食蟹猴CD 19(

GWKV；SEQ ID NO:31)细胞外结构域(ECD)融合至用于细胞外递呈的人PSCA GPI锚序列(DTDLCNASGA HALQPAAAIL ALLPALGLLL WGPGQL；SEQ ID NO:32)。用FACS缓冲液(含有5％胎牛血清(FCS)的PBS)洗涤各转染的细胞两次，并重悬于FACS缓冲液中至终浓度2×10⁶个细胞/mL，对应于5.0×10⁴个细胞/25μL/孔。将抗体的起始浓度设定为60μg/mL(2x终浓度)，然后以1：3(v/v)滴定系列稀释。一抗在室温下在细胞上孵育1小时，然后进行两个洗涤步骤。对于二抗检测，使用浓度为30μg/mL的缀合至Alexa488的抗huIgG(H+L)抗体。二抗在室温下孵育1小时。随后，将细胞洗涤两次并重悬于70μL/孔FACS缓冲液中，使用BD FACSCanto进行分析。

下表中显示了人源化野生型抗体和变体5(S27eP)和9(S27eP/M28S)各自的EC₅₀值。

实施例7

质谱(LC-MS/MS)

将抗体物质(约80μg)在包含约7M盐酸胍的200mM组氨酸-HCl缓冲液(pH6.0)中变性，使用10mM TCEP还原，并使用Zeba Spin Columns 7K MWCO(Thermo Scientific)将缓冲液交换成200mM组氨酸-HCl(pH6.0)。最后，将物质在37℃下用2.5μg胰蛋白酶或嗜热菌蛋白酶(Promega)消化16小时。使用NanoAcquity UPLC系统(Waters)在ACQUITY BEH300C18柱(Waters)上用RP-UPLC梯度进行数据采集，然后在具有TriVersa NanoMate(Advion)作为NanoElectrospray电离源的Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪(Thermo Scientific)上进行基于CID的MS/MS。使用Mascot MS/MS离子搜索(Matrix Science)和肽分析仪(RocheDiagnostics GmbH)在内部MS数据评估软件上评估数据。通过整合提取的相应肽的离子流色谱图进行定量。

结果：

在下表中显示了在野生型人源化抗CD19抗体(变体0：wt)的PBS缓冲液中在37℃在pH7.4下孵育2周时脱酰胺和琥珀酰亚胺形成的水平(使用的片段：SSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYR；SEQ ID NO:35)。

在下表中显示了人源化抗CD19抗体变体5(S27eP)孵育后的脱酰胺和琥珀酰亚胺形成的水平(使用的片段：SSQSLENPNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYR；SEQ ID NO:35)。

在下表中显示了人源化抗CD19抗体变体3(S27eA)孵育后的脱酰胺和琥珀酰亚胺形成的水平(使用的片段：SSQSLENANGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYR；SEQ ID NO:35)。

在下表中显示了人源化抗CD19抗体变体7(G29A)孵育后的脱酰胺和琥珀酰亚胺形成的水平(使用的片段：SSQSLENSNANTYLNWYLQKPGQSPQLLIYR；SEQ ID NO:35)中。

实施例8

CD19亲和力测定

使用基于表面等离子体共振(SPR)的测定法来测定抗人CD19抗体与重组人CD19受体胞外结构域之间结合的动力学参数。

方案1：

为了捕获抗人CD19抗体，使用抗人F(ab)'2抗体片段(Jackson Immuno Research；订购代码：109-006-006)作为捕获抗体。通过使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)根据制造商说明书在pH 4.5下将20μg/mL的捕获抗体固定在CM5芯片(GE Healthcare；BR-1005-30)上。样品和运行缓冲液是HBS-EP+(GE Healthcare；BR-1006-69)。流经池设置为25℃。样品块设置为12℃。两者都用运行缓冲液预处理。通过以流速20μL/分钟注射35nM溶液持续60秒来捕获抗人CD19抗体。通过注射溶液中不同浓度的重组人CD19 ECD持续120秒来测量结合，其中流速为50μL/分钟，从900nM起始，以1：3稀释，总共5个浓度。监测解离相长达600秒，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液触发。通过用10mM甘氨酸溶液(pH 1.5)以30μL/分钟的流速洗涤60秒和30秒两次，再生表面。通过减去从山羊抗人F(ab)'2表面获得的响应来校正本体折射率(Bulk refractive index)差异。也减去空白注射(＝双重参照)。为了计算表观KD和其他动力学参数，使用Langmuir 1：1模型。

方案2：

为了捕获抗人CD19抗体，使用抗人Fab捕获抗体。首先通过使用胺偶联试剂盒(GEHealthcare)根据制造商的说明在pH5.0下将30μg/mL山羊抗人Fab抗体(订购代码：28958325；GE Healthcare Bio-Sciences AB)固定到CM5芯片(GE Healthcare；BR-1005-30)上。样品和运行缓冲液是HBS-EP+(GE Healthcare；BR-1006-69)。流经池设置为25℃。样品块设置为12℃。两者都用运行缓冲液预处理。通过以流速10μL/分钟注射10nM溶液持续60秒来捕获抗人CD19抗体。通过以流速10μL/分钟、以浓度250nM注射重组人CD19ECD持续90秒来测量结合。监测解离相长达60秒，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液触发。通过用10mM甘氨酸溶液(pH 2.1)以10μL/分钟的流速洗涤60秒再生表面。通过减去来自空白表面的响应来校正本体折射率差异。

计算：

样品的相对结合是从捕获水平和结合水平计算的比率(RU结合除以RU捕获)：

样品的相对活性浓度是样品与参照样品比较的比率：

Claims (14)

1.一种特异性结合人CD19的抗体，其中所述抗体包含

(a)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H1，

(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H2，

(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3，

(d)包含SEQ ID NO：20或28的氨基酸序列的HVR-L1，

(e)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L2，和

(f)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L3。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人、人源化或嵌合抗体。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中所述抗体是特异性结合人CD19的抗体片段。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含

(a)与SEQ ID NO：09的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列，或

(b)与SEQ ID NO：09的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列，或

(c)如(a)或(b)中的VH序列和VL序列。

6.一种药物制剂，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，用作药物。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，用于治疗B细胞癌症。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，用于消除B细胞。

10.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体在制备药物中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述药物用于治疗B细胞癌症。

12.根据权利要求10所述的用途，其中所述药物用于消除B细胞。

13.一种治疗患有B细胞癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的抗体。

14.一种消除个体中B细胞的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的抗体以消除B细胞。