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CN108136042A - 治疗性细胞内化缀合物 - Google Patents

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CN108136042A
CN108136042A CN201680058474.9A CN201680058474A CN108136042A CN 108136042 A CN108136042 A CN 108136042A CN 201680058474 A CN201680058474 A CN 201680058474A CN 108136042 A CN108136042 A CN 108136042A
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nucleic acid
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Abstract

本文提供了细胞穿透缀合物。缀合物包括非细胞穿透蛋白、硫代磷酸酯核酸、将硫代磷酸酯核酸连接至非细胞穿透蛋白的第一接头和将硫代磷酸酯核酸连接至治疗性部分(例如siRNA或小分子)的第二接头，其中硫代磷酸酯核酸增强非细胞穿透蛋白的细胞内递送。本文提供的缀合物尤其可用于治疗癌症。

Description

治疗性细胞内化缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年8月6日提交的美国临时申请No.62/201,993的优先权，在此通过引用将其全部内容并入本文。
关于联邦政府赞助的研究和开发所获得的发明的权利的声明
本发明使用由国立卫生研究院授予的资助号CA122976的资助获得。政府对发明享有一定的权利。
发明背景
在过去的二十年中，使用治疗性单克隆抗体(TMA)治疗癌症在其分子复杂性和临床功效方面均有所改进。开发有效的TMA的最初努力主要集中于(i)将抗体蛋白质人源化以克服与免疫原性有关的问题，和(ii)扩展靶抗原库。同时开发了抗体-药物缀合物(ADC)，用于靶向递送有效的抗癌药物以避免常规化疗法引起的常见并发症。尽管两个领域都取得了进展，但是TMA和ADC仍然存在与例如癌细胞特异性、缀合化学、肿瘤渗透、产品异质性和制造问题有关的限制。本文提供的组合物和方法解决了本领域中的上述及其他缺陷。
发明概述
第一方面，提供了细胞穿透缀合物。所述细胞穿透缀合物包括：(i)非细胞穿透蛋白，(ii)硫代磷酸酯核酸，(iii)将所述硫代磷酸酯核酸连接至所述非细胞穿透蛋白的第一接头，和(iv)将所述硫代磷酸酯核酸连接至治疗性部分的第二接头，其中所述硫代磷酸酯核酸增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。
另一方面，提供了形成细胞穿透缀合物的方法。所述方法包括：(i)使非细胞穿透蛋白与第一硫代磷酸酯核酸接触，其中所述非细胞穿透蛋白连接至第一生物素结合对的第一成员，且所述第一硫代磷酸酯核酸连接至第一生物素结合对的第二成员，由此形成包含第一生物素结构域和第一生物素结合结构域之间的非共价键的第一缀合物。(ii)使治疗性部分与第二硫代磷酸酯核酸接触，由此形成第二缀合物。并且(iii)将第一硫代磷酸酯核酸与第二硫代磷酸酯核酸杂交，由此形成细胞穿透缀合物。
另一方面，提供了形成细胞穿透缀合物的方法。该方法包括：(i)使硫代磷酸酯核酸与治疗性部分接触，由此形成第一缀合物。(ii)使所述第一缀合物与非细胞穿透蛋白接触，其中所述非细胞穿透蛋白连接至生物素结合对的第一成员，并且所述第一缀合物连接至生物素结合对的第二成员，由此形成包含生物素结构域和生物素结合结构域之间的非共价键的细胞穿透缀合物。
另一方面，提供了包含本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)的细胞。
另一方面，提供了包含本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)和药学上可接受的载体的药物组合物。
另一方面，提供了将非细胞穿透蛋白递送至细胞中的方法，包括使细胞与本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)接触。
另一方面，提供了将治疗性部分递送到细胞中的方法，包括使细胞与本文提供的细胞穿透性缀合物(包括其实施方案)接触。
另一方面，提供了治疗有需要的对象中的疾病的方法。该方法包括给对象施用有效量的本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)，由此治疗对象中的疾病。
附图说明
图1：细胞内化ADC的凝胶纯化。当经修饰的抗体和经修饰的药物的杂交完成后，对ADC进行凝胶过滤并将含有1.IgG蛋白质、2.DNA和3.荧光基团的三重阳性级分视为完整ADC，并因此收集用于进一步基于细胞的分析。
图2A和2B：通过细胞内化ADC识别肿瘤细胞。将人PSMA(前列腺特异性膜抗原)+LNCaP(前列腺腺癌)细胞分别与非内化抗-PSMA-PO(磷酸酯)-ds(双链)DNA-DM1或内化抗-PSMA-PS(硫代磷酸酯)-dsDNA-DM1孵育4小时。(图2A)流式细胞术分析显示细胞内化ADC的识别。(图2B)人PSMA和LNCaP的共聚焦显微镜分析显示用抗-PSMA-PO-dsDNA-DM1处理后在表面积聚但未发生细胞内化。由于高细胞毒性和肿瘤细胞杀伤，抗-PSMA-PS-dsDNA-DM1的细胞定位成像失败。
图3A和3B：通过修饰的抗体-药物缀合物的内化诱导的肿瘤细胞死亡。将人PSMA和LNCaP细胞与所标明的非内化抗-PSMA-PO-dsDNA-DM1或内化抗-PSMA-PS-dsDNA-DM1分别孵育4小时。(图3A)流式细胞术分析显示内化抗-PSMA-PS-dsDNA-DM1处理有效诱导Annexin V+肿瘤细胞的凋亡(当它们内化该构建体时)。(图3B)通过流式细胞术检测的用于确定细胞内化抗-PSMA-PS-dsDNA-DM1诱导的绝对肿瘤细胞凋亡的整体分析。
图4：siRNA肿瘤抗原靶向性递送的设计。前列腺癌特异性抗-PSMA通过硫代磷酸酯化的ssDNA接头与STAT3 siRNA融合。组分：(i)PSMA-抗生物素蛋白和(ii)PS-ssDNA/siRNA-生物素和如所示的具体功能。
图5A和5B：缀合物抗-PSMA-PS-ssDNA-RNAi的纯化和分析。对所示缀合物进行凝胶过滤并收集三重阳性级分用于进一步的体外分析。分析缀合物的PSMA-IgG蛋白质含量、硫代磷酸酯化的ssDNA含量和掺入ssDNA接头中的报道荧光基团(荧光素)。
图6A和5B：缀合物抗-PSMA-PS-ssDNA-RNAi的细胞摄取和细胞内定位。(图6A)所示缀合物与人前列腺癌LNCaP细胞孵育并测定摄取(图6A，上图)。此外，通过用未标记的抗-PSMA抗体同时阻断表面PSMA蛋白，影响PSMA特异性摄取抗-PSMA-PS-ssDNA-STAT3 siRNA(图6A，下图)。(图6B)将所示缀合物与人前列腺癌LNCaP细胞孵育，通过共聚焦显微镜检测抗-PSMA-PS-ssDNA-RNAi中的人抗-PSMA和荧光标记的PS-ssDNA在细胞内的共定位。比例尺，20μm。
图7：抗-PSMA-PS-ssDNA-STAT3siRNA缀合物在体外发挥敲低作用。将人前列腺癌LNCaP细胞与所示缀合物孵育48小时，然后通过RT-PCR评估STAT3mRNA的表达。
图8A和8B：细胞穿透PSMA-ADC在体外诱导肿瘤细胞凋亡。ADC-FM(由PS修饰的PSMA-ADC)内化至LNCaP细胞中并在体外诱导细胞凋亡。图8A免疫细胞化学检测PSMA-DM1647(未修饰的PSMA-ADC)和(PS修饰的)PSMA-DM1-FM 495的细胞内化。将LNCaP细胞与10μg/ml用荧光基团缀合的ADC各合并的级分B1-3于37℃孵育30分钟，随后用Hoechst复染法对PSMA进行染色。比例尺为20μm。显示了几个类似结果的一个代表性图像。对PSMA-DM1 647(ADC)和PSMA-DM1-FM 495(ADC-FM)的合并级分B1-3(图8B)或单个ADC级分B1至B3和ADC-FM级分B1至B5进行流式细胞凋亡测定。
图9A和9B：PS修饰的抗-PSMA-ADC-在体外的有效细胞穿透活性。ADC2-FM以温度依赖的方式内化至LNCaP细胞中。图9A温度依赖性ADC内化的流式细胞术分析。将LNCaP细胞与5μg/ml的ADC2或ADC2-FM在冰上孵育60分钟以使抗体结合，洗涤并移至4℃或37℃孵育不同时长。对表面结合的IgG染色并通过流式细胞术分析。37℃样品表面IgG染色的MFI信号除以4℃样品的IgG信号以百分比(MFI(FL4-A::IgG)的百分比)作图于Y轴，针对表示不同时间点(左)的X轴。类似地，计算了与4℃样品相比，来自37℃样品ADC2-FM偶联的荧光基团的MFI百分比(右)。0分钟时间点的MFI百分比与所有其他时间点的统计学比较以p<0.05(*)，p<0.01(**)和p<0.001(***)的显著性水平或不显著(n.s.)表示。误差线表示标准差。图9B对ADC2-FM的温度依赖性细胞内化的免疫细胞化学测定。将LNCaP细胞与5μg/ml488标记的ADC2-FM于4℃孵育60分钟，洗涤并移至4℃或37℃孵育120分钟。用Hoechst复染法针对PSMA对细胞进行染色。比例尺为20μm。显示了几个类似结果的一个代表性图像。
图10A-10D：PS修饰的抗-PSMA-ADC；体内抑制肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡。ADC2-FM降低体内LNCaP人前列腺异种移植小鼠模型中的肿瘤细胞增殖。图10A NSG小鼠中LNCaP人前列腺癌异种移植物的肿瘤生长治疗方案，用10μg ADC2、ADC2-FM或PBS以12小时连续间隔处理5次。每只动物107个LNCaP细胞移植入NSG小鼠，并在植入后第70天至第73天处理。制备自末次处理后12小时安乐死的经所示处理的小鼠的LNCaP人前列腺癌肿瘤显微切片进行针对IgG和PSMA(图10B)或Ki67增殖活性和CD31肿瘤血管系统(图10C左)的染色。细胞核用Hoechst法复染。比例尺为100μm。Ki67的平均荧光强度(MFI)从n＝4个独立的视野(FoV)量化，并绘制为条形图(图10C右)。通过RT-qPCR检测肿瘤样品中的人胱天蛋白酶8(图10D左图)，胱天蛋白酶9(图10D中图)和胱天蛋白酶3(图10D右图)的mRNA表达(图10D)。Y轴显示与PBS处理样品相比的相对倍数变化，归一化至核糖体蛋白L2(胱天蛋白酶9，胱天蛋白酶3)或微管蛋白β链(胱天蛋白酶8)的mRNA水平。对图10C和图10D进行了统计学比较，以p<0.05(*)，p<0.01(**)和p<0.001(***)显著性水平或不显著(n.s.)表示。误差线表示标准偏差。
发明详述
定义
尽管本文示出和描述了本发明的各种实施方案和方面，对于本领域技术人员来说显而易见的是，这样的实施方案和方面仅作为示例提供。本领域技术人员现在将想到许多不偏离本发明的变化、改变和替换。应该理解的是，这里所描述的发明的各种替代方案可能被用于实践这项发明。
本节所使用的章节标题仅用于组织目的，不被解释为限制所描述的主题。申请中所引用的所有文件，或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册和论文，出于所有的目的以其整体通过引用明确地并入本文。
本文所使用的缩写在化学和生物领域中有其传统意义。本文所列的化学结构和公式是按照化学领域中已知的化学物质的标准规则构建的。
除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员一般理解的含义相同的含义。例如，Singleton et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,Cold Springs Harbor Press(Cold SpringsHarbor,NY 1989)。与本文所述相似或等同的任何方法、装置和材料均可用于本发明的实践中。提供以下定义以帮助理解本文中经常使用的某些术语，而不意味着限制本公开的范围。
本文使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或语法上的等价物表示共价连接在一起的至少两个核苷酸。术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，或其互补物。术语“多核苷酸”是指核苷酸的线性序列。术语“核苷酸”通常是指多核苷酸的单个单元，即单体。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其修饰形式。本文考虑的多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA(包括siRNA)以及具有单链和双链DNA和RNA混合物的杂交分子。该术语还包括合成的、天然存在的和非天然存在的，含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，其具有与参考核酸类似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯和2-O-甲基核糖核苷酸。
术语“硫代磷酸酯核酸”是指其中一个或多个核苷酸间键是通过硫代磷酸酯部分(硫代磷酸酯)的核酸。硫代磷酸酯部分可以是单硫代磷酸酯(-P(O)3(S)3--)或二硫代磷酸酯(-P(O)2(S)2 3--)。在实施方案中，硫代磷酸酯部分是单硫代磷酸酯(-P(O)3(S)3--)。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸是单硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸的一个或多个核苷通过硫代磷酸酯部分(例如单硫代磷酸酯)连接，并且剩余的核苷通过磷酸二酯部分(-P(O)4 3--)连接。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸的一个或多个核苷通过硫代磷酸酯部分(例如单硫代磷酸酯)连接，并且剩余的核苷通过甲基膦酸酯键连接。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸的所有核苷通过硫代磷酸酯部分(例如单硫代磷酸酯)连接。
硫代磷酸酯寡核苷酸(硫代磷酸酯核酸)的长度通常为约5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或更多个核苷酸，长度多达约100个核苷酸。硫代磷酸酯核酸的长度也可以更长，例如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10000等。如上所述，在某些实施方案中，本文的硫代磷酸酯核酸含有一个或多个磷酸二酯键。在其它实施方案中，硫代磷酸酯核酸包括交替的主链(例如，本领域已知的磷酸二酯的模拟物或类似物，如硼烷磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯或O-甲基磷酰胺键(参见Eckstein,Oligonucleotides andAnalogues:A Practical Approach,Oxford University Press)。硫代磷酸酯核酸还可以包括一种或多种本领域已知的核酸类似物单体，例如肽核酸单体或聚合物、锁核酸单体或聚合物、吗啉代单体或聚合物、乙二醇核酸单体或聚合物，或苏糖核酸单体或聚合物。其它类似物核酸包括具有正电荷主链、非离子主链和非核糖主链的那些，包括美国专利No.5,235,033和5,034,506以及ASC Symposium Series 580,Carbohydrate Modifications inAntisense Research,Sanghui&Cook,eds的第6和7章所描述的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的一个定义中。核糖-磷酸主链的修饰可以由于多种原因而进行，例如为了增加这种分子在生理环境中的稳定性和半衰期，或作为生物芯片上的探针。可以制备天然存在的核酸和类似物的混合物；或者，可以制备不同核酸类似物的混合物，以及天然存在的核酸和类似物的混合物。硫代磷酸酯核酸和硫代磷酸酯聚合物主链可以是线性的或分支的。例如，分支的核酸被重复地分支以形成更高级的结构如树枝状聚合物等。
在实施方案中，硫代磷酸酯核酸包括硫代磷酸酯聚合物主链。如本文所用，“硫代磷酸酯聚合物主链”是具有至少两个硫代磷酸酯键(例如单硫代磷酸酯)(例如将糖亚基、环状亚基或烷基亚基连接在一起)的化学聚合物。硫代磷酸酯聚合物主链可以是硫代磷酸酯糖聚合物，其是其中一个或多个(或全部)戊糖链缺少核酸中正常存在的碱基(核碱基)的硫代磷酸酯核酸。硫代磷酸酯聚合物主链可以包括两个或更多个硫代磷酸酯键。硫代磷酸酯聚合物主链可以包括5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50或更多个键，并且可以含有多达约100个硫代磷酸酯键。硫代磷酸酯聚合物主链也可以含有大量的键，例如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10000等。
硫代磷酸酯核酸和硫代磷酸酯聚合物主链可以部分或完全被硫代磷酸酯化。例如，硫代磷酸酯核酸的50％或更多的核苷酸间键可以是硫代磷酸酯键。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸的核苷酸间键中的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％是硫代磷酸酯键。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸的核苷酸间键的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％是硫代磷酸酯键。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸的核苷酸间键的75％、80％、85％、90％、95％或99％是硫代磷酸酯键。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸的核苷酸间键的90％、95％或99％是硫代磷酸酯键。在实施方案中，其余的核苷酸间键是磷酸二酯键。在实施方案中，其余的核苷酸间键是甲基膦酸酯键。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸的核苷酸间键的100％是硫代磷酸酯键。类似地，硫代磷酸酯聚合物主链中5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的糖间键可以是硫代磷酸酯键。在实施方案中，硫代磷酸酯聚合物主链中50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的糖间键可以是硫代磷酸酯键。在实施方案中，硫代磷酸酯聚合物主链中75％、80％、85％、90％、95％或99％的糖间键可以是硫代磷酸酯键。在实施方案中，硫代磷酸酯聚合物骨架中90％、95％或99％的糖间键可以是硫代磷酸酯键。在实施方案中，其余的核苷酸间键是磷酸二酯键。在实施方案中，其余的核苷酸间键是甲基膦酸酯键。在实施方案中，硫代磷酸酯聚合物主链的100％的糖间键是硫代磷酸酯键。
核酸可能包含非特异性序列。如本文所用，术语“非特异性序列”是指含有一系列未被设计为与任何其他核酸序列互补或仅部分互补的残基的核酸序列。举例来说，非特异性核酸序列是当与细胞或生物体接触时不起抑制性核酸作用的核酸残基序列。“抑制性核酸”是能够与靶核酸(例如可翻译成蛋白质的mRNA)结合并减少靶核酸的转录(例如从DNA转录为mRNA)，或减少靶核酸(例如mRNA)的翻译，或改变转录物剪接(例如单链吗啉代寡核苷酸)的核酸(例如DNA、RNA、核苷酸类似物的聚合物)。
“标记的核酸或寡核苷酸”是通过接头或化学键共价地，或者通过离子键、范德华力、静电或氢键非共价地结合到标记上的核酸或寡核苷酸，从而核酸的存在可以通过检测与核酸结合的可检测标记的存在来检测。或者，使用高亲和力相互作用的方法可以获得相同的结果，其中一对结合配偶体之一与另一个相结合，例如生物素、链霉亲和素。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链包含如本文所公开的和本领域通常已知的可检测标记。
词语“互补”或“互补性”是指多核苷酸中的核酸与第二种多核苷酸中的另一核酸形成碱基对的能力。例如，序列A-G-T与序列T-C-A互补。互补性可以是部分的，其中只有一些核酸根据碱基配对匹配，或者是完全的，其中所有核酸根据碱基配对匹配。
当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时，其是“可操作地连接”的。例如，前序列或分泌前导序列的DNA如果作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与该序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点位于促进翻译的位置，则其与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列彼此靠近，并且在分泌性前导序列中是连续的并处于阅读相。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在方便的限制性位点进行连接来完成的。如果这样的位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适配子或接头。
术语“基因”是指参与产生蛋白质的DNA区段；它包括编码区之前和之后的区域(前导序列和尾部序列)以及各编码区(外显子)之间的间插序列(内含子)。前导序列、尾部序列以及内含子包括在基因的转录和翻译过程中必需的调控元件。此外，“蛋白质基因产物”是从特定基因表达的蛋白质。
如本文所用的关于基因的词“表达”或“表达的”是指该基因的转录和/或翻译产物。DNA分子在细胞中的表达水平可以通过存在于细胞内的相应mRNA的量或由细胞产生的该DNA编码的蛋白质的量来确定。非编码核酸分子(例如siRNA)的表达水平可以通过本领域众所周知的标准PCR或Northern印迹方法检测。参见Sambrook et al.,1989MolecularCloning:A Laboratory Manual,18.1-18.88。
本文所述的“siRNA”“小干扰RNA”“小RNA”或“RNAi”是指形成双链RNA的核酸，其中双链RNA当与基因或靶基因在相同的细胞中表达时，具有减少或抑制该基因表达能力。核酸的杂交以形成双链分子的互补部分通常具有实质或完全的相同性。在一个实施方案中，siRNA或RNAi是指与靶基因具有实质或完全相同性并形成双链siRNA的核酸。在实施方案中，所述siRNA通过与互补的细胞mRNA相互作用来干扰互补的mRNA的表达，从而抑制基因表达。通常，核酸的长度至少为约15-50个核苷酸(例如，双链siRNA的每个互补序列的长度为15-50个核苷酸，且双链siRNA的长度为约15-50个碱基对)。在其它实施方案中，长度为20-30个碱基核苷酸，优先选长度约20-25个或约24-29个的核苷酸，例如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。siRNA的非限制性实例包括核酶、RNA诱饵、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和核仁小RNA(snoRNA)。
当与上下文中例如细胞，或核酸、蛋白质或载体一起使用时，术语“重组”指细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质，或改变天然核酸或蛋白质进行修饰，或者指细胞衍生自经过如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的基因，或表达异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。转基因细胞和植物为表达异源基因或编码序列的那些，通常通过重组方法获得。
当术语“异源”用于关于核酸的部分时，表示核酸包含于自然界中彼此没有发现相同关系的两个或更多个子序列。例如，具有来自不相关基因的两个或更多个序列的核酸通常是重组产生的，所述两个或更多个序列被排列以制备新的功能性核酸，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白质指蛋白质来源于在自然界中彼此没有发现相同关系的两个或更多个子序列(例如，融合物
术语“外源”是指源自给定细胞或生物体外部的分子或物质(例如，化合物、核酸或蛋白质)。例如，本文所提及的“外源启动子”是不来源于表达其的细胞或生物体的启动子。相反，术语“内源”或“内源启动子”是指天然存在于或来源于给定细胞或生物体的分子或物质。
当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示该核酸或蛋白质基本上不含有在天然状态下与其相关的其他细胞组分。例如，它可以是均质状态，且可以是干燥的或在水溶液中。纯度和均质性通常使用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来确定。其是存在于制剂中的主要物质的蛋白质是基本上纯化的。
术语“多肽”“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，其中聚合物在一些实施方案中可以缀合至不由氨基酸组成的部分。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。“融合蛋白”是指编码重组表达为单个部分的两个或更多个不同蛋白质序列的嵌合蛋白。
术语“肽基”和“肽基部分”是指单价肽。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些以及其后经过修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但是以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化学化合物。术语“非天然存在的氨基酸”和“非天然氨基酸”是指自然中不存在的氨基酸类似物、合成氨基酸和氨基酸模拟物。
氨基酸在本文中可以通过其众所周知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来引用。同样，核苷酸可以用它们通常接受的单字母代码来表示。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。就特定的核酸序列而言，“保守性修饰的变体”是指编码相同或基本相同氨基酸序列的核酸。由于遗传密码的简并性，多个核酸序列将编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在每个编码丙氨酸的密码子位置上，密码子可以改变成任何相应密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，是一种保守修饰的变异。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子AUG和通常为色氨酸的唯一密码子TGG外)可被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含于每个描述的序列中。
关于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质的个别取代、缺失或添加(其改变、增加或缺失编码的序列中单个氨基酸或小百分比氨基酸)是“保守性修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸所取代。在本领域众所周知，保守取代表提供了功能上相似的氨基酸。此类保守修饰的变体不排除本发明的多态性变体、种间同系物和等位基因。
以下八组各自含有彼此保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)
(参见例如Creighton,Proteins(1984))。
当上下文含有两个或更多个核酸或多肽序列时，术语“相同的”或百分比“相同性”是指两个或更多个序列或子序列相同，或具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸与使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法，或通过手动比对和目视检查所测量的相同(即，约60％相同性，当在比较窗口或指定区域上比较和对齐以达到最大对应性时优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或在特定区域内更高的相同性)(参见例如NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)。这样的序列被认为是“基本上相同的”。此定义也指，或者可以应用于，对测试序列的互补物。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。如下所述，优选的算法可以解决间隙等问题。更好地，相同性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更好地，在长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。
对于本文所述的特定蛋白质(例如PSMA、STAT3)，所述蛋白质包括蛋白质的任何天然存在形式，或维持蛋白质转录因子活性的变体或同系物(例如至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性)。在一些实施方案中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或部分序列(例如50、100、150或200个连续的氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在其他实施方案中，蛋白质是通过其NCBI序列参考鉴定的。在其他实施方案中，蛋白质是通过其NCBI序列参考或其功能片段或同源物鉴定的。
因此，本文提及的“STAT3蛋白”包括任何重组或天然形式的信号转导因子和转录激活因子3(STAT3)蛋白或其保持STAT3蛋白活性的变体或同源物(例如至少与STAT3相比具有至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性)。在某些方面，所述变体或同系物与天然存在的STAT3多肽相比，在整个序列或部分序列(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相同性。在实施方案中，STAT3蛋白与由UniProt参考号P40763鉴定的蛋白质或与其具有实质相同性的变体或同系物基本上相同。
本文所提及的“PSMA蛋白”包括任何重组或天然形式的前列腺特异性膜抗原(PSMA)蛋白或其保持PSMA蛋白活性(例如与PSMA相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性)的变体或同系物。在某些方面，与天然存在的PSMA多肽相比，在整个序列或部分序列(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上，变体或同系物至少有90％、95％、96％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。PSMA是指在本领域中也被称为谷氨酸羧肽酶II(GCPII)、n-乙酰-l-天冬氨酰-谷氨酸肽酶I(NAALADase I)或NAAG肽酶的蛋白质。在实施方案中，PSMA蛋白与由UniProt参考号P04609鉴定的蛋白质或与其具有实质相同性的变体或同系物基本上相同。
本文所提及的“VEGFR蛋白”包括任何重组或天然形式的血管内皮生长因子受体(VEGFR)蛋白或其保持VEGFR蛋白活性(例如与VEGFR相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性)的变体或同系物。在某些方面，与天然存在的VEGFR多肽相比，在整个序列或部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上，变体或同系物至少有90％、95％、96％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，VEGFR蛋白与由UniProt参考号P17948鉴定的蛋白质或与其具有实质相同性的变体或同系物基本上相同。
本文所提供的术语“CTLA-4”或“CTLA-4蛋白”包括任何重组或天然形式的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)蛋白或其保持CTLA-4蛋白活性(例如与CTLA-4相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性)的变体或同系物。在某些方面，与天然存在的CTLA-4多肽相比，在整个序列或部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上，变体或同系物至少有90％、95％、96％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，CTLA-4蛋白是由NCBI序列参考GI：83700231鉴定的蛋白质，其同源物或功能片段。
本文所提供的术语“EGFR”包括任何重组或天然形式的表皮生长因子受体(EGFR)蛋白或其保持EGFR蛋白活性(例如与EGFR相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性)的变体或同系物。在某些方面，与天然存在的EGFR多肽相比，在整个序列或部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上，变体或同系物至少有90％、95％、96％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。EGFR是指本领域中也称为ErbB-1或HER1的蛋白质。在实施方案中，EGFR蛋白是由NCBI序列参考GI：29725609鉴定的蛋白质，其同源物或功能片段。
本文所提供的术语“IL6-R”包括任何重组或天然形式的白细胞介素6受体(IL6-R)蛋白或其保持IL6-R蛋白活性(例如与IL6-R相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性)的变体或同系物。在某些方面，与天然存在的IL6-R多肽相比，在整个序列或部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上，变体或同系物至少有90％、95％、96％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，IL6-R蛋白是由NCBI序列参考GI：4504673鉴定的蛋白质，其同源物或功能片段。
本文所提供的术语“IL7-R”包括任何重组或天然形式的白细胞介素7受体(IL7-R)蛋白或其保持IL7-R蛋白活性(例如与IL7-R相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性)的变体或同系物。在某些方面，与天然存在的IL7-R多肽相比，在整个序列或部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上，变体或同系物至少有90％、95％、96％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，IL7-R蛋白是由UniProt序列参考P16871鉴定的蛋白质，其同源物或功能片段。
本文所提供的术语“PDL-1”包括任何重组或天然形式的程序性死亡配体1(PDL-1)蛋白或其保持PDL-1蛋白活性(例如与PDL-1相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性)的变体或同系物。在某些方面，与天然存在的PDL-1多肽相比，在整个序列或部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上，变体或同系物至少有90％、95％、96％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，PDL-1蛋白是由UniProt序列参考Q9NZQ7鉴定的蛋白质，其同源物或功能片段。
本文所提供的术语“PDGFR”包括任何重组或天然形式的血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)蛋白或其保持PDGFR蛋白活性(例如与PDGFR相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性)的变体或同系物。在某些方面，与天然存在的PDGFR多肽相比，在整个序列或部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上，变体或同系物至少有90％、95％、96％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，PDGFR蛋白是由UniProt序列参考P16234鉴定的蛋白质，其同源物或功能片段。
本文所提供的术语“S1PR1”包括任何重组或天然形式的鞘氨醇-1-磷酸受体1(S1PR1)蛋白或其保持S1PR1蛋白活性(例如与S1PR1相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性)的变体或同系物。在某些方面，与天然存在的S1PR1多肽相比，在整个序列或部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上，变体或同系物至少有90％、95％、96％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，S1PR1蛋白是由UniProt序列参考P21453鉴定的蛋白质，其同源物或功能片段。
“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区的、能够特异性结合和识别抗原的多肽。已发现的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其又分别将免疫球蛋白定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE几类。通常，抗体的抗原结合区在结合的特异性和亲和性方面是最关键的。在一些实施方案中，抗体或抗体片段可来源于不同的生物体，包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、骆驼等。本发明中的抗体可能包括为改善或调节抗体的期望功能(例如糖基化、表达、抗原识别、效应子功能、抗原结合、特异性等)，已经在一个或多个氨基酸位置被修饰或突变的抗体。
示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻”(约25kD)链和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端限定了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。Fc(即片段可结晶区域)是免疫球蛋白的“基部”或“尾部”，并且通常根据抗体种类，由贡献两个或三个恒定结构域的两条重链组成。通过与特定蛋白质结合，Fc区确保每种抗体对给定抗原产生适当的免疫应答。Fc区还结合各种细胞受体，如Fc受体和其他免疫分子，如补体蛋白。
例如，抗体以完整的免疫球蛋白形式存在，或者以通过用各种肽酶消化产生的许多良好表征的片段存在。因此，例如胃蛋白酶在铰链区二硫键下方消化抗体以产生F(ab)'2，即其本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链的Fab二聚体。在温和的条件下，F(ab)'2可以被还原并打断铰链区中的二硫键，从而F(ab)'2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体实质上是具有部分铰链区的抗原刺激部分(参见Fundamental Immunology(Paul ed.,3ded.1993))。虽然各种抗体片段根据完整抗体的消化来定义，但本领域技术人员将会理解，这样的片段可以以化学方式或通过使用重组DNA方法从头合成。因此，本文使用的术语抗体还包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的那些(例如单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的那些(参见，例如，McCafferty et al.,Nature 348:552-554(1990))。
单链可变片段(scFv)通常是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其与10至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头通常可富含甘氨酸以获得柔性，以及丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性。接头可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。
为了制备合适本发明的抗体和根据本发明使用抗体，例如重组、单克隆或多克隆抗体，可以使用本领域已知的许多技术(参见，例如Kohler&Milstein,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor et al.,Immunology Today 4:72(1983)；Cole et al.,pp.77-96inMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985)；Coligan,Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow&Lane,Antibodies,A LaboratoryManual(1988)；and Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(2ded.1986))。可以从细胞克隆获取编码感兴趣抗体的重链和轻链基因，例如，可以从杂交瘤中克隆编码单克隆抗体的基因，并用于生产重组单克隆抗体。编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库也可以由杂交瘤或浆细胞制备。重链和轻链基因产物的随机组合产生具有不同抗原特异性的大量抗体(参见，例如Kuby,Immunology(3rd ed.1997))。用于生产单链抗体或重组抗体的技术(美国专利No.4,946,778、美国专利No.4,816,567)可适用于生产本发明的多肽抗体。而且，转基因小鼠或其他生物如其他哺乳动物可用于表达人源化或人源抗体(参见，例如美国专利Nos.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016,Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwild et al.,NatureBiotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996)；andLonberg&Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。此外，可以使用噬菌体展示技术来鉴定与选择的抗原特异性结合的抗体和异源Fab片段(参见，例如McCafferty et al.,Nature 348:552-554(1990)；Marks et al.,Biotechnology 10:779-783(1992))。也可以制备能够识别两种不同抗原的双特异性抗体(参见，例如WO 93/08829,Traunecker etal.,EMBO J.10:3655-3659(1991)；和Suresh et al.,Methods in Enzymology 121:210(1986))。抗体也可以是异源缀合物，例如两种共价连接的抗体或免疫毒素(参见，例如U.S.Patent No.4,676,980,WO 91/00360；WO 92/200373；and EP 03089)。
用于人源化或初始化非人抗体的方法是本领域众所周知的(例如美国专利Nos.4,816,567；5,530,101；5,859,205；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,777,085；6,180,370；6,210,671；and 6,329,511；WO 87/02671；EP Patent Application 0173494；Joneset al.(1986)Nature 321:522；and Verhoyen et al.(1988)Science 239:1534)。人源化抗体被进一步描述于例如Winter and Milstein(1991)Nature 349:293。通常，人源化抗体具有从非人源导入的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为外来残基，其通常取自外来可变结构域。根据Winter和同事的方法，基本上可以通过用啮齿动物的CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列进行人源化。(参见，例如Morrison et al.,PNASUSA,81:6851-6855(1984),Jones et al.,Nature321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-327(1988)；Morrison and Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988),Verhoeyen et al.,Science239:1534-1536(1988)and Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992),Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994))。因此，这种人源化抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中少于完整的人可变结构域大体上被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基所取代的人抗体。例如，包含编码人源化免疫球蛋白构架区的第一序列和编码所需免疫球蛋白互补决定区的第二序列组的多核苷酸可通过合成或组合合适的cDNA和基因组DNA片段产生。人类恒定区DNA序列可根据众所周知的程序从各种人类细胞中分离出来。
“嵌合抗体”是一类抗体分子，其(a)恒定区或其中一部分被改变、置换或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接至具有不同的或改变的效应功能和/或种类的恒定区或完全不同的赋予嵌合抗体新的性质的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等)；或(b)可变区或其部分被具有不同的或改变的抗原特异性的可变区所改变、置换或交换。本发明优选的抗体和用于本发明的抗体包括人源化和/或嵌合单克隆抗体。
将治疗剂缀合至抗体的技术是众所周知的(参见，例如see,e.g.,Arnon et al.,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy",inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom et al.,“Antibodies For Drug Delivery”in ControlledDrug Delivery(2nd Ed.),Robinson et al.(eds.),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:AReview"in Monoclonal Antibodies‘84:Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985)；and Thorpe et al.,"The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.,62:119-58(1982))。如本文所用，术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”是指以缀合或其他方式共价结合抗体的治疗剂。本文所提及的“治疗剂”是用于治疗或预防诸如癌症的疾病的组合物。
当涉及蛋白质或肽时，术语“特异性(或选择性地)结合”抗体或“特异性地(或选择性地)免疫反应性”是指通常在蛋白质和其他生物制剂的异质群体中决定蛋白质存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，特定的抗体与特定蛋白结合至少高于背景两倍，更典型的超过背景10至100倍。在这样的条件下，与抗体的特异性结合需要针对特定蛋白的特异性选择抗体。例如，可以在多克隆抗体中进行选择，以获得仅与所选抗原发生特异性免疫反应而不与其他蛋白质反应的抗体亚群。这种选择可以通过去除与其他分子交叉反应的抗体来实现。多种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，常规使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质发生特异性免疫反应的抗体(参见，例如Harlow&Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998)for a description ofimmunoassay formats and conditions that can be used to determine specificimmunoreactivity)。
“配体”是指能够结合受体的试剂，例如多肽或其他分子。
“标记”、“可检测标记”或“可检测部分”是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的组合物。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，在ELISA中通常使用的)、生物素、地高辛或半抗原和蛋白质或其它可以被检测到的实体，例如通过掺入放射性标记成与靶肽特异性反应的肽或抗体。可以使用本领域已知的用于将抗体缀合至标记的任何合适的方法，例如使用Hermanson，BioconjugateTechniques 1996，Academic Press，Inc.，San Diego中所述的方法。
本文所提供的术语“生物素”是指以与四氢噻吩环稠合的脲基(四氢咪唑并酮)环为特征的化合物。因此，本文所提供的“生物素”是指5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酸，且在习惯上是指CAS注册号58-85-5。如本文所用，“生物素结合结构域”是能够结合生物素的蛋白质结构域。生物素结合结构域的非限制性例子包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。在实施方案中，生物素结合结构域非共价结合生物素。
本文所提供的术语“抗生物素蛋白”或“链霉抗生物素蛋白”包括保持天然存在形式的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的活性(与天然蛋白质相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性)的任何抗生物素蛋白或链霉抗生物素的天然存在形式、同系物、变体或衍生物(例如中性抗生物素蛋白)。在一些实施方案中，与天然形式相比，变体在整个序列或部分序列(例如50、100、150或200个连续的氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在一些实施方案中，抗生物素蛋白是由UniProt序列参考P02701鉴定的蛋白质，其同源物或功能片段。在实施方案中，链菌抗生物素蛋白是由UniProt序列参考P22629鉴定的蛋白质，其同源物或功能片段。
“接触”根据其一般意思使用，是指允许至少两种不同物质(例如包括生物分子或细胞的化学化合物)变得足够近以反应、相互作用或物理接触的过程。然而，应该意识到，所得到的反应产物可以直接由所加入的试剂之间的反应或者从可以在反应混合物中产生的一种或多种加入的试剂的中间体来制备。
术语“接触”可以包括允许两种物质反应、相互作用或物理接触，其中两种物质可以是例如本文所述的生物素结构域和生物素结合结构域。例如在实施方案中，接触允许如本文所述的生物素结构域与生物素结合结构域相互作用。
“对照”样品或值是指作为参考的样品，通常是已知的参考，用于与测试样品比较。例如，测试样品可以获取自测试条件，例如在测试化合物的存在下，并且与来自已知条件的样品(例如在不存在测试化合物的情况下(阴性对照))或者存在的已知化合物(阳性对照)相比较。对照也可以表示从大量测试或结果中收集的平均值。本领域的技术人员将认识到，对照可以被设计用于评估任何数量的参数。例如，可以设计对照以比较基于药理学数据(例如半衰期)或治疗措施(例如副作用比较)的治疗益处。本领域技术人员将理解哪些对照在给定情况下是有价值的，并且能够通过与对照值比较来分析数据。对照对于确定数据的显著性也是有价值的。例如，如果给定参数的值在对照中变化很大，则测试样本的变化被认为是不显著的。
“对照”或“标准对照”是指用作参考(通常是已知参考)的样品、测量或值，用于与测试样品、测量或值进行比较。例如，可以从疑似患有特定疾病的患者(例如自身免疫疾病、炎症性自身免疫疾病、癌症、传染病、免疫疾病或其他疾病)中获取测试样品，并与已知的正常(未患病)个人(例如标准对照对象)比较。标准对照还可以表示从没有给定疾病的相似个体(例如标准对照对象)的群体(例如标准对照群体)收集的平均测量值或数值，例如具有相似医学背景、相同年龄、体重等的健康个体。标准对照值也可以从同一个体获得，例如，来自患者疾病发作之前较早获得的样品。技术人员将认识到，可以设计标准对照用于评估任何数量的参数(例如RNA水平、蛋白质水平、特定细胞类型、特定体液、特定组织、滑膜细胞、滑液、滑液组织、成纤维细胞样滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜细胞等)。
本领域技术人员将理解在给定情况下哪些标准对照是最合适的，并且能够通过与标准对照值的比较来分析数据。标准对照对于确定数据的显著性(例如统计显著性)也是有价值的。例如，如果给定参数的值在标准对照中变化很大，那么测试样本的变化被认为是不显着的。
“患者”或“有需要的对象”是指患有或容易得疾病或病症的活生物体，所述疾病或病症可通过给予本文所提供的组合物或药物组合物来治疗。非限制性例子包括人、其他哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、牛、鹿和其他非哺乳动物。在一些实施方案中，患者是人。
术语“疾病”或“病症”是指能够用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的患者或对象的状态或健康状态。在实施方案中，疾病是癌症(例如肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌(例如默克尔细胞癌)、睾丸癌、白血病、淋巴瘤、头颈癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、神经母细胞瘤)。该疾病可能是自身免疫性、炎症性、癌症、传染性、代谢性、发育性、心血管性、肝脏性、肠道性、内分泌性、神经性或其他疾病。
本文所用术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、肿瘤或恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌肿瘤、癌和肉瘤。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑瘤、宫颈癌、结肠癌、食管癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性、ER阳性、ER阴性、化疗耐药、赫赛汀耐药、HER2阳性、多柔比星耐药、他莫昔芬耐药、导管癌、小叶癌、原发性、转移性)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、去势难治性前列腺癌、乳腺癌，三阴性乳腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头部，颈部或食道)、结肠直肠癌、白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。其他实例包括甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或神经母细胞瘤、霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑瘤、癌症、恶性胰岛瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺髓样肉瘤、黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺乳头状癌、肝细胞癌、乳头佩吉特病、叶状肿瘤、小叶癌、导管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌或前列腺癌。
术语“白血病”广泛地指血液形成器官的进行性恶性疾病，并且通常以血液和骨髓中的白细胞及其前体的异常增殖和发展为特征。白血病的临床分类一般根据(1)急性或慢性疾病的持续时间和特征；(2)涉及的细胞类型；粒系(髓系)、淋巴系(淋巴系统)或单核细胞；和(3)血液白血病或白细胞缺乏的白血病(亚白血病)中异常细胞的数目增加或不增加。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性白血病包括例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、成人T细胞性白血病、白细胞减少性白血病、白细胞增多性白血病、嗜碱性粒细胞性白血病、干细胞性白血病、牛白血病、慢性粒细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、Gross白血病、毛细胞白血病、成血白血病、成血细胞白血病、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴母细胞白血病，淋巴细胞白血病、淋巴性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、微小粒细胞性白血病、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、Naegeli白血病、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、早幼粒细胞白血病、Rieder细胞白血病、Schilling氏白血病、干细胞白血病、亚白血病或未分化细胞白血病。
术语“肉瘤”通常是指由类似胚胎结缔组织的物质组成的肿瘤，并且通常由嵌入纤维状或均质基质中的紧密堆积的细胞组成。可以用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的肉瘤包括软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy's肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、肺泡样软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色癌肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、维尔姆斯瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤因肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素性出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、Jensen肉瘤、卡波西肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白细胞肉瘤、恶性间叶肉瘤、骨旁骨肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、囊泡肉瘤、滑膜肉瘤或毛细血管肉瘤。
术语“黑色素瘤”被认为是指由皮肤和其他器官的黑素细胞系统引起的肿瘤。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的黑色素瘤包括例如肢端雀斑样痣黑色素瘤、无黑素性黑色素瘤、良性少年黑色素瘤、Cloudman黑色素瘤，S91黑色素瘤，Harding-Passey黑色素瘤，少年黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、甲下黑色素瘤或浅表扩散性黑色素瘤。
术语“癌(carcinoma)”是指由上皮细胞趋于渗入周围组织并引起转移的恶性新生物。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性癌症包括，例如甲状腺髓样癌、家族性甲状腺髓质癌、腺泡癌、腺泡状癌、腺样癌、腺样囊性癌、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基癌、基底样癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶质性癌、粉刺性癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、导管癌、硬癌、胚胎性癌、髓样癌、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡癌、纤维癌、明胶酶胃癌、胶状癌、巨细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、发母质癌、血液癌、肝细胞癌，Hurthle细胞癌、透明细胞癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、Krompecher氏癌、Kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌、扁桃体癌、脂肪瘤、小叶癌、淋巴上皮癌、延髓癌、延髓癌、髓样癌、黑色素瘤、软癌、粘液癌、粘液癌、粘液表皮样癌、粘液癌、粘液癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、类骨质癌、乳头状癌、门静脉周癌、侵入前癌、棘细胞癌、红斑癌、肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、schneiderian癌、硬皮癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、类癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、鳞状细胞癌、线状癌、毛细胆管癌、毛细血管癌、移行细胞癌、结节性癌、结节性皮癌、结节性癌、疣状癌或乳头状癌。
本文所用术语“转移”“转移性”和“转移性癌症”可互换使用，是指来自于一个器官或另一个非相邻器官或身体部分的增殖性疾病或病症，例如癌症。癌症发生在原发部位的，例如乳房，被称为原发性肿瘤，例如原发性乳腺癌。原发性肿瘤或原发部位中的一些癌细胞获得穿透和渗透局部区域周围正常组织的能力和/或穿透淋巴系统或血管系统壁的能力，并经由所述淋巴系统或血管系统进入系统循环至身体的其他部位和组织。由原发性肿瘤的癌细胞形成的临床可检的继发性肿瘤称为转移性或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，转移的肿瘤及其细胞被认为与原始肿瘤相似。因此，如果肺癌转移到乳腺，乳腺部位的继发性肿瘤则由异常的肺细胞组成，而不是异常的乳腺细胞。乳腺中的继发性肿瘤是指转移性肺癌。因此，术语转移性癌症是指其中对象患有或具有原发性肿瘤并具有一种或多种继发性肿瘤的疾病。术语非转移性癌症或具有非转移性癌症的对象是指对象具有原发性肿瘤但不具有一种或多种继发性肿瘤。例如，转移性肺癌是指对象患有或具有原发性肺肿瘤病史并且在第二位置或多个位置(例如在乳腺中)具有一个或多个继发性肿瘤的疾病。
本文所用“自身免疫性疾病”是指因对象的免疫系统使免疫反应发生改变引起的疾病或病症，例如针对通常存在于对象体内的物质组织和/或细胞。自身免疫性疾病包括但不限于关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、幼年特发性关节炎、硬皮病、系统性硬皮病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、幼年型糖尿病、1型糖尿病、格林-巴利综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、干燥综合征、血管炎、肾小球肾炎、自身免疫性甲状腺炎、白塞病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、大疱性类天疱疮、结节病、牛皮癣、鱼鳞病、格雷夫斯眼病、艾迪生病、白癜风、哮喘和过敏性哮喘。
本文所用“炎症性疾病”是指与异常或改变的炎症相关的疾病或病症。炎症是由免疫系统引发的生物应答，其为对病原体、受损细胞或组织或刺激物发生应答的愈合过程的一部分。慢性炎症会导致多种疾病。炎症性疾病包括但不限于动脉粥样硬化、变态反应、哮喘、类风湿性关节炎、移植排斥、乳糜泻、慢性前列腺炎、炎性肠病、盆腔炎症和炎性肌病。
本文所用“代谢紊乱”是指涉及包括例如碳水化合物，氨基酸和有机酸的多种分子和物质的异常代谢的疾病或病症。代谢紊乱包括但不限于碳水化合物代谢紊乱(例如糖原贮积症)、氨基酸代谢紊乱(例如苯丙酮尿症、枫糖尿症、1型戊二酸血症)、尿素循环紊乱或尿素循环缺陷(例如氨基甲酰磷酸合成酶I缺乏症)、有机酸代谢障碍(有机酸尿症)(例如尿黑酸尿症)、脂肪酸氧化和线粒体代谢障碍(例如中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症)、卟啉代谢障碍(例如急性间歇性卟啉症)、嘌呤或嘧啶代谢障碍(例如Lesch-Nyhan综合征)、类固醇代谢障碍(例如类脂先天性肾上腺增生症、先天性肾上腺增生症)、线粒体功能障碍(例如Kearns-Sayre综合征)、过氧化物酶体功能障碍(例如Zellweger综合征)和溶酶体贮积症(例如戈谢氏病和尼曼匹克病)。
本文所用“发育障碍”是指通常起源于儿童时期的，与语言障碍、学习障碍、运动障碍和神经发育障碍相关的疾病或障碍。实例包括但不限于自闭症谱系障碍和注意力缺陷障碍。
本文所用“心血管疾病”是指与心脏、血管或两者相关的疾病。心血管疾病包括但不限于冠心病、心肌病、高血压性心脏病、心力衰竭、心脏节律失常、炎性心脏病、外周动脉疾病、脑血管疾病和炎性心脏病。
本文所用“肝脏疾病”是指与肝脏和/或肝脏功能异常有关的疾病。肝脏疾病包括但不限于肝炎、酒精性肝病、脂肪性肝病、肝硬化、布加综合征、吉尔伯特综合征和癌症。
本文所用术语“肠道疾病”是指与(小或大)肠中异常相关的疾病或病症。肠道疾病包括但不限于胃肠炎、结肠炎、回肠炎、阑尾炎、乳糜泻、克伦氏病、肠道病毒、肠易激综合征和憩室病。
本文所用术语“内分泌疾病”是指内分泌系统的疾病或病症，包括内分泌腺分泌过多、内分泌腺分泌过多和肿瘤。内分泌疾病包括但不限于艾迪生病、糖尿病、康恩综合征、库欣综合征、糖皮质激素可治性醛固酮增多症、低血糖症、甲亢、甲状腺功能减退症、甲状腺炎、垂体机能减退症、性腺机能减退症和甲状旁腺疾病。
本文所用术语“神经障碍”是指身体神经系统的疾病或病症，包括结构性、生化或电异常。神经障碍包括但不限于脑损伤、脑功能障碍、脊髓障碍、外周神经病、颅神经障碍、自主神经系统障碍、癫痫、运动障碍例如帕金森病和多发性硬化以及中枢神经病。
本文所用术语“感染性疾病”是指与感染、宿主对象中病原体的存在和/或生长相关的疾病或病症。感染性病原体包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物、多细胞寄生虫和异常蛋白质，例如朊病毒。与感染性疾病有关的病毒包括但不限于单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、水痘带状疱疹病毒、疱疹病毒、水泡性口炎病毒、肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、流感病毒、麻疹病毒、多瘤病毒、人肺炎病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、劳氏肉瘤病毒、黄热病毒、埃博拉病毒、猿免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒。与感染性疾病相关的细菌包括但不限于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、沙门氏菌属(Salmonella)、大肠杆菌、衣原体属(Chlamydia)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种和假单胞菌属(Pseudomonas)物种。
“抗癌剂”按照其普通含义使用，是指具有抗肿瘤特性或抑制细胞生长或增殖能力的组合物(例如化合物、药物、拮抗剂、抑制剂、调节剂)。在实施方案中，抗癌剂是化学治疗剂。在实施方案中，抗癌剂是本文鉴定的在治疗癌症的方法中具有实用性的药剂。在实施方案中，抗癌剂是美国FDA或美国以外的国家的类似管理机构批准用于治疗癌症的药剂。
“化疗剂”或“化学治疗剂”根据其普通意义使用，是指具有抗肿瘤特性或抑制细胞生长或增殖能力的化学组合物或化合物。
术语“相关”或“与……相关”在与疾病(例如糖尿病，癌症(例如前列腺癌，肾癌，转移性癌症，黑素瘤，去势抵抗性前列腺癌，乳腺癌，三阴性乳腺癌，胶质母细胞瘤，卵巢癌，肺癌，鳞状细胞癌(例如头部，颈部或食道)，结直肠癌，白血病，急性骨髓性白血病，淋巴瘤，B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤))相关的物质或物质活性或功能的上下文中意指疾病(例如肺癌，卵巢癌，骨肉瘤，膀胱癌，宫颈癌，肝癌，肾癌，皮肤癌(例如默克尔细胞癌)，睾丸癌，白血病，淋巴瘤，头颈癌，结直肠癌，前列腺癌，胰腺癌，黑素瘤，乳腺癌，神经母细胞瘤)是由(全部或部分)所述物质或物质活性或功能引起的，或者疾病的症状是由(全部或部分)所述物质或物质活性或功能引起的。
这里使用的术语“异常”是指与正常不同的。当用于描述酶活性时，异常是指比正常对照或正常非患病对照样品的平均值更高或更低的活性。异常活性可以指导致疾病的活性的量，其中异常活性恢复至正常或非疾病的量(例如通过使用本文所述的方法)，导致疾病或一种或更多疾病症状减轻。
本文所用术语“细胞穿透性”或“细胞穿透”是指分子(例如抗体、治疗性部分)以显著或有效剂量从细胞外环境传递穿到细胞中的能力。因此，细胞穿透缀合物是从细胞外环境通过细胞膜进入细胞的分子。
本文所用术语“非细胞穿透的”或“非细胞穿透”是指分子(例如抗体、治疗性部分)不能以显著或有效剂量从细胞外环境进入细胞。因此，非细胞穿透肽或蛋白质通常不能从细胞外环境穿过细胞膜进入细胞从而对细胞、器官或生物体群体实现显著的生物学作用。该术语不排除少量的一种或多种肽或蛋白质能够进入细胞的可能性。然而，该术语是指通常不能从细胞外环境以显著程度进入细胞的分子。非细胞穿透分子和物质的实例包括但不限于大分子，例如高分子量蛋白质(例如抗体)。使用本领域技术人员已知的方法可以确定肽或蛋白质是非细胞穿透的。举例来说，肽或蛋白质可以被荧光标记，并且肽或蛋白质从细胞外环境进入细胞的能力可以通过流式细胞术分析或共聚焦显微镜在体外测定。在一些实施方案中，“非细胞穿透蛋白”是指蛋白质(例如抗体)穿透细胞的能力至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、10,000或100,000倍低于与硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链连接的相同蛋白质。在一些实施方案中，“非细胞穿透蛋白”是指不可测量地穿透细胞的蛋白质。
本文所用“分子量”(M.W.)或“分子质量”是指分子中所有原子的原子量的总和。就分子而言，具有高分子量的分子通常具有25kDa或更高的分子量。举例来说，高分子量蛋白质可具有约25kDa至1000kDa或更高的M.W.。
本文所用术语“细胞内”意指在细胞内部。本文所用“细胞内靶”是位于细胞内的靶标，例如核酸、多肽或其他分子(例如碳水化合物)，并且是与本文提供的非细胞穿透蛋白结合的靶标。结合可以是直接的或间接的。在实施方案中，非细胞穿透蛋白选择性结合细胞内靶。术语“选择性结合”，“选择性结合的”或“特异性结合的”是指第一种试剂(例如，非细胞穿透蛋白)与第二种试剂(例如细胞内靶标)之间部分或完全排除其他试剂的相互作用。“结合”是指可检测的结合是测定方法背景的至少约1.5倍。对于选择性或特异性结合，可以针对给定的药剂而不是对照药剂检测到这种可检测的结合。或者或另外，结合的检测可以通过测定下游分子或事件的存在来确定。
本文所用术语“缀合物”是指原子或分子之间的缔合。该缔合可以是直接或间接的。例如，核酸(例如硫代磷酸酯核酸)与蛋白质(例如抗体，本文提供的治疗性部分)之间的缀合物可以是直接的(例如通过共价键)，或间接的(例如通过非共价键(例如静电相互作用(例如离子键、氢键、卤键))、范德华相互作用(例如偶极-偶极、偶极诱导偶极、伦敦分散)、环堆积(π效应)、疏水相互作用等)。在实施方案中，使用缀合化学形成缀合物，包括但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如烯胺反应)以及碳-碳和碳-杂原子多重键(例如Michael反应、Diels-Alder加成)。这些和其他有用的反应讨论于，例如March,ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY,3rd Ed.,John Wiley & Sons,New York,1985；Hermanson,BIOCONJUGATE TECHNIQUES,Academic Press,San Diego,1996；and Feeney etal.,MODIFICATION OF PROTEINS；Advances in Chemistry Series,Vol.198,AmericanChemical Society,Washington,D.C.,1982。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸、硫代磷酸酯主链聚合物或非细胞穿透蛋白通过硫代磷酸酯核酸的组分、硫代磷酸酯主链聚合物和硫代磷酸酯主链聚合物(例如单硫代磷酸酯)之间的非共价化学反应非共价连接至生物素结合结构域或生物素结构域或非细胞穿透蛋白和生物素结合结构域或生物素结构域的组分(例如氨基酸)。在其他实施方案中，硫代磷酸酯核酸、硫代磷酸酯主链聚合物或非细胞穿透蛋白包括一个或多个反应性部分，例如本文所述的共价反应性部分(例如，氨基酸反应性部分，如乙烯基砜部分(-S(O)2CH＝CH 2)。一个或多个反应性部分可以与生物素结合结构域或生物素结构域的第二反应性部分反应，从而形成共价键。生物素结构域或生物素结合结构域的反应性部分可不受限制地与非细胞穿透蛋白或硫代磷酸酯核酸的胍或胞嘧啶碱基或硫代磷酸酯主链聚合物的伯胺、巯基部分、羧基部分、碳水化合物部分、酪氨酸侧链或组氨酸侧链反应。生物素化(与生物素区域结合)或抗生物素蛋白化(与生物素结合域结合)和其他有用反应的反应化学讨论于，例如Nelson WM,Wojnar WA.The use ofphotobiotinylated PCR primers for magnetic bead-based solid phasesequencing.Human Genome III October 21-23,1991San Diego,CA.Poster no.T41；andThermo ScientificAvidin-Biotin Technical Handbook published March,2009,as1601675_AvBi_HB_INTL.pdf.。
有用的反应部分，包括用于本文缀合物化学的共价反应性部分或官能团，包括例如：
(a)羧基及其各种衍生物，包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰基卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳族酯；
(b)可以转化成酯、醚、醛等的羟基；
(c)卤代烷基，其中卤素可随后用亲核基团例如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、碳阴离子或醇盐离子置换，从而导致新基团共价连接于卤素原子的位置；
(d)能够参与狄尔斯-阿德耳反应的亲双烯体基团，例如马来酰亚胺基团；
(e)醛或酮基，使得随后的衍生化可通过形成羰基衍生物例如亚胺、腙、缩氨基脲或肟，或通过例如格氏加成或烷基锂加成的机制而形成；
(f)磺酰卤基团，用于随后与胺反应，例如形成磺酰胺；
(g)可转化为二硫化物的硫醇基团，与酰基卤化物反应或与金属例如金结合；
(h)胺或巯基，其可以例如酰化、烷基化或氧化；
(i)烯烃，其可以经历例如环加成反应、酰化反应、迈克尔加成等；
(j)可与例如胺和羟基化合物反应的环氧化物；
(k)亚磷酰胺和用于核酸合成的其他标准官能团；
(l)金属氧化硅键合；
(m)与反应性磷基(例如膦)键合形成例如磷酸二酯键的金属；和
(n)砜，例如乙烯基砜。
可以选择反应性官能团，使得它们不参与或干扰本文所述蛋白质的化学稳定性。举例来说，核酸可以包含乙烯基砜或其他反应性部分。例如，具有乙烯基砜反应性部分的核酸可以由具有S-S-R部分的核酸形成，其中R是-(CH2)6-OH。具有乙烯基砜的核酸还可以由具有末端磷酸酯(PS)的核酸形成。
“生物样品”或“样品”是指从对象或患者取得或获得的材料。生物样品包括组织切片，例如组织活检样品和尸检样品，以及为了组织学目的而取的冷冻切片。此类样品包括体液如血液和血液成分或产品(例如血清、血浆、血小板、红细胞等)、痰、组织、培养的细胞(例如原代培养物，外植体和转化的细胞)、粪便、滑液、关节组织、滑膜组织、滑膜细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜细胞、免疫细胞、造血细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞等。生物样品，典型地获取自真核生物，如哺乳动物，如灵长类如黑猩猩或人；牛；狗；猫；啮齿动物例如豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鸟；爬虫；或鱼。
本文使用的“细胞”是具有足以保存或复制其基因组DNA的代谢或其他功能的细胞。细胞可以通过本领域众所周知的方法鉴定，包括例如完整膜的存在、特定染料的染色、产生后代的能力、或者在配子的情况下能够与第二配子产生一个有活性的后代。细胞可以包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞和来源于植物和动物的细胞，例如哺乳动物、昆虫(例如斜纹夜蛾)和人类细胞。当细胞天然不贴壁或已被如胰蛋白酶消化处理至不贴壁到表面时，细胞可以使用。
细胞穿透缀合物
本文提供的细胞穿透缀合物包括通过硫代磷酸酯核酸分子连接到治疗性部分的非细胞穿透蛋白。一方面，提供了细胞穿透缀合物。细胞穿透缀合物包括(i)非细胞穿透蛋白(例如抗体)，(ii)硫代磷酸酯核酸，(iii)将硫代磷酸酯核酸连接(例如，共价或非共价)至非细胞穿透蛋白(例如抗体)的第一接头，和(iv)将硫代磷酸酯核酸连接(例如，共价或非共价)至治疗性部分(例如，小分子，siRNA)的第二接头，其中硫代磷酸酯核酸增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。本文提供的缀合物尤其可用于细胞内递送治疗性部分以治疗多种疾病(例如癌症)。非细胞穿透蛋白可以是能够结合肿瘤特异性细胞表面蛋白(例如抗原)的抗体。通过将非细胞穿透蛋白与癌细胞上的细胞表面蛋白质结合，缀合物被癌细胞内化，从而向癌细胞内递送治疗性部分。
本文提供的第一和第二接头可以是化学接头。在实施方案中，化学接头是共价接头、非共价接头、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基或其任何组合。因此，如本文所提供的化学接头可以包括多个化学部分，其中多个部分中的每一个是化学上不同的。
在实施方案中，第一接头是非共价接头。在实施方案中，第一接头是共价接头。在实施方案中，第二接头是非共价接头。在实施方案中，第二接头是共价接头。在实施方案中，第一接头是非共价接头并且第二接头是共价接头。在实施方案中，第一接头是共价接头并且第二接头是非共价接头。在实施方案中，第一接头或第二接头是键。在实施方案中，第一接头是键。在实施方案中，第二接头是键。
在实施方案中，第一接头是非共价接头。如本文所提供的非共价接头是包含非共价连接至第二结合结构域(例如，生物素结合结构域或生物素结构域)的第一结合结构域(例如，生物素结构域或生物素结合结构域)的接头。因此，非共价接头通过第一结合结构域和第二结合结构域之间的非共价结合形成。
在实施方案中，第一接头包含第一结合结构域和第二结合结构域。在实施方案中，第二接头包含第三结合结构域和第四结合结构域。第一结合结构域、第二结合结构域、第三结合结构域和第四结合结构域可以相同或不同。在实施方案中，第一结合结构域是第一生物素结合结构域(例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白)。在实施方案中，第二结合结构域是第一生物素结构域(例如生物素)。在实施方案中，第三结合结构域是第二生物素结合结构域(例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白)。在实施方案中，第四结合结构域是第二生物素结构域(例如生物素)。在实施方案中，第一结合结构域是第一生物素结构域(例如生物素)。在实施方案中，第二结合结构域是第一生物素结合结构域(例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白)。在实施方案中，第三结合结构域是第二生物素结构域(例如生物素)。在实施方案中，第四结合结构域是第二生物素结合结构域(例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白)。在实施方案中，第一接头包含非共价连接至第一生物素结构域的第一生物素结合结构域。在实施方案中，第二接头包括非共价连接至第二生物素结构域的第二生物素结合结构域。
第一生物素结合结构域、第二生物素结合结构域、第一生物素结构域和第二生物素结构域可分别共价或非共价连接至非细胞穿透蛋白、硫代磷酸酯核酸或治疗性部分。在实施方案中，非细胞穿透蛋白与第一生物素结合结构域(例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白)共价连接，并且硫代磷酸酯核酸与第一生物素结构域(例如生物素)共价连接。在实施方案中，非细胞穿透蛋白共价连接至第一生物素结构域(例如生物素)，并且硫代磷酸酯核酸共价连接至第一生物素结合结构域(例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白)。在实施方案中，治疗性部分共价连接至第二生物素结合结构域(例如抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白)，并且硫代磷酸酯核酸共价连接至第二生物素结构域(例如生物素)。在实施方案中，治疗性部分共价连接至第二生物素结构域(例如生物素)，并且硫代磷酸酯核酸共价连接至第二生物素结合结构域(例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白)。
本文提供的第一接头和第二接头可以是共价接头。本文提供的接头(例如第一接头，第二接头)可以共价连接非细胞穿透蛋白、硫代磷酸酯核酸或其应用方法为本领域众所周知的且与接头组合物和非细胞穿透蛋白相容的治疗性部分、硫代磷酸酯核酸和治疗性部分。本文提供的接头可以包括，在与非细胞穿透蛋白的连接点处、在与硫代磷酸酯核酸的连接点处或在与治疗性部分的连接点处的反应性基团(例如，炔烃、叠氮化物、马来酰亚胺或硫醇反应性部分)。因此，本文提供的接头可以是多价的并且可以通过缀合化学技术形成。可用于本文提供的组合物和方法(例如第一接头、第二接头)的接头的非限制性实例包括烷基(包括取代的烷基和含有杂原子部分的烷基)、短烷基、酯、酰胺、胺、环氧基团和乙二醇或其衍生物。本文提供的接头(例如第一接头、第二接头)可以包括砜基、形成磺酰胺、酯基或醚基(例如三乙基醚)。
在实施方案中，第一接头包括非共价连接至第一生物素结构域的第一生物素结合结构域。在实施方案中，第一生物素结合结构域是第一抗生物素蛋白结构域。在实施方案中，第一生物素结合结构域是第一链霉抗生物素蛋白结构域。在实施方案中，第一链霉抗生物素蛋白结构域结合多个第一生物素结构域。在实施方案中，第一链霉抗生物素蛋白结构域结合约四个第一生物素结构域。
在实施方案中，第一生物素结合结构域连接至非细胞穿透蛋白。在实施方案中，第一生物素结合结构域共价连接至非细胞穿透蛋白。在实施方案中，第一生物素结合结构域非共价连接至非细胞穿透蛋白。在实施方案中，多个第一生物素结合结构域连接至非细胞穿透蛋白。在实施方案中，第一生物素结合结构域连接至硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，第一生物素结合结构域共价连接至硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，第一生物素结合结构域非共价连接至硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，多个硫代磷酸酯核酸连接至第一生物素结合结构域。
在实施方案中，第一生物素结构域连接于硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，第一生物素结构域共价连接至硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，第一生物素结构域非共价连接至硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，多个硫代磷酸酯核酸连接至第一生物素结构域。在实施方案中，第一生物素结构域连接至非细胞穿透蛋白。在实施方案中，第一生物素结构域共价连接至非细胞穿透蛋白。在实施方案中，第一生物素结构域非共价连接至非细胞穿透蛋白。在实施方案中，第一生物素结合结构域非共价连接至第一生物素结构域，从而形成第一接头。
在实施方案中，第一接头或第二接头是共价接头。在实施方案中，第二接头是共价接头。在实施方案中，第一接头是共价接头。在实施方案中，第一接头是键。在实施方案中，第二接头是键。在实施方案中，第一接头是共价接头，第二接头是共价接头。在实施方案中，第一接头是非共价接头，第二接头是非共价接头。在实施方案中，第一接头是共价接头，第二接头是非共价接头。在实施方案中，第一接头是非共价接头并且第二接头是共价接头。在进一步的实施方案中，第二接头是键。
在实施方案中，第二接头包括非共价连接至第二生物素结构域的第二生物素结合结构域。在实施方案中，第二生物素结合结构域是第二抗生物素蛋白结构域。在实施方案中，第二生物素结合结构域是第二链霉抗生物素蛋白结构域。在实施方案中，第二链霉抗生物素蛋白结构域结合多个第二生物素结构域。在实施方案中，第二链霉抗生物素蛋白结构域结合约四个第二生物素结构域。
在实施方案中，第二生物素结合结构域连接至治疗性部分。在实施方案中，第二生物素结合结构域共价连接至治疗性部分。在实施方案中，第二生物素结合结构域非共价连接至治疗性部分。在实施方案中，多个第二生物素结合结构域连接至治疗性部分。在实施方案中，第二生物素结合结构域连接至硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，第二生物素结合结构域共价连接至硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，第二生物素结合结构域非共价连接至硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，多个硫代磷酸酯核酸连接至第二生物素结合结构域。
在实施方案中，第二生物素结构域连接至硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，第二生物素结构域共价连接至硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，第二生物素结构域非共价连接于硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，多个硫代磷酸酯核酸连接到第二生物素结构域。在实施方案中，第二生物素结构域连接至治疗性部分。在实施方案中，第二生物素结构域共价连接至治疗性部分。在实施方案中，第二生物素结构域非共价连接至治疗性部分。在实施方案中，第二生物素结合结构域非共价连接至第二生物素结构域，从而形成第二接头。
如上所述，核酸(例如硫代磷酸酯核酸)通过共价接头或非共价接头(本文也称为第一接头)连接至非细胞穿透蛋白。核酸(例如硫代磷酸酯核酸)可通过共价接头或非共价接头(本文也称为第二连接头)连接至治疗性部分。当接头是非共价接头时，接头可以包括生物素结合结构域(例如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)和生物素结构域。核酸例如硫代磷酸酯核酸可以通过各种机制连接到第一或第二生物素结合结构域或第一或第二生物素结构域。类似地，非细胞穿透蛋白或治疗性部分可通过多种机制连接到第一生物素结构域或第一生物素结合结构域或第二生物素结构域或第二生物素结合结构域。硫代磷酸酯核酸、非细胞穿透蛋白或治疗性部分可以共价或非共价连接至生物素结合结构域或生物素结构域。非细胞穿透蛋白可以与生物素结合结构域或生物素结构域共价结合。当非细胞穿透蛋白与生物素结合结构域或生物素结构域共价结合时，生物素结合结构域或生物素结构域共价结合蛋白质的氨基酸。在实施方案中，非细胞穿透蛋白包括共价反应性部分(如上所述)，并且反应性部分与生物素结合结构域或生物素结构域具有反应性。在实施方案中，生物素结合结构域或生物素结构域包括共价反应性部分，并且反应性部分与非细胞穿透蛋白有反应性。
在实施方案中，硫代磷酸酯核酸包含共价反应性部分，并且反应性部分与生物素结合结构域或生物素结构域具有反应性。在实施方案中，治疗性部分包括共价反应性部分，并且反应性部分与生物素结合结构域或生物素结构域有反应性。如上所述，共价反应性部分可以与蛋白质的赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或组氨酸(例如与氨基酸侧链)有反应性。在实施方案中，共价反应性部分与半胱氨酸有反应性。共价反应性部分可以是乙烯基砜。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸包括具有式S-S-R的反应性部分，其中R是保护基。在实施方案中，R是己醇(一价取代基)。如本文所用，术语己醇包括具有式C6H13OH的化合物并且包括1-己醇、2-己醇、3-己醇、2-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、1-戊醇、2-甲基-2-戊醇、3-甲基-2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、3-甲基-3-戊醇、2,2-二甲基-1-戊醇、丁醇、2,3-二甲基-1-丁醇、3,3-二甲基-1-丁醇、2,3-二甲基-2-丁醇、3,3-二甲基-2-丁醇和2-乙基-1-丁醇。在实施方案中，R是1-己醇。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸与生物素结合结构域或生物素结构域共价结合。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸包含反应性部分。在实施方案中，治疗性部分包含反应性部分。在实施方案中，反应性部分是乙烯基砜或具有式S-S-R的反应性部分，如上所述。在实施方案中，R为己醇，例如1-己醇。
在实施方案中，多个硫代磷酸酯核酸连接至生物素结合结构域或生物素结构域，并且多个核酸中的每一个核酸共价或非共价连接。在实施方案中，多个生物素结合结构域或生物素结构域连接至非细胞穿透蛋白，并且多个结构域中的每一个都共价或非共价连接。在实施方案中，多个生物素结合结构域或生物素结构域连接至治疗性部分，并且多个结构域中的每一个共价或非共价连接。硫代磷酸酯核酸、非细胞穿透蛋白或治疗性部分可以包含反应性部分，例如氨基酸反应性部分或共价反应性部分，其促进硫代磷酸酯核酸、非细胞穿透蛋白或治疗部位与生物素结合结构域或生物素结构域连接。因此，硫代磷酸酯核酸、非细胞穿透蛋白或治疗部位可通过本文所述的反应性部分连接至生物素结合结构域或生物素结构域。
在实施方案中，第一和第二接头独立地是共价接头。因此，在实施方案中，非细胞穿透蛋白通过第一接头共价连接至硫代磷酸酯核酸，并且治疗性部分通过第二接头共价连接至硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，第一和第二接头独立地是非共价接头。因此，在实施方案中，非细胞穿透蛋白通过第一接头非共价连接至硫代磷酸酯核酸，并且治疗性部分通过第二接头非共价连接至硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，第一接头是非共价接头并且第二接头是共价接头。因此，在实施方案中，非细胞穿透蛋白通过第一接头非共价连接至硫代磷酸酯核酸，并且治疗性部分通过第二接头共价连接至硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，第一接头是共价接头，第二接头是非共价接头。因此，在实施方案中，非细胞穿透蛋白通过第一接头共价连接至硫代磷酸酯核酸，并且治疗性部分通过第二接头非共价连接至硫代磷酸酯核酸。
在一个实施方案中，非细胞穿透蛋白是抗体。第一接头包括第一生物素结合结构域和第一生物素结构域，其中所述第一生物素结合结构域是抗生物素蛋白结构域，第二接头是共价接头，治疗性部分是siRNA。在另一个实施方案中，抗体是抗-PSMA抗体。在另一个实施方案中，siRNA是STAT3 siRNA。
在一个实施方案中，非细胞穿透蛋白是抗体，第一接头是共价接头，第二接头是共价接头，治疗性部分是siRNA。在另一个实施方案中，抗体是抗-PSMA抗体。在另一个实施方案中，siRNA是STAT3 siRNA。
在另一个实施方案中，所述非细胞穿透蛋白是抗体，所述第一接头包含第一生物素结合结构域和第一生物素结构域，其中所述第一生物素结合结构域是抗生物素蛋白结构域，所述第二接头是共价接头，治疗性部分是化合物。在另一个实施方案中，抗体是抗-PSMA抗体。在另一个实施方案中，该化合物是DM1。
在另一个实施方案中，非细胞穿透蛋白是抗体，第一接头是共价接头，第二接头是共价接头，治疗性部分是化合物。在另一个实施方案中，抗体是抗-PSMA抗体。在另一个实施方案中，该化合物是DM1。
在一个实施方案中，非细胞穿透蛋白是抗体，第一接头包含第一生物素结合结构域和第一生物素结构域，其中所述第一生物素结合结构域是抗生物素蛋白结构域，第二接头包含第二生物素结合结构域和第二生物素结构域，其中所述第二生物素结合结构域是抗生物素蛋白结构域，并且所述治疗性部分是抗体。在另一个实施方案中，治疗性部分是抗Her2抗体。在另一个实施方案中，治疗性部分是曲妥珠单抗。
在实施方案中，硫代磷酸酯核酸是双链硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸是单链硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸长度为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个核酸残基。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸的长度为约10至约30个核酸残基。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸的长度为约20个核酸残基。在实施方案中，每个核酸的长度为至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个核酸残基或糖残基。在实施方案中，每个硫代磷酸酯核酸长度为5至50、10至50、15至50、20至50、25至50、30至50、35至50、40至50、45至50、5至75、10至75、15至75、20至75、25至75、30至75、35至75、40至75、45至75、50至75、55至75、60至75、65至75、70至75、5至100、10至100、15至100、20至100、25至100、30至100、35至100、40至100、45至100、50至100、55至100、60至100、65至100、70至100、75至100、80至100、85至100、90至100、95至100或更多个残基。在实施方案中，每个硫代磷酸酯核酸长度为10至15、10至20、10至30、10至40或10至50个残基。
在实施方案中，非细胞穿透蛋白具有大于25kD的分子量。在实施方案中，非细胞穿透蛋白具有约25kD至约750kD的分子量。因此，非细胞穿透蛋白的分子量为至少约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750或更多千道尔顿(kD)。在实施方案中，非细胞穿透蛋白的分子量为至少约25至100kD，至少约25至150kD，至少约25至200kD，至少约25至250kD，至少约25至少约25至350kD，至少约25至400kD，至少约25至450kD，至少约25至500kD，至少约25至550kD，至少约25至600kD，至少约25至650kD，至少约25至700kD或至少约25至750kD。
在实施方案中，非细胞穿透蛋白是抗体。如上面更详细讨论的，抗体可以是全长抗体，例如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体或其片段。在实施方案中，抗体是IgG抗体或其片段。在实施方案中，抗体是IgG抗体或其片段。在实施方案中，抗体是scFv片段或人源化抗体。在实施方案中，抗体是IgA、IgM、IgD或IgE抗体。在实施方案中，抗体是scFv片段。在实施方案中，抗体是人源化抗体。在实施方案中，抗体是人抗体。因此，本文提供的是形成缀合物的一部分的抗体，其中所述抗体通过第一接头与硫代磷酸酯核酸连接，并且所述硫代磷酸酯核酸通过第二接头连接至治疗性部分，其中所述硫代磷酸酯核酸增强缀合物的递送入细胞。
在实施方案中，非细胞穿透蛋白结合细胞表面蛋白。细胞表面蛋白可以在癌细胞表面表达。因此，在实施方案中，细胞表面蛋白是癌蛋白。在实施方案中，细胞表面蛋白是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。在实施方案中，细胞表面蛋白是人表皮生长因子受体2(HER2)。在实施方案中，细胞表面蛋白是VEGFR。在实施方案中，细胞表面蛋白是CTLA4。在实施方案中，细胞表面蛋白是EGFR。在实施方案中，细胞表面蛋白是IL-6R。在实施方案中，细胞表面蛋白是IL-17R。在实施方案中，细胞表面蛋白是PDL-1。在实施方案中，细胞表面蛋白是PDL。在实施方案中，细胞表面蛋白是PDGFR。在实施方案中，细胞表面蛋白是S1PR1。
如本文所提供的术语“治疗性部分”根据其普通含义使用，并且是指当给予有需要的对象时具有治疗益处(例如预防、根除、改善所治疗的潜在病症)的单价化合物。本文提供的治疗性部分可以包括但不限于肽、蛋白质、核酸、核酸类似物、小分子、抗体、酶、前药、细胞毒性剂(例如毒素)，包括但不限于蓖麻毒素、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素和糖皮质激素。在实施方案中，治疗性部分是如本文所述的抗癌剂或化学治疗剂。在实施方案中，治疗性部分是核酸部分(例如，siRNA部分)、肽部分或小分子药物部分。在实施方案中，治疗性部分是核酸部分。在实施方案中，治疗性部分是抗体部分。在实施方案中，治疗性部分是肽部分。在实施方案中，治疗性部分是小分子药物部分。在实施方案中，治疗性部分是核酸酶。在实施方案中，治疗性部分是免疫刺激剂。在实施方案中，治疗性部分是毒素。在实施方案中，治疗性部分是核酸酶。在实施方案中，治疗性部分是小抑制性RNA(siRNA)。在实施方案中，治疗性部分是化合物、小分子、核酸或多肽。在实施方案中，治疗性部分是siRNA、saRNA、shRNA或miRNA。在实施方案中，siRNA是STAT3 siRNA。在实施方案中，治疗性部分是抗体或其片段。在实施方案中，治疗性部分是曲妥珠单抗。在实施方案中，治疗性部分是小分子。在实施方案中，治疗性部分是细胞毒性部分。在实施方案中，治疗性部分是DM1。本文提供的DM1是指N2'-脱乙酰-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素，并且在常规意义上指PubChem No.11343137。
在实施方案中，非细胞穿透蛋白进一步包含与蛋白质连接的标记、小分子或功能性核酸。标记或可检测部分是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的组合物。有用的标记包括但不限于32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如在ELISA中常用的)、生物素、地高辛、或半抗原和蛋白质或其他可以被检测的实体，例如通过将放射性标记掺入到与靶肽特异性反应的肽或抗体中。可以使用本领域已知的用于将非细胞穿透蛋白(例如抗体)缀合至标记的任何方法，例如使用Hermanson,BioconjugateTechniques 1996,Academic Press,Inc.,San Diego中所描述的方法。
细胞组合物
另一方面，提供包括本文提供的细胞穿透缀合物及其实施方案的细胞。提供了包括一种或多种所提供的细胞穿透缀合物的细胞，例如，细胞可包括多种细胞穿透缀合物。在实施方案中，缀合物与细胞表面蛋白结合。
药物组合物
本文提供了包含细胞穿透缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。所提供的组合物尤其适用于体外或体内的配制和施用。Remington:The Science and Practice ofPharmacy,21st Edition,David B.Troy,ed.,Lippicott Williams&Wilkins(2005)中描述了合适的载体和赋形剂及其制剂。药学上可接受的载体是指并非在生物学上或其他方面是不良的材料，即将材料施用至对象而不引起不良的生物效应或不与其药物组合物中的其它组分以有害的方式相互作用。如果施用至对象，则选择性地选择载体以最小化活性成分的降解并使对象中的不利副作用最小化。
本发明提供的药物组合物包括，其中活性成分(例如本文所述的组合物，包括实施方案或实施方案)具有有效治疗量，即有效实现其预期目的的量的组合物。对特定应用，有效的实际量将取决于所治疗的病症等。当在治疗疾病的方法中施用时，本文所述的重组蛋白将含有一定量的活性成分以有效获得所需结果，例如调节靶分子的活性，和/或减少、消除或减缓疾病症状。确定本发明化合物的治疗有效量，特别是当根据本文的详细公开内容时，完全在本领域技术人员的能力范围内。
另一方面，提供了包含本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)和药学上可接受的载体的药物组合物。所提供的组合物可以包含单一药剂或多于一种药剂。用于施用的组合物通常将包含本文所述的、溶解于药学上可接受的载体中的试剂，优选水性载体。可以使用各种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶剂是无菌的，并且通常没有不良的问题。这些组合物可以通过常规的、众所周知的灭菌技术灭菌。所述组合物可以根据需要包含药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中活性剂的浓度可以在很宽的范围内变化，并且将根据所选择的特定施用模式和对象的需要，主要基于流体体积、粘度、体重等来选择。
作为游离碱或药学上可接受的盐的活性化合物溶液可以在与表面活性剂如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物的生长。
药物组合物可通过鼻内或可吸入溶液或喷雾剂、气雾剂或吸入剂递送。鼻腔溶液可以是设计成以滴剂或喷雾的形式给予鼻腔的水溶液。可以制备鼻腔溶液，使其在许多方面与鼻腔分泌物类似。因此，鼻用水溶液通常是等渗的并且缓冲以保持5.5至6.5的pH。另外，如果需要，抗微生物防腐剂可以包含在制剂中，类似于在眼用制剂和适当的药物稳定剂中使用的防腐剂。各种商业鼻用制剂是已知的，并且可以包括例如抗生素和抗组胺剂。
口服制剂可以包括赋形剂，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素，碳酸镁等。这些组合物采取溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉剂的形式。在一些实施方案中，口服药物化合物将包含惰性稀释剂或可吸收的可食用载体，或者它们可以封装在硬或软壳明胶胶囊中，或者它们可以被压制成片剂，或者它们可以直接掺入饮食食品。对于口服治疗施用，活性化合物可以与赋形剂混合并以可吸收片剂、口腔片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式使用。这种组合物和制剂应含有至少0.1％的活性化合物。当然，组合物和制剂的百分比可以变化，并且可以适当地在单位重量的约2％至约75％之间，或者优选在25％至60％之间。这种组合物中的活性化合物的合适剂量是可以获得的。
例如，对于用水溶液的肠胃外施用，溶液应适当地缓冲并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。水溶液，特别是无菌水介质特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。例如，一个剂量可以溶解在1毫升的等渗NaCl溶液中，并加入到1000毫升的皮下注射液中，或者在建议的注射部位注射。
无菌注射溶液可通过将活性化合物或构建物以所需量掺入合适的溶剂中然后过滤灭菌来制备。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质的无菌载体中来制备分散液。可以使用真空干燥和冷冻干燥技术(其产生活性成分加任何其他所需成分的粉末)来制备用于配制无菌注射溶液的无菌粉末。还设想了用于直接注射的更多或高度浓缩溶液的制备。DMSO可以用作极其快速渗透的溶剂，将高浓度的活性剂递送到小区域。
化合物的制剂可以存于单位剂量或多剂量的密封容器，如安瓿和小瓶。因此，组合物可以是单位剂量形式。在这种形式下，制剂被细分成含有适量活性成分的单位剂量。因此，依据施用方法，组合物可以以各种单位剂量形式施用。例如，适于口服施用的单位剂型包括但不限于粉末、片剂、丸剂、胶囊和锭剂。
施用至哺乳动物的剂量和频率(单剂量或多剂量)可以根据各种因素而变化，例如，哺乳动物是否患有另一种疾病及其施用途径；体型、年龄、性别、健康状况、体重、体重指数和饮食情况；被治疗疾病症状的性质和程度(例如，癌症的症状和这种症状的严重程度)、并行治疗的种类、正在治疗的疾病的并发症或其他与健康有关的问题。其他治疗方案或药剂可以与本发明的方法和化合物联合使用。已建立的剂量(例如频率和持续时间)的调整和操作完全在本领域技术人员的能力范围内。
对于本文所述的任何组合物(例如，提供的细胞穿透缀合物)，治疗有效量可以首先由细胞培养测定法确定。如使用本文所述或本领域已知的方法测量，目标浓度将是能够实现本文所述方法的那些活性化合物浓度。如本领域众所周知的，用于人类的有效量也可以由动物模型确定。例如，可以配制人用剂量以达到已经发现的在动物中的有效浓度。如上所述，可以通过监测有效性并向上或向下调整剂量来调整人体剂量。基于上述方法和其他方法，调整剂量以达到人体最大功效完全在普通技术人员的能力范围内。
剂量可根据患者和所用化合物的需要而变化。在本发明的背景中给予患者的剂量应该足以随时间影响患者的有益治疗反应。剂量的大小还取决于任何不良副作用的存在、性质和程度。确定特定情况下的适当剂量在医师的技能范围内。一般而言，治疗以小于化合物最佳剂量的较小剂量开始。此后，剂量以小增量增加，直到达到最佳效果。
可以单独调整剂量和间隔，以提供对于正在治疗的特定临床适应症有效的施用化合物水平。这将提供与个体疾病状态的严重程度相称的治疗方案。
利用本文提供的教导，可以制定有效的预防性或治疗性治疗方案，其不会引起显着的毒性，但能有效治疗特定患者所表现的临床症状。该方案应包括仔细选择活性化合物，考虑诸如化合物效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的存在和严重程度等因素。
“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”是指帮助活性剂的施用和对象的吸收的物质，并且可以包含在本发明的组合物中而不会对患者产生显着的不利毒理学作用。药学上可接受的赋形剂的非限制性例子包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、正常蔗糖、正常葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、香料、盐溶液(例如林格溶液)、酒精、油、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷和颜料等。此类制剂可以灭菌，并且如果需要，与辅助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、着色剂和/或芳香物质等混合，且不与本发明的化合物发生有害反应。本领域技术人员将认识到其他药物赋形剂可用于本发明。
术语“药学上可接受的盐”是指衍生自本领域众所周知的各种有机和无机抗衡离子的盐，仅作为示例，包括钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；当分子含有碱性官能团时，有机或无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
术语“剂型”指包括活性化合物与作为载体的包封材料的制剂，其中具有或不具有其它载体的活性组分被载体包围，并与载体相结合。同样，包括扁囊剂和锭剂。片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可以用作适于口服施用的固体剂型。
形成缀合物的方法
另一方面，提供了形成细胞穿透缀合物的方法。所述方法包括(i)使非细胞穿透蛋白与第一硫代磷酸酯核酸接触，其中所述非细胞穿透蛋白连接至第一生物素结合对的第一成员并且所述第一硫代磷酸酯核酸连接至第一生物素结合对的第二成员，从而形成包含第一生物素结构域和第一生物素结合结构域之间的非共价键的第一缀合物。(ii)使治疗部分与第二硫代磷酸酯核酸接触，由此形成第二缀合物；和(iii)使第一硫代磷酸酯核酸与第二硫代磷酸酯核酸杂交，由此形成细胞穿透缀合物。在实施方案中，治疗性部分连接至第二生物素结合对的第一成员并且第二硫代磷酸酯核酸连接至第二生物素结合对的第二成员，并且其中第二缀合物包含第二生物素结构域和第二生物素结合结构域之间的非共价键。在实施方案中，第二硫代磷酸酯核酸包括共价反应性部分。
另一方面，提供了形成细胞穿透缀合物的方法。该方法包括(i)使硫代磷酸酯核酸与治疗性部分接触，由此形成第一缀合物。(ii)将第一缀合物与非细胞穿透蛋白接触，其中非细胞穿透蛋白连接至生物素结合对的第一成员，并且第一缀合物连接至生物素结合对的第二成员，由此形成包含生物素结构域和生物素结合结构域之间的非共价键的细胞穿透缀合物。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸包括共价反应性部分。如上所述，治疗性部分可以是siRNA。当治疗性部分是siRNA时，本文提供的缀合物可以通过将siRNA的反义链共价连接到硫代磷酸酯核酸，并且随后允许连接到硫代磷酸酯核酸的反义链与互补有义链杂交来形成与硫代磷酸酯核酸共价连接的双链siRNA。因此，在实施方案中，步骤(i)的接触包括(ia)使硫代磷酸酯核酸与单链RNA接触，由此形成硫代磷酸酯核酸-RNA缀合物，和(ib)使硫代磷酸酯核酸-RNA缀合物与互补于所述单链RNA的RNA接触。
递送方法
另一方面，提供了将非细胞穿透蛋白递送进细胞中的方法。该方法包括使细胞与本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)接触。
另一方面，提供了将治疗性部分递送进细胞中的方法。该方法包括使细胞与本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)接触。
治疗方法
本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)和包含本文所述的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)的组合物可用于预防性和治疗性治疗。对于预防性使用，在早期发作之前或期间(例如，在自身免疫性疾病的初始体征和症状之后)，将治疗有效量的本文所述的药剂给对象施用。治疗性治疗包括在诊断或疾病进展后向对象施用治疗有效量的本文所述的药剂。因此，另一方面，提供了在有需要的对象中治疗疾病的方法。该方法包括向对象施用有效量的本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)，以此在对象中治疗该疾病。在实施方案中，所述疾病选自自身免疫性疾病，发育障碍，炎症性疾病，代谢性疾病，心血管疾病，肝脏疾病，肠道疾病，感染性疾病，内分泌疾病，神经障碍和癌症。在实施方案中，该疾病是自身免疫性疾病。在实施方案中，该疾病是发育障碍。在实施方案中，疾病是炎症性疾病。在实施方案中，疾病是代谢紊乱。在实施方案中，疾病是心血管疾病。在实施方案中，疾病是肝脏疾病。在实施方案中，该疾病是肠道疾病。在实施方案中，该疾病是感染性疾病。在实施方案中，疾病是内分泌疾病。在实施方案中，该疾病是神经障碍。在实施方案中，疾病是癌症。在实施方案中，癌症是前列腺癌或乳腺癌。
在所提供的治疗方法中，可以使用适合于所治疗的疾病的其他治疗剂。因此，在一些实施方案中，所提供的治疗方法进一步包括向对象施用第二治疗剂。合适的其他治疗剂包括但不限于由以下组别中选择的治疗剂：镇痛药、麻醉剂、镇痛药、皮质类固醇、抗胆碱能药、抗胆碱酯酶、抗惊厥药、抗肿瘤药、变构抑制剂、合成代谢类固醇、抗风湿药、精神治疗药、抗神经阻断剂、抗炎剂、抗蠕虫药、抗生素、抗凝剂、抗真菌剂、抗组胺剂、抗毒蕈碱剂、抗分支杆菌剂、抗原虫剂、抗病毒剂、多巴胺能药、血液制剂、免疫制剂和荷尔蒙。基于所治疗的给定疾病，本领域技术人员可以容易地确定药剂和剂量的选择。
试剂或组合物的组合可以伴随(例如作为混合物)、分别但同时(例如通过分开的静脉内途径)或顺序地(例如首先施用一种药剂，然后施用第二药剂)施用。因此，术语组合用于指两种或更多种药剂或组合物的伴随、同时或顺序施用。治疗过程最好根据个体的特定特征和所选治疗类型在个体基础上确定。可以以治疗有效的每日、每日两次、每两周、每月或任何适用的基础(例如本文公开的那些)对对象进行治疗。治疗可以单独施用或与本文公开的或本领域已知的任何其它治疗组合施用。其他治疗可以在不同的时间或用完全不同的治疗计划，与第一次治疗同时进行(例如，第一次治疗可以是每天进行，而其他治疗每周进行)。
根据本文提供的方法，向对象施用有效量的一种或多种本文提供的药剂。术语有效量和有效剂量可互换使用。术语有效量被定义为产生所需生理反应(例如炎症减轻)所必需的任何量。本领域技术人员可凭经验确定用于施用药剂的有效量和时间表。施用的剂量范围足够大以产生疾病或病症的一种或多种症状受到影响(例如减少或延迟)的所需效果。剂量不应该太大，以致引起显着的不良副作用，例如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随着年龄、病情、性别、疾病类型、疾病或病症的程度、施用途径或者其他药物是否包括在方案中而变化，并且可以由本领域技术人员决定。如有任何禁忌症，可由个人医师调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天一次或多次剂量施用，持续一天或几天。可以在文献中找到给定类别的药物产品的适当剂量的指导。例如，对于给定的参数，有效量将表现出至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％。功效也可以表示为“倍数”增加或减少。例如，与对照相比，治疗有效量可以具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多的作用。确切的剂量和配方将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition,Gennaro,Editor(2003),and Pickar,Dosage Calculations(1999))。
所公开的是可用于、可以与所公开的方法和组合物一起使用、可以用于制备或者是所公开的方法和组合物的产品的材料、组合物和组分。这些和其他材料在本文中公开，并且应该理解，当公开这些材料的组合、亚单位、相互作用、组等时，尽管可能没有明确地公开这些化合物的各个不同个体和集体组合和排列的具体参考，但每一个均在此特意考虑和描述。例如，如果公开和讨论了一种方法，并且可以对包括该方法在内的许多分子进行的许多修改，则该方法的每个组合和排列以及可能的修改都被明确地考虑，除非明确地指示出其相反项。同样地，这些的任何亚单位或组合也被明确考虑和公开。这个概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各种附加步骤，则应该理解，这些附加步骤中的每一个都可以利用所公开的方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来执行，并且每个这样的组合或亚单位明确考虑了组合并且应该被认为是公开的。
术语“对象”、“患者”、“个体”等并不是限制性的，并且通常可以互换。也就是说，被描述为“患者”的个体不一定具有给定的疾病，而可能仅仅是寻求医疗建议。
如本文所用，与病症、疾病或紊乱相关的病症、疾病或紊乱或症状的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指用于获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。有益的或期望的临床结果可以包括但不限于一种或多种症状或病症的减轻或改善，病症、紊乱或疾病程度的减轻，病症、紊乱或疾病状态的稳定，病症、紊乱或疾病进展的预防，病症、紊乱或疾病传播的预防，病症、紊乱或疾病发生的延迟或减缓，病症、紊乱或疾病的改善或减轻，以及部分或全部的缓解。“治疗”还可能意味着延长超过预期治疗时间的对象的生存期。“治疗”还意味着抑制病症、紊乱或疾病的进展，暂时减缓病症、紊乱或疾病的进展，尽管在一些情况下，其涉及永久地停止病症、紊乱或疾病的进展。如本文所用，术语治疗、治疗或治疗的是指减少以蛋白酶的表达或症状以蛋白酶的表达为特征的疾病或病症的一种或多种症状的效果的方法。因此，在所公开的方法中，治疗可以指减轻已确定疾病、病症或症状的严重程度的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，治疗疾病的方法如果与对照相比，对象的疾病的一种或多种症状减少10％，则认为是治疗。因此，于10％至100％之间的减少可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或与初始或对照水平相比的任何百分比。应该理解，治疗不一定是指治愈或完全消除疾病或病症的疾病、病症或症状。此外，如本文所使用的，提到的下降、降低或抑制包括与对照相比10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，这些术语可以包括但不一定包括完全消除。
在考虑组合治疗的情况下，本文所述的药剂(即核糖核酸化合物)不应受到组合的特定性质的限制。例如，本文所述的药剂可以作为简单混合物以及化学混合物组合施用。后者的一个例子是药剂与靶向载体或活性药物共价连接的情况。共价结合可以以许多方式完成，例如但不限于使用市售的交联剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的”与“生理上可接受的”和“药理上可接受的”同义使用。药物组合物通常将包含用于储存缓冲和保存的试剂，并且取决于施用途径，可以包括适合递送的缓冲剂和载体。
“有效量”是足以实现所述目的的量(例如达到其施用的效果、治疗疾病、降低酶活性、减少疾病或病症的一种或多种症状)。“有效量”的实例是足以有助于治疗、预防或减轻疾病的症状或症状的量，其也可被称为“治疗有效量”。症状或症状(以及该短语的语法等价物)的“减少”是指减轻症状的严重程度或频率或消除症状。药物的“预防有效量”是当给予对象药物时将具有预期的预防效果，例如预防或延迟损伤、疾病、病理或病症的发作(或复发)的药物的量，或减少损伤、疾病、病理或病症或其症状发作(或再发)的可能性。完全的预防效果不一定通过施用一次剂量而发生，可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。本文所用“活性降低量”是指相对于不存在拮抗剂而言，降低酶或蛋白质活性所需的拮抗剂的量。本文所用“功能破坏量”是指相对于不存在拮抗剂而言，破坏酶或蛋白质功能所需的拮抗剂的量。在文献中可以找到关于给定类别的药物产品的适当剂量的指导。例如，对于给定的参数，有效量将表现出至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％的增加或减少。功效也可以表示为“倍数”增加或减少。例如，与对照相比，治疗有效量可以具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多的作用。确切的量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,TheArt,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,DosageCalculations(1999)；and Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20thEdition,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins)。
本文所用术语“施用”意指口服施用、作为栓剂施用、外用、静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下施用，或给对象植入缓释装置，例如迷你渗透泵。施用可通过任何途径，包括肠胃外和透粘膜(例如，口腔、舌下、腭、齿龈、鼻、阴道、直肠或透皮)。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。其他递送模式包括但不限于脂质体制剂的使用、静脉内输注、透皮贴剂等。“共同施用”是指本文所述的组合物同时施用，恰好在施用一种或多种另外的疗法(例如癌症疗法如化学疗法、激素疗法、放射疗法或免疫疗法)之前或之后。本发明的化合物可以单独施用或者可以共同给予患者。共同施用指包括单独的或组合的化合物(多于一种化合物)的同时或顺序施用。因此，当需要时，制剂也可以与其它活性物质组合(例如减少代谢降解)。本发明的组合物可通过透皮、通过局部途径递送、配制成涂抹棒、溶液、悬浮液、乳液、凝胶、乳膏、软膏、糊剂、凝胶剂、涂料、粉剂和气雾剂。
本发明的组合物可另外包含提供持续释放和/或舒适型的组分。这样的组分包括高分子量、阴离子粘细菌聚合物、胶凝多糖和精细分散的药物载体基质。这些化合物详细讨论于美国专利No.4,911,920；5,403,841；5,521,542和4,861,760中。为所有目的，这些专利的全部内容通过引用整体并入本文。本发明的组合物也可以以微球体在体内缓释。例如，微球体可通过皮内注射含药微球体施用，并缓慢地在皮下释放(参见Rao，J.BiomaterSci.Polym.Ed.7：623-645,1995)；作为可生物降解的和可注射的凝胶制剂(参见，例如GaoPharm.Res.12：857-863,1995)；或作为用于口服施用的微球体(参见，例如Eyles，J.Pharm.Pharmacol.49：669-674,1997)。在实施方案中，本发明的组合物制剂可以通过使用与细胞膜融合或内吞的脂质体来递送，即通过使用与脂质体相连的受体配体，其与细胞的表面膜蛋白受体结合，引发内吞作用。通过使用脂质体，特别是在脂质体表面携带对靶细胞特异的受体配体，或者优先针对特定器官的情况下，可以将本发明组合物的递送集中于体内的靶细胞中。(参见，例如Al-Muhammed,J.Microencapsul.13:293-306,1996；Chonn,Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708,1995；Ostro,Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587,1989)。本发明的组合物也可以作为纳米颗粒递送。
利用本文提供的教导，可以规划有效的预防性或治疗性治疗方案，其不会引起实质的毒性，而是有效地治疗特定患者所表现的临床症状。该方案应通过考虑诸如化合物效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的存在和严重程度、优选的施用方式和所选药剂的毒性特征等因素，仔细选择活性化合物。
实施例
实施例1：
生产特异性结合并内化入肿瘤细胞的抗体-药物缀合物(ADC)(细胞内化ADC)。
针对在肿瘤细胞(前列腺癌)表面特异性表达的蛋白质(PSMA)产生的药物修饰抗体(抗-PSMA)将识别肿瘤细胞。一旦结合药物(DM1)定位于细胞内，其将发挥细胞毒活性。然而，细胞内化的主要障碍是通过使用由硫代磷酸酯化(PS)有义/反义双链DNA寡核苷酸构成的接头来解决的。使用非硫代磷酸酯化的有义/反义dsDNA-寡核苷酸(PO)连接抗体和药物作为非内化和无毒的对照。一旦使用链霉抗生物素蛋白/生物素将人PSMA抗体非共价连接至有义硫代磷酸酯化的ssDNA寡核苷酸且药物非共价连接至反义硫代磷酸酯化ssDNA寡核苷酸，我们使杂交后的ADC经过凝胶过滤并收集纯化的级分(图1)。
在人PSMA+的前列腺癌肿瘤细胞LNCaP中，测试了识别PSMA的纯化的细胞内化ADC。通过流式细胞术分析，两种构建体均在细胞表面或细胞内显示PSMA的信号。然而，由于有效的肿瘤细胞杀伤，通过硫代磷酸酯化dsDNA寡核苷酸缀合于抗PSMA的药物DM1的细胞毒性效力使其不能够获取适当的成像，而流式细胞术能够收集在细胞培养物上清液中“漂浮”的细胞，因而使分析成为可能(图2)。
在人PSMA+的前列腺癌肿瘤细胞中，测试纯化的识别PSMA的细胞内化ADC以确定肿瘤细胞杀伤效应。将人PSMA+LNCaP细胞与10mg/ml非内化抗PSMA-PO-dsDNA-DM1或内化抗PSMA-PS-dsDNA-DM1孵育4小时，通过流式细胞术检测AnnexinV+细胞，确定肿瘤细胞的死亡(图3)。
实施例2：
在这里，我们使用针对人前列腺癌高表达的PSMA产生的肿瘤抗原识别抗体，直接向细胞内递送靶向STAT3mRNA转录物的STAT3 siRNA。因为已知PSMA抗体不具有或仅具有非常小的细胞内化活性，所以我们通过将硫代磷酸酯化的ssDNA与反义STAT3 siRNA链合成融合来促进细胞内化。完全缀合物通过(i)siRNA链的杂交和(ii)生物素化硫代磷酸酯化ssDNA-siRNA的非共价连接产生抗-PSMA-抗生物素蛋白-生物素-硫代磷酸酯化ssDNA-siRNA而产生(图4)。
在缀合了主要组分(i)PSMA-抗生物素蛋白和(ii)PS-ssDNA/siRNA-生物素之后，我们纯化了与抗-PSMA抗体融合的scrRNA(左图)和STAT3siRNA(右图)的缀合物(图5A和5B)。
接下来，我们评估了抗PSMA-PS-ssDNA-RNAi缀合物的细胞内化。因此，将表达PSMA的人前列腺癌细胞LNCaP与10μg/ml抗-PSMA-PS-ssDNA-scrRNA或抗-PSMA-PS-ssDNA-STAT3siRNA孵育，通过流式细胞术和共聚焦显微镜分析摄取以及细胞内定位(图6和6B)。
最重要的是，抗PSMA-PS-ssDNA-STAT3 siRNA缀合物对STAT3mRNA转录物发挥预期的沉默效应。因此，在收集RNA并通过RT-PCR分析STAT3mRNA表达之前，将人前列腺癌LNCaP细胞与10μg/ml抗PSMA-PS-ssDNA-scrRNA和抗-PSMA-PS-ssDNA-STAT3 siRNA以孵育48小时(图7)。
实施方案
实施方案1.细胞穿透缀合物，其包含：(i)非细胞穿透蛋白；(ii)硫代磷酸酯核酸；(iii)将所述硫代磷酸酯核酸连接至所述非细胞穿透蛋白的第一接头；和(iv)将所述硫代磷酸酯核酸连接至治疗部分的第二接头，其中所述硫代磷酸酯核酸增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。
实施方案2.实施方案1的细胞穿透缀合物，其中所述第一接头包含与第一生物素结构域非共价连接的第一生物素结合结构域。
实施方案3.实施方案2的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结合结构域是第一抗生物素蛋白结构域。
实施方案4.实施方案2的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结合结构域是第一链霉抗生物素蛋白结构域。
实施方案5.实施方案4的细胞穿透缀合物，其中所述第一链霉抗生物素蛋白结构域结合多个第一生物素结构域。
实施方案6.实施方案5的细胞穿透缀合物，其中所述第一链霉抗生物素蛋白结构域结合约四个第一生物素结构域。
实施方案7.实施方案2-6之一的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结合结构域共价连接至所述非细胞穿透蛋白。
实施方案8.实施方案2-7之一的细胞穿透缀合物，其中多个第一生物素结合结构域连接至所述非细胞穿透蛋白。
实施方案9.实施方案2-8之一的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结构域连接于所述硫代磷酸酯核酸。
实施方案10.实施方案2-9之一的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结构域共价连接于所述硫代磷酸酯核酸。
实施方案11.实施方案2-10之一的细胞穿透缀合物，其中多个硫代磷酸酯核酸附着于所述第一生物素结构域。
实施方案12.实施方案1-11之一的细胞穿透缀合物，其中所述第一接头或所述第二接头是共价接头。
实施方案13.实施方案1-12之一的细胞穿透缀合物，其中所述第二接头是共价接头。
实施方案14.实施方案1-11之一的细胞穿透缀合物，其中所述第二接头包含与第二生物素结构域非共价连接的第二生物素结合结构域。
实施方案15.实施方案14的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结合结构域是第二抗生物素蛋白结构域。
实施方案16.实施方案14的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结合结构域是第二链霉抗生物素蛋白结构域。
实施方案17.实施方案16的细胞穿透缀合物，其中所述第二链霉抗生物素蛋白结构域结合多个第二生物素结构域。
实施方案18.实施方案16或17的细胞穿透缀合物，其中所述第二链霉抗生物素蛋白结构域结合约四个第二生物素结构域。
实施方案19.实施方案14-18之一的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结合结构域共价连接于所述治疗部分。
实施方案20.实施方案19的细胞穿透缀合物，其中多个第二生物素结合结构域连接至所述治疗部分。
实施方案21.实施方案14-20之一的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结构域连接于所述硫代磷酸酯核酸。
实施方案22.实施方案21的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结构域共价连接于所述硫代磷酸酯核酸。
实施方案23.实施方案22的细胞穿透缀合物，其中多个硫代磷酸酯核酸连接至所述第二生物素结构域。
实施方案24.实施方案1-23之一的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸是双链硫代磷酸酯核酸。
实施方案25.实施方案1-23之一的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸是单链硫代磷酸酯核酸。
实施方案26.实施方案1-25之一的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸长度约为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个核酸残基。
实施方案27.实施方案1-25之一的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸长度为约10至约30个核酸残基。
实施方案28.实施方案1-25之一的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸长度为约20个核酸残基。
实施方案29.实施方案1-28之一的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有大于25kD的分子量。
实施方案30.实施方案29的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有约25kD至约750kD的分子量。
实施方案31.实施方案1-30之一的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白是抗体。
实施方案33.实施方案31的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是IgA、IgM、IgD或IgE抗体。
实施方案34.实施方案31的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是scFv片段。
实施方案35.实施方案31-34之一的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是人源化抗体。
实施方案36.实施方案1至35之一的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白结合细胞表面蛋白。
实施方案37.实施方案36的细胞穿透缀合物，其中所述细胞表面蛋白是癌蛋白。
实施方案38.实施方案36的细胞穿透缀合物，其中所述细胞表面蛋白是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
实施方案39.实施方案36的细胞穿透缀合物，其中所述细胞表面蛋白是人表皮生长因子受体2(HER2)。
实施方案40.实施方案1-39之一的细胞穿透缀合物，其中所述治疗性部分是化合物、小分子、核酸或多肽。
实施方案41.实施方案1-40之一的细胞穿透缀合物，其中所述治疗性部分是siRNA、saRNA、shRNA或miRNA。
实施方案42.实施方案41的细胞穿透缀合物，其中所述siRNA是STAT3 siRNA。
实施方案43.实施方案1-40之一的细胞穿透缀合物，其中所述治疗性部分是抗体或其片段。
实施方案44.实施方案43的细胞穿透缀合物，其中所述治疗部分是曲妥珠单抗。
实施方案45.实施方案1-40之一的细胞穿透缀合物，其中所述治疗性部分是小分子。
实施方案46.实施方案1-45之一的细胞穿透缀合物，其中所述治疗性部分是细胞毒性部分。
实施方案47.实施方案1-46之一的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白进一步包含与所述蛋白连接的标记、小分子或功能性核酸。
实施方案48.形成细胞穿透缀合物的方法，所述方法包括：(i)使非细胞穿透蛋白与第一硫代磷酸酯核酸接触，其中所述非细胞穿透蛋白连接至第一生物素结合对的第一成员，且所述第一硫代磷酸酯核酸连接到所述第一生物素结合对的第二成员，从而形成包含第一生物素结构域和第一生物素结合结构域之间的非共价键的第一缀合物；(ii)使治疗部分与第二硫代磷酸酯核酸接触，由此形成第二缀合物；和(iii)使所述第一硫代磷酸酯核酸与所述第二硫代磷酸酯核酸杂交，由此形成细胞穿透缀合物。
实施方案49.实施方案48的方法中所述治疗性部分连接至第二生物素结合对的第一成员，并且所述第二硫代磷酸酯核酸连接至所述第二生物素结合对的第二成员，并且其中所述第二缀合物包含第二生物素结构域和第二生物素结合结构域之间的非共价键。
实施方案50.实施方案48的方法中所述第二硫代磷酸酯核酸包含共价反应性部分。
实施方案51.一种形成细胞穿透缀合物的方法，所述方法包括：(i)使硫代磷酸酯核酸与治疗性部分接触，由此形成第一缀合物；(ii)使所述第一缀合物与非细胞穿透蛋白接触，其中所述非细胞穿透蛋白连接至生物素结合对的第一成员，并且所述第一缀合物连接至所述生物素结合对的第二成员，由此形成包含生物素结构域和生物素结合结构域之间的非共价键的细胞穿透缀合物。
实施方案52.实施方案51的方法中所述硫代磷酸酯核酸包含共价反应性部分。
实施方案54.包含实施方案1至47之一的细胞穿透缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
实施方案55.将非细胞穿透蛋白递送至细胞中的方法，其包括使细胞与实施方案1至47中任一项的所述细胞穿透缀合物接触。
实施方案56.将治疗性部分递送至细胞中的方法，其包括使细胞与实施方案1至47之一的所述细胞穿透性缀合物接触。
实施方案57.一种在有需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括向对象施用有效量的实施方案1至47之一的细胞穿透缀合物，由此治疗所述对象的疾病。
实施方案58.实施方案57的方法并包括向所述对象施用第二治疗剂。
实施方案59.如实施方案57或58所述的方法，其中所述疾病选自自身免疫疾病、发育障碍、炎症性疾病、代谢障碍、心血管疾病、肝脏疾病、肠道疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。
实施方案60.实施方案59的方法，其中所述疾病是癌症。
实施方案61.实施方案60的方法，其中所述癌症是前列腺癌或乳腺癌。

Claims (61)

1.一种细胞穿透缀合物，其包含：
(i)非细胞穿透蛋白；
(ii)硫代磷酸酯核酸；
(iii)将所述硫代磷酸酯核酸连接至所述非细胞穿透蛋白的第一接头；和
(iv)将所述硫代磷酸酯核酸连接至治疗部分的第二接头，其中所述硫代磷酸酯核酸增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。
2.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述第一接头包含与第一生物素结构域非共价连接的第一生物素结合结构域。
3.权利要求2的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结合结构域是第一抗生物素蛋白结构域。
4.权利要求2的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结合结构域是第一链霉抗生物素蛋白结构域。
5.权利要求4的细胞穿透缀合物，其中所述第一链霉抗生物素蛋白结构域结合多个第一生物素结构域。
6.权利要求5的细胞穿透缀合物，其中所述第一链霉抗生物素蛋白结构域结合约四个第一生物素结构域。
7.权利要求2的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结合结构域共价连接至所述非细胞穿透蛋白。
8.权利要求2的细胞穿透缀合物，其中多个第一生物素结合结构域连接至所述非细胞穿透蛋白。
9.权利要求2的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结构域连接于所述硫代磷酸酯核酸。
10.权利要求2的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结构域共价连接至所述硫代磷酸酯核酸。
11.权利要求2的细胞穿透缀合物，其中多个硫代磷酸酯核酸连接至所述第一生物素结构域。
12.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述第一接头或所述第二接头是共价接头。
13.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述第二接头是共价接头。
14.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述第二接头包含与第二生物素结构域非共价连接的第二生物素结合结构域。
15.权利要求14的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结合结构域是第二抗生物素蛋白结构域。
16.权利要求14的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结合结构域是第二链霉抗生物素蛋白结构域。
17.权利要求16的细胞穿透缀合物，其中所述第二链霉抗生物素蛋白结构域结合多个第二生物素结构域。
18.权利要求16的细胞穿透缀合物，其中所述第二链霉抗生物素蛋白结构域结合约四个第二生物素结构域。
19.权利要求14的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结合结构域共价连接至所述治疗部分。
20.权利要求19的细胞穿透缀合物，其中多个第二生物素结合结构域连接至所述治疗部分。
21.权利要求14的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结构域连接至所述硫代磷酸酯核酸。
22.权利要求21的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结构域共价连接至所述硫代磷酸酯核酸。
23.权利要求22的细胞穿透缀合物，其中多个硫代磷酸酯核酸连接至所述第二生物素结构域。
24.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸是双链硫代磷酸酯核酸。
25.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸是单链硫代磷酸酯核酸。
26.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸的长度为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个核酸残基。
27.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸的长度为约10至约30个核酸残基。
28.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸的长度为约20个核酸残基。
29.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有大于25kD的分子量。
30.权利要求29的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有约25kD至约750kD的分子量。
31.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白是抗体。
32.权利要求31的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是IgG抗体。
33.权利要求31的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是IgA、IgM、IgD或IgE抗体。
34.权利要求31的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是scFv片段。
35.权利要求31的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是人源化抗体。
36.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白结合细胞表面蛋白。
37.权利要求36的细胞穿透缀合物，其中所述细胞表面蛋白是癌蛋白。
38.权利要求36的细胞穿透缀合物，其中所述细胞表面蛋白是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
39.权利要求36的细胞穿透缀合物，其中所述细胞表面蛋白是人表皮生长因子受体2(HER2)。
40.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述治疗性部分是化合物、小分子、核酸或多肽。
41.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述治疗性部分是siRNA、saRNA、shRNA或miRNA。
42.权利要求41所述的细胞穿透缀合物，其中所述siRNA是STAT3siRNA。
43.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述治疗性部分是抗体或其片段。
44.权利要求43的细胞穿透缀合物，其中所述治疗性部分是曲妥珠单抗。
45.权利要求140的细胞穿透缀合物，其中所述治疗性部分是小分子。
46.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述治疗性部分是细胞毒性部分。
47.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白进一步包含与所述蛋白连接的标记、小分子或功能性核酸。
48.一种形成细胞穿透缀合物的方法，所述方法包括：
(i)使非细胞穿透蛋白与第一硫代磷酸酯核酸接触，其中所述非细胞穿透蛋白连接至第一生物素结合对的第一成员，并且所述第一硫代磷酸酯核酸连接至所述第一生物素结合对的第二成员，从而形成包含第一生物素结构域和第一生物素结合结构域之间的非共价键的第一缀合物；
(ii)使治疗部分与第二硫代磷酸酯核酸接触，由此形成第二缀合物；和
(iii)使所述第一硫代磷酸酯核酸与所述第二硫代磷酸酯核酸杂交，由此形成细胞穿透缀合物。
49.权利要求48的方法，其中所述治疗性部分连接至第二生物素结合对的第一成员，并且所述第二硫代磷酸酯核酸连接至所述第二生物素结合对的第二成员，并且其中所述第二缀合物包含第二生物素结构域和第二生物素结合结构域之间的非共价键。
50.权利要求48的方法，其中所述第二硫代磷酸酯核酸包含共价反应性部分。
51.一种形成细胞穿透缀合物的方法，所述方法包括：
(i)使硫代磷酸酯核酸与治疗性部分接触，从而形成第一缀合物；
(ii)使所述第一缀合物与非细胞穿透蛋白接触，其中所述非细胞穿透蛋白连接至生物素结合对的第一成员，并且所述第一缀合物连接至所述生物素结合对的第二成员，由此形成包含生物素结构域和生物素结合结构域之间的非共价键的细胞穿透缀合物。
52.权利要求51的方法，其中所述硫代磷酸酯核酸包含共价反应性部分。
53.包含权利要求1的细胞穿透缀合物的细胞。
54.包含权利要求1的细胞穿透缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
55.将非细胞穿透蛋白递送进细胞中的方法，包括使细胞与权利要求1的所述细胞穿透缀合物接触。
56.将治疗性部分递送进细胞中的方法，包括使细胞与权利要求1所述的细胞穿透性缀合物接触。
57.在有需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括向对象施用有效量的权利要求1的细胞穿透缀合物，从而在所述对象中治疗所述疾病。
58.权利要求57的方法，还包括向所述对象施用第二治疗剂。
59.权利要求57的方法，其中所述疾病选自自身免疫性疾病、发育障碍、炎症性疾病、代谢紊乱、心血管疾病、肝脏疾病、肠道疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。
60.权利要求59的方法，其中所述疾病是癌症。
61.权利要求60的方法，其中所述癌症是前列腺癌或乳腺癌。
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