CN108135907A

CN108135907A - 氘化化合物和其用途

Info

Publication number: CN108135907A
Application number: CN201680059219.6A
Authority: CN
Inventors: 托德·布雷迪; 斯科特·杨; 威廉姆·A·金尼; 苏珊·麦克唐纳
Original assignee: Aldexa Therapeutics Inc
Current assignee: Aldeyra Therapeutics Inc
Priority date: 2015-08-21
Filing date: 2016-08-22
Publication date: 2018-06-08
Also published as: HK1256980A1; US11046650B2; AU2016311158A1; JP2021167358A; US20180354905A1; KR20180073554A; ES2989113T3; US20230174491A1; US20240132451A1; IL257611A; EP3337486B1; US20200199075A1; CO2018002822A2; US11845722B2; EP3337486A4; WO2017035077A1; MX2018002155A; EP4400106A1; ZA201801678B; CA2996183A1

Abstract

本发明提供通过使用伯胺清除如MDA和HNE等毒性醛来治疗、预防发病机制中涉及醛毒性的疾病、病症或病状和/或降低其风险，所述疾病、病症或病状包括眼部病症、皮肤病症、与糜烂性毒剂的有害效应相关的病状，以及自体免疫、发炎、神经和心血管疾病。

Description

氘化化合物和其用途

背景技术

细胞在代谢和发炎过程中产生产生了毒性醛类，如丙二醛(MDA)和4-羟基-2-壬烯醛(HNE或4HNE)。这些醛类对蛋白质、碳水化合物、脂质和DNA具有高度反应性，从而产生经化学修饰的生物分子，激活炎性介体，如NF-κB，且损伤多种器官。举例来说，视黄醛能够与磷脂酰乙醇胺(PE)反应而形成称为A2E的高毒性化合物，其是脂褐质(lipofuscin)的组分，脂褐质被认为涉及年龄相关性黄斑变性(AMD)的发展和进展。许多身体防御机制的功能是清除或降低毒性醛类的含量。新颖的小分子治疗剂能够用于清除视网膜中“逃逸”的视黄醛，从而减少A2E形成并且减轻AMD风险(乔丹(Jordan)等人(2006))。

醛类牵涉到多种多样的病理学病状，如干眼、白内障、圆锥形角膜、富克氏角膜内皮营养不良(Fuch's endothelial dystrophy in the cornea)、葡萄膜炎、过敏结膜炎、眼瘢痕类天疱疮、与屈光性角膜切除术(PRK)愈合或其它角膜愈合相关的病状、与泪脂质降解或泪腺机能不良相关的病状、炎性眼病状(如眼部红斑痤疮(伴有/不伴有睑板腺机能不良))，和非眼部病症或病状，如皮肤癌、牛皮癣、接触性皮炎、异位性皮肤炎、寻常痤疮、休格连-拉森综合症(Sjogren-Larsson Syndrome)、局部缺血再灌注损伤、炎症、糖尿病、神经变性(例如帕金森病(Parkinson's disease))、硬皮病、肌肉萎缩性侧索硬化、自体免疫病症(例如狼疮)、心血管病症(例如动脉粥样硬化)，以及与糜烂性毒剂的有害效应相关的病状(内格雷-萨尔瓦格雷(Negre-Salvagre)等人(2008)，中村(Nakamura)等人(2007)，巴蒂斯塔(Batista)等人(2012)，肯尼(Kenney)等人，国际皮肤病学杂志(Int J Dermatol)43:494(2004)，(Invest Ophthalmol Vis Sci)48:1552(2007)，格拉芙临床与实验眼科学(Graefe’s Clin Exp Ophthalmol)233:694(1994)，分子视觉(Molecular Vision)18:194(2012))。因此，减少或消除醛类应该改善这些病理学病状的症状并且减缓其进展。

MDA、HNE和其它毒性醛类通过多种代谢机制产生，所述代谢机制包括：脂肪醇、鞘脂、糖脂、植醇、脂肪酸、二十碳四烯酸代谢(里索(Rizzo)(2007))、多元胺代谢(伍德(Wood)(2006))、脂质过氧化反应、氧化性代谢(布迪(Buddi)等人(2002)；周(Zhou)等人(2005))，和葡萄糖代谢(波齐(Pozzi)等人(2009))。醛类能够与蛋白质、磷脂、碳水化合物和DNA上的伯氨基和其它化学部分发生交联，在许多情况下引起中毒后果，如突变诱发和癌发生(玛莱特(Marnett)(2002))。MDA与病变角膜、圆锥形角膜、大疱和其它角膜病以及富克氏角膜内皮营养不良相关(布迪等人(2002))。另外，皮肤病，例如休格连-拉森综合症，可能与如十八醛和十六醛等脂肪醛的积聚有关(里索(Rizzo)等人(2010))。另外，增强的脂质过氧化反应和所引起的醛产生与糜烂性毒剂的毒性效应相关(舒托(Sciuto)等人(2004)和帕耳(Pal)等人(2009))。

所属领域中尚未提出通过投与充当醛(例如MDA和/或HNE)清除剂的小分子治疗剂来治疗与毒性醛相关的各种病状。因此，存在着治疗、预防发病机制中涉及醛毒性的疾病或病症和/或减少其风险的需求。本发明解决了此类需求。

相应地，仍存在治疗、预防发病机制中涉及醛毒性的疾病、病症或病状和/或减少其风险的需求。

发明内容

现已发现，本发明的化合物和其组合物适用于治疗、预防发病机制中涉及醛毒性的疾病、病症或病状和/或减少其风险。此类化合物具有通式I：

或其医药学上可接受的盐，其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自如本文所定义。

本发明的化合物和其医药学上可接受的组合物适用于治疗与毒性醛相关的多种疾病、病症或病状。此类疾病、病症或病状包括本文所述的那些。

本发明所化合物的还适用于研究生物学和病理学现象中的某些醛。

附图说明

图1描绘了NS2在人类肝细胞中、在0分钟和120分钟时的代谢物谱的EIC(萃取离子色谱图)相较于参照(空白肝细胞)的覆盖图。如覆盖图所示，120分钟之后，NS2代谢成M1、M7、M8和少量的M9，剩余一些NS2未发生变化。

图2描绘了NS2在猴肝细胞中、在0分钟和120分钟时的代谢物谱的EIC相较于参照(空白肝细胞)的覆盖图。如覆盖图所示，120分钟之后，NS2代谢成M1、M3、M4、M7、M8和少量的M9，剩余一些NS2未发生变化。

图3描绘了NS2在犬肝细胞中、在0分钟和120分钟时的代谢物谱的EIC相较于参照(空白肝细胞)的覆盖图。如覆盖图所示，120分钟之后，NS2代谢成M1、M2、M5和M6，剩余一些NS2未发生变化。

图4描绘了NS2在大鼠肝细胞中、在0分钟和120分钟时的代谢物谱的EIC相较于参照(空白肝细胞)的覆盖图。如覆盖图所示，120分钟之后，NS2代谢成M1、M7和M8，剩余一些NS2未发生变化。

图5描绘了氘化NS2(NS2-D6；化合物I-1)在人类肝细胞中、在0分钟和120分钟时的代谢物谱的EIC相较于参照(空白肝细胞)的覆盖图。如覆盖图所示，120分钟之后，NS2-D6代谢成少量M1，剩余的大部分NS2-D6未发生变化。

图6描绘了NS2的质谱分析(m/z＝237)。

图7描绘了代谢物M1的质谱分析(m/z＝253，RT＝2.1分钟)。

图8描绘了代谢物M2的质谱分析(m/z＝253，RT＝2.9分钟)。

图9描绘了代谢物M3的质谱分析(m/z＝429，RT＝3.0分钟)。

图10描绘了代谢物M4的质谱分析(m/z＝429，RT＝3.2分钟)。

图11描绘了代谢物M5的质谱分析(m/z＝542，RT＝3.5分钟)。

图12描绘了代谢物M6的质谱分析(m/z＝542，RT＝3.7分钟)。注释：m/z为413表示中性丢失(NL)为129，指示GSH碎裂模式。

图13描绘了代谢物M7的质谱分析(m/z＝429，RT＝3.7分钟)。

图14描绘了代谢物M8的质谱分析(m/z＝413，RT＝3.9分钟)。

图15描绘了代谢物M9的质谱分析(m/z＝429，RT＝3.9分钟)。

图16描绘了NS2-D6的质谱分析(化合物I-1；m/z＝243)。

图17描绘了NS2-D6的代谢物1的质谱分析(m/z＝259)。

图18描绘了NS2(CoreRx)与10μM过氧化氢共处理5小时之后对神经元活力的影响。

图19描绘了不同NS2(CoreRx；在中)浓度下的CFDA(相对荧光单位)数据与EC₅₀值所来源的曲线拟合的图。

图20描绘了NS2(CoreRx)在与10μM过氧化氢共处理5小时之后对海马体培养物中的细胞死亡的影响。*表示与单独HP处理显著不同的数据点。

图21描绘了不同NS2(CoreRx；在中)浓度下的碘化丙锭数据(相对荧光单位)与EC₅₀值所来源的曲线拟合的图。

图22描绘了NS2(CoreRx；在DMSO中)与10mM过氧化氢共处理5小时之后对神经元活力的影响。*表示与单独HP处理显著不同的数据点。

图23描绘了不同NS2(CoreRx；在DMSO中)浓度下的CFDA(相对荧光单位)数据与EC₅₀值所来源的曲线拟合的图。

图24描绘了NS2(CoreRx；在DMSO中)在与10μM过氧化氢共处理之后对海马体培养物中的细胞死亡的影响。*表示与单独HP处理显著不同的数据点。

图25描绘了不同NS2(CoreRx；在DMSO中)浓度下的碘化丙锭数据(相对荧光单位)与EC₅₀值所来源的曲线拟合的图。

图26描绘了中的未研磨NS2(J-Star)的剂量反应数据，其展现了与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响。*表示与单独HP处理显著不同的数据点。

图27描绘了不同NS2(J-Star；在DMSO中)浓度下的CFDA(相对荧光单位)数据与EC₅₀值所来源的曲线拟合的图。

图28描绘了中的未研磨NS2(J-Star)的剂量反应数据，其展现了与10μM过氧化氢共处理之后对海马体培养物中的细胞死亡的影响。*表示与单独HP处理显著不同的数据点。

图29描绘了不同NS2(未研磨(J-Star)，在中)浓度下的碘化丙锭数据(相对荧光单位)与EC₅₀值所来源的曲线拟合的图。

图30描绘了DMSO中的未研磨NS2(J-Star)的剂量反应数据，其展现了与10μM过氧化氢共处理之后对海马体培养物中的神经元活力的影响。*表示与单独HP处理显著不同的数据点。

图31描绘了不同的未研磨NS2((J-Star)，在DMSO中)浓度下的CFDA(相对荧光单位)数据与EC₅₀值所来源的曲线拟合的图。

图32描绘了DMSO中的未研磨NS2(J-Star)的剂量反应数据，其展示了与10μM过氧化氢共处理之后对海马体细胞的细胞死亡的影响。*表示与单独HP处理显著不同的数据点。

图33描绘了不同的未研磨NS2((J-Star)，在DMSO中)浓度下的碘化丙锭数据(相对荧光单位)与EC₅₀值所来源的曲线拟合的图。

图34描绘了配制媒剂与10μM过氧化氢共处理之后针对神经元细胞活力的剂量反应数据。

图35描绘了配制媒剂与10μM过氧化氢共处理之后针对细胞死亡的剂量反应数据。

图36描绘了ALD-6(化合物I-1)对经10μM过氧化氢处理的海马体培养物中的神经元活力的影响。*表示与单独HP处理显著不同的数据点。

图37描绘了使用经ALD-6处理的海马体培养物进行的神经元活力分析的所计算对数曲线和EC₅₀值。

图38描绘了ALD-6与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的剂量反应效应。*表示与单独HP处理显著不同的数据点。

图39描绘了使用经ALD-6处理的海马体培养物进行的细胞死亡分析的所计算对数曲线和EC₅₀值。

图40描绘了ALD-5与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的剂量反应效应。

图41描绘了ALD-5与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的剂量反应效应。

图42描绘了ALD-2与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的剂量反应效应。

图43描绘了ALD-2与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的剂量反应效应。

图44-46描绘了以每种对照化合物的特异性结合的百分比表示的NS2-D6的特异性结合结果的直方图。

图47描绘了NS2-D6在酶和吸收分析中的试管内药理学结果的直方图。

具体实施方式

1.本发明某些方面的一般描述

在某些实施例中，本发明提供用于治疗、预防发病机制中涉及醛毒性的疾病、病症或病状和/或减少其风险的化合物、组合物和方法。在一些实施例中，此类化合物包括本文所述式的那些化合物，或其医药学上可接受的盐，其中每个变量如本文中所定义和在实施例中描述。在一个方面中，本发明提供一种式I化合物：

或其医药学上可接受的盐，其中：

R¹选自-NH₂、-NHD或-ND₂；

R²选自氢或氘；

R³和R⁴独立地选自-CH₃、-CH₂D、-CHD₂或-CD₃；且

R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地选自氢或氘；

其限制条件为R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

2.定义

本发明化合物包括上文大体描述的那些化合物，且通过本文所公开的类别、子类和种类进一步说明。除非另外指明，否则应该应用如本文所用的以下定义。出于本发明的目的，化学元素是根据元素周期表，CAS版，化学与物理手册(Handbook of Chemistry andPhysics)，第75版来鉴别。另外，有机化学的一般原理描述于“有机化学(OrganicChemistry)”，托马斯索雷尔(Thomas Sorrell)，大学科学书籍(University ScienceBooks)，索萨利托(Sausalito)：1999，和“马奇高等有机化学(March's Advanced OrganicChemistry)”，第5版，编辑：史密斯M.B.(Smith,M.B.)和马奇J.(March,J.)，约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons),纽约：2001中，这些文献的全部内容特此以引用的方式并入。

如本文所用，术语“医药学上可接受的盐”是指在合理医学判断范围内适用于与人类和低等动物的组织接触而无不当毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的效益/风险比相称的那些盐。医药学上可接受的盐在所属领域中众所周知。举例来说，S.M.贝尔奇(S.M.Berge)等人在医药科学杂志(J.Pharmaceutical Sciences)，1977，66，1-19中详细描述了医药学上可接受的盐，所述文献以引用的方式并入本文中。本发明化合物的医药学上可接受的盐包括衍生自适合无机酸和有机酸和无机碱和有机碱的盐。医药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是氨基与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和过氯酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸或丙二酸)形成的盐，或通过使用所属领域中所用的其它方法(例如如离子交换)形成的盐。医药学上可接受的其它盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙烷磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、丁二酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。

由适当的碱衍生的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N⁺(C_1-4烷基)₄盐。代表性碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。医药学上可接受的其它盐在适当时包括使用平衡离子(例如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳数烷基磺酸根和芳基磺酸根)形成的无毒铵、季铵和胺阳离子。

除非另有说明，否则本文中所描绘的结构还意图包括所述结构的所有异构(例如对映异构、非对映异构和几何异构(或构形异构))形式；例如，关于每个不对称中心的R与S构形、Z与E双键异构体，以及Z与E构形异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体、非对映异构体以及几何异构体(或构形异构体)混合物都在本发明的范围内。除非另有说明，否则本发明化合物的所有互变异构形式都在本发明的范围内。

“视网膜”是中枢神经系统的一个区域，其具有大约15000万个神经元。其位于眼后部，其中其搁置在专门的上皮组织上，称为视网膜色素上皮(RPE)。视网膜通过转导称为“感光器”的专门神经元中的视觉刺激来启动视觉处理的第一阶段。它们的突触输出通过视网膜中的精密神经网络处理，然后传输到脑。视网膜已进化成两类专门的感光器以在多种多样的光条件下运作。“视杆”感光器在低光条件下转导视觉影像且介导无色差视力。“锥体”感光器在暗淡到亮光条件下转导视觉影像且介导色觉和高视敏度。

每种感光体分隔为两个区域，称为“外部”和“内部”区段。内部区段是含有细胞核的神经元细胞体。内部区段在视网膜疾病不存在的情况下终身存活。外部区段是其中光敏感性视觉色素分子以堆叠的膜结构的密集阵列聚集的区域。外部区段的一部分常规地按照昼夜过程脱落和再生长，称为外部区段更新。脱落的外部区段被RPE细胞摄入且代谢。

“黄斑”是视网膜中心区域，其含有由细长视锥以高空间清晰度(“视敏度”)处理视觉影像的凹窝。“黄斑变性”是一种视网膜神经变性形式，其攻击黄斑且损伤视野中心的高敏锐度视力。年龄相关黄斑变性(AMD)开始呈现“干燥形式”，其特征为RPE细胞中存在残余溶酶体颗粒，称为脂褐质，以及细胞外沉积物，称为“脉络膜小疣”。脉络膜小疣含有RPE细胞排出的细胞废弃产物。“脂褐质”和脉络膜小疣在临床上可以由眼科医师检测且使用荧光技术量化。其可以是黄斑变性的第一临床征象。

脂褐质含有A2E聚集体。脂褐质在RPE细胞中积聚且通过多种已知机制使其中毒。当RPE细胞中毒时，它们的生物化学活性下降且感光器开始变性。细胞外的脉络膜小疣可以通过干扰血管营养物供应给它们来进一步损害RPE细胞。脉络膜小疣还触发了发炎过程，使十位患者中有一位的黄斑受到脉络膜新生血管性入侵，从而进展为湿式AMD。干式和湿式均进展为失明。

“ERG”是视网膜电图的首字母缩写，其测量视网膜神经元在它们对实验上所定义的光刺激物作出反应期间所发出的电场电位。ERG是一种无创测量，其可以针对活的个体(人类或动物)或已从活动物中手术移出的存于溶液中的半切眼进行。

如本文所用，术语“RAL”是指视黄醛。术语“RAL捕获剂”是指一种治疗化合物，其结合游离RAL且从而防止RAL与膜磷脂酰乙醇胺(PE)发生希夫碱(Schiff base)缩合。“游离RAL”定义为未结合到视觉周期蛋白质的RAL。术语“反式-RAL”和“所有反式-RAL”可互换地使用且意指所有反式-视黄醛。

A2E是RPE细胞和感光体外部区段中协同运作的的复杂生物化学路径(称为“视觉周期”)的反应副产物。视觉周期使光反应性醛发色团再循环，所述发色团称为“视黄醛”，衍生自维生素A且对视力至关重要。简单地说，视觉周期具有四个主要步骤：1)其使RPE中的维生素A转化成具有一个光反应性应变双键的醛发色团(11-顺式-RAL)；2)其将11-顺式-RAL输送到视网膜中，在视网膜中其结合到专门的感光蛋白，称为视蛋白；3)光使所结合的11-顺式-RAL发生光异构化而形成反式-RAL，启动了所结合的RAL从视蛋白结合位点中释放；和4)其使反式-RAL(醛)转化成维生素A(醇)且将维生素A输送回至RPE中，在RPE中再次开始循环。

RAL的醛基有助于所述分子通过与视蛋白结合位点中的氨基酸侧链形成可逆化学键来结合到视蛋白。虽然RAL上的醛基是分子锚定于视蛋白结合位点所必需的，但是由于其倾向于与其它生物胺形成希夫碱，因此其另外带来了危险。前三个反应发生于感光体外部区段中且产生了称为A2PE的中间产物。A2PE一经形成，即分溶到脂质相中且在感光体外部区段膜中积聚。当RPE细胞摄取所丢弃的外部区段时，它们所积聚的A2PE被导引到它们的溶酶体中。

如上文所述，黄斑变性和病源学涉及A2E和/或脂褐质积聚的其它形式的视网膜疾病可以通过降低A2E形成量来治疗或预防。适用于此举的化合物包括RAL捕获剂。RAL捕获剂降低了A2E形成量，例如通过与已逃避钳合的RAL形成共价键。已经与捕获RAL的化合物反应的RAL由此无法与磷脂酰乙醇胺反应。

本发明还涉及本文所述化合物用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防发病机制中涉及醛毒性的疾病、病症或病状和/或减少其风险。更确切地说，本发明的这个方面涉及本文所述化合物的用途，其用于制造供治疗、预防以下疾病和/或减少其风险的药剂：(1)眼部疾病、病症或病状，包括(但不限于)角膜疾病(例如干眼综合症、白内障、圆锥形角膜、大疱和其它角膜病变以及富克氏内皮营养不良(Fuch's endothelial dystrophy))、其它眼部病症或病状(例如过敏性结膜炎、眼部瘢痕性类天疱疮、与PRK愈合和其它角膜愈合相关的病状，以及与泪脂质降解或泪腺机能不良相关的病状)，以及与炎症所致醛含量高相关的其它眼部病状(例如葡萄膜炎、巩膜炎、史蒂文琼森眼综合症，以及眼部红斑痤疮(伴有或不伴有睑板腺机能不良))；(2)皮肤病症或病状或美容适应症。举例来说，所述疾病、病症或病状包括(但不限于)牛皮癣、局部(盘状)狼疮、接触性皮炎、异位性皮炎、过敏性皮炎、辐射性皮炎、寻常痤疮、休格连-拉森综合症和其它鱼鳞癣、日光性弹性组织变性/皱纹、肤色紧致、浮肿、湿疹、烟尘或刺激物诱发的皮肤变化、真皮切口，以及与灼伤和创伤相关的皮肤病状；(3)与糜烂性毒剂的毒性效应或碱性试剂灼伤相关的病状；或(4)自体免疫、免疫介导、炎性、心血管或神经疾病(例如狼疮、硬皮病、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、类风湿性关节炎、炎性肠病、败血症、动脉粥样硬化、局部缺血再灌注性损伤、帕金森氏病、阿兹海默氏病、多发性硬化症、肌肉萎缩性侧索硬化、糖尿病、代谢综合症以及纤维化疾病)。

本发明还涉及本文所述化合物的用途，其用于治疗、预防发病机制中涉及醛毒性的疾病、病症或病状和/或减少其风险。更确切地说，本发明的这个方面涉及本文所述化合物用于治疗、预防以下疾病和/或减少其风险的用途：(1)眼部疾病、病症或病状，包括(但不限于)角膜疾病(例如干眼综合症、白内障、圆锥形角膜、大疱和其它角膜病变，以及富克氏内皮营养不良)、其它眼部病症或病状(例如过敏性结膜炎、眼部瘢痕性类天疱疮、与PRK愈合和其它角膜愈合相关的病状，以及与泪脂质降解或泪腺机能不良相关的病状)，以及与发炎所致醛含量高相关的其它眼部病状(例如葡萄膜炎、巩膜炎、史蒂文琼森眼综合症，以及眼部红斑痤疮(伴有或不伴有睑板腺功能障碍))；(2)皮肤病症或病状或美容适应症。举例来说，所述疾病、病症或病状包括(但不限于)牛皮癣、局部(盘状)狼疮、接触性皮炎、异位性皮炎、过敏性皮炎、辐射性皮炎、寻常痤疮、休格连-拉森综合症和其它鱼鳞癣、日光性弹性组织变性/皱纹、肤色紧致、浮肿、湿疹、烟尘或刺激物诱发的皮肤变化、真皮切口，以及与灼伤和创伤相关的皮肤病状；(3)与糜烂性毒剂的毒性效应或碱性试剂灼伤相关的病状；或(4)自体免疫、免疫介导、炎性、心血管或神经疾病(例如狼疮、硬皮病、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、类风湿性关节炎、炎性肠病、败血症、动脉粥样硬化、局部缺血再灌注性损伤、帕金森氏病、阿兹海默氏病、多发性硬化症、肌肉萎缩性侧索硬化、糖尿病、代谢综合症以及纤维化疾病)。

本文所述的化合物也可以体表投与，如直接投与眼睛，例如以滴眼剂或眼用软膏形式。滴眼剂典型地包含有效量的至少一种本文所述化合物和能够安全地施加到眼睛的载剂。举例来说，滴眼剂呈等张溶液的形式，并且溶液的pH经调节以使得眼睛不受到刺激。在许多情况下，上皮屏障干扰分子渗透到眼睛中。因此，目前使用的大部分眼用药物都补充有某种形式的渗透增强剂。这些渗透增强剂通过使最上面的上皮细胞的紧密连接松开而起作用(伯斯坦(Burstein)，英国眼科学会会刊(Trans Ophthalmol Soc UK)104:402(1985)；艾什顿(Ashton)等人，药理学与实验治疗学杂志(J Pharmacol Exp Ther)259:719(1991)；格林(Green)等人，美国眼科学杂志(Am J Ophthalmol.)72:897(1971))。最常用的渗透增强剂是苯扎氯铵(benzalkonium chloride)(唐(Tang)等人，药学杂志(J Pharm Sci.)83:85(1994)；伯斯坦等人，眼科研究与视力学(Invest Ophthalmol Vis Sci.)19:308(1980))，其也具有针对微生物污染的防腐剂作用。

体表投与可以呈以下形式：乳膏、悬浮液、乳液、软膏、滴剂、油剂、洗剂、贴片、胶带、吸入剂、喷雾剂，或控制释放体表调配物，包括凝胶、膜、贴片以及粘合剂。眼内投与可以采取结膜下、眼筋膜下胶囊、眼球后或玻璃体内注射、积存注射或植入剂形式。通过这些途径投与的化合物可以呈溶液或悬浮液形式。通过积存注射投与化合物可以含有医药上可接受的载剂或赋形剂；这些医药上可接受的载剂或赋形剂可以是天然或合成的，并且可以是可生物降解或不可生物降解的并且以可控方式促进药物释放。用于控制释放化合物的植入物可以由天然或合成的可生物降解或不可生物降解材料组成。载剂可接受之处在于其与组合物中的其它组分相容且对患者无害。载剂的一些实例包括(1)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖，(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉，(3)纤维素以及(4)环糊精。适用的体表调配物在PCT公开WO 2011/072141中描述，所述公开的内容以引用的方式并入本文中。

用于体表投与皮肤的调配物可以包括例如医药学上可接受的载剂中包含伯胺化合物的软膏、乳膏、凝胶以及糊剂。体表用的伯胺化合物调配物包括油性或水溶性软膏基质制剂，如所属领域的技术人员众所周知。举例来说，这些调配物可以包括植物油、动物脂肪以及例如从石油获得的半固体烃类。所用的特定组分可以包括白软膏、黄软膏、鲸蜡酯蜡、油酸、橄榄油、石蜡、矿脂、白矿脂、鲸蜡、甘油淀粉、白蜡、黄蜡、羊毛脂、无水羊毛脂以及单硬脂酸甘油酯。还可以使用各种水溶性软膏基质，包括二元醇醚和衍生物、聚乙二醇、聚乙二醇40硬脂酸酯以及聚山梨醇酯。

用于体表投与的调配物可以含有浓度在0.001％到10％、0.05％到10％、0.1％到10％、0.2％到10％、0.5％到10％、1％到10％、2％到10％、3％到10％、4％到10％、5％到10％或7％到10％(重量/体积)范围内，或在0.001％到2.0％、0.001％到1.5％或0.001％到1.0％(重量/体积)范围内，或在0.05％到2.0％、0.05％到1.5％或0.05％到1.0％(重量/体积)范围内，或在0.1％到5.0％、0.1％到2.0％、0.1％到1.5％或0.1％到1.0％(重量/体积)范围内，或在0.5％到5.0％、0.5％到2.0％、0.5％到1.5％或0.5％到1.0％(重量/体积)范围内，或在1％到5.0％、1％到2.0％或1％到1.5％(重量/体积)范围内的用于本申请的化合物。用于体表投与的调配物还可以含有浓度在0.001％到2.5％、0.01％到2.5％、0.05％到2.0％、0.1％到2.0％、0.2％到2.0％、0.5％到2.0％或1％到2.0％(重量/重量)范围内或在0.001％到2.0％、0.001％到1.5％、0.001％到1.0％或0.001％到5％(重量/重量)范围内的用于本申请的化合物。

在滴眼剂调配物中，组合物可以含有浓度为0.01％到20％、0.02％到15％、0.04％到10％、0.06％到5％、0.08％到1％或0.09％到0.5％(重量/体积)的活性化合物(在对溶液进行或不进行pH和/或渗透性调节的情况下)。更确切地说，滴眼剂调配物可以含有浓度为0.09％到0.5％(重量/体积)(例如0.1％)的本文所述化合物。

在一个示例中，医药组合物涵盖通过将治疗有效量的本文所述化合物与寡聚或聚合载剂混合而制成的组合物，所述寡聚或聚合载剂如环糊精或化学改性环糊精，包括三甲基-β-环糊精、2-羟乙基-β-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、3-羟丙基-β-环糊精以及β-环糊精磺基丁醚钠盐(或钾盐)。举例来说，寡聚或聚合载剂是β-环糊精磺基丁醚钠盐。组合物中的β-环糊精磺基丁醚钠盐含量可以在约0.01到30％(重量/体积)范围内。在一个示例中，β-环糊精磺基丁醚钠盐的浓度是5到25％(重量/体积)。进一步示例，β-环糊精磺基丁醚钠盐浓度的是6到20％(重量/体积)。在一个示例中，β-环糊精磺基丁醚的浓度是6到12％(重量/体积)。进一步示例，β-环糊精磺基丁醚浓度的是9-10％(重量/体积)，包括9.5％(重量/体积)。本文所述化合物在组合物中的含量可以在0.01％到20％、0.02％到15％、0.04％到10％、0.06％到5％、0.08％到1％或0.09％到0.5％(重量/体积)范围内。更确切地说，组合物可以含有浓度为0.09％到0.5％(重量/体积)(例如0.1％)的本文所述化合物。

本文所述的化合物可以经口投与，并且含有活性成分的医药组合物因此可以呈适于经口服用的形式，例如片剂、糖衣锭、口含锭、水性或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒剂、乳液、硬或软胶囊，或糖浆或酏剂。预定经口使用的组合物可以根据所属领域中已知用于制造医药组合物的任何方法来制备，并且此类组合物可以含有一或多种选自由以下组成的群组的药剂：甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂以便提供医药学上精致并且适口的制剂。

以片剂或胶囊(例如明胶胶囊)的形式经口投与时，活性药物组分可以与医药学上可接受的口服无毒惰性载剂(例如乙醇、甘油、水等)合并。此外，期望或需要时，也可以将适合的粘合剂、润滑剂、崩解剂以及着色剂并入混合物中。适合的粘合剂包括淀粉、硅酸镁铝、淀粉糊剂、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯啶酮、天然糖类(例如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成胶(例如阿拉伯胶)、黄蓍或海藻酸钠、聚乙二醇、蜡等。这些剂量形式中所用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、二氧化硅、滑石、硬脂酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇等。崩解剂包括(但不限于)淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐，或泡腾混合物、交联羧甲纤维素或其钠盐等。稀释剂包括例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸。

片剂含有与适于制造片剂的医药学上可接受的无毒赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未经包覆的，或其可以通过已知技术包覆包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，由此提供更长时间的持续作用。

本文所述化合物在口服调配物中的治疗有效剂量可以为每天每公斤患者体重0.01mg到50mg不等，更确切地说0.01mg/kg到10mg/kg，其可以按每天单次或多次剂量投与。口服时，药物递送形式可以是含有1mg到500mg活性成分，确切地说1mg、5mg、10mg、20mg、50mg、100mg、250mg以及500mg活性成分的锭剂或胶囊，或含有至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％(w/w)活性成分的片剂或胶囊。举例来说，胶囊可以含有50mg活性成分或5％到10％(w/w)活性成分。举例来说，片剂可以含有100mg活性成分或20-50％(w/w)活性成分。举例来说，除活性成分之外，片剂还可以含有崩解剂(例如交联羧甲纤维素或其钠盐和甲基纤维素)、稀释剂(例如微晶纤维素)以及润滑剂(例如硬脂酸钠和硬脂酸镁)。药物可以按天计每天投与一次、两次或更多次。

吸入投与时，所述化合物以气溶胶喷雾形式从含有适合推进剂(例如气体，例如二氧化碳)的加压容器或分配器或喷雾器递送。

对于经粘膜或经皮投药来说，调配物中使用适于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在所属领域中通常已知，并且对于经粘膜投药来说，包括例如清洁剂、胆汁盐以及梭链孢酸衍生物。经粘膜投药可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂实现。如所属领域中通常已知，对于经皮投药来说，活性化合物配制成软膏、药膏、凝胶或乳膏。

包含本文所述化合物的肠胃外调配物可以制备成水性等张溶液或悬浮液，并且栓剂宜由脂肪乳液或悬浮液制备。调配物可以经灭菌且/或含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，其还可以含有治疗上有价值的其它物质。组合物是根据常规方法制备，并且可以含有约0.1％到75％、优选约1％到50％的本文所述化合物。

短语“肠胃外投药(parenteral administration)”和“肠胃外投药(administeredparenterally)”是所属领域公认的术语，并且包括除肠内和体表投药外的投药方式，如注射，并且包括(但不限于)静脉内、肌肉内、胸膜内、血管内、心包内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊椎内以及胸骨内注射和输注。

3.示例性化合物的描述

氘(D或²H)是氢的稳定非放射性同位素且具有2.0144的原子量。氢天然地以同位素¹H(氢或氕)、D(²H或氘)和T(³H或氚)的混合物形式存在。所属领域的技术人员了解，含氢化合物中的标识“氢”实际上表示氢和约0.015％氘的混合物。

在实验室中，可能难以在任何一个位点实现完全氘化或100％氘化。当本文所述的任何化合物在指定位点处标有氘原子时，应了解仍可以存在较小百分比的氢。称此类化合物富含氘。富氘化合物通过使用经适当富集的起始材料合成来制备。如本文所用，术语“富含氘”或“富氘”是指化合物或所述化合物的特定位点包含氘的含量大于其天然同位素丰度(0.015％)。相应地，在一些实施例中，本发明提供包含位于指定位点的氘的化合物，其中氘并入的百分比或含量大于其天然同位素丰度。

根据一个方面，本发明提供一种式I化合物：

或其医药学上可接受的盐，其中：

R¹选自-NH₂、-NHD或-ND₂；

R²选自氢或氘；

R³和R⁴独立地选自-CH₃、-CH₂D、-CHD₂或-CD₃；且

R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地选自氢或氘；

根据另一方面，本发明提供式I-A化合物：

或其医药学上可接受的盐，其中：

R¹选自-NH₂、-NHD或-ND₂；

R²选自氢或氘；

R³和R⁴独立地选自-CH₃、-CH₂D、-CHD₂或-CD₃；且

R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地选自氢或氘；

根据另一方面，本发明提供式II-A或II-B化合物：

或其医药学上可接受的盐，其中：

R¹选自-NH₂、-NHD或-ND₂；

R²选自氢或氘；

R³和R⁴独立地选自-CH₃、-CH₂D、-CHD₂或-CD₃；且

R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地选自氢或氘；

其限制条件为式II-A中的R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

根据另一方面，本发明提供式III-A、III-B或III-C化合物：

或其医药学上可接受的盐，其中：

R¹选自-NH₂、-NHD或-ND₂；

R²选自氢或氘；

R³和R⁴独立地选自-CH₃、-CH₂D、-CHD₂或-CD₃；且

R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地选自氢或氘；

根据另一方面，本发明提供式IV化合物：

或其医药学上可接受的盐，其中：

R¹选自-NH₂、-NHD或-ND₂；

R²选自氢或氘；

R³和R⁴独立地选自-CH₃、-CH₂D、-CHD₂或-CD₃；且

R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地选自氢或氘；

根据另一方面，本发明提供式V化合物：

或其医药学上可接受的盐，其中：

R¹选自-NH₂、-NHD或-ND₂；

R²选自氢或氘；

R³和R⁴独立地选自-CH₃、-CH₂D、-CHD₂或-CD₃；且

R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地选自氢或氘；

根据另一方面，本发明提供式VI-A或VI-B化合物：

或其医药学上可接受的盐，其中：

每个A独立地是氢或氘；

R¹选自-NH₂、-NHD或-ND₂；

R²选自氢或氘；且

R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地选自氢或氘；

其限制条件为A、R¹、R²、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

根据另一方面，本发明提供式VII-A或VII-B化合物：

或其医药学上可接受的盐，其中：

每个A独立地是氢或氘；

R¹选自-NH₂、-NHD或-ND₂；

R²选自氢或氘；

R³和R⁴独立地选自-CH₃、-CH₂D、-CHD₂或-CD₃；且

R⁸选自氢或氘；

其限制条件为R¹、R²、R³、R⁴、A或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

根据另一方面，本发明提供式VIII-A或VIII-B化合物：

或其医药学上可接受的盐，其中：

每个A独立地是氢或氘；

R¹选自-NH₂、-NHD或-ND₂；

R²选自氢或氘；

R³和R⁴独立地选自-CH₃、-CH₂D、-CHD₂或-CD₃；且

R⁵和R⁸各自独立地选自氢或氘；

其限制条件为A、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

根据另一方面，本发明提供式IX-A或IX-B化合物：

或其医药学上可接受的盐，其中：

R¹选自-NH₂、-NHD或-ND₂；

R²选自氢或氘；

R³和R⁴独立地选自-CH₃、-CH₂D、-CHD₂或-CD₃；且

R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地选自氢或氘；

根据另一方面，本发明提供式X化合物：

或其医药学上可接受的盐，其中：

R¹选自-NH₂、-NHD或-ND₂；

R²选自氢或氘；

R³和R⁴独立地选自-CH₃、-CH₂D、-CHD₂或-CD₃；且

R⁵和R⁶各自独立地选自氢或氘；

其限制条件为R¹、R²、R³、R⁴、R⁵或R⁶中的至少一个是氘或含有氘。

以下实施例适用于前述每一种化学式。

如上文所定义且如本文所述，R¹选自-NH₂、-NHD或-ND₂。

在一些实施例中，R¹是-NH₂。在一些实施例中，R¹是-NH₂且R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

在一些实施例中，R¹是-NHD。在一些实施例中，R¹是-NHD且R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

在一些实施例中，R¹是-ND₂。在一些实施例中，R¹是-ND₂且R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

如上文所定义且如本文所述，A选自氢或氘。

在一些实施例中，A是氢。在一些实施例中，A是氢且R¹、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。在一些实施例中，A是氘。在一些实施例中，A是氘且R¹、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

如上文所定义且如本文所述，R²选自氢或氘。

在一些实施例中，R²是氢。在一些实施例中，R²是氢且R¹、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。在一些实施例中，R²是氘。在一些实施例中，R²是氘且R¹、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

如上文所定义且如本文所述，R³选自-CH₃、-CH₂D、-CHD₂或-CD₃。

在一些实施例中，R³是-CH₃。在一些实施例中，R³是-CH₃且R¹、R²、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

在一些实施例中，R³是-CH₂D。在一些实施例中，R³是-CH₂D且R¹、R²、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

在一些实施例中，R³是-CHD₂。在一些实施例中，R³是-CHD₂且R¹、R²、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

在一些实施例中，R³是-CD₃。在一些实施例中，R³是-CD₃且R¹、R²、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

如上文所定义且如本文所述，R⁴选自-CH₃、-CH₂D、-CHD₂或-CD₃。

在一些实施例中，R⁴是-CH₃。在一些实施例中，R⁴是-CH₃且R¹、R²、R³、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

在一些实施例中，R⁴是-CH₂D。在一些实施例中，R⁴是-CH₂D且R¹、R²、R³、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

在一些实施例中，R⁴是-CHD₂。在一些实施例中，R⁴是-CHD₂且R¹、R²、R³、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

在一些实施例中，R⁴是-CD₃。在一些实施例中，R⁴是-CD₃且R¹、R²、R³、R⁵、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

如上文所定义且如本文所述，R⁵选自氢或氘。

在一些实施例中，R⁵是氢。在一些实施例中，R⁵是氢且R¹、R²、R³、R⁴、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。在一些实施例中，R⁵是氘。在一些实施例中，R⁵是氘且R¹、R²、R³、R⁴、R⁶、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

如上文所定义且如本文所述，R⁶选自氢或氘。

在一些实施例中，R⁶是氢。在一些实施例中，R⁶是氢且R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。在一些实施例中，R⁶是氘。在一些实施例中，R⁶是氘且R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

如上文所定义且如本文所述，R⁷选自氢或氘。

在一些实施例中，R⁷是氢。在一些实施例中，R⁷是氢且R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。在一些实施例中，R⁷是氘。在一些实施例中，R⁷是氘且R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶或R⁸中的至少一个是氘或含有氘。

如上文所定义且如本文所述，R⁸选自氢或氘。

在一些实施例中，R⁸是氢。在一些实施例中，R⁸是氢且R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶或R⁷中的至少一个是氘或含有氘。在一些实施例中，R⁸是氘。在一些实施例中，R⁸是氘且R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶或R⁷中的至少一个是氘或含有氘。

在一些实施例中，本发明提供式I、I-A、II-A、II-B、III-A、III-B、III-C、IV或V化合物，其中R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自如上文所定义且如本文所述，且其中R¹和R²各自如下表1a所列表项中所定义。

表1a.

表项	R¹	R²
			i	-NH₂	H
ii	-NH₂	D
			iii	-NHD	H
iv	-NHD	D
			v	-ND₂	H
vi	-ND₂	D

在一些实施例中，本发明提供式I、I-A、II-A、II-B、III-A、III-B、III-C、IV或V化合物，其中R¹、R²、R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自如上文所定义且如本文所述，且其中R³和R⁴各自如下表1b所列表项中所定义。

表1b.

表项	R³	R⁴
			i	-CH₃	-CH₃
ii	-CH₃	-CH₂D
			iii	-CH₃	-CHD₂
iv	-CH₃	-CD₃
			v	-CH₂D	-CH₃
vi	-CH₂D	-CH₂D
			vii	-CH₂D	-CHD₂
viii	-CH₂D	-CD₃
			ix	-CHD₂	-CH₃
x	-CHD₂	-CH₂D
			xi	-CHD₂	-CHD₂
xii	-CHD₂	-CD₃
			xiii	-CD₃	-CH₃
xiv	-CD₃	-CH₂D
			xv	-CD₃	-CHD₂
xvi	-CD₃	-CD₃

在一些实施例中，本发明提供式I、I-A、II-A、II-B、III-A、III-B、III-C、IV或V化合物，其中R¹、R²、R³和R⁴各自如上文所定义且如本文所述，且其中R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自如下表1c所列表项中所定义。

表1c.

表项	R⁵	R⁶	R⁷	R⁸
					i	H	H	H	H
ii	H	H	H	D
					iii	H	H	D	H
iv	H	D	H	H
					v	D	H	H	H
vi	H	H	D	D
					vii	H	D	H	D
viii	D	H	H	D
					ix	H	D	D	H
x	D	H	D	H
					xi	D	D	H	H
xii	H	D	D	D
					xiii	D	H	D	D
xiv	D	D	H	D
					xv	D	D	D	H
xvi	D	D	D	D

在一些实施例中，本发明提供式I、I-A、II-A、II-B、III-A、III-B、III-C、IV或V化合物，其中R¹和R²各自如上表1a所列表项中所定义，R³和R⁴各自如上表1b所列表项中所定义，且R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自如上表1c所列表项中所定义。

在一些实施例中，本发明提供的化合物选自任一个表1a、表1b或表1c中所述的化合物或其医药学上可接受的盐。

在一些实施例中，本发明提供的式I化合物选自下表2中所描绘之这些化合物。

表2.代表性式I化合物

在一些实施例中，本发明提供上表2中所描绘的化合物，或其医药学上可接受的盐。

在一些实施例中，本发明提供下表2A中所描绘的化合物或其医药学上可接受的盐的富氘类似物，其中氘是在任何可利用的氢处富集。

表2A.

在一些实施例中，本发明提供包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或十三个氘原子的本文所述任何化合物。

在一些实施例中，所提供的化合物包含氘的含量为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。如本文所用，在富氘的背景下，术语“约”是指±2％。

在某些实施例中，本发明提供上文和本文所述的任何化合物，或其医药学上可接受的盐。

在一些实施例中，本发明提供上文和本文所述的任何化合物的分离形式。

4.化合物和其医药学上可接受的组合物的用途

发现本文所述的某些化合物适用于清除毒性醛，如MDA和HNE。本文所述的化合物与MDA、HNE或其它毒性醛经历希夫碱(Schiff base)缩合反应，并且与醛按照能量上有利的反应形成络合物，从而减少或消除可用于与蛋白质、脂质、碳水化合物或DNA反应的醛。重要的是，本文所述的化合物能与醛反应而形成具有闭环结构的含醛化合物，从而捕获醛并且防止醛被释放回到细胞环境中。

如本文中所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指逆转、减轻如本文所述的疾病或病症或其一或多种症状，延迟其发作，或抑制其进展。在一些实施例中，在一或多种症状已经出现之后投与疗法。在其它实施例中，在缺乏症状的情况下投与疗法。举例来说，在症状发作之前，向易感个体投与疗法(例如根据症状病史和/或根据遗传学或其它易感因素)。症状已消退之后，还继续治疗，例如以预防、延迟或减轻其复发的严重程度。

本发明涉及用于治疗、预防发病机制中涉及醛毒性的疾病、病症或病状和/或减少其风险的本文所述化合物。

醛毒性所牵涉的疾病、病症或病状的实例包括眼部疾病、病症或病状，包括(但不限于)角膜疾病(例如干眼综合症、白内障、圆锥形角膜、大疱和其它角膜病变以及富克氏内皮营养不良)、其它眼部病症或病状(例如过敏性结膜炎、眼部瘢痕性类天疱疮；与PRK愈合和其它角膜愈合相关的病状；以及与泪脂质降解或泪腺机能不良相关的病状)，以及与炎症引起的醛含量高相关的其它眼部病状(例如葡萄膜炎、巩膜炎、史蒂文琼森眼综合症(ocular Stevens Johnson Syndrome)、眼部红斑痤疮(伴有或不伴有睑板腺机能不良))。在一个实例中，眼部疾病、病症或病状不是黄斑变性，如年龄相关性黄斑变性(“AMD”)或斯塔加特氏病(Stargardt's disease)。在另一实例中，眼部疾病、病症或病状是干眼综合症、眼部红斑痤疮或葡萄膜炎。

醛毒性所牵涉的疾病、病症、病状或适应症的实例还包括非眼部病症，包括牛皮癣、局部(盘状)狼疮、接触性皮炎、异位性皮肤炎、过敏性皮炎、辐射性皮炎、寻常痤疮、休格连-拉森综合症和其它鱼鳞癣、日光性弹性组织变性/皱纹、肤色紧致、浮肿、湿疹、烟尘或刺激物诱发皮肤变化、真皮切口、与灼伤和/或创伤相关的皮肤病状、狼疮、硬皮病、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、类风湿性关节炎、发炎性肠病、败血症、动脉粥样硬化、局部缺血再灌注损伤、帕金森病、阿兹海默氏病、丁二酸半缩醛脱氢酶缺乏症、多发性硬化症、肌肉萎缩性侧索硬化、糖尿病、代谢综合症、年龄相关的病症，和纤维化疾病。在另一实例中，非眼部病症是选自接触性皮炎、异位性皮炎、过敏性皮炎和辐射性皮炎的皮肤疾病、病症或病状。在另一实例中，非眼部病症是皮肤疾病、病症或病状，其选自休格连-拉森综合症和与灼伤和/或创伤相关的美容适应症。

在另一实例中，醛毒性所牵涉的疾病、病症或病状是与年龄有关的病症。与年龄有关的疾病、病症或病状的实例包括皮肤的皱纹、干燥和色素沉着。

醛毒性所牵涉的疾病、病症或病状的实例进一步包括与糜烂性毒剂的毒性效应或碱性试剂灼伤相关的病状。本文所述的化合物减少或排除毒性醛，从而治疗、预防这些疾病或病症和/或减少其风险。

在一个实施例中，本发明涉及治疗、预防发病机制中涉及醛毒性的眼部疾病、病症或病状和/或减少其风险，包含向有需要的个体投与本文所述的化合物。所述眼部疾病、病症或病状包括(但不限于)角膜疾病(例如干眼综合症、白内障、圆锥形角膜、大疱和其它角膜病变以及富克氏角膜内皮营养不良)、其它眼部病症或病状(例如过敏性结膜炎、眼部瘢痕性类天疱疮、与PRK愈合和其它角膜愈合相关的病状，以及与泪脂质降解或泪腺机能不良相关的病状)，以及炎症导致醛含量高的其它眼部病状(例如葡萄膜炎、巩膜炎、史蒂文琼森眼综合症、眼部红斑痤疮(伴有或不伴有睑板腺机能不良))。眼部疾病、病症或病状不包括黄斑变性(如AMD)或斯塔加特氏病。在一个示例中，在眼部疾病、病症或病状中，眼部组织或细胞中的MDA或HNE的量或浓度增加。举例来说，醛(例如MDA或HNE)的量或浓度相较于正常眼部组织或细胞增加至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、5倍、10倍。本文所述化合物(如化合物9)使醛(例如MDA和HNE)浓度按照时间相关方式减少。醛(例如MDA或HNE)的量或浓度可以通过所属领域中已知的方法或技术测量，如图克赞(Tukozkan)等人，Furat Tip Dergisi 11:88-92(2006)中所述的方法或技术。

在一类中，眼部疾病、病症或病状是干眼综合症。在第二类中，眼部疾病、病症或病状是与PRK愈合和其它角膜愈合相关的病状。举例来说，本发明涉及促进PRK愈合或其它角膜愈合，包含向有需要的个体投与本文所述的化合物。在第三类中，眼部疾病、病症或病状是与炎症引起的醛含量高相关的眼部病状(例如葡萄膜炎、巩膜炎、史蒂文琼森眼综合症和眼部红斑痤疮(伴有或不伴有睑板腺机能不良))。在第四类中，眼部疾病、病症或病状是圆锥形角膜、白内障、大疱和其它角膜病变、富克氏内皮营养不良、眼部瘢痕性类天疱疮或过敏性结膜炎。本文所述的化合物可以体表或全身性投与，如下文所述。

在第二实施例中，本发明涉及治疗、预防发病机制中涉及醛毒性的皮肤病症或病状或美容适应症和/或减少其风险，包含向有需要的个体投与本文所述的化合物。所述皮肤病症或病状包括(但不限于)牛皮癣、硬皮病、局部(盘状)狼疮、接触性皮炎、异位性皮炎、过敏性皮炎、辐射性皮炎、寻常痤疮和休格连-拉森综合症以及其它鱼鳞癣，且美容适应症是日光性弹力组织变性/皱纹、肤色紧致、浮肿、湿疹、烟尘或刺激物诱发的皮肤变化、真皮切口，或与灼伤和/或创伤相关的皮肤病状。在一些实施例中，本发明涉及年龄相关的皮肤疾病、病症或病状，如本文所述。

各种皮肤病症或病状，如异位性皮肤炎、局部(盘状)狼疮、牛皮癣和硬皮病，均以MDA和HNE含量高为特征(英国皮肤病学杂志(Br J Dermatol.)149:248(2003)；欧洲皮肤病与性病学会杂志(JEADV)26:833(2012)；临床风湿病学(Clin Rheumatol.)25:320(2006))。另外，休格连-拉森综合症(SLS)的鱼鳞癣特征来源于脂肪醛的积聚，所述脂肪醛积聚破坏板层体(LB)的正常功能和分泌并且导致角质层(SC)中产生细胞间脂质沉积物且导致表层产生有缺陷的阻水性(W.B.Rizzo等人(2010))。使醛代谢的酶脂肪醛脱氢酶在SLS患者中功能异常。因此，减少或消除醛的化合物(例如本文所述的化合物)可以用于治疗、预防发病机制中涉及醛毒性的皮肤病症或病状(如本文所述的皮肤病症或病状)，和/或减少其风险。此外，在改善阻水性和预防醛介导发炎的情况下(包括纤维化和弹性组织变性(切尔普托(Chairpotto)等人(2005))，许多美容适应症(如日光性弹性组织变性/皱纹、肤色、紧致(浮肿)、湿疹、烟尘或刺激物诱发的皮肤变化以及真皮切口美容术)以及与灼伤和/或创伤相关的皮肤病状可以使用本发明的方法治疗。

在一类中，皮肤疾病、病症或病状是牛皮癣、硬皮病、局部(盘状)狼疮、接触性皮炎、异位性皮炎、过敏性皮炎、辐射性皮炎、寻常痤疮或休格连-拉森综合症以及其它鱼鳞癣。在一个示例中，皮肤疾病、病症或病状是接触性皮炎、异位性皮炎、过敏性皮炎、辐射性皮炎或休格连-拉森综合症以及其它鱼鳞癣。在第二类中，美容适应症是日光性弹力组织变性/皱纹、肤色紧致、浮肿、湿疹、烟尘或刺激物诱发的皮肤变化、真皮切口，或与灼伤和/或创伤相关的皮肤病状。

在第三实施例中，本发明涉及治疗、预防发病机制中涉及醛毒性的与糜烂性毒剂的毒性效应或碱性试剂灼伤相关的病状和/或减少其风险，包含向有需要的个体投与本文所述的化合物。

糜烂性毒剂包括(但不限于)硫芥、氮芥和光气肟。糜烂性毒剂的毒性或有害效应包括皮肤、眼睛和/或粘膜的疼痛、刺激和/或流泪，以及结膜炎和/或眼角膜损伤。硫芥是化合物双(2-氯乙基)硫醚。氮芥包括化合物双(2-氯乙基)乙胺、双(2-氯乙基)甲胺以及三(2-氯乙基)胺。硫芥或其类似物能引起氧化应激增强，具体地说，引起HNE含量提高，且通过耗乏抗氧化防御系统且借此增强脂质过氧化反应，可以诱导氧化应激反应且从而提高醛含量(贾法里(Jafari)等人(2010)；帕耳(Pal)等人(2009))。体表施药时，抗氧化剂(如水飞蓟宾(Silibinin))减轻由暴露于硫芥或其类似物所诱发的皮肤损伤，并且抗氧化酶活性增强可以是对硫芥所产生的活性氧种类的补偿反应(贾法里等人(2010)；特瓦芮-辛格(Tewari-Singh)等人(2012))。此外，减少自由基种类的干预是暴露后针对光气诱发肺损伤的有效疗法(舒托(Sciuto)等人(2004))。因此，减少或消除醛的化合物(如本文所述的化合物)可以用于治疗、预防与糜烂性毒剂(如硫芥、氮芥和光气肟)的毒性效应相关的病状，和/或减少其风险。

碱性试剂包括(但不限于)石灰、碱液、氨以及排水渠清洁剂。减少或消除醛的化合物(如本文所述的化合物)可以用于治疗、预防与碱性剂灼伤相关的病状，和/或减少其风险。

在第四实施例中，本发明涉及治疗、预防发病机制中涉及醛毒性的自体免疫、免疫介导、炎性、心血管或神经疾病、病症或病状，或代谢综合症，或糖尿病，和/或减少其风险，包含向有需要的个体投与本文所述的化合物。自体免疫或免疫介导疾病、病症或病状包括(但不限于)狼疮、硬皮病、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和类风湿性关节炎。发炎疾病、病症或病状包括(但不限于)类风湿性关节炎、炎性肠病(例如克罗恩氏病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎)、败血症和纤维化(例如肾、肝、肺和心脏纤维化)。心血管疾病、病症或病状包括(但不限于)动脉粥样硬化和局部缺血再灌注损伤。神经疾病、病症或病状包括(但不限于)帕金森病、阿兹海默氏病、丁二酸半缩醛脱氢酶缺乏症、多发性硬化症、肌肉萎缩性侧索硬化，和休格连-拉森综合症的神经病学方面(认知迟缓和痉挛)。

技术人员将理解，本文中所列的疾病、病症或病状可能涉及超过一种病理学机制。举例来说，本文中所列的疾病、病症或病状可能涉及免疫反应和发炎反应中的调节异常。因此，疾病、病症或病状的上述分类不是绝对的，并且所述疾病、病症或病状可以视为免疫、炎性、心血管、神经和/或代谢疾病、病症或病状。

发现醛脱氢酶缺乏的个体具有较高的醛含量和增强的帕金森病风险(美国国家科学院院刊(PNAS)110:636(2013))和阿兹海默氏病(生物化学与生物物理学研究通讯(BioChem Biophys Res Commun.)273:192(2000))。在帕金森病中，醛尤其干扰多巴胺生理学(自由基生物学和医药(Free Radic Biol Med,)，51:1302(2011)；医药的分子方面(MolAspects Med.)24:293(2003)；脑研究(Brain Res.)1145:150(2007))。另外，多发性硬化症、肌肉萎缩性侧索硬化、自体免疫疾病(如狼疮、类风湿性关节炎、狼疮、牛皮癣、硬皮病和纤维化疾病)中的醛含量升高，且HNE和MDA的含量增加牵涉到动脉粥样硬化和糖尿病的进展(细胞与分子医学杂志(J Cell Mol Med.)15:1339(2011)；关节炎与风湿病(ArthritisRheum.)62:2064(2010)；临床实验免疫学(Clin Exp Immunol.)101:233(1995)；国际风湿性疾病杂志(Int J Rheum Dis.)14:325(2011)；欧洲皮肤病与性病学会杂志，26:833(2012)；临床风湿病学(Clin Rheumatol.)25:320(2006)；肠道，54:987(2005)；美国肾脏病学会杂志(J Am Soc Nephrol)20:2119(2009))。MDA进一步牵涉到泡沫细胞的形成增加，其引起动脉粥样硬化(雷本古特(Leibundgut)等人，药理学当前观点(Current OpinionPharmacol.)13:168(2013))。此外，醛相关毒性在许多炎性肺疾病(例如哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD))的发病机制中起重要作用(巴托丽(Bartoli)，炎症介体(Mediators ofInflammation)2011，论文891752)。因此，减少或消除醛的化合物(例如本文所述的化合物)可以用于治疗、预防自体免疫、免疫介导、炎性、心血管或神经疾病、病症或病状或代谢综合症或糖尿病，和/或减少其风险。举例来说，本文所述的化合物预防醛介导神经元发生细胞死亡。此外，本文所述的化合物下调广谱的促炎性细胞因子且/或上调抗炎性细胞因子，这表明本文所述的化合物适用于治疗发炎疾病，如多发性硬化症和肌肉萎缩性侧索硬化。

如上文所论述，可以将所公开的组合物投与个体以便治疗或预防黄斑变性和病源学涉及A2E和/或脂褐质积聚的其它形式的视网膜疾病。以A2E积聚为特征的其它疾病、病症或病状可以按类似方式治疗。

在一个实施例中，将化合物投与个体，从而减少A2E形成。举例而言，所述化合物可以和PE竞争与反式-RAL的反应，借此减少A2E的形成量。在另一个实施例中，将化合物投与个体，从而防止A2E积聚。举例来说，所述化合物如此成功地和PE竞争与反式-RAL的反应，未形成A2E。

待治疗的个体分成三组：(1)临床上基于视觉缺陷(包括(但不限于)暗适应、对比敏感性和敏锐度)(如通过视觉检查和/或视网膜电图所确定)和/或视网膜健康状况(如通过眼底检查视网膜和RPE组织的脉络膜小疣堆积物、组织萎缩和/或脂褐质荧光)诊断而患有黄斑变性或病源学涉及A2E和/或脂褐质积聚的其它形式的视网膜疾病的个体；(2)出现黄斑变性疾病的前期症状、但基于所述相同测量项目的异常结果被认为处于风险中的个体；和(3)出现前期症状、但基于黄斑变性疾病家族史和/或基因分型结果被认为处于遗传风险中的个体，所述基因分型结果展示与所述疾病相关的一或多种等位基因或多态性。每个月、每周或每天体表或全身投与组合物。为了避免副作用(若存在)，可以根据暗适应的视觉表现来选择剂量。治疗持续至少一个月、三个月、六个月或十二个月或更长的时间段。可以按照一、三、六或十二个月或更长的时间间隔来测试患者以评估安全和功效。通过如上文所述检查视觉表现和视网膜健康状况来测量功效。

在一个实施例中，个体经诊断而患有黄斑变性症状，然后投与所公开的化合物。在另一个实施例中，个体可以经鉴定处于出现黄斑变性的风险中(风险因素包括吸烟史、年龄、女性和家族史)，然后投与所公开的化合物。在另一个实施例中，个体双眼可能患有干性AMD，然后投与所公开的化合物。在另一个实施例中，个体可能一只眼患有湿性AMD，而另一只眼患有干性AMD，然后投与所公开的化合物。在又另一个实施例中，个体可以经诊断而患有斯塔加特氏病，然后投与所公开的化合物。在另一个实施例中，个体经诊断而患有其它形式的视网膜疾病的症状，所述视网膜疾病的病源学涉及A2E和/或脂褐质的积聚，然后投与所述化合物。在另一个实施例中，个体可以经鉴定处于出现其它形式的视网膜疾病的风险中，所述视网膜疾病的病源学涉及A2E和/或脂褐质的积聚，然后投与所公开的化合物。在一些实施例中，预防性投与化合物。在一些实施例中，个体在视网膜明显损伤之前已经诊断患有所述疾病。举例来说，在任何眼科病征显现之前，发现个体携带ABCA4的基因突变且经诊断处于斯塔加特氏病的风险中，或在个体意识到对视力的任何影响之前，发现个体存在指示黄斑变性的早期黄斑变化。在一些实施例中，人类个体可能知道他或她需要黄斑变性治疗或预防。

在一些实施例中，可以监测个体的黄斑变性程度。可以通过多种方式监测个体，如通过眼睛检查、散瞳检查、眼底检查、视敏度测试和/或活组织检查。监测可以在多个时间进行。举例来说，可以在投与化合物之后监测个体。举例来说，监测可以在化合物首次投与之后的一天、一周、两周、一个月、两个月、六个月、一年、两年、五年或任何其它时间段进行。可以反复地监测个体。在一些实施例中，可响应于监测改变化合物的剂量。

在一些实施例中，可以将所公开的方法与用于治疗或预防黄斑变性或病源学涉及A2E和/或脂褐质积聚的其它形式的视网膜疾病的其它方法(如光动力疗法)组合。举例来说，患者可以针对一或多种疾病或病症用超过一种疗法治疗。举例来说，患者的一只眼睛可能罹患干式AMD，其用本发明化合物治疗，而另一只眼睛罹患湿式AMD，其用例如光动力疗法治疗。

在一些实施例中，可以长期投与用于治疗或预防黄斑变性或病源学涉及A2E和/或脂褐质积聚的其它形式的视网膜疾病的化合物。所述化合物可以每天投与，每天超过一次，一周两次，一周三次，每周一次，每两周一次，每月一次，每两个月一次，半年一次，每年一次和/或每两年一次。

神经鞘胺醇1-磷酸酯(一种具有多种细胞功能的生物活性信号传导分子)被内质网酶神经鞘胺醇1-磷酸酯裂解酶不可逆地降解，产生反式-2-十六烯醛和磷酸乙醇胺。已经证明，反式-2-十六烯醛在多种细胞类型中通过JNK依赖性路径引起细胞骨架重组织、脱离和细胞凋亡。参见生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem Biophys Res Commun.)，2012年7月20；424(1):18-21。这些结果和相关α,β-不饱和醛的已知化学性质使得反式-2-十六烯醛与其它细胞组分相互作用的可能性提高。已经表明，其容易和脱氧鸟苷和DNA发生反应，产生非对映异构的环状1,N(2)-脱氧鸟苷加成物3-(2-脱氧-β-d-赤-戊呋喃糖基)-5,6,7,8-四氢-8R-羟基-6R-十三烷基嘧啶并[1,2-a]嘌呤-10(3H)酮和3-(2-脱氧-β-d-赤-戊呋喃糖基)-5,6,7,8-四氢-8S-羟基-6S-十三烷基嘧啶并[1,2-a]嘌呤-10(3H)酮。这些结果证明，神经鞘胺醇1-磷酸酯裂解酶内源性产生的反式-2-十六烯醛和DNA直接发生反应，从而形成醛衍生的DNA加成物，潜在地引起突变诱发后果。

丁二酸半缩醛脱氢酶缺乏症(SSADHD)，也称为4-羟基丁酸尿症或γ-羟基丁酸尿症，是GABA代谢的最流行常染色体隐性遗传病症(沃格尔(Vogel)等人，2013)，显现了早期儿童期的发育迟缓和张力减退表型，以及青春期和成人期的重度表达语言障碍和强迫症表型。一半患者存在癫痫症，因为通常发生全身性的强直阵挛发作(虽然有时不存在)和肌阵挛发作(佩尔(Pearl)等人，2014)。大于三分之二的患者在青春期和成人期显现神经精神问题(即，ADHD、OCD和攻击性)，可能成为残废。在代谢上，主要抑制性神经传递素GABA和γ-羟基丁酸酯(GHB)(一种神经调节性单羧酸)发生积聚(斯奈德(Snead)和吉布森(Gibson)，2005)。另外，患者和相应的鼠类模型中均已检测到这种病症所特有的若干其它中间体。氨己烯酸(Vigabatrin，VGB；γ-乙烯基GABA)，GABA转氨酶的一种不可逆抑制剂，是治疗SSADH缺乏症的合理选择，原因是其防止GABA转化成GHB。结果已经混合，且在所选患者中，治疗已引起恶化(古德(Good)，2011；佩罗克(Pellock)，2011；埃斯喀勒(Escalera)等人，2010；卡萨拉诺(Casarano)等人，2011；玛藤(Matern)等人，1996；艾尔伊萨(Al-Essa)等人，2000)。SSADH缺乏症的靶向疗法仍难以实现且干预是姑息性的。

5.医药学上可接受的组合物

使用有效治疗上文所提供的病症或减轻其严重程度的任何量和任何投药途径来投与根据本发明方法的化合物和组合物。所需的确切量将因个体而异，这取决于个体的物种、年龄和一般状况、感染的严重程度、特定药剂、其投药模式等。为了便于投药和剂量均一性，本发明的化合物优选配制成单位剂型。如本文所用，表述“单位剂型”是指适于所治疗患者的实体上离散药剂单元。然而，应了解，本发明化合物和组合物的每日总用量将由主治医师在合理医学判断范围内决定。针对任何特定患者或生物体的特定有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和所述病症的严重程度；所用特定化合物的活性；所用特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的投与时间、投与途径和排泄速率；治疗持续时间；与所用特定化合物组合或同时使用的药物；和医学领域中熟知的类似因素。

本发明的医药学上可接受的组合物可以经口、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、体表(如通过散剂、软膏或滴剂)、经颊、口服或鼻喷雾等投与人类及其它动物，这取决于所治疗感染的严重程度。在某些实施例中，按每天每千克个体体重约0.01毫克到约50毫克且优选约1毫克到约25毫克，一天一或多次的剂量水平经口或肠胃外投与本发明化合物，以达到所期望的治疗效果。

口服液体剂型包括(但不限于)医药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物外，液体剂型还可以含有本领域中常用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(具体地说，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯，和其混合物。除惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包括佐剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。

可以根据已知技术，使用适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂也可以是存在于肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如存在于1,3-丁二醇中的溶液形式。可以采用的可接受媒剂和溶剂是水、林格氏溶液(U.S.P.)和等张氯化钠溶液。另外，通常采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可以使用任何温和不挥发性油，包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯。另外，使用脂肪酸(例如油酸)制备可注射剂。

可注射调配物可以通过例如经由细菌截留过滤器过滤，或通过并入灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂呈无菌固体组合物形式，其在使用前可以溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。

为了延长本发明化合物的作用，往往期望皮下或肌肉内注射的化合物缓慢吸收。这可以通过使用水溶性不良的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。化合物的吸收速率则取决于其溶解速率，溶解速率又可以取决于晶体大小和结晶形式。或者，通过将化合物溶解或悬浮于油媒剂中来实现肠胃外投与的化合物形式的延迟吸收。通过形成化合物在生物可降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中的微胶囊基质来制造可注射积存形式。依据化合物与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质，可以控制化合物的释放速率。其它生物可降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将化合物截留于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备积存可注射调配物。

用于直肠或阴道投与的组合物优选栓剂，所述栓剂可以通过将本发明化合物与适合的无刺激性赋形剂或载剂混合而制备，如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡，所述赋形剂或载剂在环境温度下是固体，但在体温下是液体并且因此在直肠或阴道腔中熔融并且释放活性化合物。

口服固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、散剂及颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与以下各者混合：至少一种医药学上可接受的惰性赋形剂或载剂，如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)保湿剂，如甘油；d)崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶解延迟剂，例如石蜡；f)吸收促进剂，如季铵化合物；g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂，例如高岭土和膨润土；和i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，和其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。

在使用如乳糖(lactose/milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中，也可以使用相似类型的固体组合物作为填充剂。可以用包衣和外壳(例如肠溶衣和医药配制领域中众所周知的其它包衣)来制备片剂、糖衣药丸、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型。其可以任选地含有遮光剂，并且其组成也可以使其任选地在肠道某一部分中以延迟方式仅释放或优先释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。在使用如乳糖(lactose/milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中，也可以使用相似类型的固体组合物作为填充剂。

活性化合物还可以呈与一或多种如上文所提及的赋形剂形成的微胶囊化形式。片剂、糖衣药丸、胶囊、丸剂以及颗粒的固体剂型可以用包衣和外壳(例如肠溶衣、释放控制包衣以及医药配制领域中众所周知的其它包衣)来制备。在这些固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂(例如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。按惯例，这些剂型还可以包含除惰性稀释剂以外的其它物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂，如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。其可以任选地含有遮光剂，并且其组成也可以使其任选地在肠道某一部分中以延迟方式仅释放或优先释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。

用于体表或透皮投与本发明化合物的剂型包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片。需要时，将活性组分与医药学上可接受的载剂和任何所需防腐剂或缓冲剂在无菌条件下混合。本发明的范围内还涵盖眼科调配物、滴耳剂和滴眼剂。另外，本发明涵盖了使用透皮贴片，其具有使化合物可控制地递送到身体的的附加优点。这些剂型可以通过将化合物溶解或分配于适当介质中来制备。还可以使用吸收增强剂来提高化合物穿过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制速率。

本发明化合物也可以体表投与，如直接投与眼睛，例如以滴眼剂或眼用软膏形式。滴眼剂典型地包含有效量的至少一种本发明化合物和能够安全地施加到眼睛的载剂。举例来说，滴眼剂呈等张溶液的形式，并且溶液的pH经调节以使得眼睛不受到刺激。在许多情况下，上皮屏障干扰分子渗透到眼睛中。因此，目前使用的大部分眼用药物都补充有某种形式的渗透增强剂。这些渗透增强剂通过使最上面的上皮细胞的紧密连接松开而起作用(伯斯坦(Burstein)，1985，英国眼科学会会刊(Trans Ophthalmol Soc U K)104(Pt 4):402-9；艾什顿(Ashton)等人，1991，药理学与实验治疗学杂志(J Pharmacol Exp Ther.)259(2):719-24；格林(Green)等人，1971，美国眼科学杂志(Am J Ophthalmol.)72(5):897-905)。最常用的渗透增强剂是苯扎氯铵(benzalkonium chloride)(唐(Tang)等人，1994，药学杂志(J Pharm Sci.)83(1):85-90；伯斯坦等人，1980，眼科研究与视力学(Invest OphthalmolVis Sci.)19(3):308-13)，其也具有针对微生物污染的防腐剂作用。其添加的最终浓度典型地是0.01-0.05％。

如本文所用，术语“生物样品”包括(但不限于)细胞培养物或其提取物；由哺乳动物获得的活组织检查材料或其提取物；和血液、唾液、尿液、粪便、精液、眼泪或其它体液或其提取物。

本发明各方面的所有特征作必要的修正即适用于所有其它方面。

为了可以更全面地理解本文中所述的本发明，阐述以下实例。应了解，这些实例仅用于说明性目的并且不应理解为以任何方式限制本发明。

范例

如下文实例中所描绘，在某些示范性实施例中，根据以下通用程序制备化合物。应了解，虽然一般方法描绘了某些本发明化合物的合成，但以下一般方法和本领域普通技术人员已知的其它方法可以适用于如本文中所述的所有化合物和这些化合物中的每一者的子类和种类。

实例1.化合物的一般反应顺序

经氘标记的醛捕获剂如2013年7月23日公布的美国专利申请公开US 2013/0190500中所述，任选地在流程1所示的位点使用经氘标记的中间体制备。示例性方法在下文进一步描述。

流程1

实例2：A-1的合成

1-(3-乙氧基-2,3-二氧代丙基)吡啶-1-鎓溴化物。将乙醇(220mL)和吡啶(31g，392mmol)装入2L圆底烧瓶中，且所得溶液在氮气下按中度搅拌速率搅拌。将溴代丙酮酸乙酯(76.6g，354mmol)按缓慢、稳定的物料流添加到此溶液中。允许反应混合物在65±5℃搅拌2小时。

实例3：A-2a的合成

1-(6-氯-2-(乙氧基羰基)喹啉-3-基)吡啶-1-鎓溴化物。实例2中完成2小时搅拌时间后，将反应混合物缓慢冷却到18-22℃。将烧瓶抽真空-吹扫三次，此时使用长塑料漏斗将2-氨基-5-氯-苯甲醛(ACB)(50.0g，321mmol)作为固体直接添加到反应烧瓶中。添加吡啶(64.0g，809mmol)，随后添加EtOH冲洗液(10mL)且在氮气下，在80±3℃加热反应混合物约16小时(整夜)，此时HPLC分析指示反应有效完成。

实例4：A-2b的合成

1-(6-氯-2-(乙氧基羰基)喹啉-3-基-4-d)吡啶-1-鎓。用2-氨基-5-氯-苯甲醛-d取代2-氨基-5-氯-苯甲醛(ACB)、以类似于A-2a的方式(参见实例3)制备化合物A-2b。

实例5：A-3a的合成

3-氨基-6-氯喹啉-2-甲酸乙酯。将得自实例3的反应混合物冷却到约70℃且使用加料漏斗将吗啉(76.0g，873mmol)添加到2L反应烧瓶中。反应混合物在80±2℃加热约2.5小时，此时根据HPLC分析，反应视为完成(A-3a的面积％停止增加)。将反应混合物冷却到10-15℃以便进行淬灭、处理和分离。

使用加料漏斗，历经30-60分钟将水(600g)装入2L反应烧瓶中，通过调整添加速率和使用冷却浴保持温度低于15℃。反应混合物在10-15℃搅拌另外45分钟，然后使用布氏漏斗(Buchner funnel)过滤分离出粗A-3a。滤饼用水(100mL×4)洗涤，每次允许水渗透滤饼，随后施加真空。使滤饼风干，得到几乎干燥的褐色固体粗A-3a。将滤饼返回到2L反应烧瓶中且添加庚烷(350mL)和EtOH(170mL)，且将混合物加热到70±3℃维持30-60分钟。将浆液冷却到0-5℃且在真空下过滤分离。A-3a在真空干燥烘箱中、在真空下和35±3℃干燥整夜(16-18小时)，得到墨绿色固体A-3a。

实例6：A-3b的合成

3-氨基-6-氯喹啉-2-甲酸乙酯-4-d。用A2-b的反应混合物取代A2-a的反应混合物、以类似于化合物A3-a的方式(参见实例5)来制备化合物A3-b。

实例7：NS2的合成

2-(3-氨基-6-氯喹啉-2-基)丙-2-醇。将甲基氯化镁(200mL于THF中的3.0M溶液，600mmol)装入2L圆底烧瓶中。使用冰浴将溶液冷却到0-5℃。

将得自实例5的22.8克A-3a和THF(365mL)装入500mL烧瓶(磁力搅拌)中，搅拌到溶解，然后转移到2L反应烧瓶上的加料漏斗中。历经5.75小时将A-3a溶液逐滴添加到反应烧瓶中，在整个添加期间保持反应烧瓶温度在0-5℃之间。添加结束时，烧瓶内容物在0-5℃搅拌另外15分钟，然后移去冷却浴且将反应物在环境温度下搅拌整夜。

烧瓶在冰浴中冷却且小心地通过向反应混合物中逐滴添加EtOH(39.5g，857mmol)来淬灭反应混合物，在添加过程期间保持反应混合物温度低于15℃。然后小心地添加NH₄Cl水溶液(84.7g NH₄Cl于415mL水中)且在适度搅拌下搅拌混合物约30分钟，然后转移到分液漏斗中以允许各层分离。固体存在于水相中，因此添加HOAc(12.5g)且轻轻地涡旋内容物，获得几乎均匀的下部水相。将下部水层转移回到2L反应烧瓶中且在适度搅拌下与2-甲基THF(50mL)一起搅拌约15分钟。使用旋转式蒸发器在≤40℃和真空(需要时)下将最初的上部有机层的体积减小到约40mL。分离分液漏斗中的各相且将上部2-MeTHF相与产物残余物合并，转移到500mL烧瓶中，且真空蒸馏到25mL的大致体积。向此残余物中添加2-MeTHF(50mL)且蒸馏到50mL的大致体积。粗化合物NS2溶液用2-MeTHF(125mL)稀释，冷却到5-10℃，且缓慢添加2M H₂SO₄(aq)(250mL)且搅拌混合物30分钟，同时允许温度恢复到环境温度。装入庚烷(40mL)且反应混合物搅拌另外15分钟，然后转移到分液漏斗中且允许各层分离。下部水性产物层用额外的庚烷(35mL)萃取，然后将下部水相转移到装备有机械搅拌器的1L反应烧瓶中，且将混合物冷却到5-10℃。丢弃合并的有机层。制备25％NaOH溶液(水溶液)(NaOH 47g，水200mL)且缓慢添加到1L反应烧瓶中，使pH达到6.5-8.5的范围。

添加EtOAc(250mL)且搅拌混合物整夜。将混合物转移到分液漏斗中且丢弃下部相。上部有机层用盐水(25mL)洗涤，然后使上部有机产物层在旋转式蒸发器上使体积减小，获得呈深色油状的粗化合物NS2，其在几分钟内凝固。将粗化合物NS2溶解于EtOAc(20mL)中且通过硅胶塞(23g)用3/1庚烷/EtOAc洗脱直至所有化合物NS2洗脱(需要约420mL)来过滤以除去大部分深色化合物NS2。真空除去溶剂，得到14.7g呈褐色固体状的化合物NS2。将化合物NS2吸收于EtOAc(25mL)中且通过硅胶塞(72g)、使用7/1庚烷/EtOAc到3/1庚烷/EtOAc(总共1400mL)的流动相梯度洗脱。将含有化合物NS2的溶剂洗脱份汽提。化合物NS2用EtOAc(120mL)稀释且在具有Darco G-60脱色碳(4.0g)的烧瓶中搅拌约1小时。使用烧结漏斗使混合物通过硅藻土过滤，用EtOAc(3×15mL)冲洗滤饼。合并的滤液在旋转式蒸发器上汽提且将化合物NS2溶解于76℃的庚烷(160mL)/EtOAc(16mL)中。使均相溶液缓慢冷却到0-5℃，保持2小时，然后通过过滤来分离出化合物NS2。在真空烘箱中、在最佳真空度下、在35℃干燥5小时之后，获得呈白色固体状的化合物NS2。HPLC纯度：100％(AUC)；HPLC(使用标准条件)：A-2：7.2分钟；A-3：11.6分钟。

实例8：I-1的合成

2-(6-氯喹啉-2-基)丙-1,1,1,3,3,3-d₆-2-醇。用甲基-d₃-碘化镁(99原子％D)取代甲基氯化镁，以类似于化合物NS2的方式(参见实例7)制备化合物I-1。A3-a与5.3mol当量1.0M甲基-d₃-碘化镁(99原子％D)在乙醚/THF中反应，得到20％产率的I-1。MS(ESI):m/z242.9(M+1)；¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ:7.80(d,J＝6Hz,1H),7.51(d,J＝2Hz,1H),7.33(dd,J＝2及2Hz,1H),7.07(s,1H),4.68(br s,2H),3.83(br s,1H)；¹³C NMR(CDCl₃,75MHz)δ:154.3,139.5,139.1,132.4,130.6,130.0,126.3,123.7,116.4,76.8,74.9。

实例9：I-2的合成

2-(6-氯喹啉-2-基-4-d)丙-2-醇。用A3-b取代A3-a、以类似于化合物NS2的方式(参见实例7)制备化合物I-2。

ACB的制备

N₂气氛已经建立且使微弱的N₂气流流经容器之后，将干燥的还原硫化铂(5wt％/碳)(9.04g，3.0wt％，相对于硝基底物)添加到装备有大磁力搅拌棒和热电偶的5L厚壁压力容器中。添加MeOH(1.50L)、5-氯-2-硝基苯甲醛(302.1g，1.63mol)、额外的MeOH(1.50L)和Na₂CO₃(2.42g，22.8mmol，0.014当量)。密封烧瓶且开始进行450rpm的搅拌。将溶液抽空且用N₂(35psi)再加压2次。将烧瓶抽成真空且用H₂再加压到35psi。溶液温度在20分钟内达到30℃。然后用水浴冷却溶液。将冰添加到水浴中以维持温度低于35℃。每2个小时通过抽真空和用N₂(5psi)再加压2次、随后敞开来监测反应。反应进展可以依据TLC追踪：5-氯-2-硝基苯甲醛(R_f＝0.60，CH₂Cl₂，UV)和中间体(R_f＝0.51，CH₂Cl₂，UV和R_f＝0.14，CH₂Cl₂，UV)消耗而得到ACB(R_f＝0.43，CH₂Cl₂，UV)。5小时时，反应已进行到98％完成(GC)，且视为完成。向3L中号烧结漏斗中添加硅藻土(约80g)。此硅藻土用MeOH(约200mL)沉降且在真空下抽吸干燥。浓缩的溶液通过导管转移到漏斗中，同时使用轻微的真空拉吸溶液通过硅藻土塞。此硅藻土塞用MeOH(150mL，4次)冲洗。溶液转移到5L三颈圆底烧瓶中。在旋转蒸发器上，在30℃，在减压下除去溶剂(约2L)。施加N₂气层。将溶液转移到装备有机械式搅拌棒和加料漏斗的5L四颈圆底烧瓶中。历经4小时将水(2.5L)逐滴添加到剧烈搅拌的溶液中。使用最小量的真空过滤浆液。所收集的固体用水(1.5L，2次)、iPA(160mL)洗涤，然后用己烷(450mL，2次)洗涤。所收集的固体(淡黄色，粒状固体)转移到150×75再结晶盘中。固体然后在真空烘箱中、在减压(26-28英寸Hg)下、在40℃干燥整夜。ACB(>99A％，依据HPLC)在N₂气氛下、在5℃储存。

实例10：试管内分析

LDH细胞毒性分析

将原代大鼠皮层培养物在培育箱中放置24或48小时并且用各种浓度的所公开化合物处理。然后移出20μL培养基以便进行如贝格迈尔(Bergmeyer)等人，酶分析方法(Methods of Enzymatic Analysis)，第3版(1983)中所述的LDH分析。

测定循环细胞因子的量的ELISA分析

雄性C57BI/6小鼠在其暴露于LPS(20mg/kg)之前给与所公开的化合物30分钟。在LPS暴露之后两小时，收集小鼠血液并且进行ELISA以测定循环细胞因子的量。用所公开的化合物处理使得促炎性细胞因子(如IL-5和IL-1β、IL-17和TNF)减少。另外，用所公开的化合物处理引起抗炎性细胞因子(如IL-10)升高。另外，用所公开的化合物处理还使多种其它趋化因子减少，如嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)、IL-12、IP-10、LIF、MCP-1、MIG、MIP和RANTES。

评估接触性皮炎治疗功效的分析

为了测定所公开的化合物治疗接触性皮炎的功效，将肉豆蔻酸佛波醇乙酸酯(phorbol myristate acetate，“PMA”)体表施加(2.5μg/20μL)到小鼠右耳廓的前部与后部(N＝10/组)。作为对照，左耳廓的前部与后部均接受20μL乙醇(PMA赋形剂)。在PMA施加之后六小时，测定右耳廓与左耳廓厚度。两只耳朵的相同区域至少测定两次，注意不包括毛发或折叠的耳廓。

评估过敏性皮炎治疗功效的分析

为了测量所公开的化合物治疗过敏性皮炎的功效，向小鼠已剃毛的腹部施加噁唑酮(“OXL”)(1.5％，100μL于丙酮中)。七天后，测定经OXL处理的小鼠的耳廓厚度。然后向小鼠腹膜内投与所公开的化合物(100mg/kg)或媒剂(即，卡布迪索(Captisol))，随后在30分钟后向右耳廓的前部与后部均体表施加OXL(1％，20μL)。作为对照，左耳廓的前部与后部均接受20μL丙酮(OXL赋形剂)。24小时后再次测量两只耳朵的耳廓厚度。N＝10/组。

测量醛捕获率的分析

向单独的反应瓶中添加各种所公开的化合物(0.064mmol)、MDA盐(22.7％MDA，0.064mmol)和三油酸甘油酯(600mg)。向混合物中添加含20wt％卡布迪索的PBS水溶液(约2.5ml)，随后添加亚油酸(600mg)。在环境温度下剧烈搅拌反应混合物并且通过LC/MS监测。所公开的化合物与MDA快速反应而形成MDA加成物。

希夫碱确认

使用UV/VIS光谱法监测RAL与本发明化合物的伯胺发生的希夫碱缩合反应。对所公开的化合物与RAL的希夫碱缩合产物进行试管内分析。

在溶液相分析中，测量游离化合物与RAL希夫碱缩合产物(RAL-SBC)的λ_max值，以及RAL-SBC的τ值。如本文所用，“RAL-SBC”是指RAL与RAL化合物的希夫碱缩合产物。使用化合物与RAL的100:1混合物，使用所属领域中已知的方案，进行溶液相分析。测试若干种溶剂系统，包括水溶液、乙醇、辛醇和三氯甲烷:甲醇(各种各样，例如2:1)。测量溶液动力学且发现其高度依赖于溶剂条件。

还使用化合物与RAL的1:1混合物，对希夫碱缩合进行固相分析。使用所属领域中已知的方案进行固相分析。在氮气下干燥混合物且缩合反应进行至完成。

使用所属领域中已知的方案进行脂质相分析且测量λ_max、τ(RAL-SBC相对于APE/A2PE)和竞争性抑制。脂质体条件更接近原位条件。

对暗适应的ERG分析

暗适应是曝露于光之后的视觉敏感性的恢复。暗适应具有多个部分，包括快速(神经元)过程和缓慢(光化学)过程。视色素的再生涉及缓慢的光化学过程。针对若干原因来测量暗适应速率。夜盲归因于暗适应丧失(视觉光敏性损失)。可以通过测量药物对暗适应的视觉光敏性的影响来找到针对夜间视力的安全剂量。

使用视网膜电图(ERG)测量正常条件相对于药物条件下的暗适应。ERG是视网膜神经元在其对实验上所定义的光刺激物作出反应期间所发出的电场电位的量度。更具体地说，ERG测量了闪光(例如50ms)之后的角膜处的视网膜电场电位。电场电位是102到103微伏，其起源于视网膜细胞。

ERG是一种无创测量，其可以针对活的个体(人类或动物)或已从活动物中手术移出的存于溶液中的半切眼进行。ERG需要减慢暗适应的全身麻醉且必须按照实验设计计算。

在暗适应实验的典型ERG分析中，每只大鼠暗适应数小时以达到一致的光敏状态。然后对大鼠进行“光漂白”，即，短暂曝露于足以使视网膜中的游离11-顺-RAL瞬时耗乏(例如在300lux下，2分钟)的强光。然后立即使大鼠返回到黑暗中以开始暗适应，即，光敏性因视色素再生而恢复。使用ERG测量大鼠多快适应黑暗和恢复光敏性。具体地说，针对光敏性定义标准反应变量。

事先通过动力学分析所测定的漂白后暗恢复的特定持续时间(例如30分钟)之后，进行ERG测量。使用曲线拟合法计算敏感性变量值且展示同一个大鼠在麻醉情况下的恢复，包括暗适应动力学Y₅₀和σ。光敏性越弱，观察到的适应就越慢，其中Y₅₀达到-4.0且τ＝22.6分钟。光敏性越强，观察到的适应越快，其中Y₅₀达到-5.5且τ＝9.2分钟。

依循如上文所述的相同范例在ERG剂量范围方案中的剂量范围，腹膜內化合物使得暗适应大鼠的光敏性按照剂量依赖性方式降低。3小时之后，对视力的影响减少。

对RAL反应的NMR分析

使用NMR光谱法监测RAL与本发明化合物的伯胺发生的希夫碱缩合反应和环形成。

A2E形成的抑制

此实验是为了建立以下概念验证而设计：捕获RAL的化合物的慢性腹膜內注射使A2E在野生型史泊格多利大鼠(Sprague Dawley rats)中的积聚速率降低。这些实验是对捕获RAL的化合物与对照化合物的治疗功效和缺乏治疗进行比较。

材料和方法：

使用野生型史泊格多利大鼠进行研究。大鼠处理组包括例如每种处理条件8只性别混合的大鼠。每只动物利用以下条件之一进行处理：

●对照组：(1)抑制视觉周期蛋白质的类视黄醇结合位点的13-顺式视黄酸作为方案对照组，其中此类处理使所释放且从而可用于形成A2E的游离反式-RAL的量减少，但具有夜盲的不良副作用，和(2)临床上已知可调节人视网膜功能且在实验上已知可与游离RAL在试管内和动物模型活体内形成希夫碱加成物的市售化合物。

●媒剂

●化合物

●未处理

在包括1、5、15和50mg/kg的剂量范围内测试所公开的化合物。处理每天通过腹膜內注射投与8周。

化学：

实验使用多种化学操作。举例来说，这些实验使用配有分析说明书以表征杂质的市售化合物。还合成了化合物。制备数量对于所需剂量来说足够的化合物。化合物的调配物适用于涉及腹膜内(i.p.)注射的初步动物安全性研究。确定反式-RAL与本发明化合物形成的希夫碱反应产物的以下三种属性：

●就反应速率而言的稳定性

●吸收特性，具体地说，紫外-可见光吸收最大值和消光系数(参见例如拉普(Rapp)和巴辛格(Basinger)，视力研究(Vision Res.)22:1097，1982中的图5)或反应动力学的NMR谱分析

●log P和log D溶解度值，例如所计算的数值

生物学和生物化学：

本文所述的实验使用多种生物学和生物化学操作。确立本发明化合物按照滴眼剂调配物进行日常处理的“无作用水平”(NOEL)剂量，例如对兔使用眼部刺激方案和对啮齿动物使用ERG测量作为对光刺激的视觉反应的暗适应。处理之后且在眼摘除之前，对动物(例如兔)进行以下无创分析：

●RPE和感光细胞变性，如根据眼底摄影所显而易见(卡兰(Karan)等人，2005，美国国家科学院院刊102:4164)

●细胞外脉络膜小疣和细胞内脂褐质，如根据眼底荧光摄影所测量(卡兰等人，2005)

光反应用ERG表征(翁(Weng)等人，细胞(Cell)98:13，1999)。根据治疗方案的结论，使用如以下文献中所述的那些分析方法测量所有经处理动物的视网膜RPE细胞萃取物的细胞内A2E浓度：卡兰等人，2005；那杜(Radu)等人，2003；和帕里什(Parish)等人，美国国家科学院院刊95:14609，1998。举例来说，对于经处理动物的样品，分析一只眼，而另一只眼加以保存以供组织学分析(如下文所述)。对于其余动物而言，两只眼均分别分析其A2E形成。

对于搁置一旁供组织学分析用的处理后眼(如上文所述)，利用光学显微术组织学技术(卡兰等人，2005，例外之处为本文所述的实验中不使用电子显微术)评估视网膜形态和RPE。

评估处理方案的安全性，例如使用以下的组合来评估：

●在整个处理期间，每天记录动物行为和摄食习惯的观察结果

●处理期结束时的视觉表现，如依据ERG所测量

●处理结束时的眼部组织学

实例11：氘化NS2(NS2-D6；化合物I-1)的跨种类代谢物分布测试目的：

小分子投与动物后，可以经历多种反应而产生多种代谢物。所产生的确切代谢物取决于许多因素，如动物、分子结构，和分子的组织分布。小分子代谢的目的可以是增强水溶性以有助于分子随尿液或粪便排出，或可以仅仅是偶发酶催化反应的结果。示例性代谢物包括氧化和葡萄糖醛酸苷化产物。通常无法预测所产生的代谢物的分布和量。此研究的一个目的是对测试制品NS2在低温保存的原代肝细胞中的跨种类代谢物分布进行分析。如下文所述，产生多种NS2代谢物且代谢物分布在不同种类间显著不同。通常期望减少小分子药物的代谢物的数目和量，例如以延长药物在体内的半衰期和/或防止转化成毒性或非活性代谢物。掌握了这种知识，将NS2氘化作为减少代谢物数目和量的可能途径加以探究。分子氘化(即，一或多个氢原子被氘置换)通常对代谢物产生速率具有显著的影响；然而，氘化对既定分子的影响在大多数情况下几乎无法预测。因此，对氘化-NS2在人类肝细胞中的代谢物分布进行分析。

研究条件：

此研究是在非GLP条件下进行。所有工作均依照适当的地方卫生法规和伦理批准来进行。

实验设计：

样品分析

通过LC-MS/MS，使用与Agilent 1290 HPLC Infinity系列、CTC PAL冷却式自动取样器耦接的SCIEX QTrap 5500质谱仪(所有均通过Analyst软件控制)来分析样品。在C18逆相HPLC柱(Acquity UPLC HSS T3，1.8，2.1×50mm)上使用乙腈-水梯度系统分离之后，通过使用ESI电离、处于Q1扫描模式的质谱(MS)来分析峰。LC条件展示于下表3中。

表3：LC梯度

溶液A：含有0.1％甲酸的H₂O；溶液B：含有0.1％甲酸的乙腈

表4展示了代谢物分布的实验参数。

表4：肝细胞中的代谢物分布：实验条件

实验程序

测试制品与低温保存的原代肝细胞在37℃双重复培育。使细胞解冻，对活细胞计数，且根据供应商说明书平衡。在轻微搅拌下、在37℃平衡30分钟之后，将测试化合物添加到细胞中，得到所期望的3μM最终浓度。细胞悬浮液如上文所述在37℃培育。在指定的时间，移出样品且与等体积的冰冷终止溶液(甲醇)混合。

同时，使空白肝细胞样品在测试剂不存在的情况下培育120分钟且作为对照用于展示来源于肝细胞的峰的存在。所终止的反应物在冰上培育至少十分钟，且添加额外体积的水。使样品离心以除去所沉淀的蛋白质，且利用LC-MS/MS分析上清液。

正电离和负电离模式下的全扫描质谱(100-800m/z)跨越整个梯度运作，以寻找潜在代谢物的存在(新的质量和已知的阶段I和II代谢物，如：氧化、硫酸化、二氧化、脱氢、硫酸化+氧化、葡萄糖醛酸苷化、氧化+葡萄糖醛酸苷化，和谷胱甘肽结合)。质谱方法展示于表5中。

表5：质谱方法开发

结果

惊人地发现，NS2氘化大大减少了人类肝细胞的代谢物数目和量。如下表6A和6B所概述，大鼠、犬、猴或人类肝细胞在仅120分钟期间便使NS2的蛋白(非氘富集)形式发生显著的代谢。举例来说，犬肝细胞使NS2代谢成两种不同的单氧化产物(M1和M2)和两种不同的谷胱甘肽(GSH)结合物(M5和M6)，如根据LC滞留时间和质谱数据所评估(参见图3)。食蟹猕猴肝细胞使NS2代谢成单氧化代谢物(M1)、四种氧化+葡萄糖醛酸苷化代谢物(M3、M4、M7和M9)，和葡萄糖醛酸苷化代谢物(M8)(参见图2)。人类肝细胞使NS2代谢成单氧化代谢物(M1)、两种氧化+葡萄糖醛酸苷化代谢物(M7和M9)，和葡萄糖醛酸苷化代谢物(M8)(参见图1)。

表6A：NS2在肝细胞中的代谢物分布：数据汇总

m/z：分析物的质荷比

NA＝不适用

所观察的代谢物形成的相对程度用“+”表示，++++是最丰裕的代谢物(假设亲本的电离电位类似于代谢物的电离电位)

表6B：所观察到的代谢物的峰面积

峰面积

NS2、每种代谢物M1-M9、氘化NS2和氘化NS2在人类肝细胞中所产生的代谢物的质谱分析展示于图6-17中。

与非氘富集的NS2相比，氘富集的NS2(即，化合物I-1，或表7中的NS2-D6)暴露于人类肝细胞120分钟产生了单氧化代谢物M1作为唯一可检测到的代谢物(参见表7和图5和17)。M1产生量相对于当非氘化NS2暴露于人类肝细胞时所产生的量也大大减少(比较图1和5)。代谢物产生量的此显著减少预先可能无法预测。

表7：氘化NS2在人类肝细胞中的代谢物分布：数据汇总

m/z：分析物的质荷比

NA＝不适用

所观察的代谢物形成的相对程度用“+”表示，++++是最丰裕的代谢物(假设亲本的电离电位类似于代谢物)

注释：基于所观察到的代谢物数目，氘化NS2在2小时期间展现的代谢比非氘化NS2分子少

表7中所示的结果惊人之处还在于，代谢物的数目和量的减少不能简单地归因于氘并入，氘并入使得酶催化速率决定步骤更困难。相反，259的m/z观察值与单氧化产物中保留所有六个氘原子一致。不希望受理论束缚，这可能表明氘富集影响分子远端位置的代谢，并且或许不能简单地通过例如初始动力学同型效应来影响。

参考文献：1)麦克基提D.F.(McGinnity,D.F.)等人(2004)，“新鲜和低温保存的肝细胞作为用于预测代谢清除率的试管内药物代谢工具的评估(Evaluation of fresh andcryopreserved hepatocytes as in vitro drug metabolism tools for theprediction of metabolic clearance.)”，药物代谢与处置(Drug Metab.Dispos.)32(11):1247-1253。2)萨希J.(Sahi,J.)等人(2010)，“肝细胞作为工具在药物发现中的药物代谢、转运和安全评估(Hepatocytes as a tool in drug metabolism,transport andsafety evaluations in drug discovery.)”，现行药物开发技术(Current DrugDiscov.Technol.)7(3):188-198。

实例12：NS2(即，非氘化NS2)针对所解离海马体培养物过氧化氢中毒的保护性活性的剂量反应评估

NS2防止过氧化氢毒性的剂量反应评估的实验计划

A.测试剂：NS2 FW：236

1.来源1：CoreRx批号093-FOR CNS2；使用量：6.4mg；微研磨样品(平均粒度是约16微米)；来源于J-Star批号BR-NS2-11-01

2.来源2：J-Star批号BR-NS2-1；使用量：6mg；非研磨样品

B.调配物和储备溶液制备

比较两种类型的调配物：二甲亚砜(DMSO)和

1.调配物：将以5mg/ml(即，0.5％)溶解于达尔伯克氏磷酸盐缓冲生理盐水(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline，DPBS)中。通过将1mg(4.24μmol)溶解于0.42ml溶液中以得到10μmol/ml或10mM(即，2.38mg/mL)初始储备液来制备10mM NS2储备溶液(储备液A)。涡旋混合之后，储备溶液呈透明状。

2.DMSO调配物：DMSO用作的比较例。将5mg(21.12μmol)NS2溶解于0.21mL DMSO中作为100mM储备溶液(即，23.8mg/mL)。100mM NS2 DMSO调配物呈透明状。使用DPBS进行对数稀释。用DPBS按1:10稀释到10mM后，溶液变得混浊，但在广泛的涡旋混合之后变得透明。一般来说，为了避免DMSO的药理学作用，我们使DMSO在原代神经元培养物中的基准浓度目标小于0.1％。应注意，1mM测试浓度的NS2使用1％DMSO。在分析中，在5小时测试中未观察到明显毒性(参见下述实验9的结果)。

C.关于制备储备溶液的细节

NS2/

1.储备液A是含有10mM NS2的0.5％在每个孔中，添加10μl到100μl中，以使最终浓度为1mM NS2/0.05％

2.通过将50μl储备液A添加到450μl DPBS中以产生1mM NS2溶液来制备储备液B。添加10μl到100μl DPBS中，以使最终浓度为100μM NS2/0.005％

3.通过将50μl储备液B添加到450μl DPBS中以产生100μM NS2溶液来制备储备液C。添加10μl到100μl DPBS中，以使最终浓度为10μM NS2/0.0005％

4.通过将50μl储备液C添加到450μl DPBS中以产生10μM NS2溶液来制备储备液D。添加10μl到100μl DPBS中，以使最终浓度为1μM NS2/0.00005％

5.通过将50μl储备液D添加到450μl DPBS中以产生1μM NS2溶液来制备储备液E。添加10μl到100μl DPBS中，以使最终浓度为0.1μM NS2/0.000005％

NS2/DMSO：

1.储备液A是100mM NS2/100％DMSO。

2.通过将50μl储备液A添加到450μl DPBS中以使最终浓度为10mM NS2来制备储备液B。添加10μl到100μl DPBS中，以产生1mM NS2/1％DMSO的最终浓度。

3.通过将50μl储备液B添加到450μl DPBS中以使最终浓度为1mM NS2来制备储备液C。添加10μl到100μl DPBS中，以产生100μM NS2/0.1％DMSO的最终浓度。

4.通过将50μl储备液C添加到450μl DPBS中以使最终浓度为100μM NS2来制备储备液D。添加10μl到100μl DPBS中，以产生10μM NS2/0.01％DMSO的最终浓度。

5.通过将50μl储备液D添加到450μl DPBS中以使最终浓度为10μM NS2来制备储备液E。添加10μl到100μl DPBS中，以产生1μM NS2/0.001％DMSO的最终浓度。

6.通过将50μl储备液E添加到450μl DPBS中以使最终浓度为1μM NS2来制备储备液F。添加10μl到100μl DPBS中，以使最终浓度为0.1μM NS2/0.0001％DMSO。

在所有情况下，添加10μl适当稀释液到100μl中以使孔中的总体积为110μl。

D.培养条件经设计以检测NS2介导的针对与过氧化氢相关的氧化应激的神经保护作用

1.如先前所述制备大鼠海马体培养物(布莱曼DE(Brenneman DE)，史密斯GR(Smith GR)，张Y(Zhang Y)，杜Y(Du Y)，康达维提SK(Kondaveeti SK)，杂迪拉MJ(ZdillaMJ)，雷兹AB(Reitz AB)(2012)，分子神经科学杂志(J.Molecular Neuroscience)，47:368-379)。在这些条件下，培养物是至少90％神经元。最丰裕的非神经元细胞是星形胶质细胞。

2.所有培养物均在96孔形式中按每孔10K细胞的涂铺密度制备。E18海马体组织解离之后的第10天与第21天之间处理培养物。对于这些实验来说，第13天处理所有培养板。在所有实验中，用NS2或大麻二酚(CBD)处理之后的10分钟将过氧化氢添加到培养物中。对于每种处理条件来说，重复次数是五。

3.所有培养物涂铺于B27/神经基础培养基中。处理当天，所有培养物的培养基均完全更换成不含抗氧化剂的B27/神经基础培养基。

4.如此前所确定(布莱曼(Brenneman)等人，2012)，使用10μM过氧化氢产生毒性和氧化应激。如此前所述[贾勒特SG(Jarrett SG)，梁L-P(Liang,L-P)，海涅尔(Hellier,JL)，斯塔雷(Staley,KJ)和帕特尔M.(Patel,M.)(2008)，疾病神经生物学(Neurobiol.Dis)30(1):130-138]，已经使用持续性癫痫红藻氨酸模型在大鼠海马体中观察10μM过氧化氢。

5.所有研究中使用的阳性对照物是10μM大麻二酚(CBD)，一种已知的抗氧化剂[汉普逊(Hampson)等人(1998)，美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci)95:8268-8273]，其可预防原代神经元中的氧化应激[布莱曼DE(Brenneman,DE)，派特康纳D(Petkanas,D)和金尼W.A.(Kinney W.A.)(2014)，关于大麻素的年度研讨会(Annual Symposium on theCannabinoids)第129页]。

6.阴性对照孔、过氧化氢孔、阳性对照孔均不含有任何药物媒剂。

E.分析

此研究中所用的两种分析已经详细地描述[布莱曼DE，史密斯GR，张Y，杜Y，康达维提SK，杂迪拉MJ，雷兹AB，(2012)，分子神经科学杂志(J.Molecular Neuroscience)，47:368-379]。

1.CFDA神经元活力分析。在此分析中，CFDA染料被所有活细胞吸收且被酯酶裂解而释放荧光素。由于神经元不能除去此染料，因此获得神经元特异性，而染料可以随时间从非神经元细胞中流出。洗掉细胞外染料之后，用荧光计读取培养物；细胞内染料强度与活神经元群成比例。原始参考物：派特罗斯基RE(Petroski,RE)和杰勒HM(Geller HM)，(1994)，用5(6)-羧基荧光素二乙酸酯(CFDA)对星形胶质细胞单层上的胚胎神经元培养物进行选择性标记(Selective labeling of embryonic neurons cultures on astrocytemonolayers with 5(6)-carboxyfluorescein diacetate(CFDA))，神经科学方法杂志(J.Neurosci.Methods)52:23.32。每个实验的平均对照水平以长虚参考线显示。

2.使用碘化丙锭的细胞死亡分析与CFDA分析在相同的孔中同时进行。此染料从活细胞中排除且结合到死亡细胞的DNA。所述分析检测坏死和凋亡细胞死亡；其无法区分神经元细胞死亡和非神经元细胞死亡。参见萨拉芬TA(Sarafian TA)，库尤简S(KouyoumjianS)，塔西金D(Tashkin D)，罗斯MD(Roth MD)，(2002)，毒理学快报(Tox.Letters)133:171-179。平均对照水平以中等虚参考线显示。

3.所用试剂：

a.30wt％过氧化氢溶液；西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(216736-100ml，批号MKBV382V)

b.Aldeyra Therapeutics所提供的(批号17CX01-HQ-00088)

c.二甲亚砜；西格玛-奥德里奇公司(472301-100ml)，批号21096JK

d.碘化丙锭，西格玛-奥德里奇公司(P4864-10ml；1mg/ml水溶液)

e.CFDA[5(6)-羧基荧光素二乙酸酯]，西格玛-奥德里奇公司，产品编号：21879-100mg-F

f.10mg/ml存在于乙醇中的大麻二酚溶液；西格玛-奥德里奇公司，产品编号：90899-1ml

g.达尔伯克氏磷酸盐缓冲生理盐水，Gibco(14190-144)批号1165767

4.数据分析

a.数据采集：数据存储在高级神经动力学计算机上用于分析。在Cytofluor荧光计上进行数据采集且传输到Excel电子表格以便用Sigma Plot 11分析。

b.统计分析：所有数据均通过相对于对照组进行多重比较(霍姆-丝达克(Holm-Sidak))的变异数分析方法来进行统计学分析。获得P<0.05水平的统计显著性。在所有情况下，均与阴性对照(10μM过氧化氢处理)进行比较。

c.EC₅₀测定方法：

i.在EC₅₀效能分析中选择较宽的浓度范围来筛选NS2。使用0.1μM到1mM的基于对数的浓度系列，认识到为了评估EC₅₀，可能需要涉及半对数浓度的进一步分析。

ii.使用非线性回归分析来确定与数据最佳拟合的线条的方程式。(四参数逻辑斯蒂曲线(Logistic curve))

iii.基于下述对数方程式，计算针对神经保护的EC₅₀且利用SigmaPlot 11绘图，以确定产生半最大反应所需的浓度用于两种分析。使用垂直线展示轴交点，从而确定EC₅₀。

四参数逻辑斯蒂方程

由此得到典型的剂量反应曲线和可变的斜率参数。其有时缩写为4PL。四参数是：min(曲线底部)、max(曲线顶部)。EC₅₀＝产生50％最大有效反应的配体浓度。

5.结果汇总

表8展示了NS2(即，非氘化NS2)在大鼠海马体培养物中的保护研究概述。

表8：NS2在大鼠海马体培养物中的保护研究概述

*由于针对这些数据集所观察到的逻辑斯蒂曲线的陡峭性质，因此可能需要使用半对数浓度的进一步分析，以确定这些条件下的EC₅₀。所公布的数值应该视为估算值。

**测试剂浓度展示分析反应水平与无处理对照的分析反应水平无显著差异。

6.实验结果和原始数据的图形分析

a.实验1：对中的微研磨NS2(CoreRx)的剂量反应。与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响。

i.NS2来源：微研磨的CoreRx

ii.配制：初始储备液在0.5％中配制

iii.分析：CFDA

iv.毒素：10μM过氧化氢

v.处理持续时间：5小时

vi.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

vii.培养基质：聚-L-赖氨酸

viii.结论：在6.8μM的情况下观察到EC₅₀；相对于对照(CBD+HP和无处理对照)，在100μM NS2的情况下观察到完全的功效。

NS2在此分析中、在100μM具有针对过氧化氢毒性的完全神经保护作用。结果展示于表9和图18和19中。

表9：与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

b.实验2：对中的微研磨NS2(CoreRx)的剂量反应与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的影响。

i.NS2来源：CoreRx(微研磨)

ii.配制：初始储备液在0.5％中配制

iii.分析：碘化丙锭

iv.毒素：10μM过氧化氢

v.处理持续时间：5小时

vi.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

vii.培养基质：聚-L-赖氨酸

viii.结论：在1.3μM的情况下观察到EC₅₀；相对于对照(CBD+HP和无处理对照)，在10μM NS2的情况下观察到完全的功效。

根据此分析，NS2具有针对过氧化氢毒性的完全神经保护作用。这些数据表明针对细胞死亡的保护作用可能比针对神经元活力所观察到的保护作用稍微强些。结果展示于表10和图20和21中。

表10：NS2(CoreRx)在与10μM过氧化氢共处理5小时之后对海马体培养物中的细胞死亡的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

c.实验3：针对DMSO中的微研磨NS2(CoreRx)的剂量反应。与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响。

i.NS2来源：CoreRx(微研磨)

ii.配制：初始储备液在100％DMSO中配制

iii.分析：CFDA

iv.毒素：10μM过氧化氢

v.处理持续时间：5小时

vi.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

vii.培养基质：聚-L-赖氨酸

viii.结论：在9.8μM的情况下观察到EC₅₀；相对于对照(CBD+HP和无处理对照)，在100μM NS2的情况下观察到完全的功效。

使用DMSO作为调配物产生的EC₅₀非常类似于使用所观察到的EC₅₀。NS2在此分析中具有针对过氧化氢毒性的完全神经保护作用。结果展示于表11和图22和23中。

表11：NS2(CoreRx；在DMSO中)与10mM过氧化氢共处理5小时之后对神经元活力的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

d.实验4：针对DMSO中的微研磨NS2(CoreRx)的剂量反应与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的影响。

i.NS2来源：CoreRx(微研磨)

ii.配制：初始储备液在100％DMSO中配制

iii.分析：碘化丙锭

iv.毒素：10μM过氧化氢

v.处理持续时间：5小时

vi.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

vii.培养基质：聚-L-赖氨酸

根据此分析，NS2具有针对过氧化氢毒性的完全神经保护作用。这些数据表明针对细胞死亡的保护作用可能比针对神经元活力所观察到的保护作用稍微强些。结果展示于表12和图24和25中。

表12：NS2(DMSO中的CoreRx)在与10μM过氧化氢共处理之后对海马体培养物中的细胞死亡的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

e.实验5：对中的非研磨NS2(J-Star)的剂量反应。与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响。

i.NS2来源：J-Star(非研磨)

ii.配制：初始储备液在0.5％中配制

iii.分析：CFDA

iv.毒素：10μM过氧化氢

v.处理持续时间：5小时

vi.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

vii.培养基质：聚-L-赖氨酸

viii.结论：在9.1μM的情况下观察到EC₅₀；相对于对照(CBD+HP和无处理对照)，在100μM NS2的情况下观察到完全的功效。

根据此分析，NS2具有针对过氧化氢毒性的完全神经保护作用。结果展示于表13和图26和27中。

表13：中的非研磨NS2(J-Star)的剂量反应数据，其表明在与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

f.实验6：对中的非研磨NS2(J-Star)的剂量反应。与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的影响。

i.NS2来源：J-Star(非研磨)

ii.配制：初始储备液在0.5％中配制

iii.分析：碘化丙锭

iv.毒素：10μM过氧化氢

v.处理持续时间：5小时

vi.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

vii.培养基质：聚-L-赖氨酸

viii.结论：在2.8μM的情况下观察到EC₅₀；相对于对照(CBD+HP和无处理对照)，在10μM NS2的情况下观察到完全的功效。

根据此分析，NS2具有针对过氧化氢毒性的完全神经保护作用。这些数据表明针对细胞死亡的保护作用可能比针对神经元活力所观察到的保护作用稍微强些。结果展示于表14和图28和29中。

表14：中的非研磨NS2(J-Star)的剂量反应数据，其展示在与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

g.实验7：对DMSO中的非研磨NS2(J-Star)的剂量反应与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响。

i.NS2来源：J-Star(非研磨)

ii.配制：初始储备液在100％DMSO中配制

iii.分析：CFDA

iv.毒素：10μM过氧化氢

v.处理持续时间：5小时

vi.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

vii.培养基质：聚-L-赖氨酸

viii.结论：在2.6μM的情况下观察到EC₅₀；相对于对照(CBD+HP和无处理对照)，在100μM NS2的情况下观察到完全的功效。

根据此分析，NS2具有针对过氧化氢毒性的完全神经保护作用。结果展示于表15和图30和31中。

表15：DMSO中的非研磨NS2(J-Star)的剂量反应数据，其表明在与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

h.实验8：对DMSO中的非研磨NS2(J-Star)的剂量反应与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的影响。

i.NS2来源：J-Star(非研磨)

ii.配制：初始储备液在100％DMSO中配制

iii.分析：碘化丙锭

iv.毒素：10μM过氧化氢

v.处理持续时间：5小时

vi.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

vii.培养基质：聚-L-赖氨酸

viii.结论：在1.1μM的情况下观察到EC₅₀；相对于对照(CBD+HP和无处理对照)，在10μM NS2的情况下观察到完全的功效。

根据此分析，NS2具有针对过氧化氢毒性的完全神经保护作用。这些数据表明针对细胞死亡的保护作用可能比针对神经元活力所观察到的保护作用稍微强些。结果展示于表16和图32和33中。

表16：DMSO中的非研磨NS2(J-Star)的剂量反应数据，其展示在与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

i.实验9：对调配物媒剂的剂量反应。与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响。

i.测试剂：[Cap；(5mg/ml，即，0.5％)]和1％DMSO(缩写为DM；1％是最高使用浓度)。调配物用量与NS2研究中所用的量匹配。

ii.分析：CFDA

iii.毒素：10μM过氧化氢

iv.处理持续时间：5小时

v.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

vi.培养基质：聚-L-赖氨酸

vii.结论：或DMSO当在与NS2相同的条件下测试时对神经元活力未产生可检测到的影响。结果展示于表17和18以及图34中。

表17：调配物媒剂的剂量反应数据，其展示在与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

表18：调配物媒剂的剂量反应数据，其展示在与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

j.实验10：对调配物媒剂的剂量反应。与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的影响。

i.测试剂：[CP(5mg/ml，即，0.5％)]和DMSO(缩写为DM；1％是最高使用浓度)

ii.分析：碘化丙锭

iii.毒素：10μM过氧化氢

iv.处理持续时间：5小时

v.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

vi.培养基质：聚-L-赖氨酸

vii.结论：或DMSO当在与NS2相同的条件下测试时对细胞死亡未产生可检测到的影响。结果展示于表19和20以及图35中。

表19：调配物媒剂的剂量反应数据，其展示在与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的影响

Cap＝媒剂.

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

表20：调配物媒剂的剂量反应数据，其展示在与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的影响

DM＝DMSO媒剂。

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

7.观察概述和结论

A.NS2在CFDA分析中展现针对过氧化氢毒性的神经保护活性，所述CFDA分析使用两种调配物(DMSO和)且使用两种化合物批料(分别为经研磨和非经研磨的CoreRx和J-Star)。

B.NS2在CFDA分析中的神经保护作用等于对照(无HP处理)和阳性对照(CBD)，表明存在完全保护。

C.在CFDA神经元活力分析中，对于100μM NS2的NS2调配物和NS2批料均观察到相对于对照的完全保护作用，而调配物和批料的无作用浓度是1μM。

D.非线性曲线逻辑斯蒂拟合分析显示CFDA神经元活力分析中的NS2 EC₅₀在3到10μM范围内。最佳的可利用EC₅₀估算值得自在中所配制的CoreRx NS2(研磨)，其展示7±4μM的EC₅₀。CFDA分析中得自不同NS2调配物的所有EC₅₀处于此范围内。我们的结论是，两种化合物批料和两种调配物的特征为它们实质性相似。

E.NS2在PI分析中展现针对过氧化氢毒性的保护活性。对于两种调配物和两种化合物批料来说，均观察到此活性。

F.NS2在PI分析中的保护作用等于对照(无HP处理)和阳性对照(CBD)的保护作用，表明存在完全保护。

G.在PI分析中，对于10μM NS2的NS2调配物和NS2批料均观察到相对于无处理对照的完全保护作用，而调配物和批料的无效应浓度是1μM。一致地发现，细胞死亡分析中的NS2反应展现的完全保护效能大于在CFDA分析中。应认识到，细胞死亡分析对神经元无特异性且可以涉及存在于此模型CNS系统中的非神经元细胞。

H.非线性逻辑斯蒂曲线拟合表明PI分析中的EC₅₀在1.1到2.8μM范围内。然而，在不测量半对数浓度反应以帮助定义曲线的拐点的情况下，此分析中的逻辑斯蒂曲线的陡峭性质使得估算变得困难。最佳的可利用估算值是所有PI数据的平均值，其是2±1μM。我们的结论是，两种化合物批料和两种调配物的特征为它们实质性相似。由于PI分析中的窄反应范围，因此可能需要进一步的分析来改进EC₅₀估算值。这些数据表明NS2在防止细胞死亡方面的效能可能比提高针对过氧化氢毒性的神经元活力更强。

I.10μM过氧化氢产生的毒性信号是过去已经测试的多种氧化性应激源(乙醇、重金属、乙酸铵和谷氨酸盐)所特有的，其中自对照的降低范围为30到50％。

J.阳性对照(10μM大麻二酚)在每个测试板上均具有活性，表明所述模型系统按照典型的方式响应。

实例13：三种氘化化合物的剂量反应，评估在所解离海马体培养物中针对过氧化氢毒性的保护活性

A.防止过氧化氢毒性的剂量反应评估实验计划。

1.测试剂：

a.ALD-6-批料1(传统ID：NS2-D6或化合物I-1)；用量：5.0mg；MW＝242.734

b.ALD-5-批料1(传统ID：D3)；用量：6.1mg；MW＝203.24；

结构：

c.ALD-2-批料1(传统ID：D2)；用量：5.6mg；MW＝203.24；

结构：

2.调配物和储备溶液制备

a.对于所有样品均使用100％二甲亚砜(DMSO)。

b.观察：

i.ALD-6：将(5mg，20.6μmol)ALD-6溶解于0.206ml DMSO中作为100mM储备溶液。100mM ALD-6/DMSO溶液是透明的。使用DPBS进行对数稀释。用DPBS按1:10稀释到10mM后，溶液变得混浊，但在涡旋混合之后变得透明。一般来说，为了避免DMSO的药理学作用，使DMSO在原代神经元培养物中的基准浓度目标小于0.1％。应注意，对于300μM测试浓度的所有样品均使用0.3％DMSO。5小时测试之后，分析中未观察到明显的毒性。

ii.ALD-5：通过将6.1mg(30μmol)溶解于0.3ml DMSO中来制备100mM ALD-5储备溶液。ALD-5/DMSO混合物是透明的黄色溶液。使用DPBS进行对数稀释。用DPBS按1:10稀释到10mM后，溶液仍为透明的黄色溶液。

iii.ALD-2：通过将5.6mg(27.55μmol)溶解于0.275ml DMSO中来制备100mM ALD-2储备溶液。ALD-2/DMSO混合物是透明的琥珀色溶液。使用DPBS进行对数稀释。用DPBS按1:10稀释到10mM后，溶液仍为透明的琥珀色溶液。

c.关于制备储备溶液的细节：在DMSO/DPBS中稀释化合物

i.储备液A是100mM化合物/100％DMSO。

ii.通过将50μl储备液A添加到450μl DPBS中以使最终浓度为10mM来制备储备液B。添加3.3μl到100μl DPBS中，以在0.3％DMSO中产生300μM最终浓度。

iii.通过将50μl储备液B添加到450μl DPBS中以使最终浓度为1mM来制备储备液C。添加10μl到100μl DPBS中，以在0.1％DMSO中产生100μM最终浓度。

iv.通过将50μl储备液C添加到450μl DPBS中以使最终浓度为100μM来制备储备液D。添加10μl到100μl DPBS中，以在0.01％DMSO中产生10μM最终浓度。

v.通过添加50μl储备液D到450μl DPBS中以使最终浓度为10μM来制备储备液E。添加10μl到100μl DPBS中，以在0.001％DMSO中产生1μM最终浓度。

vi.通过将50μl储备液E添加到450μl DPBS中以使最终浓度为1μM来制备储备液F。添加10μl到100μl DPBS中，以使0.0001％DMSO中的最终浓度为0.1μM。

vii.添加10μl适当稀释液到90μl中，以使孔中的总体积为100μl。

3.培养条件经设计以检测针对与过氧化氢相关的氧化应激的神经保护作用：

a.如此前所述制备大鼠海马体培养物(布莱曼DE(Brenneman DE)，史密斯GR(Smith GR)，张Y(Zhang Y)，杜Y(Du Y)，康达维提SK(Kondaveeti SK)，杂迪拉MJ(ZdillaMJ)，雷兹AB(Reitz AB)(2012)，分子神经科学杂志(J.Molecular Neuroscience)，47:368-379)。在这些条件下，培养物是至少90％神经元。最丰裕的非神经元细胞是星形胶质细胞。大鼠E18海马体组织购自Brain Bits有限责任公司(斯普林菲尔德，伊利诺斯(SpringfieldIL))。组织存储在Hibernate E培养基中以便转运。

b.所有培养物均在96孔形式中按每孔10K细胞的涂铺密度制备。E18海马体组织解离之后的第10天与第21天之间处理培养物。对于这些实验来说，第13天处理所有培养板。在所有实验中，用测试剂或阳性对照物(大麻二酚)处理之后10分钟，将过氧化氢添加到培养物中。对于每种处理条件来说，重复次数是五。

c.所有培养物涂铺于B27/神经基础培养基中。处理当天，所有培养物的培养基均完全更换成不含抗氧化剂的无血清B27/神经基础培养基。

d.如此前所确定(布莱曼(Brenneman)等人，2012)，使用10μM过氧化氢产生毒性和氧化应激。如此前所述(贾勒特SG(Jarrett SG)，梁L-P(Liang,L-P)，海涅尔(Hellier,JL)，斯塔雷(Staley,KJ)和帕特尔M.(Patel,M.)(2008)，疾病神经生物学(Neurobiol.Dis)30(1):130-138)，已经使用持续性癫痫红藻氨酸模型在大鼠海马体中观察10μM过氧化氢。

e.所有研究中使用的阳性对照物是10μM大麻二酚(CBD)，一种已知的抗氧化剂(汉普逊(Hampson)等人(1998)，美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci)95:8268-8273)，其可预防原代神经元中的氧化应激(布莱曼DE(Brenneman,DE)，派特康纳D(Petkanas,D)和金尼W.A.(Kinney W.A.)(2014)，关于大麻素的年度研讨会(Annual Symposium on theCannabinoids)第129页)。

f.阴性对照孔、过氧化氢孔、阳性对照孔均不含有任何药物媒剂。

4.分析：

此研究中所用的两种分析已经详细地描述(布莱曼DE，史密斯GR，张Y，杜Y，康达维提SK，杂迪拉MJ，雷兹AB，(2012)，分子神经科学杂志(J.Molecular Neuroscience)，47:368-379)。

a.CFDA神经元活力分析：在此分析中，CFDA染料被所有活细胞吸收且通过酯酶裂解以释放荧光素。由于神经元不能除去此染料，因此获得神经元特异性，而染料可以随时间从非神经元细胞中流出。洗掉细胞外染料之后，用荧光计读取培养物；细胞内染料强度与活神经元群成比例。原始参考文献：派特罗斯基RE(Petroski,RE)和杰勒HM(Geller HM)，(1994)，“用5(6)-羧基荧光素二乙酸酯(CFDA)对星形胶质细胞单层上的胚胎神经元培养物进行选择性标记(Selective labeling of embryonic neurons cultures on astrocytemonolayers with 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA))”，神经科学方法杂志(J.Neurosci.Methods)52:23.32。每个实验的平均对照水平以长虚参考线显示。

b.使用碘化丙锭的细胞死亡分析与CFDA分析在相同的孔中同时进行。此染料从活细胞中排除且结合到死亡细胞的DNA。所述分析检测坏死和凋亡细胞死亡；其无法区分神经元细胞死亡和非神经元细胞死亡。参见萨拉芬TA(Sarafian TA)，库尤简S(KouyoumjianS)，塔西金D(Tashkin D)，罗斯MD(Roth MD)，(2002)，毒理学快报(Tox.Letters)133:171-179。平均对照水平以红色中等虚参考线显示。

c.所用试剂

i.30wt％过氧化氢溶液；西格玛-奥德里奇公司(216736-100ml，批号MKBV382V)

ii.二甲亚砜；西格玛-奥德里奇公司(472301-100ml)，批号21096JK

iii.碘化丙锭，西格玛-奥德里奇公司(P4864-10ml；1mg/ml水溶液)

iv.CFDA[5(6)-羧基荧光素二乙酸酯]，西格玛-奥德里奇公司，产品编号：21879-100mg-F

v.10mg/ml存在于乙醇中的大麻二酚溶液；西格玛-奥德里奇公司，产品编号：90899-1ml

vi.达尔伯克氏磷酸盐缓冲生理盐水(DPBS)，Gibco(14190-144)，批号1165767

5.数据分析：

c.EC₅₀测定方法：

i.在EC₅₀效能分析中选择较宽的浓度范围来筛选所述化合物。使用0.1μM到300μM的基于对数的浓度系列。

ii.使用非线性回归分析来确定与数据最佳拟合的线条的方程式。(四参数逻辑斯蒂曲线)

iii.基于前述实例中所用的逻辑斯蒂方程，计算针对神经保护的EC₅₀且利用SigmaPlot 11绘图，以确定两种分析中产生半最大反应所需的浓度。使用垂直线展示轴交点，从而确定EC₅₀。

B.Aldeyra化合物在大鼠海马体培养物中的保护研究概述

表21：保护研究数据概述

*测试剂浓度展示分析反应水平与无处理对照的分析反应水平无显著差异。

C.实验结果和原始数据的图形分析

1.实验1：ALD-6的剂量反应。与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响。

a.调配物：DMSO

b.分析：CFDA

c.毒素：10μM过氧化氢

d.处理持续时间：5小时

e.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

f.培养基质：聚-L-赖氨酸

g.结论：在6.8±1.2μM的情况下观察到EC₅₀；相对于对照(CBD+HP和无处理对照)，在100μM ALD-6的情况下观察到完全的功效。ALD-6在此分析中、在100μM具有针对过氧化氢毒性的完全神经保护作用。结果展示于表22和图36和37中。

表22：ALD-6的剂量反应数据，其展示了在与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

2.实验2：ALD-6与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的剂量反应效应。

a.调配物：DMSO

b.分析：碘化丙锭

c.毒素：10μM过氧化氢

d.处理持续时间：5小时

e.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

f.培养基质：聚-L-赖氨酸

g.结论：在0.32+0.03μM的情况下观察到EC₅₀；相对于对照(CBD+HP和无处理对照)，在10μM ALD-6的情况下观察到完全的功效。ALD-6在此分析中具有针对过氧化氢毒性的完全神经保护作用。这些数据表明针对细胞死亡的保护作用可能比针对神经元活力所观察到的保护作用更强。结果展示于表23和图38和39中。

表23：ALD-6的剂量反应数据，其展示了在与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

3.实验3：对DMSO中的ALD-5的剂量反应。与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响。

a.调配物：DMSO

b.分析：CFDA

c.毒素：10μM过氧化氢

d.处理持续时间：5小时

e.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

f.培养基质：聚-L-赖氨酸

g.结论：0.1到300μM ALD-5不存在统计上显著的针对过氧化氢毒性的神经保护活性。结果展示于表24和图40中。

表24：ALD-5的剂量反应数据，其展示了在与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

4.实验4：对ALD-5的剂量反应。与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的影响。

a.调配物：DMSO

b.分析：碘化丙锭

c.毒素：10μM过氧化氢

d.处理持续时间：5小时

e.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

f.培养基质：聚-L-赖氨酸

g.结论：0.1到300μM ALD-5对细胞死亡不存在统计上显著的保护作用。结果展示于表25和图41中。

表25：ALD-5的剂量反应数据，其展示了在与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

5.实验5：对ALD-2的剂量反应。与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响。

a.调配物：DMSO

b.分析：CFDA

c.毒素：10μM过氧化氢

d.处理持续时间：5小时

e.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

f.培养基质：聚-L-赖氨酸

g.结论：ALD-2对于经过氧化氢处理的培养物中的神经元活力的降低无统计上显著的神经保护作用。结果展示于表26和图42中。

表26：ALD-2的剂量反应数据，其展示了在与10μM过氧化氢共处理之后对神经元活力的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

6.实验6：对ALD-2的剂量反应。与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的影响。

a.调配物：DMSO

b.分析：碘化丙锭

c.毒素：10μM过氧化氢

d.处理持续时间：5小时

e.生长培养基：不含抗氧化剂的B27/神经基质培养基

f.培养基质：聚-L-赖氨酸

g.结论：ALD-2处理之后，不存在统计上显著的针对过氧化氢所产生的细胞死亡的保护作用。结果展示于表27和图43中。

表27：ALD-2的剂量反应数据，其展示了在与10μM过氧化氢共处理之后对细胞死亡的影响

*与单独10μM过氧化氢处理有显著差异。

N.S.：与单独10μM过氧化氢处理无显著差异。

7.观察概述和结论

a.ALD-6在CFDA分析中展现针对过氧化氢毒性的神经保护活性。

b.ALD-6在CFDA分析中的神经保护作用与对照(无HP处理)和阳性对照(CBD)数值在统计学上无差异，表明存在完全保护。

c.在CFDA神经元活力分析中，在100μM ALD-6的情况下，观察到相对于对照的完全保护作用。ALD-6在CFDA分析中的无作用浓度是1μM。

d.语逻辑斯蒂分析拟合的非线性曲线表明，ALD-6在CFDA神经元活力分析的EC₅₀是6.8±1.2μM。

e.ALD-6在碘化丙锭(PI)分析中展现针对过氧化氢处理所致的细胞死亡的保护活性。

f.ALD-6在PI分析中针对细胞死亡的保护作用与对照(无HP处理)和阳性对照(CBD)数值在统计学上无差异，表明存在完全保护。

g.在PI分析中，在10μM ALD-6的情况下观察到相对于无处理对照值的完全保护作用，而无作用浓度是0.1μM。细胞死亡分析中的ALD-6反应展现的效能比在CFDA分析中更大。应认识到，细胞死亡分析对神经元无特异性且可以涉及存在于此模型CNS系统中的非神经元细胞。

h.非线性逻辑斯蒂曲线拟合表明ALD-6在PI分析中的EC₅₀是0.32±0.03μM。

i.0.1到300μM ALD-5或ALD-2处理产生的神经保护作用与单独过氧化氢处理无统计显著性，如使用CFDA分析所评估。

j.0.1到300μM ALD-5或ALD-2处理对过氧化氢处理所产生的细胞死亡未产生统计上显著的保护作用，如使用PI分析所评估。

k.10μM过氧化氢产生的毒性信号是过去已经测试的多种氧化性应激源(乙醇、重金属、乙酸铵和谷氨酸盐)所特有的，相对于对照的降幅范围为30到50％。

l.阳性对照(10μM大麻二酚)在每个测试板上均具有活性，表明所述模型系统按照典型的保护方式响应。

实例14：NS2-D6(化合物I-1)的活体内药理学

在结合和酶吸收分析中测试NS2-D6(化合物ID 100029054-1；批号1603356191)。化合物结合作为特异性针对每种目标的经放射性标记的配体的结合抑制％来计算。化合物酶抑制效应是作为对照酶活性的抑制％来计算。展示抑制或刺激高于50％的结果被认为是表示测试化合物的显著效应。在此观察到此类效应且列举于下表中。

参考化合物

在每个实验中且如果适用，那么与NS2-D6并行测试相应的参考化合物，且将数据与在相同研究机构所测定的历史值进行比较。实验根据行业标准操作程序进行。

结果

表28概括了酶抑制结果。

表28：酶抑制结果的概述

测试化合物结果展示于图44-46中。表29展示了NS2-D6的特异性结合结果。

表29：测试化合物结果

表29(续)

表30展示了与NS2-D6比较的各种参考化合物的IC₅₀、K_i和nH值。

表30：参考化合物结果

表30(续)

表31展示NS2-D6的对照值的抑制％。

表31：测试化合物结果

表31(续)

干扰：测试化合物干扰分析检测方法。

表32展示参考化合物的IC₅₀和nH值。

表32：参考化合物IC₅₀和nH值

表32(续)

表33展示NS2-D6对鸟苷酰基环化酶的测试化合物结果。

表33：使用鸟苷酰基环化酶的测试化合物结果

表34展示针对鸟苷酰基环化酶的参考化合物EC₅₀结果。

表34：使用鸟苷酰基环化酶的参考化合物结果

展示抑制(或在基本条件下运作的分析中的刺激)高于50％的结果被认为是测试化合物的显著效应。50％是进一步研究的最常见截止值(利用浓度反应曲线确定IC₅₀或EC₅₀值)。展示抑制(或刺激)在25％与50％之间的结果表示微弱到中度效应(在大部分分析中，其应该通过进一步测试来证实，因为其在可能会发生更多实验间可变性的范围内)。展示抑制(或刺激)低于25％的结果不视为显著的且大部分可归因于围绕对照水平的信号的可变性。

低到中度阴性值不具有真实含义且可归因于围绕对照水平的信号的可变性。在高浓度测试化合物的情况下有时获得的高阴性值(≥50％)通常可归因于测试化合物在分析中的非特异效应。在罕见的场合下，其可以表明测试化合物的异位效应。

实验条件

表35概括了结合分析条件。

表35：结合分析条件

表35(续)

表36展示酶和吸收分析条件。

表36：酶和吸收分析条件

表36(续)

结果的分析和表达

试管内药理学：结合分析

结果是以对照物特异性结合百分比：(所测量的特异性结合/对照物特异性结合)×100；和在NS2-D6存在下获得的对照物特异性结合的抑制百分比：100-((所测量的特异性结合/对照物特异性结合)×100)表示。

IC₅₀值(引起对照物特异性结合的半数最大抑制的浓度)和希尔系数(nH)是通过对竞争曲线进行非线性回归分析来确定，所述竞争曲线是使用希尔方程式曲线拟合、使用平均重复值产生：

其中Y＝特异性结合，A＝曲线的左渐近线，D＝曲线的右渐近线，C＝化合物浓度，C₅₀＝IC₅₀，且nH＝斜率因数。此分析是使用Cerep开发的软件(Hill软件)进行且通过与的商用软件4.0(SPSS有限公司)所产生的数据比较来验证。使用Cheng Prusoff方程式计算抑制常数(K_i)：

其中L＝分析中的放射性配体浓度，且KD＝放射性配体对受体的亲和力。利用斯卡查德图(scatchard plot)确定KD。

试管内药理学：酶和吸收分析

结果是以对照物特异活性的百分比：(所测量的特异活性/对照物特异活性)×100；和在NS2-D6存在下获得的对照物特异活性的抑制百分比：100-((所测量的特异活性/对照物特异活性)×100)表示。

IC₅₀值(引起对照物特异活性的半数最大抑制的浓度)、EC₅₀值(产生对照物基本活性的半数最大增加的浓度)和希尔系数(nH)是通过对使用希尔方程式曲线拟合、使用平均重复值产生的抑制/浓度反应曲线进行非线性回归分析来确定：

其中Y＝特异活性，A＝曲线的左渐近线，D＝曲线的右渐近线，C＝化合物浓度，C₅₀＝IC₅₀或EC₅₀，且nH＝斜率因数。此分析是使用Cerep开发的软件(Hill软件)进行且通过与的商用软件4.0(SPSS有限公司)所产生的数据比较来验证。

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Claims

1.一种式I化合物，

或其医药学上可接受的盐，其中：

R¹选自-NH₂、-NHD或-ND₂；

R²选自氢或氘；

R³和R⁴独立地选自-CH₃、-CH₂D、-CHD₂或-CD₃；且

R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地选自氢或氘；

2.根据权利要求1所述的化合物，其中R¹是-NH₂。

3.根据权利要求1所述的化合物，其中R¹是-NHD。

4.根据权利要求1所述的化合物，其中R¹是-ND₂。

5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的化合物，其中R²是氢。

6.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的化合物，其中R²是氘。

7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的化合物，其中R³是-CH₃。

8.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的化合物，其中R³是-CH₂D。

9.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的化合物，其中R³是-CHD₂。

10.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的化合物，其中R³是-CD₃。

11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的化合物，其中R⁴是-CH₃。

12.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的化合物，其中R⁴是-CH₂D。

13.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的化合物，其中R⁴是-CHD₂。

14.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的化合物，其中R⁴是-CD₃。

15.根据权利要求1到14中任一权利要求所述的化合物，其中R⁵、R⁶、R⁷和R⁸中的每一个是氢。

16.根据权利要求1到14中任一权利要求所述的化合物，其中R⁵、R⁶、R⁷和R⁸中的一个是氘。

17.根据权利要求1到14中任一权利要求所述的化合物，其中R⁵、R⁶、R⁷和R⁸中的两个是氘。

18.根据权利要求1到14中任一权利要求所述的化合物，其中R⁵、R⁶、R⁷和R⁸中的三个是氘。

19.根据权利要求1到14中任一权利要求所述的化合物，其中R⁵、R⁶、R⁷和R⁸中的每一个是氘。

20.根据权利要求1到19中任一权利要求所述的化合物，其中R⁵、R⁶、R⁷和R⁸中的每一个如以下表项中的一个中所定义：

21.根据权利要求1所述的化合物，其选自以下结构中的任一种：

或其医药学上可接受的盐。

22.一种组合物，其包含根据权利要求1到21中任一权利要求所述的化合物和医药学上可接受的佐剂、载剂或媒剂。

23.根据权利要求22所述的组合物，其与另一种治疗剂组合。

24.一种治疗个体的黄斑变性和病源学涉及A2E和/或脂褐质积聚的其它形式的视网膜疾病的方法，所述方法包含将包含根据权利要求1到23中任一权利要求所述的化合物或其医药学上可接受的盐的组合物投与所述个体，从而使A2E积聚量相对于未投与所述组合物的所述个体中的A2E积聚量降低。

25.一种治疗、预防有需要的个体的涉及醛毒性的疾病、病症、病状或美容适应症或降低其风险的方法，包含向所述个体局部或全身性投与包含根据权利要求1到23中任一权利要求所述的化合物的组合物。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是眼部病症。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述疾病、病症或病状选自黄斑变性或斯塔加特氏病。

28.根据权利要求26所述的方法，其中所述眼部病症选自由以下组成的群组：干眼综合症、白内障、圆锥形角膜、大疱和其它角膜病变、富克氏内皮营养不良、过敏性结膜炎、眼部瘢痕性类天疱疮、与PRK愈合和其它角膜愈合相关的病状、与泪脂质降解或泪腺机能不良相关的病状、葡萄膜炎、巩膜炎、史蒂文琼森眼综合症以及眼部红斑痤疮。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述眼部病症是干眼综合症。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述眼部病症是与PRK愈合和其它角膜愈合相关的病状。

31.根据权利要求28所述的方法，其中所述眼部病症选自由葡萄膜炎、巩膜炎、史蒂文琼森眼综合症以及眼部红斑痤疮组成的群组。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述眼部病症是眼部红斑痤疮或葡萄膜炎。

33.根据权利要求28所述的方法，其中所述眼部病症选自由圆锥形角膜、白内障、大疱和其它角膜病变、富克氏内皮营养不良、眼部瘢痕性类天疱疮以及过敏性结膜炎组成的群组。

34.根据权利要求25所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是选自由以下组成的群组的皮肤疾病、病症或病状：牛皮癣、局部(盘状)狼疮、接触性皮炎、异位性皮炎、过敏性皮炎、辐射性皮炎、寻常痤疮、休格连-拉森综合症以及其它鱼鳞癣，并且所述美容适应症选自由以下组成的群组：日光性弹性组织变性/皱纹、肤色紧致、浮肿、湿疹、烟尘或刺激物诱发的皮肤变化、真皮切口以及与灼伤或创伤相关的皮肤病状。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述皮肤疾病、病症或病状选自由以下组成的群组：牛皮癣、硬皮病、局部(盘状)狼疮、接触性皮炎、异位性皮炎、过敏性皮炎、辐射性皮炎、寻常痤疮和休格连-拉森综合症以及其它鱼鳞癣。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述皮肤疾病、病症或病状是接触性皮炎、异位性皮炎、过敏性皮炎或辐射性皮炎。

37.根据权利要求35所述的方法，其中所述皮肤疾病、病症或病状是休格连-拉森综合症。

38.根据权利要求34所述的方法，其中所述美容适应症选自由以下组成的群组：日光性弹性组织变性/皱纹、肤色紧致、浮肿、湿疹、烟尘或刺激物诱发的皮肤变化、真皮切口以及与灼伤或创伤相关的皮肤病状。

39.根据权利要求25所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是与糜烂性毒剂的毒性效应或碱性试剂灼伤相关的病状。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述糜烂性毒剂是硫芥、氮芥或光气肟。

41.根据权利要求39所述的方法，其中所述碱性试剂是石灰、碱液、氨或排水渠清洁剂。

42.根据权利要求25所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是自体免疫、免疫介导、发炎、心血管或神经疾病，或糖尿病、代谢综合症，或纤维化疾病。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述疾病、病症或病状选自由以下组成的群组：狼疮、硬皮病、哮喘、慢性阻塞性肺病COPD、类风湿性关节炎、发炎性肠病、败血症、动脉粥样硬化、局部缺血再灌注损伤、帕金森病、阿兹海默氏病、丁二酸半缩醛脱氢酶缺乏症、多发性硬化症，和肌肉萎缩性侧索硬化。

44.根据权利要求42所述的方法，其中所述纤维化疾病是肾脏、肝脏、肺或心脏纤维化。

45.根据权利要求25所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是年龄相关性疾病、病症或病状。