CN108048573A - 用于确定癌症对象之预后的方法和核酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于确定癌症对象之预后的方法和核酸。本发明提供了用于确定患癌症对象之预后的方法、核酸及试剂盒。本发明公开了基因组序列，其甲基化模式具有用于下列的应用：改进的对所述病症的检测，从而实现改进的对患者的诊断和治疗。

Description

用于确定癌症对象之预后的方法和核酸

本申请是申请号为201280033813.X的中国专利申请的分案申请，原申请是2012年7月9日提交的PCT国际申请PCT/EP2012/063436于2014年1月7日进入中国国家阶段的申请。

技术领域

本发明涉及可用于以下的基因组DNA标志物：确定癌症对象的预后；确定癌症对象的医学治疗；确定来自癌症对象的肿瘤是否指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少；检测对象中侵袭性形式的癌症；选择用于癌症治疗的癌症对象；或者确定对象中的肿瘤负荷或癌症负担。一些特定实施方案提供了可用于确定患癌症对象之预后的方法、核酸、核酸阵列以及试剂盒。

背景技术

用于确定癌症患者之预后的方法并且因而用于确定癌症患者之治疗的方法和试剂包括基于多种标准来确定肿瘤的分期。通常来说，该确定包括侵入性方法以观察组织形态学的组织学变化及肿瘤侵袭进入相邻组织和转移的水平。

特别地，结直肠癌在欧洲和美国是第二常见的癌症(在2006年，分别为412,900例和150,000例)。在75％的病例中，通过手术除去疾病。但是，有30％至40％的II至III期结直肠癌患者复发，大多数在最初诊断的3至5年内。此外，只有16％至66％的患者在复发诊断时是有症状的，并且在这些肿瘤中，只有1.7％至7％可切除。因此，93％至98.3％的复发病例是在切除足以除去所有肿瘤或肿瘤细胞的时间之后鉴定出来的。参见Fakih，M.G.MD，CEAMonitoring in Colorectal Cancer， What You Should Know，第20卷：第6期：2006。

目前有关II期和更晚期肿瘤的切除后监视的现有操作指南包括：每3至6个月监测CEA(癌胚抗原)，进行2年，然后每6个月，进行总计5年；和/或在1年后进行结肠镜检查，任选地每两年重复。就在手术前对CEA呈阳性的结直肠I期和II期患者而言，通过基于CEA的监测只能监测3％至32％的患者，剩下68％至97％的用CEA根本无法监测的I&II期患者。此外，CEA灵敏度取决于复发部位，使得3％至32％的可以被监测的患者中只有一部分可以获益。

目前，在预测结直肠癌(CRC)患者之结局中唯一有效的预后标志物是肿瘤-结-转移(Tumor-Node-Metastasis，TNM)分期体系。该体系的参数一般是定性的，并且不为进一步区分标准风险患者的风险(其构成大多数II期结肠癌)提供信息。约30％的结肠癌患者患有II期疾病。现有国家综合癌症网络(Current National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南不推荐对所有II期结肠癌患者常规地使用辅助化学治疗，而是在高复发风险的情况下考虑辅助治疗。估计整个II期患者群体的5年存活率为75％至80％。尽管单独采用手术具有这些相对高的治愈率，但癌症将在显著比例的II期患者中复发。将具有低疾病复发风险的患者与具有较高疾病复发风险的患者区分开的标志物的鉴定将有助于鉴定可以成为辅助化学治疗候选的那些患者。到目前为止，II期结肠癌的生物标志物仍限于临床诊断，并未用于预后或临床结局。

为了试图改善预后信息以及预测全身治疗的益处，已描述了若干蛋白质和遗传标志物。不同于其他类型的癌症，到目前为止，所研究的标志物均未进入结直肠癌的临床管理(KRAS突变除外)。

CpG岛甲基化：CpG岛的异常甲基化已示出导致先前已与多种细胞增殖病症(包括癌症)的发病机制相关联之某些基因的转录沉默。CpG岛是富含CpG二核苷酸的序列，并且通常可见于全部人基因中约50％的5’区。在这些岛中胞嘧啶的甲基化导致基因表达丧失，并且在X染色体的失活和基因组印记(genomic imprinting)中已有报道。

DNA甲基化和疾病预后：在许多公开例如EP 1692316和WO 2007/085497中，已示出DNA甲基化与患者预后相关。

需要更好的方法来确定患者的预后、临床结局、肿瘤负荷、癌症负担、和/或在从初始诊断开始并在治疗过程期间持续的任意点纳入治疗组中，包括使用最低侵入性测试技术来确定再发、缓解或复发状态的能力。

发明内容

本发明提供了用于确定癌症对象之预后的方法，其包括以下步骤：测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示对所述对象进行额外癌症治疗。在一个实施方案中，与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加指示所述癌症是侵袭性的或具有转移潜能或所述对象的存活时间减少。在一个优选的实施方案中，本发明的方法提供了用于确定癌症对象之预后的方法，其包括以下步骤：a)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；b)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平；以及c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示不良预后，因此，所述对象需要额外的癌症治疗。在该方法的一个优选的实施方案中，该方法包括如下步骤c)和d)：c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，和d)基于步骤c)的比较结果确定癌症对象的预后，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示不良预后，因此，所述对象需要额外的癌症治疗。

稳定的或者甚至水平提高的甲基化基因组DNA优选地指示所选治疗未能除去释放甲基化DNA片段的癌细胞，或者尽管经历了治疗，这些癌细胞的数目仍增加，即，癌进一步生长。与此相反，水平降低的甲基化基因组DNA优选地指示癌细胞的数目减少，即，该治疗成功地减少了患者的肿瘤负荷。特别地，降低至低于检出水平之水平指示可能已经从患者清除了所有癌细胞，即，癌症的治愈。通常来说，认为对治疗应答不良的癌症是侵袭性的。

如果所施用的癌症治疗是局部治疗，则甲基化基因组DNA的水平降低至低于检出限的水平优选地指示癌症的治愈。本领域技术人员将理解，根据临床研究的结局(outcome)，可以定义用于定义患者之“治愈”的其他阈值水平。可以通过(医学)统计学领域中常用的统计学方法来实现这样的阈值水平的建立。

但是，如果在局部治疗之后测量的甲基化基因组DNA的水平高于该检出水平，则其优选地指示局部治疗不足以实现完全治愈。如果癌症已扩散超出受局部治疗影响的区域，则通常是这种情况。因此，即使在甲基化基因组DNA水平降低的情况下，可检测水平的甲基化基因组DNA的持续存在也指示不良预后，这是因为扩散超过其最初部位的癌症通常更难以治疗。

对癌症患者的进一步治疗进行选择取决于该患者的预后。如果预后良好，则后续治疗无需具有像不良预后一样的攻击性。因为患者的预后是对癌症患者进一步治疗进行选择的一个重要参数，所以本发明提供了用于确定癌症对象之医学治疗的方法，其包括以下步骤：测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示对所述对象进行额外癌症治疗。在一个优选的实施方案中，本发明还提供了用于确定哪种医学治疗适于癌症对象的方法，其包括以下步骤：a)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；b)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平；以及c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示对所述对象进行额外癌症治疗。在该方法的一个优选的实施方案中，该方法包括如下步骤c)和d)：c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，和d)基于步骤c)的比较结果确定哪种医学治疗适于癌症对象，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示对所述对象进行额外癌症治疗。

优选地，甲基化基因组DNA的治疗后水平降低至低于检出水平指示不需要进一步医学治疗。在这些情况下，监测患者的复发可能就足够了。但是，如果甲基化基因组DNA的治疗后水平未降低或者甚至提高，那么额外的医学治疗可能是必需的。因为甲基化基因组DNA水平提高表示治疗失败，所以该情况优选地指示需要转变成不同种类的治疗。

本领域技术人员将理解，癌症患者之合适治疗的选择不能只基于单一实验室测试的结果。该决定优选地基于患者病症的医学判断。除通过应用本发明的方法获得的结果以外，所述判断还优选地包括常规诊断方法(例如影像方法)的结果以及特定患者的一般健康状态。

本发明提供了用于确定癌症对象的肿瘤是否指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少的方法，其包括：测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；和测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示癌症是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少。在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于确定癌症对象的肿瘤是否指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少的方法，其包括：a)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；b)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平；以及c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少。在该方法的一个优选的实施方案中，该方法包括如下步骤c)和d)：c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，和d)基于步骤c)的比较结果确定癌症对象的肿瘤是否指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少。

此外，本发明提供了用于确定癌症对象的肿瘤是否是侵袭性的和/或具有转移潜能的方法，其包括以下步骤：a)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；b)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平；c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示所述肿瘤是侵袭性的和/或具有转移潜能。在该方法的一个优选的实施方案中，该方法包括如下步骤c)和d)：c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，和d)基于步骤c)的比较结果确定癌症对象的肿瘤是否是侵袭性的和/或具有转移潜能，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示所述肿瘤是侵袭性的和/或具有转移潜能。

本发明提供了用于检测对象中侵袭性形式癌症的方法，其包括：a)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；b)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加指示所述癌症为侵袭性形式。在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于检测对象中侵袭性形式癌症的方法，其包括：a)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；b)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平，以及c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加指示所述癌症为侵袭性形式。在该方法的一个优选的实施方案中，该方法包括如下步骤c)和d)：c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，和d)基于步骤c)的比较结果检测对象中侵袭性形式的癌症，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA或片段的量增加指示所述癌症为侵袭性形式。

本发明提供了用于为癌症治疗选择癌症对象的方法，其包括：测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；和测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中基因之甲基化基因组DNA的量增加指示进行额外的癌症治疗。在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于为额外癌症治疗选择癌症对象的方法，其包括：测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；和测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平；将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的量增加或者所述DNA或其片段的量相当指示需要额外的癌症治疗。在该方法的一个优选的实施方案中，该方法包括如下步骤c)和d)：c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，和d)基于步骤c)的比较结果选择用于额外癌症治疗的癌症对象，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的量增加或者所述DNA或其片段的量相当指示需要进行额外的癌症治疗。

因此，本发明提供了用于确定在对象中抗癌治疗之成功的方法，其包括以下步骤：a)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；和b)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平；c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，由此(i)与治疗前样品相比，治疗后样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的量减少指示治疗是成功的，和(ii)与治疗前样品相比，治疗后样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的量增加或者所述DNA或其片段的量相当指示治疗不成功。在该方法的一个优选的实施方案中，该方法包括如下步骤c)和d)：c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，和d)基于步骤c)的比较结果确定在对象抗癌治疗之成功，由此，(i)与治疗前样品相比，治疗后样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的量减少指示治疗是成功的，和(ii)与治疗前样品相比，治疗后样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的量增加或者所述DNA或其片段的量相当指示治疗不成功。

优选地，“成功”的治疗实现了以下效果中的至少之一：癌症的缓解；癌症复发时间的增加；肿瘤进展时间的增加；癌症症状的缓解；肿瘤质量的减少和肿瘤数目的减少。更优选地，“成功的治疗”的特征在于癌症的治愈，即，完全清除可检测和不可检测的肿瘤细胞。癌症治愈的一个优选的指标是患者在无复发的情况下存活至少5年，或者更优选至少10年。

优选地，“不成功”的治疗未能实现任意上述目的。

本发明提供了用于确定对象中的肿瘤负荷(tumor load)或癌症负担(cancerburden)的方法，其包括：测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；和测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平；由此与治疗前样品相比，治疗后样品中基因之甲基化基因组DNA的量增加指示所述对象具有增加或相当的肿瘤负荷或癌症负担或者肿瘤负荷或癌症负担未因所述治疗而减少。在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于确定对象中的肿瘤负荷或癌症负担之发展的方法，其包括：a)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；b)测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平；以及c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的量增加或者所述DNA或其片段的量相当指示所述对象具有增加或相当的肿瘤负荷或癌症负担，或者肿瘤负荷或癌症负担未因所述治疗而减少。在该方法的一个优选的实施方案中，该方法包括如下步骤c)和d)：c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，和d)基于步骤c)的比较结果确定对象中肿瘤负荷或癌症负担的发展，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的量增加或者所述DNA或其片段的量相当指示对象具有增加或相当的肿瘤负荷或癌症负担，或者肿瘤负荷或癌症负担未因所述治疗而减少。

本发明提供了用于确定对象中的肿瘤负荷或癌症负担的方法，其包括：将在获自对象的生物样品中的基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平与基因之甲基化基因组DNA或片段的治疗前水平进行比较，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中基因之甲基化基因组DNA的量增加指示所述对象具有增加或相当的肿瘤负荷或癌症负担，或者肿瘤负荷或癌症负担未因所述治疗而减少。在该方法的一个优选的实施方案中，该方法包括如下步骤c)和d)：c)将甲基化DNA的所测量的治疗后水平与所测量的治疗前水平进行比较，和d)基于步骤c)的比较结果确定对象中的肿瘤负荷或癌症负担，由此与治疗前样品相比，治疗后样品中基因之甲基化基因组DNA的量增加指示所述对象具有增加或相当的肿瘤负荷或癌症负担，或者肿瘤负荷或癌症负担未因所述治疗而减少。

本发明的基因之甲基化DNA水平一般可用作癌症性质(例如侵袭性或肿瘤负荷)的标志物。因此，在不同时间点获取的甲基化DNA水平的比较独立于正在进行的治疗指示癌症性质如何随时间发展。

出于该原因，本发明提供了用于监测选自肿瘤负荷、癌症负担、癌症侵袭性和癌症对象预后的癌症性质的方法，其包括以下步骤：a)在获自患癌症对象的第一生物样品中测量基因之甲基化基因组DNA或其片段的水平；b)在获自所述对象的另一生物样品中测量基因之甲基化基因组DNA或其片段的水平；以及c)将在所述另一样品与第一样品中所测量的甲基化DNA水平进行比较，其中，在所述另一样品中基因之甲基化DNA或其片段的水平提高指示癌症的肿瘤负荷、肿瘤负担或侵袭性提高或者患者的预后变差；和(ii)在所述另一样品中基因之甲基化DNA或其片段水平降低指示癌症的肿瘤负荷、肿瘤负担或侵袭性降低，或者患者的预后改善。

在该方法的一个优选的实施方案中，该方法包括如下步骤c)和d)：c)将在所述另一样品与第一样品中所测量的甲基化DNA水平进行比较，和d)基于步骤c)的比较结果确定癌症的肿瘤负荷、肿瘤负担或侵袭性提高还是降低或者患者的预后变差还是改善。

第一样品和第二样品可以在任何时间获取，前提是第二样品在第一样品之后获取。优选地，第二样品在第一样品之后至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少9个月或至少12个月获取。

用于监测癌症性质的上述方法尤其适于监测其癌症之前已经历治疗的患者之癌症的复发和/或恶化。因此，在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述患者是对其的治疗看起来治愈了癌症的癌症患者。在治疗之后于不同时间点获取的至少2个样品中进行的本发明的基因之甲基化的确定可用于检测所述癌症的复发。癌症治疗领域的一个普遍问题是治疗可能是表面上有效是，即，其将患者的肿瘤负担降低为低于使用可用的诊断方法(特别是影像方法)可检测的水平。但是，尽管表面上是成功的治疗，但少数癌细胞可能仍然存在。这些细胞可以增殖并导致癌症复发，甚至在表面上成功的治疗之后的若干年内。因此，在治疗之后对所治疗患者进行一段时间的随访是良好的医疗实践以尽可能早地检测到复发。因为本发明的方法不仅灵敏(特别地，Septin 9可用于检测结肠癌的早期阶段)、易于实施而且无侵入性，所以其特别适于在随访期间监测经历过治疗的癌症患者。

在本发明方法的一个方面中，所述基因是SEPTIN9(SEQ ID NO：1)或RASSF2a(SEQID NO：16)。

在本发明方法的另一个方面中，所述基因是SEPTIN9(SEQ ID NO：1)。

在本发明方法的另一个方面中，所述基因是RASSF2A(SEQ ID NO：16)。

在本发明的另一个优选的实施方案中，上述方法基于SEPTIN9和RASSF2A二者的甲基化DNA水平的测量。

在本发明方法的另一个方面中，所述癌症选自：结肠癌和结直肠癌。在一个实施方案中，癌症所处的阶段是I期结直肠癌。在另一个实施方案中，癌症所处的阶段是II期结直肠癌。在另一个实施方案中，癌症是III期结直肠癌。在另一个实施方案中，癌症是IV期结直肠癌。

在本发明方法的另一个方面中，所述治疗选自：手术或切除；免疫疗法；放射治疗；化学治疗；靶向实体肿瘤的治疗；靶向软组织肿瘤的治疗；以及靶向血细胞的治疗。

在本发明方法的另一个方面中，所述治疗局限于对象中癌/肿瘤的区域。在本发明方法的另一个方面中，所述治疗不局限于对象中癌/肿瘤的区域。

术语“局部治疗”优选地指肿瘤的手术切除和/或放射治疗。术语“非局部治疗”等同于全身性治疗并且优选地指化学治疗和/或免疫治疗。

在本发明方法的另一个方面中，所述生物样品选自：组织、血液、粪便、尿和肺灌洗流体、乳腺、前列腺、结肠、直肠、或这些组织的组合。在一个实施方案中，样品是血清或血浆。优选使用血清或血浆。

在本发明方法的另一个方面中，定量地测量或部分定量地测量甲基化基因组DNA或其片段。在本发明方法的另一个方面中，定性地测量或部分定性地测量甲基化基因组DNA或片段。在本发明方法的另一个实施方案中，部分定量地和部分定性地或半定量地测量甲基化基因组DNA或片段。

在本发明方法的另一个方面中，测量甲基化基因组DNA或片段包括使来自生物样品的基因组DNA与至少一种试剂或一系列试剂相接触，所述至少一种试剂或一系列试剂区分基因组DNA的至少一个靶区域中的甲基化CpG二核苷酸与非甲基化CpG二核苷酸，其中所述靶区域包含SEQ ID NO：1、2、3或16的至少9个、至少16个或至少25个连续核苷酸序列或者在严格条件下与所述连续核苷酸序列杂交，其中所述连续核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸序列。在一个实施方案中，接触b)中的基因组DNA或其片段包括使用选自包括以下之组的试剂：重亚硫酸盐(bisulfite)、亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite)、焦亚硫酸盐(disulfite)及其组合。

本发明方法的另一个方面包括：a)从生物样品中提取或以其他形式分离基因组DNA或其片段；b)用一种或更多种试剂处理所提取或分离的基因组DNA或其片段以将其5位非甲基化的胞嘧啶碱基转变为尿嘧啶或在杂交性质方面可检测地不同于胞嘧啶的另一碱基；c)使经处理的基因组DNA或经处理的片段与扩增酶及至少一种引物相接触，所述引物包含至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少19个、至少20个、至少25个或至少50个核苷酸的连续序列，该连续序列与经处理的序列或其互补序列互补或者在中等严格条件或严格条件下与经处理的序列或其互补序列杂交，其中经处理的基因组DNA或其片段被扩增以产生至少一种扩增产物，或者未被扩增；以及d)基于所述扩增产物的存在、不存在或量或性质确定所述基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，或者反映所述基因的多个CpG二核苷酸的平均甲基化状态或水平的平均值或值。上文中提及的经处理的基因组DNA优选地选自：SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19以及20。

本发明方法的另一个方面包括：a)从生物样品中提取或以其他形式分离基因组DNA或其片段；b)用一种或更多种甲基化敏感性限制酶消化所提取或分离的基因组DNA或其片段；c)使b)的DNA限制酶消化产物与扩增酶及至少两种适于扩增包含所述基因的至少一个CpG二核苷酸之序列的引物相接触；和d)基于扩增产物的存在、不存在或类别确定所述基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平。

关于用于测量甲基化基因组DNA之水平的优选方法的其他信息可进一步在本申请的下文中找到。在本发明的一个尤其优选的实施方案中，用于测量基因组DNA之甲基化水平的方法是MethyLight^TM、HeavyMethl^TM或甲基化特异性PCR。

在另一个方面中，本发明提供了用于确定癌症对象之预后的甲基化基因组SEPTIN9核酸或包含该核酸的至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少19个、至少20个、至少25个或至少50个连续核苷酸的片段及其互补序列。本发明的另一个实施方案提供了用于确定癌症对象之预后的甲基化基因组RASSF2A核酸或包含该核酸的至少9个、至少16个、至少25个或至少50个连续核苷酸的片段及其互补序列。在一个实施方案中，所述对象患有结直肠癌。

在另一个方面中，本发明提供了甲基化基因组SEPTIN9核酸或包含该核酸的至少9个、至少16个、至少25个或至少50个连续核苷酸的片段及其互补序列在确定癌症对象之预后中的用途。在一个实施方案中，所述对象患有结直肠癌。

在另一个方面中，本发明提供了用于确定癌症对象之预后的经重亚硫酸盐处理的基因组SEPTIN9或RASSF2A DNA核酸，其包含至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少19个、至少20个、至少25个或至少50个连续核苷酸，或其互补序列。优选地，经重亚硫酸盐处理的SEPTIN9或RASSF2A DNA的序列由SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19或20来定义。在一个实施方案中，连续碱基序列包含至少一个CpG、TpG或CpA二核苷酸序列。

在另一个方面中，本发明提供了试剂盒，其用于：确定癌症对象之预后；确定癌症对象之医学治疗；确定癌症对象的肿瘤是否指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少；检测对象中侵袭性形式的癌症；选择用于癌症治疗的癌症对象；或者确定对象中的肿瘤负荷或癌症负担，该试剂盒包含：a)多个能够在严格条件或中等严格条件下与基因或甲基化基因组DNA的转录产物杂交的寡核苷酸或多核苷酸；和b)用于检测杂交的工具。在一个实施方案中，所述基因或甲基化基因组DNA是SEPTIN9。在一个实施方案中，所述基因或甲基化基因组DNA是RASSF2A。

在另一个方面中，本发明提供了试剂盒，其用于：确定癌症对象之预后；确定癌症对象之医学治疗；确定癌症对象之肿瘤是否指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少；检测对象中侵袭性形式的癌症；选择用于癌症治疗的癌症对象；或者确定对象中的肿瘤负荷或癌症负担，该试剂盒包含：a)重亚硫酸盐试剂；b)至少一组合有两个寡核苷酸的寡核苷酸，在每种情况下，所述两个寡核苷酸与SEPTIN9序列或RASSF2A基因的至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少19个、至少20个、至少25个或至少50个核苷酸长的区段相同、互补或者在严格条件或高度严格条件下杂交。

在另一些方面中，本发明提供了本文所述方法、本文所述核酸和/或本文所述试剂盒在确定癌症对象之预后中的用途。

本发明提供了用于在对象中确定患癌症对象之预后的方法，其包括：确定至少一个基因或基因组序列的表达水平，其中所述基因组序列在癌症中是甲基化的，而在非癌组织中是非甲基化的。编码基因的基因组DNA之甲基化或者特别是其启动子区的甲基化降低所述基因的表达。因此，所讨论之基因的甲基化提供与其低表达相类似的诊断信息。因此，分离自所述对象之生物样品中基因的甲基化/或表达的水平或量指示所述对象的预后。本发明的多个方面提供了遗传标志物，由此所述标志物的表达分析使得能够确定患癌症对象的预后。在一个实施方案中，通过检测由所述基因转录的mRNA的存在、不存在或水平来确定所述表达水平。在另一个实施方案中，通过检测由所述基因或其序列编码的多肽的存在、不存在或水平来确定所述表达水平。

本发明提供了用于在对象中确定患有结直肠癌(CRC)或结肠癌之对象的预后的方法，其包括：确定分离自所述对象之血浆中的Septin 9(Septin9)或RASSF2A的DNA甲基化水平，其中在切除原发性肿瘤之后，甲基化状态指示所述对象的预后。在一个实施方案中，所述切除是有疗效的。

本文所述的实施例示出Septin 9生物标志物在切除原发性肿瘤的约73％的所研究II期CRC患者中减少，并且仅在20％的III期患者中减少。可以将在以治疗为目的进行治疗之后的CRC患者中Septin 9的存在用作疾病复发的早期预后指标。在切除原发性肿瘤之后仍然可检测到Septin 9的事实表示肿瘤细胞存在(例如，微转移)的高风险，肿瘤细胞仍然在患者的身体中并且可以被Septin9灵敏地检测到。

在另一些实施方案中，通过检测所述基因中CpG甲基化的存在、不存在或量来确定所述表达，由此推断出所述癌症对象的预后。所述方法包括以下步骤：i)使分离自获自对象的生物样品之基因组DNA与至少一种试剂或一系列试剂相接触，所述试剂区分基因组DNA的至少一个靶区域中的甲基化CpG二核苷酸与非甲基化CpG二核苷酸，其中所述靶区域的核苷酸序列包含至少一个基因的至少一个CpG二核苷酸序列或该组基因的基因组序列，和ii)确定患癌症对象的预后。优选地，所述靶区域包含至少16个、至少25个或至少50个连续核苷酸序列或者在严格条件下与所述连续核苷酸序列杂交。

所述基因的用途可以通过基因表达分析、mRNA表达分析或蛋白质表达分析来实现。在一个实施方案中，患癌症对象之预后的确定通过以下来实现：在癌组织中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一个基因或基因组序列的甲基化状态的分析，所述至少一个基因或基因组序列包括同工型、片段、启动子或调节元件及其反义形式。

本发明提供了用于分析生物样品与癌症进展相关的特征的方法，该方法的特征在于：使核酸或其片段与能够在基因组序列中区分甲基化CpG二核苷酸与非甲基化CpG二核苷酸的试剂或一系列试剂相接触。在一个实施方案中，所述基因是SEPTIN9或RASSF2A。

优选地，SEPTIN9的序列由SEQ ID NO：1、2或3所定义。更优选地，SEPTIN9的序列由SEQ ID NO：2或3所定义。优选地，RASSF2A的序列由SEQ ID NO：16所定义。

在本发明的一个优选的实施方案中，确定SEPTIN9和/或RASSF2A之启动子区的甲基化状态。在一个更优选的实施方案中，确定由SEQ ID NO：32和/或34所定义的基因组序列所包含的至少一个胞嘧啶的甲基化状态。在本发明的一个更优选的实施方案中，确定选自SEQ ID NO：32的第21、28、30、37以及39位和SEQ ID NO：34的第25、29、46、52、58、70、74、79以及89位的胞嘧啶中的至少一个胞嘧啶的甲基化状态。在最优选的实施方案中，确定SEQID NO：32和/或34中所有前述位置胞嘧啶的甲基化状态。

本发明提供了用于确定与癌症发展相关的基因组DNA的表观遗传学参数(epigenetic parameter)的方法。

受试样品的来源是组织或体液，例如选自以下的组织和体液：组织、血液、血浆、血清、尿、肺泡灌洗流体、粪便、肺、乳腺、结肠、直肠、肠及其组合。

特别地，本发明提供了适合用于预后工具的用于确定患癌症对象之预后的方法，其包括：获得包含基因组核酸的生物样品；使所述核酸或其片段与足以区分对象核酸的靶序列中甲基化CpG二核苷酸与非甲基化CpG二核苷酸序列的试剂或多种试剂相接触，其中所述靶序列包含所述基因的至少16个、至少25个或至少50个连续核苷酸的序列或者在严格条件下与之杂交，所述连续核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸序列；以及至少部分地基于所述区分确定至少一个靶CpG二核苷酸序列的甲基化状态或反映多个靶CpG二核苷酸序列的平均甲基化状态的平均值或值。

区分靶序列中甲基化CpG二核苷酸与非甲基化CpG二核苷酸序列包括至少一个这样的CpG二核苷酸序列的甲基化状态依赖性转变或未转变为选自以下的序列中相应的已转变的或未转变的二核苷酸序列：重亚硫酸盐转变的基因的有义链和反义链以及对应于靶序列的其连续区。

另一些实施方案提供了用于确定患癌症对象之预后的方法，其包括：获得具有对象基因组DNA的生物样品；提取基因组DNA；用一种或更多种试剂处理所述基因组DNA或其片段以将5位非甲基化的胞嘧啶碱基转变为尿嘧啶或在杂交性质方面可检测地不同于胞嘧啶的另一碱基；使经处理的基因组DNA或经处理的其片段与扩增酶及至少两种引物相接触，在每种情况下，所述引物包含长度为至少9个核苷酸的连续序列，所述连续序列与选自重亚硫酸盐转变的有义链和反义链及其互补序列的序列互补或在中等严格条件或严格条件下杂交，其中经处理的DNA或其片段被扩增以产生扩增产物，或者未被扩增；基于所述扩增产物的存在、不存在或者类别或性质确定基因组序列的至少一个但更优选多个CpG二核苷酸的甲基化状态或反应其平均甲基化水平的平均值或值。

本文所述的方法包括使用选自以下的至少一种方法：1)将至少一种包含至少9个、至少25个、或至少50个核苷酸长连续序列的核酸分子与其互补序列杂交，所述连续序列与选自重亚硫酸盐转变的有义链和反义链的序列互补或者在中等严格条件或严格条件下与选自重亚硫酸盐转变的有义链和反义链的序列杂交；ii)将至少一种包含至少9个、至少25个、或至少50个核苷酸长连续序列的结合至固相的核酸分子与其互补序列杂交，所述连续序列与选自重亚硫酸盐转变的有义链和反义链的序列互补或者在中等严格条件或严格条件下与选自重亚硫酸盐转变的有义链和反义链的序列杂交；iii)将至少一种包含至少9个、至少25个、或至少50个核苷酸长连续序列的核酸分子与其互补序列杂交，所述核苷酸连续序列与选自重亚硫酸盐转变的有义链和反义链的序列互补或者在中等严格条件或严格条件下与选自重亚硫酸盐转变的有义链和反义链的序列杂交，并用至少一个核苷酸碱基延伸至少一种这样的杂交的核酸分子；以及iv)对扩增产物进行测序。

另一些实施方案提供了用于癌症分析(即，确定疾病进展和/或患者预后)的方法，其包括：获得具有对象基因组DNA的生物样品；提取基因组DNA；使所述基因组DNA或其片段与一种或更多种甲基化敏感性限制酶接触，所述基因组DNA或其片段包含选自基因组序列的一个或更多个序列或者在严格条件下与之杂交的序列，其中基因组DNA由此消化以产生消化片段，或者未由此消化；以及基于至少一种这样的片段的存在、不存在或者类别或性质确定所述基因组序列的至少一个CpG二核苷酸序列的甲基化状态或者反映多个其CpG二核苷酸序列的平均甲基化状态的平均值或值。所述消化的或未消化的基因组DNA可以在所述确定之前扩增。另一些实施方案提供了新的经化学修饰基因组核酸序列(genomicandchemically modified nucleic acid sequences)以及寡核苷酸和/或PNA-寡聚体以分析基因组序列中的胞嘧啶甲基化模式。

附图说明

图1至4示出通过癌分期分选的结直肠癌患者中手术后/前(x-轴)Sepfin 9 DNA之比(手术后甲基化Sept9 DNA的pg数除以手术前甲基化Sept9 DNA的pg数)的柱状图。只针对在手术前示出Septin 9 DNA水平＞0的患者绘制所述比例。图上方的四个数字是使用患者的手术后相对于手术前的成对水平的单侧t检验的p值。在图1和3中，I期：虚线和圆圈；II期：短划线和三角形；III期：短划线/虚线和十字以及IV期：闭合线和菱形。

图5和6示出手术前和手术后(x轴)结直肠癌患者中Septin 9 DNA的水平(y轴：甲基化Sept 9 DNA pg数的log10)。不同期的癌如下所示。图5：I期(4名患者)：虚线和圆圈；II期(9名患者)：短划线和三角形；III期(4名患者)：短划线/虚线和十字；IV期(2名患者)：闭合线和菱形。

图7和8示出通过癌分期分选的结直肠癌患者中手术后/前(x-轴)RASSF2A DNA之比(手术后甲基化Sept 9 DNA的pg数除以手术前甲基化RASSF2A DNA的pg数)的柱状图。只针对在手术前示出RASSF2A DNA水平＞0的患者绘制所述比。图上方的四个数字是使用患者的手术后相对于手术前的成对水平的单侧成对t检验的p值。图5：I期(4名患者)：虚线和圆圈；II期(9名患者)：短划线和三角形；III期(4名患者)：短划线/虚线和十字；IV期(2名患者)：闭合线和菱形。

图9至12示出手术前和手术后(如在x轴给出)结直肠癌患者中甲基化RASSF2A DNA的水平(y轴：甲基化RASSF2A DNA pg数的log10)。不同期的癌如下所示。I期(4名患者)：虚线和圆圈；II期(9名患者)：短划线和三角形；III期(4名患者)：短划线/虚线和十字；IV期(2名患者)：闭合线和菱形。

图13示出人基因组中的SEPT9基因在染色体17q25上的位置(Ensembl Jul 2005)。箭头表示SEQ ID NO：2和3的位置。

图14示出来自CRC患者的手术前血浆和手术后血浆的Septin 9甲基化的定量分析。

图15示出来自CRC患者的手术前血浆和手术后血浆的RASSF2A甲基化的定量分析。

具体实施方式

定义

术语“观察/期望比”(Observed/Expected Ratio)(“O/E比”)是指特定DNA序列中CpG二核苷酸的频率，并且对应于[CpG位点数/(C碱基数×G碱基数)]/每个片段的带长度。

术语“CpG岛”是指满足以下标准的基因组DNA的连续区：(1)具有对应于“观察/期望比”＞0.6的CpG二核苷酸频率；和(2)“GC含量”＞0.5。CpG岛的长度通常(但不总是)为约0.2KB至约1KB，或至约2kb。

术语“甲基化状态”或“甲基化状况”是指在DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸处5-甲基胞嘧啶(“5-mCyt”)的存在、不存在或类别。DNA序列中一个或更多个特定CpG甲基化位点(每个具有两个CpG二核苷酸序列)处的甲基化状态包括“非甲基化”、“完全甲基化”和“半-甲基化”。

术语“半-甲基化”或“半甲基化”是指双链DNA中只有其一条链被甲基化的甲基化状态。

本文使用的术语“AUC”是曲线下面积的缩写。特别地，其指受试者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积。ROC曲线是针对诊断测试的不同可能截断点作出的真阳性率相对于假阳性率的绘图。其根据所选的截断点示出灵敏度和特异性之间的平衡(灵敏度的任何提高都将伴随着特异性的下降)。ROC曲线下面积(AUC)是测试准确度的一个量度(该面积越大越好，最优为1，随机测试将具有在对角线处的面积为0.5的ROC曲线；参见：J.P.Egan.SignalDetection Theory and ROC Analysis，Academic Press，New York，1975)。

术语“微阵列”广义上表示“DNA微阵列”和“DNA芯片”二者，如在本领域中公知的，其涵盖所有本领域公知的固相支持物，并且涵盖所有用于向其附接核酸分子或在其上合成核酸的方法。

“遗传学参数(genetic parameter)”是基因和另外为调节其所需之序列的突变和多态性。特别地插入、缺失、点突变、倒位和多态性并且特别优选SNP(单核苷酸多态性)被命名为突变。

特别地，“表观遗传学参数(epigenetic parameter)”是胞嘧啶甲基化。其他表观遗传学参数包括例如组蛋白乙酰化，但是其无法通过使用与DNA甲基化相关的所述方法直接分析。

术语“重亚硫酸盐试剂”是指如本文所公开的可用于区分甲基化CpG二核苷酸与非甲基化CpG二核苷酸序列的试剂，包括重亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐或其组合。

术语“甲基化测定”是指任何用于确定DNA序列中一个或更多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的测定。

术语“MS.AP-PCR”(甲基化-敏感性随机引物聚合酶链式反应)是指本领域公知的技术，其允许使用富含CG引物进行基因组全局扫描以关注最可能包含CpG二核苷酸的区域，并且其由Gonzalgo等，Cancer Research 57：594-599，1997描述。

术语“MethyLight^TM”是指本领域公知的由Eads等，Cancer Res.59：2302-2306，1999所述的基于荧光的实时PCR技术。

在本文实施的其实施方案中，术语“HeavyMethyl^TM”是指这样的测定：其中覆盖了扩增引物之间或者扩增引物所覆盖的CpG位点的甲基化特异性阻断探针(也称为阻断剂)使得可以进行核酸样品的甲基化特异性选择性扩增。

在本文实施的其实施方案中，术语“HeavyMethyl^TM MethyLight^TM”测定是指HeavyMethyl^TM MethyLight^TM测定，其为MethyLight^TM测定的一个变化形式，其中MethyLight^TM测定与包含扩增引物之间的CpG位点的甲基化特异性阻断探针相组合。

术语“Ms-SNuPE”(甲基化敏感性单核苷酸引物延伸)是指本领域公知的由Gonzalgo & Jones，Nucleic Acids Res.25：2529-2531，1997所述的测定。

术语“MSP”(甲基化特异性PCR)是指本领域公知的由Herman等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9821-9826，1996以及由美国专利No.5,786,146所述的甲基化测定。

术语“COBRA”(联合重亚硫酸盐限制分析)是指本领域公知的由Xiong & Laird，Nucleic Acids Res.25：2532-2534，1997所述的甲基化测定。

术语“MCA”(甲基化CpG岛扩增)是指由Toyota等，Cancer Res.59：2307-12，1999和WO 00/26401A1所述的甲基化测定。

术语“杂交”应理解为寡核苷酸与互补序列沿着DNA样品中的沃森-克里克碱基配对的线相结合，形成双链体结构。

如本文所定义的“严格的杂交条件”涉及在68℃于5×SSC/5×Denhardt溶液/1.0％SDS中杂交，并在室温于0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤，或者涉及本领域公知的其等同变化形式(例如以下条件：在60℃于2.5×SSC缓冲液中进行杂交，接着在37℃于低缓冲浓度下进行若干洗涤步骤，并维持稳定)。如本文所定义的中等严格条件涉及包括在42℃于3×SSC中洗涤或者本领域公知的其等同变化形式。可以改变参数盐浓度和温度以获得探针与靶核酸之间识别的最佳水平。考虑到这样的条件的准则在本领域中可得，例如通过Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y；和Ausubel等.(编著)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley &Sons，N.Y.)的第2.10单元。

术语“甲基化特异性限制酶”或“甲基化敏感性限制酶”应理解为依赖于核酸识别位点的甲基化状态来选择性地消化核酸的酶。对于识别位点是非甲基化或半甲基化时发生特异性地切割的此类限制酶，如果识别位点是甲基化的则切割将不会发生或者效率显著降低。对于识别位点是甲基化时发生特异性地切割的此类限制酶，如果识别位点是非甲基化的，则切割将不会发生或者效率显著降低。优选甲基化特异性限制酶，其识别序列包含CG二核苷酸(例如cgcg或cccggg)。就一些实施方案而言还优选如下限制酶，即如果该二核苷酸中的胞嘧啶在碳原子C5处是甲基化的则不切割。

“非甲基化特异性限制酶”或“非甲基化敏感性限制酶”是以几乎相同的效率与甲基化状态无关地切割核酸序列的限制酶。它们也称为“甲基化非特异性限制酶”。

在提及复合阵列序列时，短语“连续核苷酸”是指复合阵列的任何单个连续序列的连续序列区域，但不包括如上文所定义的包括“结(node)”的复合阵列序列区域。

作为癌症预后指标在癌症中是甲基化的但在非癌组织中是非甲基化的生物标志物的描述应理解为包括其所有转录变体及其所有启动子和调节元件。此外，因为已知多个SNP在生物标志物或基因中，所以该术语应理解为包括所有其序列变体。

概要：

本发明提供了用于确定患癌症对象之预后的方法，其包括在分离自所述对象的生物样品中确定至少一种在癌症中是甲基化的但在非癌组织中是非甲基化的生物标志物的甲基化和/或表达水平，其中甲基化和/或表达状态指示所述患癌症对象之预后。

用于确定预后的方法因此用于治疗癌症患者之方法和试剂包括基于多种标准来确定肿瘤的分期。通常来说，该确定包括侵入性方法以观察组织形态学中的组织学变化和肿瘤侵袭进入相邻组织和转移的水平。多种癌症分期或分类方法用于使用标准分类标准来评价癌症的进展或状态。

在结直肠癌中，这些分期方法中的两种是由美国癌症联合会(AJCC癌分期手册，第6版，Springer-Verlag，New York，2002，其通过引用并入本文)开发的肿瘤-结-转移(TNM)分期(I至IV期)和经修改的Duke′s或Astler-Coller分期系统(A至D期)(Astler V B，Coller F A.，Ann Surg1954；139：846-52)。两种方法都涉及测量原发性肿瘤扩散通过结肠或直肠层至相邻器官、淋巴结以及远处的部位以评价肿瘤进展。结肠癌的复发风险和治疗决定的评价目前主要基于肿瘤分期。

本发明提供了用于以下的方法和试剂盒：确定癌症对象之预后；确定癌症对象的医学治疗；确定癌症对象的肿瘤是否表示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者表示所述对象的存活时间减少；检测对象中侵袭性形式的癌症；选择用于癌症治疗的癌症对象；或者确定对象中的肿瘤负荷或癌症负担；其包括在分离自所述对象的生物样品中确定至少一种在癌症中是甲基化的但在非癌组织中是非甲基化的生物标志物的甲基化和/或表达水平，其中甲基化和/或表达状态指示所述患癌症对象的预后。该方法包括从生物样品中提取或以其他方式分离基因组DNA或其片段；用一种或更多种试剂处理所提取或分离的基因组DNA或其片段，以将其5’位非甲基化的胞嘧啶碱基转变为尿嘧啶或在杂交性质方面可检测地不同于胞嘧啶的另一碱基；使经处理的基因组DNA或经处理的片段与扩增酶及至少一种包含至少9个、至少18个、至少25个或至少50个核苷酸的连续序列的引物相接触，该连续序列与经处理的序列或其互补序列互补或者在中等严格条件或严格条件下与经处理的序列或其互补序列杂交，其中经处理的基因组DNA或其片段扩增以产生至少一种扩增产物，或者不扩增；以及基于所述扩增产物的存在、不存在或量或性质来确定基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，或者反映基因的多个CpG二核苷酸的平均甲基化状态或水平的平均值或值。

在本文中进一步描述了处理所提取的DNA、扩增所述DNA和检测所述DNA以及分析所述DNA的方法。

本发明提供了在分离自癌症对象的生物样品中检测在癌症中是甲基化的但在非癌组织中是非甲基化的生物标志物或基因，以及癌症对象的预后、临床结局的确定或医学治疗的确定。

优选地，本发明的方法包括以下步骤：a)在获自患癌症对象的第一生物样品中测量基因之甲基化基因组DNA或其片段的水平；b)在获自所述对象的另一生物样品中测量基因之甲基化基因组DNA或其片段的水平；以及c)将在所述另一样品和所述第一样品中所测量的甲基化DNA的水平进行比较。

在一个实施方案中，检测和分析在治疗前(pre-treatment)样品中进行，并再在治疗后(post-treatment)的样品中进行，其中所述治疗是使用将减少、除去、缩小、最小化或切除肿瘤的方法或施用对患者(或患者组织)进行的任何治疗。这样的方法包括但不限于手术切除、免疫治疗、放射治疗、化学治疗、实体肿瘤靶向治疗、激光治疗、软组织靶向治疗以及血液癌症治疗。在该实施方案中，“治疗前样品”对应于“第一样品”，“治疗后样品”对应于“另一个样品”。

治疗前样品可以在治疗开始前的任何时间获取。但是，优选地在治疗开始前的不超过1周、不超过2周、不超过4周或不超过8周获取。治疗后样品优选地在治疗开始后的任何时间获取。如果治疗是化学治疗，则明确地设想治疗后样品在患者的疗程完成之前获取，前提是患者接受过至少一剂量的至少一种用于化学治疗的药物化合物。

结肠癌的建议治疗取决于肿瘤的分期。I、II和III期的特征在于不存在远处转移。因此，肿瘤的手术切除是治疗选择。至于II B、II C、III以及高风险的IIA期，可以推荐辅助化学治疗。对于IV期，如果远处转移的数目和位置表明存在通过移除所有肿瘤而完全治愈的机会，则只推荐肿瘤手术切除。在IV期疾病中，手术切除通过辅助(adjuvant)和/或新辅助(neoadjuvant)化学治疗来完成。

在本发明的一个优选的实施方案中，肿瘤是I、II或III期结肠癌。在这种情况下，示出肿瘤完全移除(优选为低于检出限的水平)的治疗后样品中甲基化基因组DNA的水平表示通过手术切除来治疗癌症是成功的。这等同于患者的良好预后，并且优选地不推荐作为额外治疗的辅助化学治疗。

在本发明的另一个优选的实施方案中，治疗是I、II或III期肿瘤或可手术的IV期肿瘤的辅助或新辅助化学治疗或者不可手术的IV期肿瘤的化学治疗，而没有作为全身治疗的额外治疗。在这种情况下，与治疗前样品相比，治疗后样品中甲基化基因组DNA的水平降低优选地表示所选化学治疗方案在降低患者的肿瘤负担中是成功的。这等同于表示该化学治疗方案不需要调整。但是，如果治疗后样品中甲基化基因组序列的水平仍然保持不变或甚至提高，则这优选地表示目前的治疗不成功，并且该治疗方案需要调整。在该实施方案中，优选在化学治疗期间于不同时间点获取多于一种治疗后样品，以连续地确定该化学治疗方案是否仍然成功。

本发明提供了用于癌症对象之预后的方法，其包括在原发性肿瘤已移除时肿瘤细胞的检测，例如通过上述方法。因此，本发明用于确定用以移除原发性肿瘤的方法是否成功和完成。此外，本发明提供了用于确定肿瘤是否已扩散的方法。在历史上，用于确定肿瘤是否已扩散的方法依赖于确定淋巴结受累和转移的病理学和组织学方法。例如上述癌分期方法。在本发明中，可以通过下述方式来确定这样的参数如肿瘤负荷、癌症负担、肿瘤扩散和/或转移：获取第一样品，在所述第一样品中针对在癌症中是甲基化的但在非癌组织中是非甲基化的基因或生物标志物的存在评价基因组DNA，和获取第二样品，在所述第二样品中针对在癌症中是甲基化的但在非癌组织中是非甲基化的基因或生物标志物的存在评价基因组DNA，以及确定对象中是否仍然存在肿瘤或癌细胞，因此进一步显示对于临床治疗的需要。

在一个优选的实施方案中，在除去原发性肿瘤之后可检测水平的生物标志物的存在表示肿瘤未被完全移除。更优选地，该情况表示肿瘤已局部扩散入周围组织或淋巴结中或者全身性地扩散入除结肠、直肠或阑尾以外的器官中。

在某些实施方案中，所述检测方法定量地、部分定量地、定性地、部分定性地或部分定量地且部分定性地进行。

在某些实施方案中，在癌症中是甲基化的但在非癌组织中是非甲基化的基因或生物标志物是Septin 9。在某些实施方案中，在癌症中是甲基化的但在非癌组织中是非甲基化的基因或生物标志物是RASSF2A。

人Septin 9基因(也称为MLL septin样融合蛋白、MLL septin样融合蛋白MSF-A、Slpa、Eseptin、Msf、septin样蛋白卵巢/乳腺septin(Ov/Br septin)以及Septin D1)位于染色体17q25上于重叠群(contig)AC068594.15.1.168501中，并且是Septin基因家族的成员。图13提供了Septin 9基因的Ensembl注释，并且示出4种转录变体、Septin 9变体及Q9HC74变体(其为Septin9转录物的截短变体)。SEQ ID NO：1提供了所述基因的序列，其包含Septin 9和Q9HC74转录物二者的区域和启动子区。SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3是其子区域，其分别提供Septin 9和Q9HC74转录物的富含CpG的启动子区的序列。SEQ ID NO：4和5分别是经化学(重亚硫酸盐)处理的Sepitn 9 DNA有义链和反义链的序列，其对应于SEQ IDNO：1(即，其中CpG二核苷酸是甲基化的)的序列，如表1所示。SEQ ID NO：10和11分别是经化学(重亚硫酸盐)处理的Septin 9 DNA有义链和反义链的序列，其对应于SEQ ID NO：1(即，其中CpG二核苷酸非甲基化)的序列，如表1所示。SEQ ID NO：6和7分别是经化学(重亚硫酸盐)处理的Septin 9 DNA有义链和反义链的序列，其对应于SEQ ID NO：2(即，其中CpG二核苷酸是甲基化的)，如表1所示。SEQ ID NO：12和13分别是经化学(重亚硫酸盐)处理的Septin 9 DNA有义链和反义链的序列，其对应于SEQ ID NO：2(即，其中CpG二核苷酸是非甲基化的)，如表1所示。SEQ ID NO：8和9分别是经化学(重亚硫酸盐)处理的Q9HC74DNA有义链和反义链的序列，其对应于SEQ ID NO：3(即，其中CpG二核苷酸是甲基化的)的序列，如表1所示。SEQ ID NO：14和15分别是经化学(重亚硫酸盐)处理的Septin 9 DNA有义链和反义链的序列，其对应于SEQ ID NO：3(即，其中CpG二核苷酸是非甲基化的)的序列，如表1所示。Septin9以及这些变体也描述于以下中：公开的美国专利申请No：US-2009-0075260，授权为美国专利No：7,951,563；公开的美国专利申请No：2006-0286576，授权为美国专利No：7,749,702；以及公开的美国专利申请No：US-2011-0039719，其因涉及SEPTIN9基因描述和基因信息并入本文。与Septin9基因相关的其它序列描述于本文的实施例和描述中。

在某些实施方案中，在癌症中是甲基化的但在非癌组织中是非甲基化的基因或生物标志物是RASSF2A(SEQ ID NO：16)。RASSF2基因位于染色体位20p13，并且编码多种mRNA转录物同工型。Ras蛋白家族的成员与癌症相关，RASSF2与K-Ras相结合，RASSF2的表达与受控细胞生长相关。表达丧失导致不受抑制的细胞增殖，因此RASSF2是肿瘤抑制因子(Vos等.J.Biol.Chem.，第278期，第30卷，28045-28051，2003年6月25日)。RASSF2基因在基因启动子中包含CpG密集区，跨越第一个2-非编码外显子。该区已被表征为共甲基化，此外，其甲基化与胃和结肠癌的发展相关。Hesson等(Oncogene.2005年6月.2；24(24)：3987-94.)通过结肠癌细胞系的COBRA分析和重亚硫酸盐测序将CpG岛表征为是共甲基化的。此外，他们通过MSP分析证实，21/30(70％)的所分析结肠癌细胞系在RASSF2A启动子区是甲基化的。其它研究表明，RASSF2甲基化可能与胃癌(Endoh等Br J.Cancer.2005年12月12日；93(12)：1395-9)及鼻咽癌(Zhang等Int J.Cancer.2007年1月1日；120(1)：32-8)相关。SEQ ID NO：16提供RASSF2A的序列。SEQ ID NO：17和18分别是经化学(重亚硫酸盐)处理的RASSF2A DNA有义链和反义链的序列，其对应于SEQ ID NO：16(即，其中CpG二核苷酸是甲基化的)，如表1所示。SEQ ID NO：19和20分别是经化学(重亚硫酸盐)处理的RASSF2A DNA有义链和反义链的序列，其对应于SEQ ID NO：16(即，其中CpG二核苷酸是非甲基化的)的序列，如表1所示。其基因组全基因序列示于SEQ ID NO：16中，其描述于公开的美国专利申请No：US-2010-0092953中，其因涉及RASSF2A基因描述和序列信息而并入本文。

使用本发明的方法，I期或II期对象的治疗后样品中定量地、部分定量地、定性地、部分定性地或部分定量地且部分定性地确定的基因或生物标志物的存在指示不良预后或需要更有侵袭性的癌症治疗。

使用本发明的方法，III期对象的治疗后样品中相等或较高水平的基因或生物标志物指示需要使用本发明所述的方法持续进行监测以观察是否有基因或生物标志物的水平提高的趋势。

本发明的方法不仅提供对治疗后样品中基因或生物标志物的水平变化的检测，还提供对对象的治疗应答或非治疗功效(efficacy 0f non-treatment)的持续监测或监视，并且可用于确定癌症或肿瘤是否去除或复发。

DNA的重亚硫酸盐修饰是本领域公知的用于评定CpG甲基化状态的工具。最常用于分析DNA的5-甲基胞嘧啶之存在的方法基于重亚硫酸盐与胞嘧啶的反应，由此在碱水解之后，胞嘧啶转变为尿嘧啶(其对应于碱基配对行为中的胸腺嘧啶)。但是，显著地，5-甲基胞嘧啶在这些条件下仍然未被修饰。因此，原始DNA以这样的方式转变：最初无法通过其杂交行为与胞嘧啶区分开的甲基胞嘧啶现在可以使用标准的本领域公知的分子生物学技术(例如，通过扩增和杂交，或者通过测序)作为仅存的胞嘧啶而被检测。所有这些技术均基于不同的碱基配对性质，其现在可以被完全开发。

Rein，T.等，Nucleic Acids Res.，26：2255，1998提供了用于检测5-甲基胞嘧啶之本领域公知方法的综述。

重亚硫酸盐技术，除了少许例外之外(例如，Zeschnigk M，et al.，Eur J HumGenet.5：94-98，1997)，目前只用在研究中。一般来说，在重亚硫酸盐处理之后扩增已知基因的短的特异性片段，完全测序(Olek & Walter，Nat Genet.1997 17：275-6，1997)，经历一个或更多个引物延伸反应(Gonzalgo & Jones，Nucleic Acids Res.，25：2529-31，1997；WO 95/00669；美国专利No.6,251,594)以分析各个胞嘧啶位，或者通过酶促消化处理(Xiong & Laird，Nucleic Acids Res.，25：2532-4，1997)。在本领域中还描述了通过杂交检测(Olek等，WO 99/28498)。此外，使用重亚硫酸盐技术来对各个基因进行甲基化检测已有描述(Grigg & Clark，Bioessays，16：431-6，1994；Zeschnigk M等，Hum Mol Genet.，6：387-95，1997；Feil R等，Nucleic Acids Res.，22：695-，1994；Martin V等，Gene，157：261-4，1995；WO 9746705以及WO 9515373)。

本发明提供了重亚硫酸盐技术与一种或更多种甲基化测定组合在确定基因组序列中的CpG二核苷酸序列之甲基化状态中的用途。基因组CpG二核苷酸可以是甲基化或非甲基化的(或者分别称为上-甲基化(up-methylated)或下-甲基化(down-methylated))。但是，本发明的方法适于分析生物样品的异质性质，例如血液或精液背景中低浓度的肿瘤细胞。因此，当分析这样的样品中的CpG位点处的甲基化状态时，本领域技术人员可以使用定量测量来确定与甲基化状态相对的特定CpG位点处的甲基化水平(例如，百分比、百分数、比率、比例或程度)。因此，术语甲基化状态或甲基化状况还应理解为意指反映CpG位点处的甲基化程度的值。除非另有指明，否则术语“高甲基化”或“上甲基化”应理解为甲基化水平高于特定截断点，其中所述截断可以是表示给定群体的平均或中值甲基化水平的值，或者优选为最佳截断水平。“截断”在本文中还指“阈值”。在本发明的上下文中，术语“甲基化”、“高甲基化”或“上甲基化”应理解为对于在癌症中是甲基化的但在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列中或者与之相关(例如，在启动子或调节区)的所有CpG位点而言，包括高于零(0)％截断的甲基化水平(或其等同形式)。

根据本发明，基因组序列中CpG二核苷酸序列的甲基化状态的确定在确定患癌症对象的预后中有用。

甲基化测定方法。多种甲基化测定方法在本领域中是已知的，并且可以与本发明联合使用。这些测定允许DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸(例如，CpG岛)的甲基化状态的确定。这样的测定涉及经重亚硫酸盐处理的DNA的DNA测序、PCR(用于序列特异性扩增)、Southern印迹分析以及使用甲基化敏感性限制酶等等。

例如，已通过使用重亚硫酸盐处理(Frommer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1827-1831，1992)针对DNA甲基化模式和5-甲基胞嘧啶分布的分析简化了基因组测序。此外，使用从重亚硫酸盐转变的DNA扩增的PCR产物的限制酶消化，例如，Sadri & Hornsby(Nucl.Acids Res.24：5058-5059，1996)或COBRA(联合重亚硫酸盐限制分析，CombinedBisulfite Restriction Analysis)(Xiong & Laird，Nucleic Acids Res.25：2532-2534，1997)所述的方法。

COBRA.COBRA^TM分析是可用于确定少量基因组DNA中特定基因座处的DNA甲基化水平的甲基化定量测定(Xiong & Laird，Nucleic Acids Res.25：2532-2534，1997)。简单来说，使用限制酶消化来披露经亚硫酸氢钠处理之DNA的PCR产物中的甲基化依赖性序列差异。首先根据Frommer等(Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89：1827-1831，1992)所述的方法通过标准重亚硫酸盐处理将甲基化依赖性序列差异引入基因组DNA中。然后使用对目的CpG岛具有特异性的引物进行重亚硫酸盐转变的DNA的PCR扩增，接着进行限制性内切酶消化、凝胶电泳以及使用特异性带标记的杂交探针进行检测。初始DNA样品的甲基化水平由在广泛的DNA甲基化水平中以线性定量形式消化和未消化的PCR产物的相对量来表示。此外，该技术可以可靠地应用于获自显微切片的石蜡包埋组织样品的DNA。

用于COBRA^TM分析的典型试剂(例如，可能见于典型的基于COBRA^TM的试剂盒中)可以包括但不限于：特定基因(或经重亚硫酸盐处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物；限制酶和合适的缓冲液；基因杂交寡核苷酸；控制杂交寡核苷酸；寡核苷酸探针的激酶标记试剂盒；以及带标记的核苷酸。此外，重亚硫酸盐转变剂可以包括：DNA变性缓冲液；磺化缓冲液；DNA回收剂或试剂盒(例如，沉淀、超滤、亲和柱)；去磺化缓冲液以及DNA回收组分。

优选地，测定例如“MethyLight^TM”(基于荧光的实时PCR技术)(Eads等，CancerRes.59：2302-2306，1999)、Ms-SNuPE^TM(甲基化敏感性单寡核苷酸引物延伸)反应(Gonzalgo& Jones，Nucleic Acids Res.25：2529-2531，1997)、甲基化特异性PCR(“MSP”；Herman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9821-9826，1996；美国专利No.5,786,146)以及甲基化CpG岛扩增(“MCA”；Toyota等，Cancer Res.59：2307-12，1999)单独使用或者与这些其它方法联合使用。

“HeavyMethyl^TM”测定技术是基于经重亚硫酸盐处理的DNA的甲基化特异性扩增评估甲基化差异的定量方法。覆盖扩增引物之间的或者由扩增引物所覆盖的CpG位点的甲基化特异性阻断探针(在本文中也称为阻断剂(blocker))使得实现核酸样品的甲基化特异性选择性扩增。

在本文实施的其实施方案中，术语“HeavyMethyl^TM MethyLight^TM”测定是指HeavyMethyl^TM MethyLight^TM测定，其为MethyLight^TM测定的变化形式，其中MethyLight^TM测定与覆盖扩增引物之间的CpG位置的甲基化特异性阻断探针联合。HeavyMethyl^TM测定也可以与甲基化特异性扩增引物联合使用。

用于HeavyMethyl^TM分析的典型试剂(例如，如可在典型的基于MethyLight^TM的试剂盒中发现的)可包括但不限于：用于特异性基因(或经重亚硫酸盐处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物、阻断寡核苷酸、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸、以及Taq聚合酶。

MSP.MSP(甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR))允许评价CpG岛内几乎任一组CpG位点的甲基化状态，而不依赖于使用甲基化敏感性限制酶(Herman等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9821-9826，1996；美国专利No.5,786,146)。简言之，通过重亚硫酸钠将所有非甲基化胞嘧啶(而非甲基化胞嘧啶)转变为尿嘧啶来修饰DNA，并随后使用针对甲基化DNA特异性的引物以及针对非甲基化DNA特异性的引物进行扩增。MSP仅需要少量的DNA，MSP对给定CpG岛基因座的0.1％甲基化等位基因敏感，并且可针对提取自石蜡包埋样品的DNA进行。用于MSP分析的典型试剂(例如，如可在典型的基于MSP的试剂盒中发现的)可包括但不限于：针对特异性基因(或经重亚硫酸盐处理的DNA序列或CpG岛)的甲基化和非甲基化PCR引物、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸、以及特异性探针。

MethyLight^TM.MethyLight^TM测定是高通量的定量甲基化测定，其利用在PCR步骤之后不需要进一步操作的基于荧光的实时PCR(TaqMan^TM)技术(Eads等.，Cancer Res.59：2302-2306，1999)。简言之，MethyLight^TM过程开始于基因组DNA的混合样品，其根据标准方法(重亚硫酸盐过程将非甲基化的胞嘧啶残基转变为尿嘧啶)在重亚硫酸钠反应中转变为甲基化依赖性序列差异的混合合并物。然后在“偏倚”(其中PCR引物与已知的CpG二核苷酸重叠)反应中进行基于荧光的PCR。序列区分可发生在扩增过程的水平和荧光检测过程的水平两种水平上。

MethyLight^TM测定可用作基因组DNA样品中甲基化模式的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交的水平上。在这种定量版本中，PCR反应提供了在与特定的推定甲基化位点重叠的荧光探针存在下的甲基化特异性扩增。通过其中引物和探针二者都不与任何CpG二核苷酸重叠的反应来提供输入DNA量的无偏倚对照。或者，通过用不“覆盖”已知甲基化位点的对照寡核苷酸(HeavyMethyl^TM和MSP技术的基于荧光的版本)或覆盖潜在甲基化位点的寡核苷酸探测偏倚PCR合并物来实现基因组甲基化的定量测试。

MethyLight^TM过程可与任意合适的探针(例如， 等)一起使用。例如，用重亚硫酸钠处理双链基因组DNA并使用探针(例如，具有MSP引物和/或HeavyMethyl阻断物寡核苷酸和探针)使其经历两组PCR反应中的一组。用荧光“报道物”和“淬灭剂”分子双标记探针，并且被设计成对相对高GC含量的区域具有特异性，使得其在PCR循环中在比正向引物或反向引物高约10℃的温度下解链。这允许探针在PCR退火/延伸步骤期间保持完全杂交。因为Taq聚合酶在PCR期间酶促合成了新链，所以其最终将实现退火的探针。然后Taq聚合酶5’至3’内切核酸酶活性将通过消化探针来移除探针，从而释放荧光报道物分子以使用实时荧光检测系统定量检测其现在未淬灭的信号。

用于MethyLight^TM分析的典型试剂(例如，如可在典型的基于MethyLight^TM的试剂盒中发现的)可包括但不限于：用于特异性基因(或经重亚硫酸盐处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物、或探针、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸、以及Taq聚合酶。

QM^TM(定量甲基化)测定是用于基因组DNA样品中甲基化模式的一种替代性定量测试，其中序列区分发生在探针杂交的水平上。在这种定量版本中，PCR反应提供了在与特定的推定甲基化位点重叠的荧光探针存在下的无偏倚扩增。通过其中引物和探针二者都不与任何CpG二核苷酸重叠的反应来提供输入DNA量的无偏倚对照。或者，通过用不“覆盖”已知甲基化位点的对照寡核苷酸(HeavyMethyl^TM和MSP技术的基于荧光的版本)或覆盖潜在甲基化位点的寡核苷酸探测偏倚PCR合并物来实现基因组甲基化的定量测试。

QM^TM方法可与任意合适的探针(例如，等)一起用于扩增过程中。例如，用重亚硫酸钠处理双链基因组DNA并使其经历无偏倚引物和探针。用荧光“报道物”和“淬灭剂”分子双标记探针，并且被设计成对相对高GC含量的区域具有特异性，使得其在PCR循环中在比正向引物或反向引物高约10℃的温度下解链。这允许探针在PCR退火/延伸步骤期间保持完全杂交。因为Taq聚合酶在PCR期间酶促合成了新链，所以其最终将实现退火的探针。然后Taq聚合酶5’至3’内切核酸酶活性将通过消化探针来除去探针，从而释放荧光报道基因分子以使用实时荧光检测系统定量检测其现在未淬灭的信号。

用于QM^TM分析的典型试剂(例如，如可在典型的基于QM^TM的试剂盒中发现的)可包括但不限于：用于特异性基因(或经重亚硫酸盐处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物、或探针、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸、以及Taq聚合酶。

Ms-SNuPE.Ms-SNuPE^TM技术是用于评估特异性CpG位点上的甲基化差异的定量方法，其基于重亚硫酸盐处理DNA，然后进行单核苷酸引物延伸(Gonzalgo & Jones，NucleicAcids Res.25：2529-2531，1997)。简言之，使基因组DNA与重亚硫酸钠反应以将非甲基化胞嘧啶转变为尿嘧啶，而不改变5-甲基胞嘧啶。然后使用特异于经重亚硫酸盐转变的DNA的PCR引物进行期望靶序列的扩增，分离所得产物并用作在目的CpG位点上进行甲基化分析的模板。可分析少量的DNA(例如，显微切片的病理学切片)，并且其避免了使用限制酶来确定CpG位点上的甲基化状态。

用于Ms-SNuPE^TM分析的典型试剂(例如，如可在典型的基于Ms-SNuPE^TM的试剂盒中发现的)可包括但不限于：用于特异性基因(或经重亚硫酸盐处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸、凝胶提取试剂盒、阳性对照引物、用于特异性基因的Ms-SNuPE^TM引物、反应缓冲液(用于Ms-SNuPE反应的反应缓冲液)以及带标记核苷酸。另外，重亚硫酸盐转变试剂可包括：DNA变性缓冲液、磺化缓冲液、DNA回收试剂或试剂盒(例如，沉淀、超滤、亲和柱)、去磺化缓冲液和DNA回收组分。

用于检测在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的生物标志物作为血液中癌症/肿瘤的预后指示的新用途。

在一个方面中，本发明的方法包括以下步骤：i)确定在癌症组织中甲基化而在非癌症组织中非甲基化的至少一种基因或基因组序列的甲基化和/或表达；以及ii)确定患癌症对象的预后。在一个实施方案中，在身体组织或血液中进行所述步骤。在一个实施方案中，所述基因是SEPTIN9(SEQ ID NO：1至15，以及如本文所述的其他序列)，其基因组序列在非癌组织中是非甲基化而在癌组织中是甲基化的。在另一个实施方案中，所述基因是RASSF2A(SEQ ID NO：16至20，以及如本文所述的其他序列)，其基因组序列在非癌组织中是非甲基化而在癌组织中是甲基化的。

本发明的方法可通过由其转录之RNA的表达或由所述RNA翻译的多肽或蛋白质的任意分析，优选地通过mRNA表达分析或多肽表达分析来实现。但是，在本发明的一个最优选的实施方案中，确定患癌症对象的预后可通过分析至少一种基因或基因组序列和/或所述基因组序列的启动子或调节元件的甲基化状态来实现，所述基因组序列在非癌组织中是非甲基化而在癌组织中是甲基化的。在另一些实施方案中，本发明还提供了预后测定和方法，其既定量也定性地检测对象中一种或更多种所述基因的表达并且由其确定所述对象中患癌症对象的预后。在另一些实施方案中，一种或更多种所述基因的超甲基化和/或低表达与癌症的进展和侵袭性有关。

在一个优选的实施方案中，存在高于3pg/ml的手术之前样品中甲基化Septin9DNA指示癌症的存在。优选地，手术之后的阴性Septin9甲基化信号指示良好的预后(0pg/ml甲基化Septin9)。优选地，手术之后甲基化Septin9的存在高于0至3pg/ml样品指示癌症复发的低风险。优选地，手术之后3至30pg/ml血浆的甲基化Septin9水平指示癌症复发的中等风险。优选地，手术之后高于30pg/ml样品的甲基化Septin9的存在指示高风险或复发。在一个优选的实施方案中，存在高于3pg/ml的手术之前样品中甲基化RASSF2A DNA指示癌症的存在，优选地，手术之后的阴性RASSF2A甲基化信号指示良好的预后(0pg/ml甲基化RASSF2A)。优选地，手术之后甲基化RASSF2A的存在高于0至3pg/ml样品指示癌症复发的低风险。优选地，手术之后3至30pg/ml血浆的甲基化RASSF2A水平指示癌症复发的中等风险。优选地，手术之后甲基化RASSF2A的存在高于30pg/ml样品指示高风险或复发。优选的样品是血液、肿瘤组织和血浆。优选地，所述癌症是结肠直肠癌。

为了检测编码基因或基因组序列的mRNA的存在，从对象中获得样品。样品可以是包含肿瘤细胞物质的任何合适样品。合适的细胞类型包括组织、血液、血浆或血清及其所有可能的组合。优选地，所述样品类型是血液。可处理样品以提取其中所包含的RNA。然后分析从样品中得到的核酸。用于确定基因表达的绝对水平和相对水平的许多技术在现有技术水平下是已知的，适用于本发明的常用技术包括原位杂交(例如，FISH)，Northern分析、RNase保护测定(RPA)、微阵列和基于PCR的技术(例如定量PCR和差异显示PCR)或任何其他的核酸检测方法。可使用逆转录/聚合链反应技术(RT-PCR)。RT-PCR的方法在本领域是公知的(例如，参见Watson和Fleming，见上)。

可如下进行RT-PCR方法。通过例如标准异硫氰酸胍方法分离总细胞RNA并对总RNA进行逆转录。逆转录方法包括使用逆转录酶和3’端寡核苷酸dT引物和/或随机六聚体引物在RNA的模板上合成DNA。然后通过PCR扩增由此产生的cDNA。(Belyavsky等，Nucl AcidRes17：2919-2932，1989；Krug和Berger，Methods in EnzymologY，Academic Press，N.Y.，Vol.152，第316-325页，1987，其通过引入并入本文)。更优选的是RT-PCR的“实时”变体，其中通过杂交探针(例如，TaqMan、LightCycler、Molecular Beacons & Scorpion)或SYBRgreen来检测PCR产物。然后通过参照标准曲线或者通过将Ct值与校准标准品的值进行比较来定量由探针或SYBR green检测的信号。管家基因的分析常用于归一化结果。

在Northern印迹分析中，总mRNA或聚(A)+mRNA在变性琼脂糖凝胶上运行，并通过在其自身的干燥凝胶中或在膜上与带标记探针杂交来检测。所得信号与RNA群体中的靶RNA量成比例。

比较来自两个或更多个细胞群体或组织的信号揭示了基因表达水平中的相对差异。绝对定量可通过比较信号与标准曲线来进行，所述标准曲线使用已知量的对应于靶RNA的体外转录物生成。管家基因(无论条件如何其表达水平都期望保持相对恒定的基因)的分析常用于归一化结果，消除了由RNA不等地转移至膜或RNA不等地负载在凝胶上所造成的任何表观差异。

Northern分析中的第一步是从目的细胞或组织中分离纯的完整RNA。因为Northern印迹通过大小区分RNA，所以样品完整性影响信号定位在单一条带中的程度。部分降解的RNA样品将导致信号变模糊或分布在几个条带中，导致灵敏度的总损失并且可能导致数据的错误解释。在Northern印迹分析中，可使用DNA、RNA和寡核苷酸探针并且这些探针优选是带标记的(例如，放射性标记、质量标记或荧光标记)。因为靶RNA大小而不是探针的大小将决定所检测条带的大小，所以方法例如随机引发标记(random-primed labelling)(产生可变长度的探针)适合于探针合成。因为探针的特异性活性将决定灵敏度的水平，所以优选使用具有高特异性活性的探针。

在RNase保护测定中，使RNA靶标与限定长度的RNA探针在溶液中杂交。杂交之后，用单链核酸特异性RNase消化RNA以移除任何未杂交的单链靶RNA和探针。使RNase失活，然后例如通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离RNA。完整RNA探针的量与RNA群体中靶RNA的量成比例。RPA可用于相对地和绝对地定量基因表达，并且也可用于对RNA结构作图，例如内含子/外显子边界和转录起始位点。RNase保护测定优于Northern印迹分析，原因是其一般具有较低的检测限。

用于RPA的反义RNA通过体外转录具有限定端点的DNA模板生成并且通常在50至600个核苷酸的范围中。使用包含与靶RNA不同源的额外序列的RNA探针使得能够区分所保护片段与全长探针。通常使用RNA探针代替DNA探针，原因是其容易生成单链RNA探针以及用RNase进行RNA：RNA双重消化的重现性和可靠性(Ausubel等.2003)，特别优选的是具有高特异性活性的探针。

特别优选的是使用微阵列。微阵列分析过程可分为两个主要部分。第一个部分是将已知基因序列固定到载玻片或其他固体支持物上，然后使带荧光标记的cDNA(包含待询问序列)与固定在载玻片(或其他固定相)上的已知基因杂交。杂交之后，使用荧光微阵列扫描仪扫描阵列。分析不同基因的相对荧光强度提供了基因表达差异的度量。

可通过将预先合成的寡核苷酸固定在制备的载玻片或其他固体表面上生成DNA阵列。在这种情况下，使用标准寡核苷酸合成和纯化方法制造并制备了代表性基因序列。这些合成的基因序列与至少一种基因的RNA转录物互补，所述至少一种基因在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化并且通常是在25至70个核苷酸范围中的较短序列。或者，可在载片表面上原位化学合成固定的寡核苷酸。原位寡核苷酸合成包括将适当核苷酸连续添加到微阵列上的斑点中；在过程的每个阶段中使用物理或虚拟掩蔽物保护没有接受核苷酸的斑点。优选地，所述合成核酸是锁核酸(locked nucleic acid)。

在表达谱微阵列实验中，使用的RNA模板是研究中细胞或组织的转录谱的代表。首先从待比较细胞群体或组织中分离RNA。然后将每种RNA样品用作模板以通过逆转录反应生成带荧光标记的cDNA。cDNA的荧光标记可通过直接标记方法或间接标记方法来完成。在直接标记期间，将荧光修饰核苷酸(例如，3-或5-dCTP)在逆转录期间直接结合到cDNA中。或者，可通过以下过程来实现间接标记：在cDNA合成期间结合氨基烯丙基修饰核苷酸，然后在逆转录反应完成之后使N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-酯染料与氨基烯丙基修饰cDNA缀合。或者，探针可以是未标记的，但是可通过与直接或间接标记的配体特异性结合来检测。用于标记配体(和探针)的合适标记和方法在本领域是已知的，并且包括例如可通过已知方法(例如，切口平移或激酶处理(kinasing))结合的放射性标记。另一些合适的标记包括但不限于生物素、荧光基团、化学发光基团(例如，二氧杂环丁烷(dioxetane)，特别是引发的二氧杂环丁烷)、酶、抗体等。

为了进行差异基因表达分析，用标记由不同RNA样品生成的cDNA。纯化所得的带标记cDNA以移除未结合的核苷酸、游离染料和残余RNA。纯化之后，使带标记cDNA样品与微阵列杂交。杂交期间和洗涤步骤期间的多个因素(包括温度、离子强度、时间长度和甲酰胺浓度)决定杂交的严格性。例如在Sambrook等(Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，1989)中概括了这些因素。使用荧光微阵列扫描仪在杂交后扫描微阵列。每个斑点的荧光强度指示所分析基因的表达水平；亮斑对应于强表达基因，并且暗斑指示弱表达。

得到图像后，就必须分析原始数据。首先，必须将背景荧光从每个斑点的荧光中减去。然后将数据归一化至对照序列例如外源添加的核酸(优选RNA或DNA)或管家基因组，以说明任何非特异性杂交、阵列装置中的阵列缺陷或变可变性、cDNA标记、杂交或洗涤。数据归一化允许得到待比较的多个阵列的结果。

本发明的另一个方面涉及用于根据本发明方法确定患癌症对象的预后的试剂盒，所述试剂盒包含：用于测量在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列基因的转录水平的工具。在一个优选实施方案中，所述用于测量转录水平的工具包括这样的寡核苷酸或多核苷酸，其能够在严格条件或中等严格条件下与在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列的转录产物杂交。在一个最优选的实施方案中，转录水平通过选自以下的技术来测定：Northern印迹分析、逆转录酶PCR、实时PCR、RNAse保护和微阵列。在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒还包含用于得到和/或存储对象生物样品的工具。优选这样的试剂盒，其还包含最优选适合于容纳用于测量转录水平的工具和对象生物样品的容器，并且可优选地还包含针对使用和解释试剂盒结果的说明书。

在一个优选的实施方案中，所述试剂盒包含(a)多种寡核苷酸或多核苷酸，其能够在严格条件或中等严格条件下与在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列的转录产物杂交；(b)容器，优选地适合于容纳寡核苷酸或多核苷酸以及对象的包含转录产物的生物样品，其中所述寡核苷酸或多核苷酸可在严格条件或中等严格条件下与转录产物杂交；(c)检测(b)的杂交的工具；以及任选地，(d)针对使用和解释试剂盒结果的说明书。

所述试剂盒还可容纳其他组分，例如包装在单独容器中的杂交缓冲液(其中寡核苷酸待用作探针)。或者，当寡核苷酸待用于扩增靶区域时，所述试剂盒可容纳包装在单独容器中的聚合酶和反应缓冲液，所述缓冲液对于通过所述聚合酶介导的引物延伸(例如PCR)是最优的。优选地，所述聚合酶是逆转录酶。更优选地，所述试剂盒还容纳Rnase试剂。

本发明还提供了用于检测由得自于所述对象之样品中的所述基因序列编码的多肽存在的方法。

在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列编码的多肽的多肽表达异常水平与患癌症对象的预后有关。

根据本发明，所述多肽的低表达与患癌症对象的预后不良有关。

可使用本领域已知的任意方法用于检测多肽。这样的方法包括但不限于质谱测定、免疫扩散、免疫电泳、免疫化学方法、结合剂-配体测定、免疫组织化学技术、凝集和补体测定(例如，参见Basic and Clinical Immunology，Sites和Terr编，Appleton & Lange，Norwalk，Conn.第217-262页，1991，其通过引用并入本文)。优选结合剂-配体免疫测定方法，其包括使抗体与一个或更多个表位反应并且竞争性替换标志物多肽或其衍生物。

本发明的某些实施方案包括使用这样的抗体，其特异性针对由在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列编码的一种或更多种多肽。

这样的抗体可用于确定患癌症对象的预后。在某些实施方案中，可通过使用由在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列之多肽编码的表位作为抗原来诱导产生单克隆或多克隆抗体。这样的抗体可进而用于检测所表达的多肽。这种多肽的存在水平可通过常规方法进行定量。可通过本领域已知的多种方法(例如，用荧光配体或放射性配体进行标记)来检测和定量抗体-多肽结合。本发明还包括用于进行上述方法的试剂盒，其中这样的试剂盒容纳所研究多肽的特异性抗体。

多种竞争性和非竞争性多肽结合免疫测定在本领域是公知的。在这种测定中采用的抗体可以是未标记的(例如，如用于凝集测试的)或标记的(用于各种各样的测定方法)。可使用的标记包括放射性核素、酶、荧光物、化学发光物、酶底物或辅因子、酶抑制剂、颗粒、染料等。优选的测定包括但不限于放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定如酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光免疫测定等。可通过本领域已知的多种方法中的任意一种制备多克隆或单克隆抗体或其表位以用于免疫测定。

在所述方法的一个替代实施方案中，可通过western印迹分析来检测蛋白质。所述分析在本领域中是标准的，简言之，通过电泳例如SDS-PAGE来分离蛋白质。然后将经分离的蛋白质转移至合适的膜(或纸)例如硝基纤维素上，保留通过电泳实现的空间分离。然后将膜与封闭物一起孵育以结合膜上剩余的结合位置，常用的试剂包括通用蛋白质(例如，乳蛋白)。然后添加特异于目的蛋白质的抗体，所述抗体可例如通过染料或酶方法(例如，碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)检测标记。然后检测膜上抗体的位置。

在所述方法的一个替代性实施方案中，可通过免疫组织化学(使用抗体来探测样品中的特定抗原)来检测蛋白质。所述分析在本领域中是标准的，其中在组织中检测抗原称为免疫组织化学，而在培养细胞中检测一般称为免疫细胞化学。简言之，通过与其特异性抗原结合来检测一级抗体。然后通过二级酶缀合抗体来结合抗原-抗体复合物。在必需底物和发色团存在下，在抗体-抗原结合位点上根据着色沉积物来检测结合酶。存在多种的合适样品类型、抗体-抗原亲和力、抗体类型和检测增强方法。因此，对于每个个例来说，必须由本领域技术人员来确定用于免疫组织化学或免疫细胞化学检测的最优条件。

用于制备多肽的抗体的一种途径是选择并制备多肽全部或一部分的氨基酸序列，化学合成氨基酸序列并将其注射到适当动物(通常是兔或小鼠)中(Milstein和KohlerNature 256：495-497，1975；Gulfre and Milstein，Methods in Enzymology：Immunochemical Techniques 73：1-46，Langone和Banatis编，Academic Press，1981，其通过引用整体并入本文)。用于制备多肽或其表位的方法包括但不限于化学合成、重组DNA技术或从生物样品中分离。

在所述方法的最后步骤中，确定对象的预后，其中(mRNA或多肽的)低表达指示患癌症对象的预后。术语低表达应认为是意指检测水平小于预定截止的表达，所述预定截止可选自平均值、中值或优化的阈值。术语过表达应认为是意指检测水平大于预定截止的表达，所述预定截止可选自平均值、中值或优化的阈值。

本发明的另一个方面提供了用于根据本发明方法确定患癌症对象的预后的试剂盒，其包含：用于检测在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列多肽的工具。所述用于检测多肽的工具优选地包括抗体、抗体衍生物或抗体片段。多肽最优选地通过利用带标记抗体的Western印迹来检测。在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒还包含用于得到对象生物样品的工具。优选的是这样的试剂盒，其还包含适合于容纳用于检测对象生物样品中多肽之工具的容器，并且最优选地还包含针对使用和解释试剂盒结果的说明书。在一个优选实施方案中，所述试剂盒包含：(a)用于检测在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列多肽的工具；(b)适合于容纳所述工具和包含多肽的对象生物样品的容器，其中所述工具可与多肽形成复合物；(c)用于检测(b)的复合物的工具；以及任选地，(d)针对使用和解释试剂盒结果的说明书。

所述试剂盒还可容纳封装在单独容器中的其他组分，例如适合于封闭、洗涤或包被的缓冲液或溶液。

甲基化分析

本发明的一些特别的实施方案提供了这样的新应用：能够区分患癌症对象之预后的在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列中甲基化水平和/或模式的分析。

在所述方法的一个实施方案中，通过分析在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列的一个或更多个CpG二核苷酸的甲基化状态来确定患癌症对象的预后。

在本发明的一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：i)使得自于对象的基因组DNA(优选地分离自组织、血液、血浆或血清)与至少一种试剂或一系列试剂相接触，所述试剂区分在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列(包括启动子及其调节元件)内的甲基化CpG二核苷酸与非甲基化CpG二核苷酸；以及ii)确定所述患癌症对象的预后。

优选的是，在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列的所述一个或更多个CpG二核苷酸包含在其各自的基因组靶序列中，如在基因组序列及其互补序列中所提供的。本发明还提供了一种用于通过分析胞嘧啶甲基化确定在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列或者根据对象内所述基因组序列的基因组序列的遗传学和/或表观遗传学参数的方法。所述方法包括使包含得自于所述对象的生物样品中的基因组序列的核酸与至少一种试剂或一系列试剂相接触，其中所述试剂或一系列试剂区分靶核酸内的甲基化CpG二核苷酸与非甲基化CpG二核苷酸。

在一个优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：在第一步中，得到待分析组织的样品。来源可以是任何合适的来源，例如组织、血液、血浆或血清及其任何可能的来源。优选地，所述DNA来源是组织、血液、血浆或血清。

然后从样品中分离基因组DNA。基因组DNA可通过本领域的任何标准方法来分离，包括使用可商购试剂盒。简言之，必须通过酶、化学或机械方法使生物样品中其中封装了目的DNA的细胞膜破坏和裂解。然后，可清除DNA溶液中的蛋白质和其他污染物(例如，通过用蛋白酶K消化)。然后从溶液中回收基因组DNA。这可通过多种方法进行，包括盐析、有机提取或使DNA与固相支持物结合。方法的选择受多种因素影响，包括时间、费用和DNA的需要量。

当样品DNA没有装在膜中时(例如，来自血液样品的循环DNA)，可采用本领域中标准的方法来分离和/或纯化DNA。这样的方法包括使用蛋白质变性试剂，例如离液序列高的盐，例如盐酸胍或尿素；或去污剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)、溴化氰。替代方法包括但不限于借助离心的乙醇沉淀或丙醇沉淀、真空浓缩等等。本领域技术人员也可使用设备例如过滤器设备(例如超滤)、硅胶表面或膜、磁性颗粒、聚苯乙烯材料、聚苯乙烯表面、带正电表面和带正电膜、带电膜、带电表面、带电荷转变的膜、带电荷转变的表面。

一旦提取了核酸，就将基因组双链DNA用于分析，可通过本领域已知的任意方法进行甲基化分析，所述方法包括但不限于甲基化敏感性限制酶分析和化学试剂分析。

化学分析

在所述方法的第二步中，以这样的方式处理基因组DNA样品使得在5’位置非甲基化的胞嘧啶碱基转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为方面不同于胞嘧啶的另一个碱基。在本文中这个理解为‘预处理’或‘处理’。

这可优选地通过用重亚硫酸盐试剂处理来实现。术语“重亚硫酸盐试剂”是指包含重亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐或其组合的试剂，如本文所公开地可用于区分甲基化和非甲基化CpG二核苷酸序列。所述处理的方法在本领域是已知的(例如PCT/EP2004/011715，其通过引用整体并入本文)。优选的是，重亚硫酸盐处理在变性溶剂(例如但不限于正亚烷基二醇，特别是乙二醇二甲醚(DME))存在下或者在二烷或二烷衍生物存在下进行。在一个优选的实施方案中，变性溶剂以在1％至35％(v/v)的浓度使用。还优选的是，重亚硫酸盐反应在清除剂(scavenger)存在下进行，所述清除剂例如但不限于色满衍生物，例如6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-羧酸或三羟基苯酸及其衍生物，例如没食子酸(参见：PCT/EP2004/011715，其通过引用整体并入本文)。重亚硫酸盐转变优选地在30℃至70℃的反应温度下进行，其中在反应期间使温度增加至超过85℃维持短时间段(参见：PCT/EP2004/011715，其通过引用整体并入本文)。经重亚硫酸盐处理的DNA优选地在定量之前进行纯化。这可通过本领域已知的任何方法(例如但不限于超滤)进行，优选地通过Microcon^(TM)柱(由Millipore^(TM)制造)进行。根据改进的制造商方案进行纯化(参见：PCT/EP2004/011715，其通过引用整体并入本文)。

在所述方法的第三步中，使用根据本发明的引物寡核苷酸集合以及扩增酶来扩增经处理DNA的片段。几种DNA区段的扩增可同时在同一个反应容器中进行。通常，使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。优选地，所述扩增产物的长度为100至2,000个碱基对。所述引物寡核苷酸集合包含至少两种寡核苷酸，其序列各自与重亚硫酸盐序列及其互补序列之一的碱基序列至少16个碱基对长的区段反向互补、相同或在严格条件或高度严格条件下杂交。

在所述方法的一个替代实施方案中，可通过使用甲基化特异性引物寡核苷酸来检测在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列内，并且优选检测根据所述基因组序列的核酸序列内预选择的CpG位点的甲基化状态。Herman的美国专利No.6,265,171描述了这种技术(MSP)。将甲基化状态特异性引物用于扩增经重亚硫酸盐处理的DNA允许区分甲基化和非甲基化核酸。MSP引物对包含与经重亚硫酸盐处理的CpG二核苷酸杂交的至少一种引物。因此，所述引物的序列包含至少一个CpG二核苷酸。特异于非甲基化DNA的MSP引物在CpG的C位置的位置上包含“T”。因此，优选地，需要所述序列的碱基序列包含长度为至少9个核苷酸并且与根据重亚硫酸盐序列及其互补序列之一的经处理核酸序列杂交的序列，其中所述寡聚物的碱基序列包含至少一个CpG二核苷酸。所述方法的另一个优选的实施方案包括使用阻断物寡核苷酸(HeavyMethyl^TM测定)。Yu等，BioTechniques 23：714-720，1997描述了这种阻断物寡核苷酸的用途。使阻断探针寡核苷酸与经重亚硫酸盐处理的核酸杂交同时与PCR引物杂交。核酸的PCR扩增在阻断探针的5’位置处结束，使得核酸的扩增在存在阻断探针互补序列时受到抑制。探针可被设计成以甲基化状态特异性方式与经重亚硫酸盐处理的核酸杂交。例如，为了检测非甲基化核酸群体中的甲基化核酸，在所讨论位置处非甲基化的核酸扩增的抑制通过使用在所讨论位置处包含‘CpA'或‘TpA'的阻断探针来进行，这与如果期望抑制甲基化核酸扩增时的‘CpG'相反。

对于使用阻断物寡核苷酸的PCR方法，聚合酶介导扩增的有效破坏需要聚合酶不延长阻断物寡核苷酸。优选地，这通过使用阻断物3’-脱氧寡核苷酸或具有除“游离”羟基之外基团的在3’位置处衍生的寡核苷酸。例如，3'-O-乙酰基寡核苷酸是阻断物分子优选类别的代表。

另外，应排除阻断物寡核苷酸的聚合酶介导分解。优选地，这样的排除包括使用缺少5'-3'外切核酸酶活性的聚合酶，或者使用在其5’末端具有例如硫桥(tioate bridge)使得阻断物分子具有核酸酶抗性的经修饰阻断物寡核苷酸。特别应用可以不需要阻断物的这种5’修饰。例如，如果阻断物结合位点与引物结合位点重叠，从而排除了引物(例如，与过量阻断物)的结合，则将基本上排除阻断物寡核苷酸的降解。这是因为聚合酶不向并且不通过(5’-3’方向)阻断物延伸引物——通常导致杂交阻断物寡核苷酸降解的过程。

出于本发明的目的并且如本文所实施的，一个特别优选的阻断物/PCR实施方案包括使用肽核酸(PNA)寡聚物作为阻断寡核苷酸。这样的PNA阻断物寡聚物是非常合适的，原因是它们既不被聚合酶分解也不被聚合酶延伸。

因此，优选地，需要所述阻断寡核苷酸的碱基序列包含长度为至少9个核苷酸并且与根据重亚硫酸盐序列及其互补序列之一的经处理核酸序列杂交的序列，其中所述寡核苷酸的碱基序列包含至少一个CpG、TpG或CpA二核苷酸。特别优选的是，需要所述阻断寡核苷酸的碱基序列包含长度为至少9个核苷酸并且与根据SEQ ID NO：5、6、9和10及其互补序列之一的经处理核酸序列杂交的序列，其中所述寡核苷酸的碱基序列包含至少一个TpG或CpA二核苷酸。

通过扩增得到的片段可携带可直接或间接检测的标记。优选的是以下形式的标记：荧光标记、放射性核素或具有可在质谱仪中检测的典型质量的可拆分分子片段。当所述标记是质量标记时，优选带标记的扩增产物具有单个正静电荷或负静电荷，使得在质谱仪中更好地检测。检测可通过例如基质辅助激光解吸/离子化质谱法(MALDI)或使用电喷雾质谱法(ESI)进行和观察。

基质辅助激光解吸/离子化质谱法(MALDI-TOF)对于生物分子分析是非常有效的进展(Karas & Hillenkamp，Anal Chem.，60：2299-301，1988)。将分析物包埋在光吸收基质中。通过短激光脉冲使基质蒸发，从而以非片段化方式将分析物分子运输至蒸气相中。通过与基质分子碰撞使分析物离子化。施加的电子将使离子加速进入无场飞行管中。由于其不同的质量，离子以不同速率被加速。较小离子比较大离子更快地到达检测器。MALDI-TOF质谱法特别适合于分析肽和蛋白质。核酸的分析稍微要困难些(Gut & Beck，CurrentInnovations and Future Trends，1：147-57，1995)。关于核酸分析的灵敏度比肽小约100倍，并且随着片段大小增加而不成比例地降低。而且，对于具有带多个负电荷的骨架的核酸，通过基质的离子化过程相当不有效。在MALDI-TOF质谱法中，基质的选择发挥着特别重要的作用。对于肽的解吸，已发现了几种非常有效的基质，其产生非常细的结晶。虽然现在有几种用于DNA的响应性基质，但是，肽与核酸之间的灵敏度差异仍没有降低。但是，可通过化学修饰DNA降低灵敏度的这种差异，以这样的方式使得其变得与肽更加类似。例如，可使用简单的烷基化化学将其中骨架通常的磷酸酯被替换为硫代磷酸酯的硫代磷酸酯核酸转变为带电的中性DNA(Gut & Beck，Nucleic Acids Res.23：1367-73，1995)。电荷标签与这种经修饰DNA的偶联导致了MALDI-TOF灵敏度增加至与对于肽所发现的相同的水平。电荷标记的另一个优点是分析针对杂质的稳定性提高，杂质使得对未修饰底物的检测要困难得多。

在所述方法的第四步中，对所述方法第三步期间得到的扩增产物进行分析以确定处理之前CpG二核苷酸的甲基化状态。

在其中通过MSP扩增得到扩增产物的一些实施方案中，根据所述引物的碱基序列，扩增产物的存在、不存在或类别本身指示由所述引物覆盖的CpG位点的甲基化状态。

可通过基于基础的方法(例如但不限于阵列技术和基于探针的技术)以及通过例如测序和模板定向延伸的技术对通过标准PCR和甲基化特异性PCR二者得到的扩增产物进行分析。

在所述方法的一个实施方案中，随后使在第三步中合成的扩增产物与寡核苷酸和/或PNA探针的阵列或集合杂交。在这种背景下，杂交以以下方式发生：杂交期间使用的探针集合优选地由至少2种寡核苷酸或PNA-寡聚物构成；在该过程中，扩增产物充当与之前与固相键合的寡核苷酸杂交的探针；随后移除未杂交片段；所述寡核苷酸包含长度为至少9个核苷酸的至少一个碱基序列，其与本发明序列表中指明的碱基序列的区段反向互补或相同；以及所述区段包含至少一个CpG、TpG或CpA二核苷酸。杂交核酸的杂交部分通常长度为至少9、15、20、25、30或35个核苷酸。但是，更长的分子具有本发明的用途，并因此在本发明的范围中。

在一个优选的实施方案中，所述二核苷酸存在于寡聚物的中间三分之一处。例如，当寡聚物包含一个CpG二核苷酸时，所述二核苷酸优选为自13-mer的5’末端起第五个至第九个核苷酸。存在一个寡核苷酸用于分析选自所述基因组序列的序列中以及重亚硫酸盐序列中等同位置处的每个CpG二核苷酸。所述寡核苷酸也可以以肽核酸的形式存在。然后移除未杂交的扩增产物。然后检测杂交的扩增产物。在该背景下，优选与扩增产物连接的标记在固相中寡核苷酸序列所处的每个位置处是可检测的。

在所述方法的又一个实施方案中，可通过寡核苷酸探针(如以上详细描述的)确定CpG位点的基因组甲基化状态，所述寡核苷酸探针与经重亚硫酸盐处理的DNA杂交同时与PCR扩增引物杂交(其中所述引物可以是甲基化特异性的或标准的)。

所述方法的一个特别优选的实施方案是使用基于荧光的实时定量PCR(Heid等，Genome Res.6：986-994，1996；还参见美国No.6,331,393)，其采用双标记荧光寡核苷酸探针(TaqMan^TM PCR，其使用ABI Prism7700 Sequence Detection System，Perkin ElmerApplied Biosystems，Foster City，California)。TaqMan^TM PCR反应采用不可延伸的询问寡核苷酸，称为TaqMan^TM探针，在一些优选的实施方案中，其被设计成与位于正向与反向扩增引物之间富含CpG的序列杂交。TaqMan^TM探针还包含与TaqMan^TM寡核苷酸的核苷酸连接的接头部分(例如，亚磷酰胺)共价结合的荧光“报道基因部分”和“淬灭剂部分”。为了在重亚磷酸盐处理后分析核酸内的甲基化，需要探针是甲基化特异性的，如美国专利No.6,331,393所述(其通过引用整体并入本文)，也称为MethyLightTM^TM测定。也适用于所描发明的TaqMan^TM检测方法的变体包括使用双探针技术(LightCycler^TM)或荧光扩增引物(Sunrise^TM技术)。这两种技术可在某种程度上调整成适用于经重亚硫酸盐处理的DNA，而且适用于CpG二核苷酸内的甲基化分析。

在所述方法的另一个优选实施方案中，所述方法的第四步包括使用模板引导的寡核苷酸延伸，例如Gonzalgo & Jones，Nucleic Acids Res.25：2529-2531，1997所述的MS-SNuPE。

在所述方法的又一个实施方案中，所述方法的第四步包括对在所述方法第三步期间生成的扩增产物进行测序并随后进行序列分析(Sanger E，等，Proc Natl Acad Sci USA74：5463-5467，1977)。

在所述方法的一个实施方案中，根据以上所述方法的前三步分离并处理基因组核酸，即：

a)从对象中得到具有对象基因组DNA的生物样品；

b)提取或以其他方式分离基因组DNA；

c)用一种或更多种试剂处理b)的基因组DNA或其片段，以将在其5-位非甲基化的胞嘧啶碱基转变为尿嘧啶或在杂交性质方面可检测地不同于胞嘧啶的另一种碱基；以及其中

d)在c)的处理之后以甲基化特异性方式(即通过使用甲基化特异性引物或阻断寡核苷酸)进行扩增；以及另外，其中

e)如上所述通过实时检测探针进行扩增产物的检测；以及

f)确定对象的预后2；

g)优选地，当如上所述通过甲基化特异性引物进行d)的后续扩增时，所述甲基化特异性序列包含长度为至少9个、至少6个、至少25个或至少50个核苷酸的序列，其与根据重亚硫酸盐序列及其互补序列之一的经处理核酸序列杂交，其中所述寡聚物的碱基序列包含至少一个CpG二核苷酸。

所述方法的步骤e)，即如上所述通过实时检测方法进行特异性扩增产物的检测，所述扩增产物指示根据基因组序列的一个或更多个CpG位点的甲基化状态。

甲基化敏感性限制酶分析

在本发明的一个替代实施方案中，以上所述的第二步可通过甲基化敏感性或甲基化特异性限制酶分析进行。方法在本领域是已知的，其中甲基化敏感性限制酶试剂或包含甲基化敏感性限制酶试剂的一系列限制酶试剂用于确定甲基化，所述甲基化敏感性限制酶试剂区分靶区域中的甲基化CpG二核苷酸和非甲基化CpG二核苷酸，所述试剂例如但不限于DMH。

在一个优选的实施方案中，可在用甲基化敏感性限制酶处理之前切割DNA。这样的方法在本领域是已知的并且可包括物理方法和酶促方法两种。特别优选的是使用一种或多种非甲基化敏感性并且其识别序列富含AT而不包含CG二核苷酸的限制酶。使用这样的酶能够保留DNA中的CpG岛和富含CpG的区域。非甲基化特异性限制酶优选地选自MseI、BfaI、Csp6I、Tru1I、Tvu1I、Tru9I、Tvu9I、MaeI和XspI。特别优选的是使用两种或三种这样的酶。特别优选的是使用MseI、BfaI和Csp6I的组合。

然后使片段化DNA与适配体寡核苷酸连接以便于后续的酶扩增。寡核苷酸与平末端和粘末端的DNA片段的连接在本领域是已知的，并且通过使末端脱磷酸(例如使用牛和虾碱性磷酸酶)并随后在dATP存在下使用连接酶(例如，T4DNA连接酶)连接来进行。适配体寡核苷酸通常长度为至少18个碱基对。

在第三步中，然后用一种或更多种甲基化敏感性限制酶消化DNA(或其片段)。进行消化使得限制位点上DNA的水解提供了在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列的特异性CpG二核苷酸甲基化状态的信息。

优选地，甲基化特异性限制酶选自Bsi E1、Hga I HinP1、Hpy99I、Ava I、Bce AI、Bsa HI、BisI、BstUI、BshI236I、AccII、BstFNI、McrBC、GlaI、MvnI、HpaII(HapII)、HhaI、AciI、SmaI、HinP1I、HpyCH4IV、EagI和以上酶的两种或更多种的混合物。优选的是包含限制酶BstUI、HpaII、HpyCH4IV和HinP1I的混合物。

在第四步中，其是任选的但是是一个优选的实施方案，对限制片段进行扩增。其优选使用聚合酶链式反应进行，并且所述扩增产物可携带如上所讨论的合适的可检测标记，即荧光标记、放射性核素和质量标记。特别优选的是通过扩增酶和至少两种引物来扩增，所述至少两种引物在每种情况下均包含长度为至少16个核苷酸的与选自所述基因组序列的序列及其互补序列的序列互补或在中等严格条件或严格条件下杂交的连续序列。优选地，所述连续序列的长度为至少16、20或25个核苷酸。在一个替代实施方案中，所述引物可与与所述片段连接的任何适配体互补。

在第五步中检测扩增产物。检测可通过本领域中标准的任意方法来进行，例如但不限于凝胶电泳分析、杂交分析、将可检测标签引入到PCR产物中、DNA阵列分析、MALDI或ESI分析。优选地，所述检测通过与至少一种核酸或肽核酸杂交来进行，所述至少一种核酸或肽核酸在每种情况下均包含长度为至少16个核苷酸的与选自所述基因组序列及其互补序列的序列互补或在中等严格条件或严格条件下杂交的连续序列。优选地，所述连续序列的长度为至少16、20或25个核苷酸。

在确定所述基因组核酸的甲基化状态或水平之后，基于在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一个CpG二核苷酸序列的甲基化状态或水平，或者反映甲基化与患癌症对象之预后有关的基因组序列中多个CpG二核苷酸的平均甲基化状态的值或平均值，，来推断患癌症对象的预后。当通过定量方法来确定所述甲基化时，用于确定所述甲基化存在的截止点优选为零(即，当样品表现出任何程度的甲基化时，确定为在所分析CpG位点上具有甲基化状态)。但是，应预见到，本领域技术人员可希望调整所述截止值以提供特别优选的灵敏度或特异性的测定。因此，可增加所述截止值(由此增加特异性)，所述截止值可在选自0％至5％、5％至10％、10％至15％、15％至20％、20％至30％和30％至50％的范围内。特别优选的是至少0.1％、1％、10％、15％、25％和30％的截止。

本文使用的术语“预后”应视为意指指示预测的疾病进展(包括但不限于侵袭性和转移潜力)和/或预测的患者存活时间。

在本发明的上下文中，术语“侵袭性”用来表示手术后复发的一种或更多种高可能性；低于平均患者存活或低于中值患者存活；低于平均无疾病存活或低于中值无疾病存活；低于平均无复发存活或低于中值无复发存活；高于平均肿瘤相关并发症；肿瘤或转移瘤的快速进展。

除非另有声明，否则本文使用的术语“存活”应认为包括以下的所有：直至死亡的存活，也称为总存活(其中所述死亡可以是不考虑原因的或肿瘤相关的)；“无复发存活”(其中术语复发应包括局部复发和远端复发两者)；无转移存活；无疾病存活(其中术语疾病应包括癌症和与其相关的疾病)。可参考限定的起点(例如，诊断或开始治疗的时间)和终点(例如，死亡、复发或转移)来计算所述存活的长度。

所公开的本发明提供了来源于所述基因组序列的经处理核酸，其中所述处理适合于使基因组DNA序列的至少一个非甲基化胞嘧啶碱基转变为尿嘧啶或在杂交方面可检测地不同于胞嘧啶的另一种碱基，以用于确定患癌症或肿瘤对象的预后。所讨论基因组序列可包含一个或更多个连续的甲基化CpG位点。所述核酸处理优选地包括使用选自重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、焦亚磷酸盐及其组合的试剂。在本发明的一个优选的实施方案中，本发明提供了非天然经修饰核酸，其包含选自重亚硫酸盐序列的，特别是选自如SEQ ID NO：5、7、10至13和18至20所限定序列的，序列长度为至少16个连续核苷酸碱基的序列。在本发明的另一些优选的实施方案中，所述核酸为所述重亚硫酸盐序列中所公开核酸序列的长度为至少50、100、150、200、250或500个碱基对的区段。特别优选的是与重亚硫酸盐序列(但不是基因组序列或其他天然DNA)的全部或一部分相同或互补的核酸分子。

优选的是，所述序列包含至少一个CpG、TpA或CpA二核苷酸及其互补序列。重亚硫酸盐序列的序列提供了根据所述基因组序列之核酸的非天然修饰版本，其中每个基因组序列的修饰导致合成了具有独特的且不同于如下所述基因组序列之序列的核酸。对于每条有义链基因组DNA，公开了四个转变版本。第一个版本，其中“C”转变为“T”但是“CpG”仍然是CpG”(即对应于下述情况：对于基因组序列，CpG二核苷酸序列的所有“C”残基是甲基化的并因此没有转变)；第二个版本公开了所公开基因组DNA序列的互补序列(即，反义链)，其中“C”转变为“T”，但是“CpG”仍然是“CpG”(即对应于下述情况：对于基因组序列，CpG二核苷酸序列的所有“C”残基是甲基化的并因此没有转变)。基因组序列的‘上甲基化(upmethylated)’转变序列对于SEPTIN9对应于SEQ ID NO：4至9，以及对于RASSF2A对应于SEQ ID NO：17和18。提供了每种基因组序列的第三个化学转变版本，其中对于所有的“C”残基(包括“CpG”二核苷酸序列的那些)“C”转变为“T”(即对应于下述情况：对于基因组序列，CpG二核苷酸序列的所有“C”残基是非甲基化的)；每种序列的最后一个化学转变版本公开了所公开基因组DNA序列的互补序列(即，反义链)，其中对于所有的“C”残基(包括“CpG”二核苷酸序列的那些)“C”转变为“T”(即对应于下述情况：对于每种基因组序列的互补序列，CpG二核苷酸序列的所有“C”残基是非甲基化的)。基因组序列的‘下甲基化(downmethylated)’转变序列对于SEPTIN9对应于SEQ ID NO：10至15，以及对于RASSF2A对应于SEQ ID NO：19和20。

显著地，迄今为止，根据重亚硫酸盐序列的核酸序列和分子不参与患癌症对象的预后或不与其相关联。

在一个替代实施方案中，本发明还提供了适用于本发明方法用于检测基因组DNA或经处理(经化学修饰)DNA中的胞嘧啶甲基化状态的寡核苷酸或寡聚物。所述寡核苷酸或寡聚物核酸提供了新的预后方法。所述寡核苷酸或寡聚物包含长度为至少九(9)个核苷酸的核酸序列，其与根据重亚硫酸盐序列和/或其互补序列的经处理核酸序列或者根据所述基因组序列和/或其互补序列的基因组序列相同或在中等严格条件或严格条件(如本文以上所定义的)下杂交。

因此，本发明包括在中等严格和/或严格杂交条件下与序列的所有或一部分或者与其互补序列杂交的核酸分子(例如，寡核苷酸和肽核酸(PNA)分子(PNA-寡聚物))。特别优选的是在中等严格和/或严格杂交条件下与序列重亚硫酸盐序列(而不与基因组序列或其他人基因组DNA)的所有或一部分杂交的核酸分子。

杂交核酸的相同部分或杂交部分通常长度为至少9、16、20、25、30或35个核苷酸。但是，更长的分子可用于本发明，因此其在本发明的范围中。

优选地，本发明杂交核酸的杂交部分与序列或与其一部分或与其互补序列至少95％、或至少98％或100％相同。

可将本文所述类型的杂交核酸用作例如探针(例如，PCR引物)或者预后探针或引物。优选地，寡核苷酸探针与核酸样品的杂交在严格条件下进行并且探针与靶序列100％相同。核酸二聚体或杂交体稳定性表示为解链温度或Tm，其是探针从靶DNA上脱离的温度。该解链温度用于定义所需的严格度条件。

对于与基因组序列的对应序列(例如等位基因变体和SNP)相关并且基本相同(不是相同)的靶序列，首先建立在盐(例如，SSC或SSPE)的特定浓度下仅发生同源杂交的最低温度是有用的。然后，假定1％的错配导致Tm降低1℃，则杂交反应的最终洗涤温度因此降低(例如，如果试图使序列与探针具有＞95％的同一性，则最终洗涤温度降低5℃)。实际上，Tm的变化可在每1％错配0.5℃与1.5℃之间。

如参照本文所述基因组序列和转变序列的多核苷酸位置所指示的，长度X(以核苷酸为单位)的本发明寡核苷酸的实例包括对应于长度X的连续重叠寡核苷酸的集合(有义集合和反义集合)的那些，其中每个连续重叠集合(对应于给定的X值)中的寡核苷酸定义为核苷酸位置中Z个寡核苷酸的有限集合：

n至(n+(X-1))；

其中n＝1、2、3、......(Y-(X-1))；

其中Y等于SEQ ID NO：1至20的长度(核苷酸或碱基对)；

其中X等于集合中每个寡核苷酸的共同长度(以核苷酸为单位)(例如，对于连续重叠20-mer的集合，X＝20)；并且

其中对于长度Y的给定SEQ ID NO：，长度X的连续重叠寡聚物的数目(Z)等于Y-(X-1)。

优选地，所述集合限于包含至少一个CpG、TpG或CpA二核苷酸的那些寡聚物。

本发明20-mer寡核苷酸的实例包括本文所述的寡聚物(及与其互补的反义集合)，其通过参照SEQ ID NO：1至20的多核苷酸位置指示：

1至20、2至21、3至22、4至23、5至24等。

优选地，所述集合限于包含至少一个CpG、TpG或CpA二核苷酸的那些寡聚物。

同样地，本发明25-mer寡核苷酸的实例包括xxx寡聚物的以下集合(及与其互补的反义集合)，其通过参照SEQ ID NO：1至20的多核苷酸位置指示：

1至25、2至26、3至27、4至28、5至29等。

优选地，所述集合限于包含至少一个CpG、TpG或CpA二核苷酸的那些寡聚物。

对于在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的每一种序列(有义和反义)，本发明包括长度为X的寡核苷酸或经修饰寡核苷酸的多个连续重叠集合，其中，例如X＝9、10、17、20、22、23、25、27、30或35个核苷酸。

根据本发明的寡核苷酸或寡聚物构成可用于确定对应于基因组序列的基因组序列的遗传学参数和表观遗传学参数的有效工具。这种寡核苷酸或经修饰寡核苷酸的集合是与在癌症中是甲基化的而在非癌组中中非甲基化的序列(及其互补序列)相对应的寡聚物的那些连续重叠的集合。优选地，所述寡聚物包含至少一个CpG、TpG或CpA二核苷酸。

特别优选的根据本发明的寡核苷酸或寡聚物是其中CpG二核苷酸(或对应的转变TpG或CpA二核苷酸)序列的胞嘧啶在寡核苷酸的中间三分之一中；即，例如当寡核苷酸长度为13个碱基时，CpG、TpG或CpA二核苷酸定位在5’末端的第五个至第九个核苷酸。

本发明的寡核苷酸也可通过使寡核苷酸与一个或更多个部分或缀合物化学连接来修饰，以增强寡核苷酸的活性、稳定性或检测。这样的部分或缀合物包括发色团、荧光团、脂质如胆固醇、胆酸、硫醚、脂肪链、磷脂、聚胺、聚乙二醇(PEG)、棕榈基部分等，如例如美国专利号5,514,758、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,597,696和5,958,773中所公开的。探针也可以以具有特别优选配对性质的PNA(肽核酸)的形式存在。因此，寡核苷酸可包含另一些附加的基团，例如肽，并且可包含杂交引发切割剂(Krol等，Bio Techniques 6：958-976，1988)或螯合剂(Zon，Pharm.Res.5：539-549，1988)。为此目的，应使寡核苷酸与另一种分子缀合，例如发色团、荧光团、肽、杂交引发交联剂、运输剂、杂交引发裂解剂等。

寡核苷酸还可包含至少一个本领域已知的修饰糖和/或基础部分，或者可包含修饰骨架或非天然核苷间连接(internucleoside linkage)。

根据本发明一些特别实施方案的寡核苷酸或寡聚物通常用于‘集合’中，所述集合包含用于分析基因组序列(选自基因组序列及其互补序列)的每一个CpG二核苷酸的至少一个寡聚物，或者分析根据重亚硫酸盐序列及其互补序列中对应的CpG、TpG或CpA二核苷酸的至少一个寡聚物。但是，预期，出于经济或其他因素，分析所述序列中有限选择的CpG二核苷酸可能是优选的，寡核苷酸集合的内容并因此而改变。

因此，在一些特别的实施方案中，本发明提供了可用于检测经处理基因组DNA(重亚硫酸盐序列)中或基因组DNA(基因组序列及其互补序列)中胞嘧啶甲基化状态的至少两(2)种(寡核苷酸和/或PNA-寡聚物)的集合。这些探针能够确定患癌症对象的预后。寡聚物的集合也可用于检测经处理基因组DNA(重亚硫酸盐序列)中或基因组DNA(基因组序列及其互补序列)中的单核苷酸多态性(SNP)。

在一些优选实施方案中，寡核苷酸集合的至少一个并且更优选所有成员与固相结合。

在另一些实施方案中，本发明提供了至少两(2)种寡核苷酸的集合，所述寡核苷酸用作‘引物’寡核苷酸以扩增在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的序列及其互补序列或其区段之一的DNA序列。

预期，寡核苷酸可构成“DNA芯片”或“阵列”(即，与固相结合的不同寡核苷酸和/或PNA-寡聚物的布置)的全部或一部分。这样的不同寡核苷酸和/或PNA-寡聚物序列的阵列的特征可在于，例如，其以矩形或六方晶格的形式布置在固相上。固相表面可由硅酮、玻璃、聚苯乙烯、铝、钢、铁、铜、镍、银或金构成。也可使用硝化纤维以及塑料如尼龙，其可以以小球形式存在或者也可以作为树脂基质。可从Nature Genetics的专刊(Nature GeneticsSupplement，第21卷，1999年1月)中获悉寡聚物阵列制造的现有技术的概述。带荧光标记探针经常用于扫描固定化DNA阵列。Cy3和Cy5染料与特异性探针5'-OH的简单连接特别适合于荧光标记。杂交探针的荧光检测可例如通过共聚焦显微镜来进行。Cy3和Cy5染料(除许多其他的之外)是可商购的。

还预计到寡核苷酸或其特定序列可构成“虚拟阵列”的所有或一部分，其中，将寡核苷酸或其特定序列用作例如‘说明符(specifier)’作为独特带标记探针不同群体的一部分或与其组合，以分析分析物的复杂混合物。例如，US 2003/0013091(2003年1月16日公开的美国序列号09/898,743)描述了这样的方法。在这样的方法中，生成足够的标记使得复杂混合物中的每种核酸(即，每种分析物)可独特地被独特标签结合并因此被检测(对每种标记进行直接计数，导致了混合物中每种分子物类的数字读出)。

特别优选的是，根据本发明的寡聚物用于确定患癌症对象的预后。

试剂盒

而且，本发明的另一个方面是试剂盒，其包含：用于确定在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列甲基化的工具(means)。用于确定在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列甲基化的工具优选地包含含重亚硫酸盐的试剂；一种或多种寡核苷酸，在每种情况下其序列与选自重亚硫酸盐序列之序列的至少9个、至少18个、至少25个或至少50个碱基长的区段相同、互补或在严格条件或高度严格条件下杂交；以及任选的用于进行并评价所述甲基化分析方法的说明书。在一个实施方案中，所述寡核苷酸的碱基序列包含至少一个CpG、CpA或TpG二核苷酸。

在另一个实施方案中，所述试剂盒还可包含用于进行CpG位点特异性甲基化分析的标准试剂，其中所述分析包括以下技术的一种或更多种：MS-SNuPE、MSP、MethyLight^TM、HeavyMethyl、COBRA和核酸测序。但是，按照本发明的试剂盒也可仅容纳上述组分的一部分。

在一个优选实施方案中，所述试剂盒可包含另外的重亚硫酸盐转变试剂，其选自：DNA变性缓冲液、磺化缓冲液、DNA回收试剂或试剂盒(例如，沉淀、超滤、亲和柱)、去磺化缓冲液和DNA回收组分。

在另一个替代实施方案中，所述试剂盒可容纳包装在单独容器中的聚合酶和反应缓冲液，所述反应缓冲液针对由聚合酶介导的引物延伸例如PCR进行了优化。在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒还包含用于得到和/或存储对象生物样品的工具。优选的是这样的试剂盒，其还包含容器，所述容器适合于容纳用于确定对象生物样品中在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列之甲基化的工具，并且最优选地还包含使用说明书和试剂盒结果的解释说明书。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒包含：(a)重亚硫酸盐试剂；(b)适合于容纳所述重亚硫酸盐试剂和对象生物样品的容器；(c)至少一个引物寡核苷酸集合，其包含两种寡核苷酸，在每种情况下所述寡核苷酸的序列与选自重亚硫酸盐序列之序列的至少9个或更优选18个碱基长的区段相同、互补或在严格条件或高度严格条件下杂交；以及任选地(d)使用说明书和试剂盒结果的解释说明书。在一个替代优选实施方案中，所述试剂盒包含：(a)重亚硫酸盐试剂；(b)适合于容纳所述重亚硫酸盐试剂和对象生物样品的容器；(c)长度为至少9或16个核苷酸的至少一种寡核苷酸和/或PNA-寡聚物，其与根据重亚硫酸盐序列及其互补序列之一的预处理核酸序列相同或杂交；以及任选地(d)使用说明书和试剂盒结果的解释说明书。

在一个替代实施方案中，所述试剂盒包含：(a)重亚硫酸盐试剂；(b)适合于容纳所述重亚硫酸盐试剂和对象生物样品的容器；(c)至少一个引物寡核苷酸的集合，其包含两种寡核苷酸，在每种情况下所述寡核苷酸的序列在严格条件或高度严格条件下与选自重亚硫酸盐序列之序列的至少9个或更优选18个碱基长的区段相同、互补或杂交；(d)长度为至少9或16个核苷酸的至少一种寡核苷酸和/或PNA-寡聚物，其与根据重亚硫酸盐序列及其互补序列之一的预处理核酸序列相同或杂交；以及任选地(e)使用说明书和试剂盒结果的解释说明书。

所述试剂盒还可包含包装在单独容器中的其他组分，例如适合于封闭、洗涤或包被的缓冲液或溶液。

本发明的另一个方面涉及用于确定患癌症对象的预后的试剂盒，所述试剂盒包含：用于测量在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列转录水平的工具，以及用于确定在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列甲基化的工具。

用于COBRA^TM分析的典型试剂(例如，如在典型的基于COBRA^TM的试剂盒中发现的)可包括但不限于：用于在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列的PCR引物、限制酶和适当的缓冲液、基因杂交寡聚物、对照杂交寡聚物、用于寡核苷酸探针的激酶标记试剂盒以及带标记核苷酸。用于MethyLight^TM分析的典型试剂(例如，如可在典型的基于MethyLight^TM的试剂盒中发现的)可包括但不限于：用于在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列的重亚硫酸盐转变序列的PCR引物、重亚硫酸盐特异性探针(例如，TaqMan^TM或LightCycler^TM)、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸以及Taq聚合酶。

用于Ms-SNuPE^TM分析的典型试剂(例如，如可在典型的基于Ms-SNuPE^TM的试剂盒中发现的)可包括但不限于：用于特异性基因(或经重亚硫酸盐处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸、凝胶提取试剂盒、阳性对照引物、用于在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列的重亚硫酸盐转变序列的Ms-SNuPE^TM引物、反应缓冲液(用于Ms-SNuPE反应)以及带标记的核苷酸。

用于MSP分析的典型试剂(例如，如可在典型的基于MSP的试剂盒中发现的)可包括但不限于：用于在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列的重亚硫酸盐转变序列的甲基化和非甲基化引物、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸以及特异性探针。

而且，本发明的另一个方面是替代性试剂盒，其包含用于确定在癌症中是甲基化的而在非癌组织中是非甲基化的至少一种基因或基因组序列的工具，其中所述工具优选地包括至少一种甲基化特异性限制酶；一种或多种引物寡核苷酸(优选一种或多种引物对)，其适合于扩增包含选自所述基因组序列之序列的至少一个CpG岛的序列；以及任选地用于进行并评价所述甲基化分析方法的说明书。在一个实施方案中，所述寡核苷酸的碱基序列与选自所述基因组序列之序列的至少18个碱基长的区段相同、互补或在严格条件或高度严格条件下杂交。

在另一个实施方案中，所述试剂盒可包含一种或更多种寡核苷酸探针用于分析消化片段，优选地所述寡核苷酸与选自基因组序列之序列的至少16个碱基长的区段相同、互补或在严格条件或高度严格条件下杂交。

在一个优选实施方案中，所述试剂盒可包含选自以下的另外的试剂：缓冲液(例如，限制酶缓冲液、PCR缓冲液、存储缓冲液或洗涤缓冲液)、DNA回收试剂或试剂盒(例如，沉淀、超滤、亲和柱)和DNA回收组分。

在另一个替代实施方案中，所述试剂盒可包含包装在单独容器中的聚合酶和反应缓冲液，所述反应缓冲液针对通过聚合酶介导引物延伸例如PCR进行了优化。在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒还包含用于得到和/或存储对象生物样品的装置。在一个优选实施方案中，所述试剂盒包含：(a)甲基化敏感性限制酶试剂；(b)适合于容纳所述试剂和对象生物样品的容器；(c)一种或多种核酸或肽核酸的寡核苷酸的至少一个集合，所述寡核苷酸的序列与选自所述基因组序列之序列的至少9个碱基长的区段相同、互补或在严格条件或高度严格条件下杂交；以及任选地(d)使用说明书和试剂盒结果的解释说明书。在一个替代优选实施方案中，所述试剂盒包含：(a)甲基化敏感性限制酶试剂；(b)适合于容纳所述试剂和对象生物样品的容器；(c)引物寡核苷酸的至少一个集合，所述引物寡核苷酸适合于扩增包含选自所述基因组序列之序列的至少一个CpG二核苷酸的序列；以及任选地(d)使用说明书和试剂盒结果的解释说明书。

在一个替代实施方案中，所述试剂盒包含：(a)甲基化敏感性限制酶试剂；(b)适合于容纳所述试剂和对象生物样品的容器；(c)引物寡核苷酸的至少一个集合，所述引物寡核苷酸适合于扩增包含选自所述基因组序列之序列的至少一个CpG二核苷酸的序列；(d)一种或多种核酸或肽核酸的寡核苷酸的至少一个集合，其序列与选自所述基因组序列之序列的至少9个碱基长的区段相同、互补或在严格条件或高度严格条件下杂交；以及任选地(e)使用说明书和试剂盒结果的解释说明书。

所述试剂盒还可容纳包装在单独容器中的其他组分，例如适合于封闭、洗涤或包被的缓冲液或溶液。

本发明还涉及用于通过甲基化敏感性限制酶分析在对象中确定患癌症对象之预后的试剂盒，所述试剂盒包含容器和DNA微阵列组分。所述DNA微阵列组分是在其上指定位置固定了多种寡核苷酸的表面并且其中所述寡核苷酸包含至少一个CpG甲基化位点。所述寡核苷酸中的至少一个对选自所述基因的至少一种基因或基因组序列具有特异性，并且包含根据基因组序列之一的序列长度为至少15个碱基对但不多于200bp的序列。优选地，所述序列为根据所述基因组序列之一的序列长度为至少15个碱基对但不多于80bp的序列。更优选的是，所述序列为根据所述基因组序列之一的序列长度为至少20个碱基对但不多于30bp的序列。所示测试试剂盒优选地还包含限制酶组分，其包括一种或多种甲基化敏感性限制酶。

在另一个实施方案中，所述测试试剂盒的特征还在于，其包含至少一种甲基化特异性限制酶，并且其中寡核苷酸包含所述至少一种甲基化特异性限制酶的限制位点。

所述试剂盒还可包含本领域已知的以下组分的一种或几种以用于DNA富集：蛋白质组分，所述蛋白质选择性结合甲基化DNA；三链体形成核酸组分，任选地在合适溶液中的一个或多个接头；用于进行连接的物质或溶液，例如连接酶、缓冲液；用于进行柱色谱的物质或溶液；用于进行基于免疫的富集(例如，免疫沉淀)的物质或溶液；用于进行核酸扩增(例如PCR)的物质或溶液；一种或几种染料，如果可以与偶联试剂一起使用的话，如果可以在溶液中使用的话；用于进行杂交的物质或溶液和/或用于进行洗涤步骤的物质和溶液。

所述的本发明还提供了可用于确定患癌症对象之预后的物质的组合物。所述组合物包含重亚硫酸盐序列中所公开之核酸序列的至少一种长度为18个碱基对的核酸区段，以及选自以下的一种或更多种底物：1至5mM氯化镁、100至500μM dNTP、0.5至5单位的taq聚合酶、牛血清白蛋白、寡聚物特别是寡核苷酸或肽核酸(PNA)-寡聚物，所述寡聚物在每种情况下均包含长度为至少9个核苷酸的至少一种碱基序列，其与根据重亚硫酸盐序列及其互补序列之一的预处理基因组DNA互补或在中等严格条件或严格条件下杂交。优选的是，所述物质的组合物包含缓冲溶液，其适合于在水溶液中稳定所述核酸并且使得能够在所述溶液中进行基于聚合酶的反应。合适的缓冲液在本领域中是已知的并且是可商购的。

本发明还涉及如前定义的试剂盒或寡核苷酸用于以下的用途：确定癌症对象预后，确定癌症对象的药物治疗，确定来自癌症对象的肿瘤是否指示肿瘤是侵袭性的或具有转移潜力或者是否指示对象的存活时间减少，检测对象中侵袭性形式的癌症，为癌症治疗选择癌症对象，或者确定包括癌症对象在内的对象中的肿瘤负荷或癌症负荷。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述至少一种核酸是重亚硫酸盐序列中公开的核酸序列的长度为至少50、100、150、200、250或500个碱基对的区段。

表1 根据本发明的基因组序列及其经处理变体

实施例1

在来自手术切除之前和之后CRC患者的匹配血浆样品中研究了作为在癌症组织中甲基化而在非癌组织中是非甲基化之基因或基因组序列实例的Septin9和甲基化RASSF2A的水平。

通过测量Septin9、甲基化RASSF2A和HB14基因的三重测定方法测定Septin9和甲基化RASSF2A的水平。可以以单重、二重、三重、四重或多重(multiplex)方式进行类似的测定。

用于测量基因和基因组序列甲基化或甲基化状态的方法在本领域是已知的。参见，例如美国专利No：7,229,759或欧洲专利EP 1370691，其二者并入本文以供参考这些甲基化测定和检测方法。测量了本文中基因和基因组序列的甲基化或甲基化状态。血浆DNA经重亚硫酸盐转变，并且在三重(triplex)测定中检测基因组序列上位置的甲基化DNA水平。

使用Invitrogen磁架(magnetic rack)(DynaMag-15和DynaMag-2)。通过将45ml乙醇(Merck，A000920；99.8％)添加到Epi proColonUS Wash A Concentrate中制备了洗液A.通过将28ml乙醇(Merck，A000920；99.8％)添加到Epi proColonUS Wash B Concentrate中制备了洗液B.将3.5ml血浆与3.5ml裂解-结合缓冲液合并到标记的15ml Falcon管中，涡旋混合，并在室温下孵育10分钟。向该裂解反应中添加90μl磁珠(Dynabeads MyOne SILANE，通过涡旋30分钟新鲜悬浮的)和2.5ml乙醇至总体积为～10ml.通过手动反转5至6次并在室温下用旋转摇床(Rotator)孵育管45分钟。将15ml管放置在磁架中维持至少5分钟，其后弃去缓冲液并将管转移至非磁性架中，进行第一次洗涤。添加1500μl洗液A(如上所述，裂解/结合缓冲液+乙醇f.d.Molekularbiologie)并通过涡旋使珠子重悬10秒。用移液器将珠子悬液转移至标记的2ml管中。将仅确保80℃孵育期间安全闭合的2ml SafeLock管用于离心。将移液器放回15ml管中维持至少2分钟以收集剩余的珠子。并且用相同移液器放置在2ml管中。将2ml管放置在磁架上维持2分钟，其后用移液器尽可能多地吸走缓冲液，同时注意不移除珠子。将管放置在离心机中并在1000rcf下旋转10分钟以在底部收集珠子，放置在磁架上维持2分钟并移除残余缓冲液。

向每个管中添加100μl洗脱缓冲液(10mM Tris pH 8.0)洗脱血浆DNA，并且将珠子通过涡旋10分钟重悬，确保沉淀完全重悬，然后在80℃在热摇床中以1000rpm孵育15分钟。使管脉冲旋转以从盖子中移除液滴。并放置在磁架上维持2分钟。将完全洗脱物(约100μl)转移至预标记的2.0ml管中。

通过向洗脱物中添加以下试剂使血浆DNA进行重亚硫酸盐转变：150μl重亚硫酸盐溶液(ABS，重亚硫酸铵溶液，仅使用未开封的管，弃去使用过的管)和25μl保护缓冲液(包含THFA)(5g Trolox+40ml THFA)。封闭管并涡旋10秒以彻底混合。使管脉冲旋转以防止液体跑到盖上，然后放置在热块或热摇床(thermal block or shaker)中，并在不振摇的情况下在80℃孵育45分钟。使管脉冲旋转以移除盖中的液滴，然后通过涡旋10秒使珠子重悬，确保所有珠子彻底悬浮。将以下组分按顺序添加到每个重亚硫酸盐反应中：1000μl洗液A和20μl磁珠(Dynabeads MyOne SILANE)，至总体积为300μl，并且通过涡旋小心混合，其后在热摇床中将其孵育并在室温下以1000rpm振摇45分钟。将管脉冲旋转以移除盖中的液滴，将其放置在磁架上维持2分钟以捕获颗粒。然后，使用新的移液器移除尽可能多的液体而不接触所捕获的颗粒。将管从磁架中移除以进行洗涤步骤。添加800μl洗液A并将珠子从壁上冲下，然后通过涡旋重悬，脉冲旋转管以移除盖中的液滴，并放置在磁架上维持2分钟。使用新的移液器移除尽可能多的液体而不接触所捕获的颗粒。将管从磁架中移除以进行洗涤步骤。添加800μl洗液B并将珠子从壁上冲下，然后通过涡旋重悬，脉冲旋转管以移除盖中的液滴，并放置在磁架上维持2分钟。使用新的移液器移除尽可能多的液体而不接触所捕获的颗粒。将管从磁中取出以进行洗涤步骤。添加400μl洗液B并将珠子从壁上冲下，然后通过涡旋重悬，脉冲旋转管以移除盖中的液滴，并放置在磁架上维持2分钟。使用新的移液器移除尽可能多的液体而不接触所捕获的颗粒。将管简单旋转以将剩余液滴收集到底部，放置在磁架上维持2分钟，然后用移液器移除残余液体。在磁体上保持管打开使沉淀在室温下干燥10分钟。

将管转移至非磁性架中并向每个管中添加55μl洗脱缓冲液(10mM Tris pH 8.0)。然后通过涡旋20秒分钟使珠子重悬，其后将管在热摇床中以1000rpm在80℃孵育5分钟，然后再涡旋10秒，稍微旋转以收集下降到底部的所有液体。将管放置在磁架上维持2分钟并将全部洗脱液转移至96孔PCR板(或预标记的0.5ml管)中。

用于进行三重测定的探针和引物的序列示于表2中。

表2

Septin9基因组序列：

Ctgcccaccagccatcatgtcggaccccgcggtcaacgcgcagctggatgggatcattt(SEQ IDNO:32)

Septin9重亚硫酸盐转变基因组序列：

Ttgtttattagttattatgtcggatttcgcggttaacgcgtagttggatgggattattt(SEQ IDNO:33)

RASSF2A基因组序列：

Acttagagctgaatgcaaagtaagcgctcgaaatgcagaagtagccggggccgcccacggcacctgcctcgctcggggcgagagaagacgccaggctgaggtcccag(SEQ ID NO:34)

RASSF2A重亚硫酸盐转变基因组序列：

atttagagttgaatgtaaagtaagcgttcgaaatgtagaagtagtcggggtcgtttacggtatttgtttcgttcggggcgagagaagacgttaggttgaggttttag(SEQ ID NO:35)

表3

结果示出I期和II期癌症患者倾向于在手术之后丢失Septin9和RASF2A信号，III期患者保留Septin9和RASF2A信号。已经具有转移疾病的2名IV期CRV患者在手术之后“保留”Septin9和RASF2A信号。这表明可通过Septin9和RASF2A检测转移，即便切除了原发性肿瘤也是如此。结果描绘于图1至12中。图14和15以定量方式示出Septin9和RASSF2A的讨论结果。值以pg甲基化Septin9/RASSF2A DNA/ml血浆来显示。

用于在原发性肿瘤治愈切除之后CRC患者预后的方法：

可通过可检测血液/血浆中DNA甲基化的几种现有技术来进行Septin9的检测。mSeptin9的定性、半定量和/或定量分析是可能的并且其与预定用途和目的患者/肿瘤群体高度相关。

分析的样品确定

对于定性分析：

I期CRC肿瘤患者。

手术之前Septin9信号阳性

手术之后Septin9信号阴性＝良好预后

手术之后Septin9信号阳性＝预后不良(发生转移的风险)

在本发明的一些优选实施方案中，良好预后应意指监测经历了手术的个体，即以一定时间间隔重复进行癌症复发的一个或更多个测试。在一个特别优选的实施方案中，这样的测试是如本文、US 2006-0286576或WO 2006/113466所公开的检测甲基化Septin9DNA。

手术之前RASSF2A信号阳性

手术之后RASSF2A信号阴性＝良好预后

手术之后RASSF2A信号阳性＝预后不良(发生转移的风险)

在本发明的一些优选实施方案中，良好预后应意指监测经历了手术的个体，即以一定时间间隔重复进行癌症复发的一个或更多个测试。

对于半定量分析：

I、II和III期CRC肿瘤患者。

手术之前Septin9信号阳性(3次重复测量中有1次)＝存在肿瘤

手术之后Septin9信号阴性＝良好预后(3次重复测量中有3次)

手术之后Septin9信号1/3阳性＝低风险

手术之后Septin9信号2/3阳性＝中等风险

手术之后Septin9信号3/3阳性＝高风险

I、II和III期CRC肿瘤患者。

手术之前RASSF2A信号阳性(3次重复测量中有1次)＝存在肿瘤

手术之后RASSF2A信号阴性＝良好预后(3次重复测量中有3次)

手术之后RASSF2A信号1/3阳性＝低风险

手术之后RASSF2A信号2/3阳性＝中等风险

手术之后RASSF2A信号3/3阳性＝高风险

对于定量分析：

II和III和(IV)期CRC肿瘤患者。

手术之前和之后Septin9之量的检测，例如通过使用内标来检测。

I、II和III期CRC肿瘤患者。

手术之前Septin9高于3pg/ml血浆＝存在肿瘤

手术之后Septin9信号阴性＝良好预后(0pg/ml Septin9)

手术之后Septin9＞0至3pg/ml血浆＝低风险

手术之后Septin9为3至30pg/ml血浆＝中等风险

手术之后Septin9高于30pg/ml血浆＝高风险

手术之前和之后RASSF2A之量的检测，例如通过使用内标来检测。I、II和III期CRC肿瘤患者。

手术之前RASSF2A高于3pg/ml血浆＝存在肿瘤

手术之后RASSF2A信号阴性＝良好预后(0pg/ml血浆RASSF2A)

手术之后RASSF2A-＞0至3pg/ml血浆＝低风险

手术之后RASSF2A为3至30pg/ml血浆＝中等风险

手术之后RASSF2A高于30pg/ml血浆RASSF2A＝高风险

以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：

1.用于确定癌症对象之预后的方法，其包括以下步骤：

a.测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；

b.测量获自所述对象的生物样品中所述基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平，

由此与所述治疗前样品相比，所述治疗后样品中所述甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示对所述对象进行额外癌症治疗。

2.根据项1所述的方法，其中与所述治疗前样品相比所述治疗后样品中所述甲基化基因组DNA或片段的量增加指示所述癌症是侵袭性的或具有转移潜能或所述对象的存活时间减少。

3.用于确定癌症对象之医学治疗的方法，其包括以下步骤：

a.测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；和

b.测量获自所述对象的生物样品中所述基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平，

由此与所述治疗前样品相比，所述治疗后样品中所述甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示对所述对象进行额外癌症治疗。

4.用于确定癌症对象的肿瘤是否指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少的方法，其包括：

a.测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；和

b.测量获自所述对象的生物样品中所述基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平，

由此与所述治疗前样品相比，所述治疗后样品中所述甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少。

5.用于检测对象中侵袭性形式癌症的方法，其包括：

a.测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；和

b.测量获自所述对象的生物样品中所述基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平，

由此与所述治疗前样品相比，所述治疗后样品中所述甲基化基因组DNA或片段的量增加指示所述肿瘤为侵袭性形式。

6.选择用于癌症治疗的癌症对象的方法，其包括：

a测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；和

b.测量获自所述对象的生物样品中所述基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平，

由此与所述治疗前样品相比，所述治疗后样品中所述基因之甲基化基因组DNA的量增加指示进行额外的癌症治疗。

7.用于确定对象中的肿瘤负荷或癌症负担的方法，其包括：

a.测量获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；和

b.测量获自所述对象的生物样品中所述基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平，

由此与所述治疗前样品相比，所述治疗后样品中所述基因之甲基化基因组DNA的量增加指示所述对象具有增加的或相当的肿瘤负荷或癌症负担，或者所述肿瘤负荷或癌症负担未因所述治疗而减少。

8.用于确定对象中的肿瘤负荷或癌症负担的方法，其包括：将获自所述对象的生物样品中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平与所述基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平进行比较，由此与所述治疗前样品相比，所述治疗后样品中所述基因之甲基化基因组DNA的量增加指示所述对象具有增加或相当的肿瘤负荷或癌症负担，或者所述肿瘤负荷或癌症负担未因所述治疗而减少。

9.根据项1至8中任一项所述的方法，其中所述基因是SEPTIN9(SEQ ID NO：1)或RASSF2a(SEQ ID NO：2)。

10.根据项9所述的方法，其中在选自SEQ ID NO：32的21、28、30、37以及39位和SEQID NO：34的25、29、46、52、58、70、74、79以及89位的至少一个胞嘧啶处测量所述基因组DNA的甲基化。

11.根据项9所述的方法，其中所述基因是SEPTIN9(SEQ ID NO：1)。

12.根据项1至11中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：

a.结肠癌；和

b.结直肠癌。

13.根据项12所述的方法，其中所述癌症的分期为I期结直肠癌。

14.根据项12所述的方法，其中所述癌症的分期为II期结直肠癌。

15.根据项12所述的方法，其中所述癌症的分期为III期结直肠癌。

16.根据项1至12中任一项所述的方法，其中所述治疗选自：

a.手术或切除；

b.免疫治疗；

c.化学治疗；

d.放射治疗；

e.靶向实体肿瘤的治疗；

f.靶向软组织肿瘤的治疗；以及

g.靶向血液癌症的治疗。

17.根据项1至16中任一项所述的方法，其中所述治疗局限于所述对象中的癌症区域。

18.根据项1至16中任一项所述的方法，其中所述治疗不局限于所述对象中的癌症区域。

19.根据项1至18中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自：

a.组织；

b.尿；

c.粪便；

d.灌洗流体；以及

e.血液。

20.根据项1至19中任一项所述的方法，其中所述样品是血清或血浆。

21.根据项1至20中任一项所述的方法，其中定量地、或部分定量地、定性地和/或部分定性地测量甲基化基因组DNA或片段。

22.根据项1至20中任一项所述的方法，其中部分定量地且部分定性地或者半定量地测量甲基化基因组DNA或片段。

23.根据项1至22中任一项所述的方法，其中测量所述甲基化基因组DNA或片段包括使来自所述生物样品的基因组DNA与在所述基因组DNA的至少一个靶区域中区分甲基化CpG二核苷酸与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂相接触，其中所述靶区域包含SEQ ID NO：1的至少9个、至少16个或至少25个连续核苷酸的序列或者在严格条件下与之杂交，其中所述连续核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸序列。

24.根据项23所述的方法，其中在b)中所述的接触基因组DNA或其片段包括使用选自包括以下的组的试剂：重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐及其组合。

25.根据项1至24中任一项所述的方法，其包括：、

a.从所述生物样品中提取或以其他方式分离所述基因组DNA或其片段；

b.用一种或更多种试剂处理所提取或分离的基因组DNA或其片段，以将其5’位非甲基化的胞嘧啶碱基转变为尿嘧啶或者在杂交性质方面可检测地不同于胞嘧啶的另一碱基；

c.使所述经处理的基因组DNA或经处理的片段与扩增酶及至少一种包含至少9个核苷酸连续序列的引物相接触，所述核苷酸连续序列与所述经处理的序列或其互补序列互补或者在中等严格条件或严格条件下与之杂交，其中所述经处理的基因组DNA或其片段扩增以产生至少一种扩增产物或者不扩增；以及

d.基于所述扩增产物的存在、不存在或量或性质确定所述基因之至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，或者反映所述基因之多个CpG二核苷酸的平均甲基化状态或水平的平均值或值。

26.根据项1至24中任一项所述的方法，其包括：

a.从所述生物样品中提取或以其他方式分离所述基因组DNA或其片段；

b.用一种或更多种甲基化敏感性限制酶消化所提取或分离的基因组DNA或其片段；

c.使b)中的DNA限制酶消化产物与扩增酶及至少两种引物相接触，所述引物适于扩增包含所述基因的至少一个CpG二核苷酸的序列；以及

d.基于扩增产物的存在、不存在或类别确定所述基因之至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平。

27.甲基化基因组SEPTIN9核酸或包含所述核酸的至少9个、至少16个、至少25个或至少50个连续核苷酸的片段及其互补序列，其用于确定癌症对象的预后。

28.根据项27所述的甲基化基因组SEPTIN9核酸，其中所述对象患有结直肠癌。

29.甲基化基因组SEPTIN9核酸或包含所述核酸的至少9个、至少16个、至少25个或至少50个连续核苷酸的片段及其互补序列用于下述项的用途：确定癌症对象之预后；确定用于癌症对象的医学治疗；确定癌症对象的肿瘤是否指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少；检测对象中侵袭性形式的癌症；选择用于癌症治疗的癌症对象或者确定对象包括癌症对象中的肿瘤负荷或癌症负担。

30.根据项29所述的用途，其中所述对象患有结直肠癌或结肠癌。

31.包含至少9个、至少16个、至少25个或至少50个连续核苷酸的经重亚硫酸盐处理的基因组SEPTIN9 DNA核酸及其互补序列，其用于：确定癌症对象之预后；确定用于癌症对象的医学治疗；确定癌症对象的肿瘤是否指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少；检测对象中侵袭性形式的癌症；选择用于癌症治疗的癌症对象或者确定对象中的肿瘤负荷或癌症负担。

32.根据项27、28或31中任一项所述的核酸，其中所述连续碱基序列包含至少一个CpG、TpG或CpA二核苷酸序列。

33.用于以下的试剂盒：确定癌症对象之预后；确定用于癌症对象的医学治疗；确定癌症对象的肿瘤是否指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少；检测对象中侵袭性形式的癌症；选择用于癌症治疗的癌症对象或者确定对象中的肿瘤负荷或癌症负担，所述试剂盒包含：

a.多个能够在严格条件或中等严格条件下与所述基因或甲基化基因组DNA的转录产物杂交的寡核苷酸或多核苷酸；和

b.用于检测所述杂交的工具。

34.根据项33所述的试剂盒，其中所述基因或甲基化基因组DNA是SEPTIN9。

35.用于以下的试剂盒：确定癌症对象之预后；确定用于癌症对象的医学治疗；确定癌症对象的肿瘤是否指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少；检测对象中侵袭性形式的癌症；选择用于癌症治疗的癌症对象或者确定对象中的肿瘤负荷或癌症负担，所述试剂盒包含：

(a)重亚硫酸盐试剂；

(b)至少一组寡核苷酸，其含有两种寡核苷酸，在每种情况下其序列与SEPTIN 9序列的至少9个或至少18个碱基长的区段相同、互补或者在严格条件或高度严格条件下杂交。

36.根据项1至26中任一项所述的方法、根据项27、28或31中任一项所述的核酸和/或根据项33或34所述的试剂盒用于以下的用途：确定癌症对象之预后；确定用于癌症对象的医学治疗；确定癌症对象的肿瘤是否指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少；检测对象中侵袭性形式的癌症；选择用于癌症治疗的癌症对象或者确定对象中的肿瘤负荷或癌症负担。

37.用于以下的方法：确定癌症对象之预后；确定用于癌症对象的医学治疗；确定癌症对象的肿瘤是否指示所述肿瘤是侵袭性的或具有转移潜能或者指示所述对象的存活时间减少；检测对象中侵袭性形式的癌症；选择用于癌症治疗的癌症对象或者确定对象中的肿瘤负荷或癌症负担，所述方法包括以下步骤：

a.测量获自所述对象的生物样品中Septin 9基因表达和/或其启动子或调节元件或其片段、或者RASSF2A基因和/或其启动子或调节元件或其片段的治疗前水平；

b.测量获自所述对象的生物样品中Septin 9基因表达和/或其启动子或调节元件或其片段、或者RASSF2A基因和/或其启动子或调节元件或其片段的治疗后水平；

由此与所述治疗前样品相比，所述治疗后样品中Septin 9或RASSF2A基因表达的量减少或相当指示对所述对象进行额外癌症治疗。

38.用于确定项37所述方法的试剂盒，其包含：

a.多个能够在严格条件或中等严格条件下与Septin 9基因和/或其启动子或调节元件(包括其所有转录变体)或RASSF2A基因和/或其启动子或调节元件(包括其所有转录变体)的转录产物杂交的寡核苷酸或多核苷酸；和

b.用于检测所述杂交的工具。

c.

39.根据项37中任一项所述的方法，其中通过检测由所述基因或其序列编码的多肽的存在、不存在或水平来确定所述表达水平。

40.用于确定项36所述方法的试剂盒，其包含：

a.用于检测Septin 9或RASSF2A之多肽的工具；和

b.用于检测a)的复合物的工具。

41.根据项39所述的方法或根据项40所述的试剂盒，其中通过一种或更多种选自包括以下之组的方法来检测所述多肽：western印迹分析、色谱法、免疫测定、ELISA免疫测定、放射免疫测定、抗体及其组合。

42.在癌症对象或来自所述癌症对象的组织中检测转移的方法，其包括在从所述对象中移除原发性肿瘤之后检测来自所述对象的甲基化基因组DNA。

43.根据项45所述的方法，其中在来自所述对象的血液或血浆中检测所述甲基化基因组DNA。

Claims (10)

1.测量基因的甲基化DNA或其片段的试剂在制备用于在移除原发性肿瘤的治疗后且在移除原发性肿瘤后所进行的治疗之前确定癌症对象之预后的试剂盒中的用途，所述确定包括：

a.测量原发性肿瘤移除前获自所述对象的生物样品(治疗前样品)中基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗前水平；

b.测量原发性肿瘤已被移除之后且在移除原发性肿瘤后所进行的治疗之前获自所述对象的生物样品(治疗后样品)中所述基因之甲基化基因组DNA或其片段的治疗后水平，

由此与所述治疗前样品相比，所述治疗后样品中所述甲基化基因组DNA或片段的量增加或相当指示对所述对象进行额外癌症治疗。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述基因是SEPTIN9(SEQ ID NO：2或3)或RASSF2a(SEQ ID NO：16)。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中所述癌症选自：

a.结肠癌；和

b.结直肠癌。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述癌症的分期为I期结直肠癌、II期结直肠癌、III期结直肠癌或IV期结直肠癌。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述移除原发性肿瘤的治疗选自：

a.手术或切除；

b.免疫治疗；

c.化学治疗；

d.放射治疗；

e.靶向实体肿瘤的治疗；

f.靶向软组织肿瘤的治疗；以及

g.靶向血液癌症的治疗。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述生物样品选自：

a.组织；

b.尿；

c.粪便；

d.灌洗流体；

e.血液；

f.血清；以及

g.血浆。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中测量所述甲基化基因组DNA或片段包括使来自所述生物样品的基因组DNA与在所述基因组DNA的至少一个靶区域中区分甲基化CpG二核苷酸与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂相接触，其中所述靶区域包含SEQ ID NO：2、3或16的至少9个、至少16个或至少25个连续核苷酸的序列或者在严格条件下与之杂交，其中所述连续核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途，其中所述确定包括：

a.从所述生物样品中提取或以其他方式分离所述基因组DNA或其片段；

b.用一种或更多种试剂处理所提取或分离的基因组DNA或其片段，以将其5位非甲基化的胞嘧啶碱基转变为尿嘧啶或者在杂交性质方面可检测地不同于胞嘧啶的另一碱基；

c.使所述经处理的基因组DNA或经处理的片段与扩增酶及至少一种包含至少9个核苷酸连续序列的引物相接触，所述核苷酸连续序列与所述经处理的序列或其互补序列互补或者在中等严格条件或严格条件下与之杂交，其中所述经处理的基因组DNA或其片段扩增以产生至少一种扩增产物或者不扩增；以及

d.基于所述扩增产物的存在、不存在或量或性质确定所述基因之至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，或者反映所述基因之多个CpG二核苷酸的平均甲基化状态或水平的平均值或值。

9.包含至少9个、至少16个、至少25个或至少50个连续核苷酸的经重亚硫酸盐处理的基因组SEPTIN9或RASSF2a核酸及其互补序列在制备用于根据权利要求1至8中任一项所述用途的试剂盒中的用途。

10.测量基因或其片段的表达水平的试剂。