CN108034690B - 一种花生粕中黄曲霉毒素降解及同步制备花生蛋白肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花生粕中黄曲霉毒素降解及同步制备花生蛋白肽的方法，属于花生食品安全与营养领域。本发明花生粕中黄曲霉毒素降解及同步制备花生蛋白肽的方法包括原料处理、微生物分段发酵、酶解、灭酶离心和喷雾干燥；微生物分段发酵所用微生物为：云芝菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉。本发明采用三种菌协同分段发酵，分段酶解，在降解黄曲霉毒素的同时，还能降解环匹阿尼酸，并制备出抗氧化活性好、营养价值高的花生蛋白肽，减少操作流程、缩短了工艺时间，节约成本，操作方法简单，易于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于花生食品安全与营养领域，具体涉及一种花生粕中黄曲霉毒素降解及同步制备花生蛋白肽的方法。
背景技术
我国是花生生产大国，每年花生榨油后可得到约300万吨的花生粕。花生粕中含有丰富的营养成分，如花生蛋白、黄酮类、糖类等。其中花生蛋白与应用较广的大豆蛋白相比，具有含肠胃胀气因子和抗营养因子较少的优点；与菜籽、棉籽蛋白相比，具有所含毒性物质较少的优点。但花生粕利用率低，主要作为饲料，价格低廉，现在约2600元/吨，远低于大豆粕的价格(3200元/吨)。限制价格和广泛应用的主要因素是其易感染黄曲菌产生黄曲霉毒素。
黄曲霉毒素具有强毒性和致癌性，严重危害人畜健康，仅0.294mg/kg剂量就能引起敏感动物的急性中毒死亡。黄曲霉毒素性质稳定，一般加工方法不能去除其毒性。多年来，科学家们致力于利用物理、化学、生物等多种方法来去除黄曲霉毒素。传统的物理和化学的黄曲霉毒素去毒方法包括臭氧、氨化法、碱法、射线辐照法、吸附法和超滤-渗滤法等，这些方法都存在一些问题，如导致食品和饲料中的营养损失，影响感官品质，有些方法所需要的设备价格昂贵等等；其次有些方法的反应机制是可逆的，黄曲霉毒素的毒性会重新出现，这些都限制了传统理化方法在实际生产中的应用。
生物法，是利用微生物及其分泌的酶等代谢产物降解黄曲霉毒素的方法，具有效率高、特异性强以及对食品、饲料和环境没有污染的特点。国内外生物降解脱除黄曲霉毒素的研究主要集中在微生物菌株直接作用于黄曲霉毒素，以及把菌株产生的酶做成制剂作用于黄曲霉毒素。而对于复杂基质如花生粕中黄曲霉毒素的降解研究较少。
生物降解所涉及的菌种目前主要涉及国内的假蜜环菌、粘细菌、嗜麦芽窄食单胞菌以及国外研究的橙色黄杆菌和红串红球菌等，但存在着菌株在花生粕中不易生长繁殖、降解率低、有些菌株不能在食品生产中应用，有一定的安全隐患等问题。且都是研究单株菌对黄曲霉毒素的降解作用，未报道多菌联合对黄曲霉毒素的降解作用。
同时花生粕中含有大量的蛋白和纤维，对花生粕中蛋白肽的制备报到较多，但对于蛋白中的黄曲霉毒素未见有去除的报到，导致制备的蛋白肽中存在黄曲霉毒素，影响消费者的健康。
发明内容
为了高效利用花生粕中的蛋白质、安全降解花生粕中的黄曲霉毒素，提高花生粕的营养和利用价值，消除黄曲霉毒素对花生粕利用的危害，本发明提供了一种花生粕中黄曲霉毒素降解及同步制备花生蛋白肽的方法，利用云芝、枯草芽孢杆菌、黑曲霉三种菌种分段发酵花生粕产生黄曲霉毒素降解酶、蛋白水解酶以及纤维素酶等，利用产生的生物酶对花生粕中黄曲霉毒素进行降解，同时对花生粕中的蛋白和纤维进行酶解，在降解黄曲霉毒素的同时，制备花生蛋白肽。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种花生粕中黄曲霉毒素降解及同步制备花生蛋白肽的方法，步骤如下：
(1)原料处理：将花生粕粉碎，过40目筛；向花生粕粉中加入2～3倍重量的蒸馏水，灭菌；
(2)微生物分段接种发酵：向灭菌的花生粕中接种活化后的云芝菌种，25-40℃固体发酵5-8d，再向发酵的花生粕中接种活化过的枯草芽孢杆菌，30-35℃固体发酵3-5d，再向花生粕中接种活化过的黑曲霉，28-35℃固体发酵3-5d；
(4)酶解：发酵后的培养基加入蒸馏水，33-35℃震荡酶解1-2h后，22-25℃震荡酶解8-12h；
(5)灭酶离心：酶解液100℃灭酶处理10-15min，冷却至室温后用高速离心机7000-10000rpm离心10-15min；
(6)喷雾干燥：将离心得到的上清液进行喷雾干燥，入料温度为50℃，进风温度为180-190℃，进风量为22-25m3/h，干燥完成后得到花生蛋白肽。
在上述方案的基础上，所述云芝菌与花生粕的质量比(g/g)为1∶20-2∶20；所述枯草芽孢杆菌与花生粕的体积质量比(mL/g)为1∶20-2∶20；所述黑曲霉与花生粕的质量比(g/g)为1∶20-2∶20。
在上述方案的基础上，所述云芝菌活化方法为：将6-8菌种塞(7mm直径)的云芝菌株接种于10g直径大约为5mm的花生根粉中，25-30℃活化培养5-7d，制得云芝活化菌种，菌种浓度达到6×103～6×105cfu·g-1花生根粉。
在上述方案的基础上，所述枯草芽孢杆菌活化方法为：将枯草芽孢杆菌接种于花生粕水溶液中，25-30℃活化培养2-3d，制得枯草芽孢杆菌菌种液，此时枯草芽孢杆菌菌种浓度为8×105～8×106cfu·mL-1。
在上述方案的基础上，所述的黑曲霉活化方法为：将2-3菌种环的黑曲霉菌株接种于10g直径5mm的花生根粉中，25-30℃活化培养3-5d，制得黑曲霉活化菌种，黑曲霉菌种浓度为7×108～7×109cfu·g-1花生根粉。
在上述方案的基础上，酶解时，蒸馏水的添加量为微生物分段发酵后的培养基重量的3～5倍。
在上述方案的基础上，所述黄曲霉毒素为B1、B2、G1和G2。
上述方法在花生粕环匹阿尼酸降解中的应用。
云芝购买于湖北省武汉华中食用菌栽培研究所；
枯草芽孢杆菌为中国农业微生物菌种保藏中心的菌种(ACCC01185)；
黑曲霉为中国工业微生物菌种保藏中心的菌种(CICC2039)。
本发明花生粕中黄曲霉毒素降解及同步制备花生蛋白肽的方法具有如下优点：
(1)本发明花生粕中黄曲霉毒素降解及同步制备花生蛋白肽的方法采用三种菌协同分段发酵，分段酶解，在降解黄曲霉毒素的同时，还能降解环匹阿尼酸，并制备出抗氧化活性好、营养价值高的花生蛋白肽，减少操作流程、缩短了工艺时间，节约成本，操作方法简单，易于工业化生产。
(2)全面降解黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2
本发明通过云芝、枯草芽孢杆菌和黑曲霉协同分段发酵花生粕可以高效降解黄曲霉毒素。云芝可以产生降解黄曲霉毒素的酶制剂，同时枯草芽孢杆菌和黑曲霉在含有黄曲霉毒素的花生粕中也可以诱导产生降解黄曲霉毒素的酶类，三种菌种协同发酵不仅可以高效降解黄曲霉毒素B1，还可以降解黄曲霉毒素B2以及黄曲霉毒素G1和G2，起到了既能提高黄曲霉毒素B1的降解率，又能起到全面降解其他黄曲霉毒素等意想不到的作用。
(3)降解环匹阿尼酸
环匹阿尼酸(Cyclopiazonic acid，CPA)是一种吲哚衍物(Indole-derived ergotalkaloids)，是曲霉属和青霉属的几种真菌次级代谢产生的一种真菌毒素，毒理学研究表明，它是一种神经毒素，会诱导神经系统紊乱。环匹阿尼酸和黄曲霉毒素往往共同存在。本发明通过云芝、枯草芽孢杆菌和黑曲霉协同分段发酵花生粕还可以产生不仅可以降解黄曲霉毒素，还可以降解环匹阿尼酸，确保了花生粕的安全。
(4)三种菌协同分段发酵有助于三种菌的生长繁殖
花生粕作为唯一的营养来源对发酵菌株云芝、枯草芽孢杆菌和黑曲霉所提供的营养较少，云芝、枯草芽孢杆菌和黑曲霉在同一培养基上发酵，能够分泌出彼此生长所需的营养物质，促进各种菌的生长，缩短了发酵时间。
(5)三种菌协同发酵后分段酶解有助于提高黄曲霉毒素的降解率和花生蛋白肽的得率
三种菌可以产生不同种类的蛋白酶，有利于花生粕中蛋白质的全面酶解，不仅可以提高花生蛋白肽的得率，可以将黄曲霉毒素和花生蛋白分开，有利于黄曲霉毒素的溶出和降解，起到提高黄曲霉毒素的降解率的作用；同时三种菌产生的纤维素酶可以酶解花生粕中的纤维素，有利于花生蛋白和黄曲霉毒素的溶出，提高黄曲霉毒素的降解率和花生蛋白肽的得率。
(6)云芝在花生根培养基上活化后，活力提高。缩短了花生粕的发酵时间；同时花生根中含有多种活性物质，不仅起到了增加花生粕营养的作用，还起到了发酵过程中抑制杂菌生长的作用。
(7)枯草芽孢杆菌在花生粕水溶液中活化，可以诱导枯草芽孢杆菌产生能够酶解花生粕蛋白(高变性)的酶类，起到提高花生蛋白肽得率的作用。
(8)制备的花生蛋白肽不含有有害物质，并且保留了花生的营养价值；同时三种菌的协同发酵还增加了花生蛋白肽更多的保健功能，如增强机体免疫力、抗衰老、增强学习记忆能力、促进核酸、蛋白质的合成、保肝、解毒以及治疗高血压和高血脂症、保护心血管等功效。
(9)花生蛋白肽产品具有较好的抗氧化活性，如清除DPPH自由基、清除羟自由基、清除超氧阴离子自由基、铁还原力、钼还原力、铁离子螯合力、铜离子螯合力、抑制亚油酸过氧化能力、抗脂质体过氧化能力等。因此，它可以作为一种功能食品用于延缓机体衰老，预防“三高”疾病的发生，同时，也可以作为一种天然抗氧化剂用在食品工业中，防止食品因脂肪氧化而变质，提高食品货架期内的品质稳定性。此外，花生抗氧化肽产品还具有较好的功能性质，如乳化性、乳化稳定性、起泡性、泡沫稳定性、溶解性、吸水性、吸油性等。在食品加工过程中，它能赋予食品特有的加工特性，使终产品具有特殊的功能性质。
附图说明
图1本发明制备的花生蛋白肽的溶解性；
图2本发明制备的花生蛋白肽的起泡性和泡沫稳定性，左侧为起泡性，右侧为起泡稳定性；
图3本发明制备的花生蛋白肽的乳化活性和乳化稳定性，左侧为乳化性，右侧为乳化稳定性；
图4本发明制备的花生蛋白肽的吸水性；
图5本发明制备的花生蛋白肽的吸油性。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
菌种准备：
云芝菌活化方法：将6-8菌种塞(7mm直径)的云芝菌株接种于10g直径大约为5mm的花生根粉中，25-30℃活化培养5-7d，制得云芝活化菌种，菌种浓度达到6×103～6×105cfu·g-1花生根粉。
枯草芽孢杆菌活化方法：将枯草芽孢杆菌接种于花生粕水溶液中，25-30℃活化培养2-3d，制得枯草芽孢杆菌菌种液，此时枯草芽孢杆菌菌种浓度为8×105～8×106cfu·mL-1。
的黑曲霉活化方法：将2-3菌种环的黑曲霉菌株接种于10g直径5mm的花生根粉中，25-30℃活化培养3-5d，制得黑曲霉活化菌种，黑曲霉菌种浓度为7×108～7×109cfu·g-1花生根粉。
其中，上述所用云芝购买于湖北省武汉华中食用菌栽培研究所；枯草芽孢杆菌为中国农业微生物菌种保藏中心的菌种(ACCC01185)；黑曲霉为中国工业微生物菌种保藏中心的菌种(CICC2039)。
实施例1
花生粕原料中黄曲霉毒素总量为92μg/kg(其中B1是55μg/kg，B2是16μg/kg，G1是19μg/kg，G2是2μg/kg)，环匹阿尼酸含量为52μg/kg。10g花生粕加入20mL的水，灭菌，接种经花生根发酵活化云芝菌种1g，25℃固体发酵8d，再向发酵的花生粕中接种花生粕水溶液活化过的枯草芽孢杆菌菌种1mL，30℃固体发酵3d，再向花生粕中接种花生根活化过的黑曲霉1g，35℃固体发酵3d；发酵后的培养基加入30mL的蒸馏水，33℃震荡酶解2h后，25℃震荡酶解8h；酶解液100℃灭酶处理15min，冷却至室温后用高速离心机10000rpm离心10min；将离心得到的上清液进行喷雾干燥，入料温度为50℃，进风温度为180℃，进风量为22m3/h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率为85.21％，花生蛋白肽中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和环匹阿尼酸未检出。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除DPPH自由基的IC50值为9.33mg/mL，清除羟自由基的IC50值为4.09mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC50值为5.98mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为6.37mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为5.11mg/mL，铁离子螯合力的IC50值为5.47mg/mL，铜离子螯合力的IC50值为3.58mg/mL，抑制亚油酸过氧化能力的IC50值为4.34mg/mL抑制脂质过氧化能力的IC50值为4.95mg/mL。
对照实验1：花生粕原料中黄曲霉毒素总量为92μg/kg(其中B1是55μg/kg，B2是16μg/kg，G1是19μg/kg，G2是2μg/kg)，环匹阿尼酸含量为52μg/kg。10g花生粕加入20mL的水，灭菌，接种经花生根发酵活化云芝菌种1g，25℃固体发酵8d，30℃固体发酵3d，35℃固体发酵3d；发酵后的培养基加入30mL的蒸馏水，33℃震荡酶解2h后，25℃震荡酶解8h；酶解液100℃灭酶处理15min，冷却至室温后用高速离心机10000rpm离心10min；将离心得到的上清液进行喷雾干燥，入料温度为50℃，进风温度为180℃，进风量为22m3/h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率为5.21％，花生蛋白肽中黄曲霉毒素量为51μg/kg(其中B1为30.5μg/kg、B2为8.9μg/kg、G1为10.5μg/kg、G2为1.1μg/kg)和环匹阿尼酸含量为42μg/kg。该抗氧化肽无抗氧化活性。
对照实验2：花生粕原料中黄曲霉毒素总量为92μg/kg(其中B1是55μg/kg，B2是16μg/kg，G1是19μg/kg，G2是2μg/kg)，环匹阿尼酸含量为52μg/kg。10g花生粕加入20mL的水，灭菌，向发酵的花生粕中接种花生粕水溶液活化过的枯草芽孢杆菌菌种1mL，30℃固体发酵3d，35℃固体发酵3d；发酵后的培养基加入30mL的蒸馏水，33℃震荡酶解2h后，25℃震荡酶解8h；酶解液100℃灭酶处理15min，冷却至室温后用高速离心机10000rpm离心10min；将离心得到的上清液进行喷雾干燥，入料温度为50℃，进风温度为180℃，进风量为22m3/h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率为21.75％，花生蛋白肽中黄曲霉毒素总量为78μg/kg(其中B1为46.6μg/kg、B2为13.6μg/kg、G1为16.1μg/kg、G2为1.7μg/kg)和环匹阿尼酸43μg/kg。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除DPPH自由基的IC50值为15.46mg/mL，清除羟自由基的IC50值为8.77mg/mL，除超氧阴离子自由基的IC50值为6.53mg/mL，清铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为7.85mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为6.17mg/mL，铁离子螯合力的IC50值为6.14mg/mL，铜离子螯合力的IC50值为4.58mg/mL，抑制亚油酸过氧化能力的IC50值为5.39mg/mL，抑制脂质过氧化能力的IC50值为5.99mg/mL。
对照实验3：花生粕原料中黄曲霉毒素总量为92μg/kg(其中B1是55μg/kg，B2是16μg/kg，G1是19μg/kg，G2是2μg/kg)，环匹阿尼酸含量为52μg/kg。10g花生粕加入20mL的水，灭菌，向花生粕中接种花生根活化过的黑曲霉1g，35℃固体发酵3d；发酵后的培养基加入30mL的蒸馏水，33℃震荡酶解2h后，25℃震荡酶解8h；酶解液100℃灭酶处理15min，冷却至室温后用高速离心机10000rpm离心10min；将离心得到的上清液进行喷雾干燥，入料温度为50℃，进风温度为180℃，进风量为22m3/h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率为25.41％，花生蛋白肽中黄曲霉毒素总量为69μg/kg(其中B1为41.25μg/kg、B2为12μg/kg、G1为14.25μg/kg、G2为1.5μg/kg)和环匹阿尼酸40μg/kg。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除DPPH自由基的IC50值为14.24mg/mL，清除羟自由基的IC50值为7.38mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC50值为6.24mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为7.76mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为6.01mg/mL，铁离子螯合力的IC50值为6.07mg/mL，铜离子螯合力的IC50值为4.35mg/mL，抑制亚油酸过氧化能力的IC50值为5.26mg/mL，抑制脂质过氧化能力的IC50值为5.81mg/mL。
实施例2
花生粕原料中黄曲霉毒素总量为92μg/kg(其中B1是55μg/kg，B2是16μg/kg，G1是19μg/kg，G2是2μg/kg)，环匹阿尼酸含量为52μg/kg。10g花生粕加入20mL的水，灭菌，接种经花生根发酵活化云芝菌种0.7g，28℃固体发酵6d，再向发酵的花生粕中接种花生粕水溶液活化过的枯草芽孢杆菌菌种0.7mL，32℃固体发酵4d，再向花生粕中接种花生根活化过的黑曲霉0.7g，32℃固体发酵4d；发酵后的培养基加入40mL的蒸馏水，34℃震荡酶解1.5h后，23℃震荡酶解10h；酶解液100℃灭酶处理15min，冷却至室温后用高速离心机10000rpm离心10min；将离心得到的上清液进行喷雾干燥，入料温度为50℃，进风温度为180℃，进风量为22m3/h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率为89.43％，花生蛋白肽中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和环匹阿尼酸未检出。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除DPPH自由基的IC50值为8.63mg/mL，清除羟自由基的IC50值为3.59mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC50值为5.08mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为6.07mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为4.81mg/mL，铁离子螯合力的IC50值为4.97mg/mL，铜离子螯合力的IC50值为3.08mg/mL，抑制亚油酸过氧化能力的IC50值为4.04mg/mL抑制脂质过氧化能力的IC50值为4.05mg/mL。
对照实验4：花生粕原料中黄曲霉毒素总量为92μg/kg(其中B1是55μg/kg，B2是16μg/kg，G1是19μg/kg，G2是2μg/kg)，环匹阿尼酸含量为52μg/kg。10g花生粕加入20mL的水，灭菌，向花生粕中接种花生粕水溶液活化过的枯草芽孢杆菌菌种0.7mL，32℃固体发酵4d，再向花生粕中接种花生根活化过的黑曲霉0.7g，32℃固体发酵4d；发酵后的培养基加入40mL的蒸馏水，34℃震荡酶解1.5h后，23℃震荡酶解10h；酶解液100℃灭酶处理15min，冷却至室温后用高速离心机10000rpm离心10min；将离心得到的上清液进行喷雾干燥，入料温度为50℃，进风温度为180℃，进风量为22m3/h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率为60.21％，花生蛋白肽中黄曲霉毒素总量为88μg/kg(其中B1为52.6μg/kg、B2为15.3μg/kg、G1为18.2μg/kg、G2为1.9μg/kg)和环匹阿尼酸62μg/kg。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除DPPH自由基的IC50值为11.23mg/mL，清除羟自由基的IC50值为6.59mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC50值为5.98mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为6.97mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为5.91mg/mL，铁离子螯合力的IC50值为5.97mg/mL，铜离子螯合力的IC50值为4.18mg/mL，抑制亚油酸过氧化能力的IC50值为4.94mg/mL，抑制脂质过氧化能力的IC50值为5.75mg/mL。
对照实验5：花生粕原料中黄曲霉毒素总量为92μg/kg(其中B1是55μg/kg，B2是16μg/kg，G1是19μg/kg，G2是2μg/kg)，环匹阿尼酸含量为52μg/kg。10g花生粕加入20mL的水，灭菌，接种经花生根发酵活化云芝菌种0.7g，28℃固体发酵6d，再向花生粕中接种花生根活化过的黑曲霉0.7g，32℃固体发酵4d；发酵后的培养基加入40mL的蒸馏水，34℃震荡酶解1.5h后，23℃震荡酶解10h；酶解液100℃灭酶处理15min，冷却至室温后用高速离心机10000rpm离心10min；将离心得到的上清液进行喷雾干燥，入料温度为50℃，进风温度为180℃，进风量为22m3/h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率为54.69％，花生蛋白肽中黄曲霉毒素总量为53μg/kg(其中B1为31.7μg/kg、B2为9.2μg/kg、G1为10.9μg/kg、G2为1.2μg/kg)和环匹阿尼酸31μg/kg。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除DPPH自由基的IC50值为12.86mg/mL，清除羟自由基的IC50值为7.01mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC50值为6.15mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为7.09mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为6.11mg/mL，铁离子螯合力的IC50值为6.08mg/mL，铜离子螯合力的IC50值为4.27mg/mL，抑制亚油酸过氧化能力的IC50值为5.17mg/mL，抑制脂质过氧化能力的IC50值为5.94mg/mL。
对照实验6：花生粕原料中黄曲霉毒素总量为92μg/kg(其中B1是55μg/kg，B2是16μg/kg，G1是19μg/kg，G2是2μg/kg)，环匹阿尼酸含量为52μg/kg。10g花生粕加入20mL的水，灭菌，接种经花生根发酵活化云芝菌种0.7g，28℃固体发酵6d，再向发酵的花生粕中接种花生粕水溶液活化过的枯草芽孢杆菌菌种0.7mL，32℃固体发酵4d；发酵后的培养基加入40mL的蒸馏水，34℃震荡酶解1.5h后，23℃震荡酶解10h；酶解液100℃灭酶处理15min，冷却至室温后用高速离心机10000rpm离心10min；将离心得到的上清液进行喷雾干燥，入料温度为50℃，进风温度为180℃，进风量为22m3/h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率为59.87％，花生蛋白肽中黄曲霉毒素总量为48μg/kg(其中B1为28.7μg/kg、B2为8.3μg/kg、G1为9.9μg/kg、G2为1.1μg/kg)和环匹阿尼酸24μg/kg。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除DPPH自由基的IC50值为12.28mg/mL，清除羟自由基的IC50值为6.87mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC50值为6.03mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为7.02mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为6.04mg/mL，铁离子螯合力的IC50值为6.00mg/mL，铜离子螯合力的IC50值为4.23mg/mL，抑制亚油酸过氧化能力的IC50值为5.07mg/mL，抑制脂质过氧化能力的IC50值为5.81mg/mL。
实施例3
花生粕原料中黄曲霉毒素总量为92μg/kg(其中B1是55μg/kg，B2是16μg/kg，G1是19μg/kg，G2是2μg/kg)，环匹阿尼酸含量为52μg/kg。10g花生粕加入25mL的水，灭菌，接种经花生根发酵活化云芝菌种0.7g，28℃固体发酵6d，再向发酵的花生粕中接种花生粕水溶液活化过的枯草芽孢杆菌菌种0.7mL，32℃固体发酵4d，再向花生粕中接种花生根活化过的黑曲霉0.7g，32℃固体发酵4d；发酵后的培养基加入40mL的蒸馏水，35℃震荡酶解1h后，22℃震荡酶解12h；酶解液100℃灭酶处理15min，冷却至室温后用高速离心机10000rpm离心10min；将离心得到的上清液进行喷雾干燥，入料温度为50℃，进风温度为180℃，进风量为22m3/h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率为88.93％，花生蛋白肽中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和环匹阿尼酸未检出。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除DPPH自由基的IC50值为8.43mg/mL，清除羟自由基的IC50值为3.39mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC50值为4.95mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为5.85mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为4.61mg/mL，铁离子螯合力的IC50值为4.57mg/mL，铜离子螯合力的IC50值为2.98mg/mL，抑制亚油酸过氧化能力的IC50值为3.94mg/mL，抑制脂质过氧化能力的IC50值为3.85mg/mL。
对照实验7：花生粕原料中黄曲霉毒素总量为92μg/kg(其中B1是55μg/kg，B2是16μg/kg，G1是19μg/kg，G2是2μg/kg)，环匹阿尼酸含量为52μg/kg。10g花生粕加入25mL的水，灭菌，向花生粕中接种花生粕水溶液活化过的枯草芽孢杆菌菌种0.7mL，32℃固体发酵4d，再向花生粕中接种花生根活化过的黑曲霉0.7g，32℃固体发酵4d；发酵后的培养基加入40mL的蒸馏水，22℃震荡酶解13h；酶解液100℃灭酶处理15min，冷却至室温后用高速离心机10000rpm离心10min；将离心得到的上清液进行喷雾干燥，入料温度为50℃，进风温度为180℃，进风量为22m3/h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率为72.53％，花生蛋白肽中黄曲霉毒素总量为35μg/kg(其中B1为20.9μg/kg、B2为6.1μg/kg、G1为7.2μg/kg、G2为0.8μg/kg)和环匹阿尼酸29μg/kg。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除DPPH自由基的IC50值为10.43mg/mL，清除羟自由基的IC50值为5.59mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC50值为5.85mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为7.65mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为5.81mg/mL，铁离子螯合力的IC50值为5.87mg/mL，铜离子螯合力的IC50值为3.91mg/mL，抑制亚油酸过氧化能力的IC50值为4.84mg/mL，抑制脂质过氧化能力的IC50值为4.95mg/mL。
对照实验8：花生粕原料中黄曲霉毒素总量为92μg/kg(其中B1是55μg/kg，B2是16μg/kg，G1是19μg/kg，G2是2μg/kg)，环匹阿尼酸含量为52μg/kg。10g花生粕加入25mL的水，灭菌，接种经花生根发酵活化云芝菌种0.7g，28℃固体发酵6d，再向发酵的花生粕中接种花生粕水溶液活化过的枯草芽孢杆菌菌种0.7mL，32℃固体发酵4d，再向花生粕中接种花生根活化过的黑曲霉0.7g，32℃固体发酵4d；发酵后的培养基加入40mL的蒸馏水，22℃震荡酶解13h；酶解液100℃灭酶处理15min，冷却至室温后用高速离心机10000rpm离心10min；将离心得到的上清液进行喷雾干燥，入料温度为50℃，进风温度为180℃，进风量为22m3/h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率为72.44％，花生蛋白肽中黄曲霉毒素总量为23μg/kg(其中B1为13.75μg/kg、B2为4.0μg/kg、G1为4.75μg/kg、G2为0.5μg/kg)和环匹阿尼酸15μg/kg。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除DPPH自由基的IC50值为9.08mg/mL，清除羟自由基的IC50值为4.25mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC50值为5.23mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为6.58mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为5.21mg/mL，铁离子螯合力的IC50值为4.99mg/mL，铜离子螯合力的IC50值为3.37mg/mL，抑制亚油酸过氧化能力的IC50值为4.32mg/mL，抑制脂质过氧化能力的IC50值为4.28mg/mL。
一、花生抗氧化肽的功能性质
以实施例3中方法制备的花生蛋白肽为例，以市售花生蛋白粉作为对照，测定本发明方法制备的花生蛋白肽的功能性质。
1.1功能性测定方法
1.1.1溶解度测定方法
1％(m/V)蛋白产品溶于去离子水中，用1.0mol/LNaOH或HCl调溶液pH值7.0，在室温下搅拌1h后，离心3000r/min，20min，收集上清液。取20mL上清液浓缩后测定蛋白含量(蛋白换算系数6.25)。
蛋白质的溶解性＝上清液中蛋白质含量/原料中总的蛋白质含量×100％。
1.1.2起泡性和泡沫稳定性测定方法
取0.45g蛋白，加入30mL蒸馏水，pH值调节到一恒定值，用转速为10000r/min的高速分散器搅拌2min，立即倒入100mL量筒中，读取泡沫体积A1，静置30min后再读取泡沫体积A2。
则起泡性(％)＝A1/B×100。式中：A1为起泡后量筒中泡沫体积，mL；B为起泡前液体体积，30mL。
泡沫稳定性(％)＝A2/A1×100。式中：A2为静置30min后量筒中泡沫体积，mL。
1.1.3乳化活性指数和乳化稳定性测定方法
采用浊度法测定，具体操作如下：取0.5％浓度(m/V)的pH为7.0的蛋白溶液40mL，加入40mL大豆油；用高速分散器(转速10000～12000r/min)搅拌2min；用注射器从底部取50μL乳状液，与10mL0.1％的SDS缓冲溶液混合均匀；在500nm波长下比色，记录吸光度(E0)；10min后再从底部取50μL乳状液，同样稀释，比色，记录吸光度(Et)。蛋白质的乳化能力以乳化能力指数E0和乳化稳定性指数ESI(min)表示，试验做3次重复。
其中ESI＝E0×t/(E0-Et)；
式中t—乳状液放置时间，min。
1.1.4吸水性测定方法
采用Beuchat(1977)的方法进行。10％的蛋白液10mL移入15mL离心管中，旋涡震荡2min确保蛋白全部均匀分散，室温下静置30min，离心3000r/min，20min。弃上清液，称重。试验做3次重复。
吸水性＝(W2-W1)/W0；
式中W0-蛋白质量，g；W1-离心管重+蛋白质量，g；W2-离心管重+沉淀物质量，g。
1.1.5吸油性测定方法
采用Chakraborty(1986)方法进行。称取1g蛋白(W0)于15mL离心管中，移入10mL(V1)大豆油，并用旋涡震荡仪使溶液混合均匀，室温下静置30min，离心3000r/min，20min，迅速将上层物小心移入干燥的10mL量筒中，记录体积(V2)。
持油性(mL/g)＝(V1-V2)/W0；试验做3次重复。
1.2结果及分析
1.2.1溶解度
本发明制备的花生蛋白粉的溶解性如图1所示：由图1可以看出，本发明方法制备的花生蛋白肽蛋白溶解度达到92％，而市售的花生蛋白粉的蛋白溶解度仅为52.1％，蛋白溶解度提高76.58％。
1.2.2起泡性和泡沫稳定性
本发明制备的花生蛋白粉的起泡性和泡沫稳定性如图2所示：由图2可以看出，本发明方法制备的花生蛋白肽起泡性为55％，而市售的花生蛋白粉的起泡性为32％；本发明制备的花生蛋白肽起泡稳定性为65％，而市售的花生蛋白粉的起泡稳定性为38％；本发明制备的花生蛋白肽起泡性比市售的花生蛋白粉起泡能力显著提高。
1.2.3乳化活性指数和乳化稳定性
本发明制备的花生蛋白粉的乳化活性指数和乳化稳定性如图3所示：由图3可以看出，本发明方法制备的花生蛋白肽乳化性达到0.6，而市售的花生蛋白粉的乳化性为0.42；本发明制备的花生蛋白肽乳化稳定性达到72.59％，而市售的花生蛋白粉乳化稳定性为45.25％。本发明制备的花生蛋白肽乳化能力比市售的花生蛋白粉显著提高。
1.2.4吸水性
本发明制备的花生蛋白粉的吸水性如图4所示：由图4可以看出，本发明方法制备的花生蛋白肽吸水性达到3.61g/g，而市售的花生蛋白粉的吸水性为2.12g/g；本发明制备的花生蛋白肽吸水性比市售的花生蛋白粉吸水性显著提高。
1.2.5吸油性
本发明制备的花生蛋白粉的吸油性如图5所示：由图5可以看出，本发明方法制备的花生蛋白肽吸油性达到3.86mL/g，而市售的花生蛋白粉的吸油性为2.3mL/g；本发明制备的花生蛋白肽吸油性比市售的花生蛋白粉吸油性显著提高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (7)
1.一种花生粕中黄曲霉毒素降解及同步制备花生蛋白肽的方法，其特征在于：包括原料处理、微生物分段发酵、酶解、灭酶离心和喷雾干燥；微生物分段发酵所用微生物为：云芝菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉；具体步骤为：
(1)原料处理：将花生粕粉碎，过40目筛；向花生粕粉中加入2～3倍重量的蒸馏水，灭菌；
(2)微生物分段接种发酵：向灭菌的花生粕中接种活化后的云芝菌种，25-40℃固体发酵5-8d，再向发酵的花生粕中接种活化过的枯草芽孢杆菌，30-35℃固体发酵3-5d，再向花生粕中接种活化过的黑曲霉，28-35℃固体发酵3-5d；
(4)酶解：发酵后的培养基加入蒸馏水，33-35℃震荡酶解1-2h后，22-25℃震荡酶解8-12h；
(5)灭酶离心：酶解液100℃灭酶处理10-15min，冷却至室温后用高速离心机7000-10000rpm离心10-15min；
(6)喷雾干燥：将离心得到的上清液进行喷雾干燥，入料温度为50℃，进风温度为180-190℃，进风量为22-25m3/h，干燥完成后得到花生蛋白肽。
2.根据权利要求1所述花生粕中黄曲霉毒素降解及同步制备花生蛋白肽的方法，其特征在于：所述云芝菌与花生粕的质量比g/g为1∶20-2∶20；所述枯草芽孢杆菌与花生粕的体积质量比mL/g为1∶20-2∶20；所述黑曲霉与花生粕的质量比g/g为1∶20-2∶20。
3.根据权利要求1所述花生粕中黄曲霉毒素降解及同步制备花生蛋白肽的方法，其特征在于：所述云芝菌活化方法为：将直径7mm菌种塞的云芝菌株接种于10g直径为5mm的花生根粉中，25-30℃活化培养5-7d，制得云芝活化菌种，其中菌种浓度为6×103～6×105cfu·g-1。
4.根据权利要求1所述花生粕中黄曲霉毒素降解及同步制备花生蛋白肽的方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌活化方法为：将枯草芽孢杆菌接种于花生粕水溶液中，25-30℃活化培养2-3d，制得枯草芽孢杆菌菌种液，其中枯草芽孢杆菌菌种浓度为8×105～8×106cfu·mL-1。
5.根据权利要求1所述花生粕中黄曲霉毒素降解及同步制备花生蛋白肽的方法，其特征在于：所述的黑曲霉活化方法为：将2-3菌种环的黑曲霉菌株接种于10g直径5mm的花生根粉中，25-30℃活化培养3-5d，制得黑曲霉活化菌种，其中黑曲霉菌种浓度为7×108～7×109cfu·g-1。
6.根据权利要求1所述花生粕中黄曲霉毒素降解及同步制备花生蛋白肽的方法，其特征在于：酶解时，蒸馏水的添加量为微生物分段发酵后的培养基重量的3～5倍。
7.权利要求1～6任一项所述方法在花生粕环匹阿尼酸降解中的应用。
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| CN108034690A (zh) | 2018-05-15 |
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