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CN108026264A - 聚烷氧基脂肪族化合物 - Google Patents

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Abstract

提供一种具有结构(I)的聚烷氧基脂肪族化合物，其中R1是脂肪族基团；R2是H或被取代或未被取代的烃基；n为0到5；X1是S或NH；X2是O、S或NH；并且R3是包含结构(II)和结构(III)的聚合单元的聚合基团。

Description

聚烷氧基脂肪族化合物
经常期望提供蛋白质的水溶液。期望这类水溶液长时间保持稳定。缺乏稳定性包括例如以下过程中的任一种或两种：蛋白质的变性或蛋白质分子的聚集。
US 5,635,461描述一种具有下式的阴离子表面活性剂：
期望提供一种提高蛋白质水溶液稳定性的表面活性剂。还期望提供这类表面活性剂与蛋白质的混合物，其中混合物可以形成蛋白质的水溶液，其中溶液具有良好的稳定性。
以下是本发明的陈述。
本发明的第一方面是一种具有结构(I)的聚烷氧基脂肪族化合物，
其中R1是脂肪族基团；R2是H或被取代或未被取代的烃基；n为0到5；X1是S或NH；X2是O、S或NH；并且R3是包含结构(II)和结构(III)的聚合单元的聚合基团，
如果n为2或更大，则各X1基团可以彼此不同或彼此相同，或其任何组合。如果n为2或更大，则各R2基团可以彼此不同或彼此相同，或其任何组合。
本发明的第二方面是一种包含一种或多种蛋白质和一种或多种聚烷氧基脂肪族化合物的组合物，其中所述蛋白质与所述聚烷氧基脂肪族化合物的重量比为0.05:1到200:1，并且其中所述聚烷氧基脂肪族化合物具有结构(I)
其中R1是脂肪族基团；R2是H或被取代或未被取代的烃基；n是0到5；X1是O、S或NH；X2是O、S或NH；并且R3是包含(II)和(III)的聚合单元的聚合基团，
以下是对本发明的详细描述。
如本文中所使用，除非上下文另外明确指示，否则以下术语具有指定定义。
聚烷氧基化合物是含有一个或多个具有结构-(-A-O)m-的基团的化合物，其中m是三或更多，并且A是未被取代的烷基。基团A可以是直链的、分支链的、环状的或其组合。各-(-A-O)-基团之间的各A基团可以彼此相同或不同。
脂肪族化合物是含有一个或多个脂肪族基团的化合物。脂肪族基团是含有8个或更多个碳原子的基团，每个碳原子与基团中的一个或多个其它碳原子键合。聚烷氧基脂肪族化合物是既是聚烷氧基化合物又是脂肪族化合物的化合物。
烃基是含有氢和碳原子的基团。未被取代的烃基仅含有氢和碳原子。被取代的烃基含有一个或多个含有除氢和碳之外的一个或多个原子的取代基。
聚合基团是由较小的化学重复单元的反应产物组成的相对较大的分子。聚合基团的数均分子量为500或更高。聚合ic基团可以具有直链、分支连、星形、环形、超支化、交联或其组合的结构；聚合基团可以具有单一类型的重复单元(“均聚基团”)或其可以具有超过一种类型的重复单元(“共聚基团”)。共聚基团可以具有随机配置、依序配置、嵌段配置、其它配置或其任何混合或组合的各种类型的重复单元。
可以彼此反应以形成聚合基团的重复单元的分子在本文中称为“单体”。由此形成的重复单元在本文中称为单体的“聚合单元”。含有一个或多个聚合基团的化合物是聚合物。
蛋白质是其中聚合单元是氨基酸的聚合单元的聚合物。氨基酸通过肽键结合在一起。蛋白质含有20个或更多个一个或多个氨基酸的聚合单元。术语蛋白质包括线性多肽链以及含有多肽链的更加复杂的结构。
如果蛋白质分子以溶解的单个分子形式分布在整个连续液体介质中，则认为蛋白质在液体介质中的溶液中(或者，同义地，溶解在液体介质中)。如果连续液体介质含有以连续液体介质的重量计呈60重量％或更多的量的水，则认为蛋白质溶解在水中。
如果pH值在4.5和8.5之间，使得当化学基团在所述pH值下与水接触时，存在的那些化学基团的50摩尔％或更多呈离子形式，则化学基团是离子基团。
缓冲液为(i)一种化合物，其具有接纳质子以形成所述化合物的共轭酸的能力，并且所述化合物的共轭酸的pKa小于9，或(ii)一种化合物，其具有释放质子的能力，并且化合物的pKa大于5。
当比率在本文中称为X:1或更大时，其意指所述比率是Y:1，其中Y大于或等于X。举例来说，如果称比率是3:1或更大，那么所述比率可以是3:1或5:1或100:1，但不可以是2:1。类似地，当本文中称比率是W:1或更小时，其意指所述比率是Z:1，其中Z小于或等于W。举例来说，如果称比率是15:1或更小，那么所述比率可以是15:1或10:1或0.1:1，但不可以是20:1。
本发明的组合物是具有结构(I)的聚烷氧基脂肪族化合物，
其中R1是脂肪族基团；R2是H或被取代或未被取代的烃基；n是0到5；X1是O、S或NH；X2是O、S或NH；并且R3是包含结构(II)和结构(III)的聚合单元的聚合基团，
优选地，R1是被取代或未被取代的脂族基团。在被取代的脂族基团中，优选的取代基是羟基。更优选地，R1是未被取代的脂族基团；更优选地，R1是未被取代的烷基。优选地，R1是直链的。优选地，R1具有9个或更多个碳原子；更优选10个或更多个。优选地，R1具有22个或更少的碳原子；更优选20个或更少；更优选18个或更少；更优选16个或更少。
优选地，X1是NH。优选地，X2是O或NH；更优选NH。
优选地，R2具有20个或更少的原子；更优选15个或更少。优选地，如果R2不是氢，则R2含有一个或多个碳原子。优选地，R2是氢或未被取代的烃基；更优选地，R2是氢、未被取代的烷基或取代基仅是未被取代的芳族烃基的烷基。在未被取代的烷基中，优选甲基。在其中取代基仅为未被取代的芳族烃基的烷基中，优选的是-CH2-(C6H5)，其中-(C6H5)为苯环。优选地，选择R2使得具有结构(IV)的化合物：
将是20个典型生物氨基酸之一。
优选地，R3具有600或更高；更优选800或更高的数均分子量。优选地，R3具有10,000或更小；更优选5,000或更小；更优选为3,000或更小；更优选2,500或更小；更优选为2,000或更小；更优选1,500或更小的数均分子量。优选地，基团R3是(II)和(III)的统计共聚物或(II)和(III)的嵌段共聚物；更优选地基团R3是(II)和(III)的统计共聚物。优选地，-R3具有结构-R4-CH3，其中R4是包含结构(II)和结构(III)的聚合单元的聚合基团。优选地，除了结构(II)和(III)之外，R4不具有其它聚合单元。
优选地，n为0或1。
表征结构(II)的单元与结构(III)的单元的摩尔比(在此为“PO/EO比率”)是有用的。优选地，PO/EO比率为0.01:1或更大；更优选0.02:1或更大；更优选0.05:1或更大；更优选为0.1:1或更大。优选地，PO/EO比率为2:1或更小；更优选1.5:1或更小；更优选为1:1或更小；更优选0.5:1或更小。
优选地，结构(I)的化合物不具有离子基团。
结构(I)的化合物可以通过任何方法制备。优选的方法是使具有结构NH2-R3的化合物与选自结构V的化合物的化合物反应
和结构VI的化合物
其中X3是O、S或NH。R1、X2、R2、R3和n的优选与上文所描述的相同。优选地，X3是O。
制造结构(I)化合物的一些实施例的更优选方法如下。在第一步骤中，使酰氯与氨基酸反应以形成羧基官能脂肪酰胺，如下：
然后，在第二步骤中，羧基官能脂肪酰胺与胺封端的聚烷氧基化合物反应如下：
其中PO是结构(II)并且EO是结构(III)。
结构(I)的化合物的优选使用是在含有一种或多种蛋白质和一种或多种结构(I)的化合物的组合物中。
优选的蛋白质具有40个或更多个；更优选100个或更多个的氨基酸聚合单元。
优选的蛋白质选自单克隆抗体、生长因子、胰岛素、免疫球蛋白、多克隆抗体、激素、酶、多肽、肽的融合物、糖基化蛋白、抗原、抗原亚基或其组合。优选的蛋白质具有治疗疾病或医学病症的疗效或充当疫苗。还考虑了对食品组合物或清洁组合物或涂料配制物具有有益作用的蛋白质。
优选地，蛋白质与结构(I)的化合物的重量比为0.1:1或更大；更优选0.2:1或更大；更优选0.5:1或更大；更优选为0.9:1或更大。优选地，蛋白质与结构(I)化合物的重量比为150:1或更小；更优选100:1或更小。
制备含有蛋白质和结构(I)化合物的配制物的优选方法是将水、一种或多种蛋白质、一种或多种结构(I)化合物以及任选的其它成分混合在一起以制备配制物(在此称为配制物“F1”)，其中蛋白质溶于水中。
优选地，以配制物F1的重量计，配制物F1中水的量为50重量％或更多；更优选60重量％或更多；更优选70重量％或更多。
在配制物F1中，优选地，即使聚集颗粒分散在液体介质中，蛋白质分子也不聚集成大颗粒。优选地，如果存在任何含有蛋白质分子的聚集颗粒，则这类颗粒的体积平均直径为10nm或更小；更优选为6nm或更小。
在配制物F1中，优选地，蛋白质的量为0.01mg/mL或更多；更优选0.1mg/mL或更多；更优选0.9mg/mL或更多；在配制物F1中，优选地蛋白质的量为400mg/mL或更少；更优选300mg/mL或更少；更优选250mg/mL或更少。
在配制物F1中，优选地结构(I)化合物的量为0.01mg/mL或更多；更优选0.1mg/mL或更多；更优选0.5mg/mL或更多。在配制物F1中，优选地结构(I)的化合物的量为50mg/mL或更少；更优选10mg/mL或更少；更优选5mg/mL或更少。
配制物F1任选地含有一种或多种其它成分。其它成分是除水、蛋白质和具有结构(I)的化合物以外的化合物。优选的其它成分是不具有结构(I)的表面活性剂、糖、盐、缓冲液、氨基酸、氨基酸的盐以及其混合物。当存在这类其它成分时，优选地所有其它成分的总量为300mg/mL或更少。
为了包括在配制物F1中，在不具有结构(I)的表面活性剂中，优选的是非离子表面活性剂；更优选的是脱水山梨糖醇单月桂酸酯(例如聚山梨酸酯20和聚山梨酸酯80)的聚氧乙烯衍生物和具有环氧丙烷聚合单元中心嵌段和环氧乙烷聚合单元末端嵌段的三嵌段共聚物(例如泊洛沙姆F127和泊洛沙姆188)。
为了包括在配制物F1中，优选的糖是蔗糖、葡萄糖、甘露糖、海藻糖、麦芽糖以及其混合物。
为了包括在配制物F1中，优选的盐具有选自氢、钠、钾、镁、钙、铵以及其混合物的阳离子。优选的盐具有选自氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、硫酸盐以及其混合物的阴离子。优选的缓冲液具有选自氢、钠、钾、镁、钙、铵以及其混合物的阳离子。优选的缓冲液具有选自氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、硫酸盐以及其混合物的阴离子。
为了包括在配制物F1中，优选的氨基酸以及其盐选自赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、组氨酸以及其混合物。
在配制物F1中，考虑含有蛋白质的颗粒溶解在连续的含水介质中。在除了存在于配制物F1中的蛋白质以外的化合物中，每种化合物可以独立于其它化合物被发现溶解在水性介质中；被发现在不含蛋白质的分散颗粒中；被发现附着在一些或全部蛋白质的溶解分子上；或被发现分布在两个或更多个这些位置之间。
考虑配制物F1将具有良好的稳定性。也就是说，考虑配制物F1将抵抗蛋白质的变性并且将抵抗溶解的分子聚集成聚集颗粒。
存储和/或运输蛋白质与结构(I)化合物的混合物的一种方法是制备配制物F1，然后通过干燥过程从配制物F1中除去水。考虑通过干燥配制物F1(在此称为固体“S1”)产生的固体材料可以容易地存储和运输而不使蛋白质变性或其它降解。进一步考虑，在运输和/或存储之后，可以使固体S1与水混合以产生具有与配制物F1的特性相似的特性的溶液。
以下是本发明的实例。
除非另有说明，否则程序在约23℃的室温下进行。
使用以下术语和缩写。
BSA＝牛血清白蛋白
IgG＝免疫球蛋白G；通常可从兔或人血清中获得；在以下实例中，记录IgG的来源。
THF＝四氢呋喃
PO＝结构(II)
EO＝结构(III)
PEA1＝JeffamineTM M1000聚醚胺(Hunstman)，近似分子量为1000，并且PO/EO比率为3/19
PEA2＝JeffamineTM M2070聚醚胺(Hunstman)，近似分子量为2070，并且PO/EO比率为10/31
动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)测量如下进行。在WyattDyanaProTM高通量DLS仪器上进行光散射测量。在柠檬酸盐-盐水缓冲液(pH 7、15毫摩尔柠檬酸钠、150毫摩尔氯化钠)中制备具有可变蛋白质浓度和1mg/mL表面活性剂的样品。恩瑞舒(Orencia)TM和英夫利西单抗(Remicade)TM粉末用水而不是缓冲液重构。将30μL各样品置于底部清澈的Aurora 384孔黑色环烯烃聚合物板(Brooks Life Science Systems)的孔中。在每个孔的顶部加入15μL硅油。对于温度升高研究，使样品在25℃下平衡，然后以0.05℃/min升至80℃。连续获得DLS测量值，孔至孔循环，每个循环每孔为5×3秒采集。对于等温研究，样品以1℃/min升至40℃、50℃并连续收集最终温度(英夫利西单抗为50℃、BSA为65℃、恩瑞舒为73℃)和数据，历时约36小时。
圆形二向色性实验(CD)在JASCO J-1500CD分光偏振计上进行。在10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH 7.3)中制备蛋白质溶液[5％BSA(50mg/mL)和0.2％IgG(2mg/mL)]。在测量前用PBS缓冲液将BSA样品稀释1:10。
纳米差示扫描量热法(nano-DSC)使用美国Calorimetry Science Corporation的6100型Nano II DSC进行。在0.3MPa(3巴)的压力和1℃/min的扫描速率下扫描样品(通常2.5mg/ml蛋白质溶液)和参考物(磷酸盐缓冲液)。扫描从15℃到105℃。
结构(I)化合物(“表面活性剂”)的合成如下进行：
通过使肉豆蔻酰氯与甘氨酸在氢氧化钠和三乙胺存在下在室温(大约23℃)下反应4小时制备N-肉豆蔻酰基氨基酸衍生物。将N-肉豆蔻酰氨基酸衍生物(5mmol)和聚醚胺(PEA1或PEA2)(5mmol胺基团)加入到含有搅拌棒并配有冷凝器和气体入口适配器的50mL单颈圆底烧瓶中。将烧瓶置于油浴中并如下加热：100℃下1h、125℃下1h、150℃下1h、175℃下1.5h、200℃下1.5h。在此时间期间，一旦反应温度达到175-200℃，就观察到放水现象(water evolution)。将反应混合物冷却至室温(约23℃)，对烧瓶施加真空，然后将烧瓶在100℃下再加热30min、在125℃下30min、在150℃下30min、在175℃下30min并且在200℃下2h。停止加热，并且使反应混合物冷却至室温，并且然后用氮气回充烧瓶。1H和13C NMR谱与表面活性剂的结构一致。
对于n＝0的结构(I)的化合物，如上所述，使肉豆蔻酰氯直接与聚醚胺树脂反应。
在制备的每种本发明的表面活性剂中，R1-是CH3(CH2)11CH2-。X1和X2两者都是N。R3是氧化丙烯单元和氧化乙烯单元的共聚物，用甲基封端。
所制备的本发明的表面活性剂如下：
实例 标签 n R 2 PEA
1 GM1000 1 H PEA1
2 AM1000 1 CH3 PEA1
3 FM1000 1 注(1) PEA1
4 0M1000 0 无 PEA1
5 GM2000 1 H PEA2
注(1)：R2是
实例1：含有BSA的蛋白质溶液的测试
如所示，扫描具有各种表面活性剂的5mg/mL BSA的DLS。扫描速度从25℃到80℃为0.05℃/分钟。表面活性剂全部为1mg/mL。在扫描DLS中，测试样品随温度变化的体积平均粒径。每个样品最终显示直径的增加。记录起始温度(T起始)。T起始越高意味着越稳定的蛋白质溶液。
利用各种表面活性剂(5mg/mL)进行BSA(5mg/mL)的Nano-DSC。热流对温度的Nano-DSC图显示60℃与85℃之间的峰，标记为“展开”峰，并且表示蛋白质以最大速率变性时的温度。报告展开峰的温度(Tm)。Tm越高意味着蛋白质溶液越稳定。
在70℃下热老化30分钟后测量具有不同表面活性剂的圆二色性(CD)BSA样品(5mg/mL)。CD对波长的图显示在222nm的峰，表示α-螺旋的吸光度。α-螺旋峰的减少表明变性。对于每个样品而言，检查222nm处的CD，并比较初始样品的值与在70℃下热老化30分钟之后的相同样品的值之间的差值；这个差值报告为ΔCD。ΔCD的绝对值越高意味着蛋白质溶液越不稳定。
还在62℃下进行了具有1mg/mL表面活性剂的BSA(5mg/mL)的等温DLS。测量随时间而变化的体积平均粒径。记录2000秒时的直径(D2k)。D2k值越低意味着越稳定的蛋白质溶液。
结果如下。“nt”意味未测试。
注(2)：鉴于实验的变化性，认为4或更小的值等于零。
在T起始结果中，所有本发明实例显示与比较实例相当或更好的稳定性，并且实例2、3和4尤其优于比较实例。在Tm结果中，所有本发明实例均显示与比较实例相当或更好的稳定性，并且实例4尤其优于比较实例。在ΔCD结果中，所有本发明的实例都显示出远胜于比较样品的结果。在D2k结果中，测试的唯一本发明实例、实例4优于比较实例。
实例2：含有IgG的蛋白质溶液的测试
对含有1mg/mL兔IgG的蛋白质溶液，以0.05℃/min从25℃至80℃进行扫描DLS，表面活性剂全部为1mg/mL。所有样品的T起始均为66℃，但随着温度升高到T起始以上，使用实例1的样品显示出比所有其它样品慢得多的粒径生长。
等温DLS在65℃下在1mg/mL来自兔的IgG下进行，并且报告在4000秒的大小(D4k)。使用人类IgG的CD技术比较由于在65℃下热老化18小时而在218nm处的吸光度变化。结果如下：
类型 表面活性剂 D4k(nm) ΔCD(mdeg)
比较 无 >200 -22
比较 聚山梨酸酯20 22 -21
比较 聚山梨醇酯80 30 nt
比较 烷基麦芽糖苷 30 nt
本发明 实例3 12.2 -15.5
本发明 实例5 40 nt
本发明 实例2 30 -16
本发明 实例4 25 -18
本发明 实例1 25 -17.5
在ΔCD结果中，本发明实例优于比较实例。在D4k结果中，实例3优于比较实例。
实例3：使用恩瑞舒TM粉末的结果。
恩瑞舒TM(阿巴西普(abatacept))粉末(由Bristol-Myers Squib生产)通过处方获得。用水将恩瑞舒稀释至4mg/mL，并通过扫描DLS检测T起始。另外，用水将恩瑞舒稀释至10mg/mL，并在73℃下通过等温DLS进行测试，并且在20小时记录直径(D20h)。在蛋白质溶液中，随着时间的推移，D20h趋于增大，并且较不稳定的溶液达到较高的D20h值。D20h的更小值意味着更稳定的蛋白质溶液。在等温步骤实验中测试1mg/mL的恩瑞舒溶液；通过DLS在50℃保持45小时、然后在60℃保持15小时期间测量随时间而变的颗粒直径。记录此过程结束时的直径Dstep。越小的Dstep值意味着越稳定的蛋白质溶液。
结果如下。
在T起始和D20h结果中，本发明样品比对比样品具有更稳定的蛋白质溶液。
实例4：英夫利昔单抗TM的测试结果
通过处方获得英夫利昔单抗TM(英夫利昔单抗)粉末(由Johnson and Johnson制造)。将英夫利昔单抗粉末在水中稀释至1mg/mL。使用扫描DLS，如上所述测量T起始。另外，等温DLS在50℃下进行，并且记录粒径开始迅速增长的时间(t-增长)。结果如下：
类型 表面活性剂 T 起始 (℃) t-增长(min)
比较 无 54 <10
比较 聚山梨酸酯20 53 1400
比较 聚山梨醇酯80 54 1400
比较 烷基麦芽糖苷 53 625
本发明 实例3 53 535
本发明 实例5 53 1100
本发明 实例2 53 250
本发明 实例4 53 175
本发明 实例1 53 870
本发明的样品显示出与比较样品相当的性能。

Claims (8)

1.一种具有结构(I)的聚烷氧基脂肪族化合物，
其中R1是脂肪族基团；R2是H或被取代或未被取代的烃基；n为0到5；X1是S或NH；X2是O、S或NH；并且R3是包含结构(II)和结构(III)的聚合单元的聚合基团，
2.根据权利要求1所述的聚烷氧基脂肪族化合物，其中-R3具有结构-R4-CH3，其中R4是包含(II)和(III)的聚合单元的聚合基团
3.根据权利要求1所述的聚烷氧基脂肪族化合物，其中-R3不具有离子基团。
4.根据权利要求1所述的聚烷氧基脂肪族化合物，其中-R3的数均分子量为600到10,000。
5.根据权利要求1所述的聚烷氧基脂肪族化合物，其中R2具有20个或更少的原子。
6.根据权利要求1所述的聚烷氧基脂肪族化合物，其中-R1是直链未被取代的烷基。
7.根据权利要求1所述的聚烷氧基脂肪族化合物，
其中-R1是具有10到16个碳原子的直链未被取代的烷基，
其中-R2选自由氢、甲基和-CH2-(C6H5)组成的群组，其中-(C6H5)为苯环，并且
其中-R3的数均分子量为800到3000。
8.一种制备权利要求1所述的聚烷氧基脂肪族化合物的方法，其中所述方法包含使具有结构NH2-R3的化合物与选自结构V化合物
和结构VI化合物的化合物反应，
其中X3是S或NH。
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