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CN101795680A - 稳定蛋白质的辅剂 - Google Patents

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CN101795680A
CN101795680A CN200880111421A CN200880111421A CN101795680A CN 101795680 A CN101795680 A CN 101795680A CN 200880111421 A CN200880111421 A CN 200880111421A CN 200880111421 A CN200880111421 A CN 200880111421A CN 101795680 A CN101795680 A CN 101795680A
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insulin
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described chemical
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杨国汉
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BOSTON PROTEIN SOLUTIONS
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Abstract

本发明揭示了一种将一类辅剂应用于蛋白质制剂的方法，以减缓或消除液体或固体中的蛋白质聚集的生成。这类化合物带有羰基，能与蛋白质表面的氨基形成席夫碱，还带有能使蛋白质分离的基团。

Description

稳定蛋白质的辅剂
背景技术
随着完善的基因重组技术的广泛应用，越来越多的蛋白质分子被作为医用药物进行研究和开发。寻找稳定的蛋白制剂配方在蛋白质分子发展成临床药物的过程中是极为重要的一个步骤。为此，人们就蛋白质稳定性进行了大量的研究工作，这些研究信息在文献中很容易获取。(a.Pearlman，R.and Wang，Y.J.，1996.Formulation，characterization，and stability of protein drugs.Plenum Press，NewYork.b.Chang，B.S.and Hershenson S.，Chapter 1，Practical Approaches toProtein Formulation Development，Rational Design of Stable Protein Formulations，edited by Carpenter and Manning.Kluwer Academic&Plenum Publishers，NewYord，2002)。然而，基于蛋白质分子的根本特性，大多数蛋白质分子在各种制剂中一般不会只以其天然形式存在。或多或少地，蛋白质会与一些辅剂一道制成溶液制剂或固体制剂(冻干、喷雾干燥、喷雾冻干)，以优化在生产和储存时蛋白质分子的稳定性。
除了各种化学反应之外，例如，二硫键异构化、脱酰胺反应、肽键裂解、氧化作用，大部分不稳定现象与非共价的聚集有关，这些聚集通常为免疫原性的，有时会产生沉淀。在溶液制剂中，酸碱度、离子添加剂、氨基酸、表面活性剂、蛋白质浓度、原料纯度都是可以调配并改良蛋白质分子稳定性的因素。在固体制剂中，蛋白质分子通常与缓冲溶液试剂、盐、大分子试剂(如甘露醇、蔗糖、海藻糖、柠檬酸等)配制在一起，使蛋白质分子互相分开，从而减少蛋白质聚集体的产生。
据报道，分子伴侣也能缓解或阻止蛋白质分子聚集(Anat Ben-Zvi，PaoloDe Los Rios，Giovanni Dietler，Pierre Goloubinoff，Active Solubilization andRefolding of Stable Protei Aggregates By Cooperative Unfolding Action ofIndividual Hsp70Chaperones，The Journal of Biological Chemistry，Vol.279，No.36，Issue of September 3，37298-37303，2004)。另外，还有报道称刚果红结合于FK506亲合蛋白和β-淀粉状蛋白多肽能阻止淀粉样纤维化的发生(Science，306，865，2004)。
以胰岛素为例，有各种方法用来减缓胰岛素的纤维化变性过程，从而扼止胰岛素在溶液中产生聚集体沉淀。在胰岛素溶液中添加锌可以使六个胰岛素与两个锌离子螯合成胰岛素六聚复合体，这种复合体比胰岛素单体要稳定得多。苯酚，间甲基苯酚也有利于胰岛素的稳定，诺和诺德(Novo Nordisk)的科学家Svend Havelund通过优化各种添加剂的配比增加肺吸胰岛素溶液的稳定性，取得一定进步。(US patent 6,211,144，and 6,489,292)安万特(Aventis Pharama)的科学家Peter Boderke用锌、表面活性剂吐温-20、吐温-80、泊洛沙姆171(Poloxamer 171)使得胰岛素产生纤维沉淀之前的稳定时间延长了五至七倍。(US patent 6,960,561B2)
据发现，胰岛素单体应用于肺部给药制剂时比胰岛素锌复合体更具优越性。美国公司Mannkind Corporation的科学家Solomon Steiner等利用哌嗪二酮制备了无锌胰岛素肺吸粉剂(US Patent 6,652885B2)，美国公司Aradigm的科学家Igor Conda等制备了赖脯胰岛素水雾喷剂。
这些单体胰岛素溶解性更好，通过肺膜吸收更快。
利用聚乙二醇进行化学修饰也能改良胰岛素的稳定性，但通常会由于化学修饰而降低其生物活性。
发明概要
本发明涉及一类辅剂在蛋白质制剂(包括治疗性蛋白)制备中的应用，该蛋白质制剂可以是溶液，胶体或固体，其目的在于减少甚至完全阻止蛋白质聚集体的产生。本发明还涉及一类辅剂在生产过程中的应用，该类辅剂在生产过程中可使得蛋白质更稳定。本发明还涉及该类辅剂在蛋白质制剂大量储存中的应用。本发明还涉及增加蛋白质产品(包括治疗性蛋白)货架存放的稳定性的方法。本发明还涉及增加蛋白质的溶解度和使得固体蛋白产品重新制备成溶液更加容易的方法。本发明还涉及该类辅剂与糖类辅剂(如葡萄糖)一起在蛋白质制剂制备中的应用，同时还涉及该类辅剂替代糖类辅剂以减低高浓度溶液粘度的应用。
本发明所涉及的还有：
一种利用一类带有电荷或大体积基团的羰基化合物来减缓蛋白质聚集的新的配制方法。羰基功能团与蛋白质分子表面的氨基形成可逆的席夫键(Schiffbond)，所带电荷或大体积基团改变蛋白质表面特性。
一类用于蛋白质制剂的辅剂化合物，具有以下通用化学结构。除此以外，只要带有一个或多个羰基，能与蛋白质形成席夫碱(Schiff base)，并且带有正电荷、负电荷、大体积基团的中的一种或多种，其它结构化合物也能提供所需的结构特征并作为合适的辅剂。
其中：
●在一定制剂pH值，尤其是接近生理pH值的情况下，或者在制剂产品较稳定的pH附近，R1或R2带有所需的正电荷或/和负电荷；“m”是1、或2、或3、或4、或5。
●或者，R1或R2带有大体积基团，包括糖、聚乙二醇、肽、核酸、无美拉德反应(Maillard reaction)效力的多羟基基团。
●R2是氢原子，或烃基，或芳香基，“n”是1，或2，或3。
●R1或R2带有一个或多个羰基以进一步加固席夫碱的形成。
●X是连接R1和R2的基团，X可以是含碳的直链、或环、或芳香基团、或化学键。
一类具有上述化学特征的化合物在蛋白质的生产过程，蛋白质制剂制备中的应用，旨在减缓或防止可溶或不可溶蛋白质形成聚集体。
一种利用上述化合物的蛋白制剂配制方法，包括液体和固体制剂，其中，固体制剂的制备途径包括但不限于结晶，沉淀(温差沉淀或溶剂置换沉淀)，喷雾干燥，喷雾冻干，冻干。
一种应用上述化合物的蛋白制剂配置方法，应用时可以单独使用，组合使用，或与其它适合的辅剂一起使用。
一种应用上述化合物的蛋白制剂配置方法，旨在保护治疗性蛋白试剂或延长其有效期。
该类辅剂在蛋白质纯化和生产过程中的应用。
该类辅剂在蛋白质大批量储存中的应用。
该类辅剂替代糖类辅剂(如葡萄糖、海藻糖等)在蛋白制剂中的应用，以减低蛋白溶液和/或重新配置溶液的粘度和/或泡沫产生。
利用上述辅剂制备稳定的蛋白质制剂的方法，旨在延长冷冻和/或非冷冻环境下储存时间，以便更容易重新配制蛋白试剂。
利用上述辅剂制备稳定的蛋白质制剂的方法，旨在增加蛋白质的溶解度，以便药物使用前更容易重新配制固体制剂。
利用上述辅剂制备稳定的胰岛素制剂中的方法，包括含锌胰岛素、无锌胰岛素、胰岛素类似物如赖脯胰岛素、含锌和无锌天冬胰岛素，胰岛素制剂可以是液体或固体，给药方式可以是鼻腔喷雾、肺吸喷雾、肺吸粉剂、注射，注射方式包括但不限于使用注射器、笔式注射器、带泵注射器。
利用上述辅剂配置稳定的胰岛素液体制剂的方法，旨在冷冻和/或非冷冻环境中延长储存时间。
利用上述辅剂制备稳定的胰岛素固体制剂的方法，旨在冷冻和/或非冷冻环境中延长储存时间，并方便固体制剂在临用前的重新配置。
附图说明
图1A-1C为磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate，代号X2)对甲醇诱发牛血清蛋白聚集体的抑制作用的体积排阻高效液相色谱(SEC HPLC)图。
图2A-2D为有无5-甲酰-1，3-苯二磺酸(5-formyl-1，3-benzenedisulfonic acid，代号X5)对孵育牛血清蛋白影响的体积排阻高效液相色谱图。
图3为制剂A、B、C和诺合灵R(Novolin R)室温保存初始降糖药效示意图。
图4为制剂A、B、C和诺合灵R室温保存一星期降糖药效示意图。
图5为制剂A、B、C和诺合灵R室温保存二星期降糖药效示意图。
图6为制剂A、B、C和诺合灵R室温保存四星期降糖药效示意图。
图7为制剂A、B、C和诺合灵R室温保存六星期降糖药效示意图。
发明详述
蛋白质分子形成聚集体主要是通过分子表面疏水区域之间的相互亲和而完成的。许多用于蛋白质制剂的辅剂，例如糖类、氨基酸，一般是通过氢键在蛋白质分子表面形成一层“外衣”，从而形成能使蛋白质分子分离的障碍。通过这种方式，蛋白质聚集能够得到减缓。另外，通常还可通过优化pH值来改变蛋白质分子表面的电荷分布特性，从而影响蛋白质聚集过程。由于许多蛋白质和多肽序列中往往会有一定数量的赖氨酸残基，赖氨酸的侧链带有一个氨基。在生理pH值或pH值更低的情况下，这些赖氨酸侧链多半被质子化并带有正电荷，与N末端氨基酸一样。本发明就是针对赖氨酸和N末端氨基酸的存在，利用一类辅剂改变蛋白质分子的表面特性，该类辅剂从未在蛋白质制剂中使用过。基于化学和药学制剂领域的常识，这些辅剂通常被认为是安全的。
第一条途径是使得赖氨酸侧链带有一个或多个电荷，最好是负电荷。这样便改变了蛋白质分子表面的电荷分布，增加了分子间的静电排斥，增加了表面的亲水性，从而增加了蛋白质的溶解度。为了实现这种分子表面的电荷修饰，而且要维持蛋白质分子的化学完整性，可逆的席夫碱形成可用于促使辅剂在蛋白质分子表面的结合。如果辅剂分子带有一个或多个电荷，做好是负电荷，辅剂设定为优化的浓度，蛋白质表面会被有效的改变。负电荷有可能来自羧酸、磺酸、次磺酸、硫酸盐、磷酸、磷酸盐、肽、核酸、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素，等等。聚乙酰氨基葡糖、壳聚糖、含有组氨酸和精氨酸的多肽、一些表面活性剂能提供正电荷。以下列有若干化合物以阐述这类辅剂的化学结构特性，但有用的试剂并不限于这些。
Figure GPA00001094852600071
本发明涉及的辅剂包括：2-甲酰苯磺酸、磷酸吡哆醛、4-甲酰-1，3-苯二磺酸，4-甲酰苯甲酸、3-甲酰-4-羟基苯甲酸、4-甲酰-3-羟基苯甲酸、苯乙醛酸、乙醛酸、丙酮酸。
第二条途径是使得赖氨酸侧链带有一个大体积水溶性的基团，用来阻挡蛋白质分子相互靠近。为了获得这种表面修饰作用而不从化学方面改变蛋白质分子，可逆的席夫碱形成可用于促使辅剂在蛋白质分子表面的结合，同时辅剂分子带有一个大体积侧链，例如聚二乙醇、糖、寡糖、多糖、肽、核酸、聚乙酰氨基葡糖、脱乙酰氨基葡糖、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素，等等。
本发明提供的的用于蛋白质制剂的辅剂化合物具有以下通用化学结构。除此以外，只要带有一个或多个羰基，能与蛋白质形成席夫碱，并且带有正电荷、负电荷、大体积基团的中的一种或多种，其它结构化合物也能提供所需的结构特征作为合适的辅剂。
Figure GPA00001094852600081
其中：
●在一定制剂pH值，尤其是接近生理pH值的情况下，或者在制剂产品较稳定的pH附近，R1或R2带有所需的正电荷或/和负电荷，“m”是1、或2、或3、或4、或5。
●或者，R1或R2带有大体积基团，例如糖、聚乙二醇、肽、核酸、无美拉德反应(Maillard reaction)效力的多羟基基团。
●R2是氢原子，或烃基，或芳香基，“n”是1，或2，或3。
●R1或R2带有一个或多个羰基以进一步加固席夫碱的形成。
●“X”是连接R1和R2的基团，X可以是含碳的直链、或环、或芳香基团、或化学键。
实施例
实施例1抑制热诱导牛血清蛋白聚集体的生成
将50微升牛血清蛋白原液(BSA，35％，水溶液，含0.85％氯化钠，Sigma)用450微升磷酸钠缓冲溶液(PBS，50mM，pH 7.4，0.85％NaCl)稀释成浓度为35mg/ml的BSA溶液。用纯水(HPLC级)另配浓度为75mg/ml的辅剂2-甲酰苯磺酸纳(Aldrich，75％)溶液，用稀盐酸将pH值调为8。
将50微升BSA(35mg/ml)用800微升PBS缓冲液(pH 7.4)稀释，添加150微升辅剂溶液使得[BSA]＝1.75mg/ml，[辅剂]＝11.25mg/ml。另配一份试样，不加辅剂。两份样品加至带盖玻璃试管，65℃孵育。在0分钟和40分钟后，各取少量样品用于体积排阻高效液相分析，分析时用PBS缓冲液(50mM，pH 7.4，0.85％NaCl)冲洗。不含辅剂的样品40分钟后有超过50％的BSA变成聚积体，而加有辅剂的样品40分钟后没有明显的BSA聚积体。加有辅剂的样品在孵育60分钟后继续分析，此时聚集体开始显现，但数量不显著。高效液相色谱分析的条件：色谱柱TSK gel G3000SW，7.5x300mm，Tosoh Biosciences，零件号码05789；流动相是磷酸纳缓冲液(50mM，pH 7.4，NaCl 0.85％)；流速为1.0ml/分钟；紫外检测280nm；仪器为BuckChrom BLC-20。
实施例2减缓甲醇诱导牛血清蛋白聚集体的生成
50微升牛血清蛋白(BSA，35％，含0.85％氯化钠，Sigma)用50微升磷酸钠缓冲溶液(50mM，pH 7.4，不含氯化钠)和50微升纯水(HPLC级)稀释。另一份试样用同样方法制备，但将50微升分析纯水替换为50微升含有磷酸吡哆醛的辅剂溶液(图1代号X2，100mg/ml水溶液，pH 7.4，)。在分别装有上述两种样品的两个试管中再分别加入350微升聚乙二醇水溶液(75％，分子量3400)，使得混合物变浑浊，然后加入500微升的甲醇(HPLC级)。离心后收集沉淀并重新溶于磷酸钠缓冲溶液，再作SEC高效液相色谱分析。不含辅剂的样品约有三分之二的BSA变成聚集体，而加有辅剂的样品只有明显的约四分之一的BSA聚集体。
实施例3减缓叔丁醇诱导牛血清蛋白聚集体的生成
在三支含有50微升牛血清蛋白(BSA，35％，含0.85％氯化钠)与50微升磷酸缓冲溶液(50mM，pH 7.4)的试管中，分别加入10微升水，10微升的2-甲酰苯磺酸钠(75mg/ml，pH 8.0)，10微升的磷酸吡哆醛(100mg/ml，pH 7.4)。在这三个试管中再分别加入500微升聚乙二醇溶液(75％，分子量3400)，然后离心使之沉淀，收集上清液。此时上清液中BSA处于饱和状态。在此三个上清液中加入500微升叔丁醇而产生新的沉淀。离心收集沉淀，并用叔丁醇洗涤两次(每次750微升)，再重新溶于磷酸钠缓冲溶液(50mM磷酸钠，pH7.4，0.85％氯化钠)，作SEC高效液相色谱分析。不含辅剂的样品约有75％的BSA变成聚积体，而加有辅剂2-甲酰苯磺酸钠的样品约有60％的BSA聚积体，而加有辅剂磷酸吡哆醛的样品有少于50％的BSA聚积体。
实施例44-甲酰-1，3-苯二磺酸抑制热诱导牛血清蛋白聚集体的生成
用牛血清蛋白溶液(BSA，350mg/ml，含0.85％氯化钠，Sigma Aldrich)和辅剂4-甲酰-1，3-苯二磺酸原液(Sigma Aldrich，图2代号X5，400mg/ml，pH 7.4，用100mM磷酸钠缓冲液配制)配制含有不同浓度辅剂的BSA溶液试样(见表1)，最终体积0.5ml，放置于带盖玻璃试管。所有样品放入设定为65℃的保温装置中。
表14-甲酰-1，3-苯二磺酸对BSA的稳定效应
  试样/成份   1   2   3   4
  [BSA]，mg/ml   262.5   262.5   262.5   262.5
  [磷酸钠]，pH 7.4，mM 25 25 25 25
  [辅剂]，mg/ml   0   50   25   12.5
  观察结果65℃，60分钟 变固体 澄清溶液 澄清溶液 澄清溶液
试验表明，即使在低浓度(12.5mg/ml)，辅剂4-甲酰-1，3-苯二磺酸能阻止BSA(262.5mg/ml)变为固体。
取10微升上述澄清溶液，各用1.0毫升磷酸缓冲溶液(pH 7.4)稀释，另用同样的缓冲液配制BSA对照样品(2.5mg/ml)。5种稀释样品各取100微升作SEC高效液相色谱分析(色谱柱TSK gel G3000SW，5mmx300mm)，用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.4，含0.85％氯化钠)冲洗，流速为1.0ml/min，紫外检测280nm，HPLC图谱如图2所示。
本试验在pH 6.8条件下重复，有辅剂的BSA溶液(12.5mg/ml)仍为澄清溶液，而没有辅剂的BSA溶液出现固体。
实施例5其它辅剂(pH 6.2)
用蔗糖作为对照辅剂，试验各种辅剂阻止BSA形成胶体的能力，试样配制在丙二酸缓冲溶液中(25mM)，65℃孵育60分钟。受试辅剂有蔗糖、4-甲酰-1，3-苯二磺酸，4-甲酰苯甲酸、苯乙醛酸、乙醛酸。(见表2、表3、表4、表5、表6)
表2蔗糖的影响
  试样/成份   1   2   3   4
  [BSA]，mg/ml   175   175   175   175
  [丙二酸]，pH 6.2，mM   25   25   25   25
  [蔗糖]，mg/ml   0   175   125   75
  观察结果65℃，60分钟 固体 透明胶体 不透明胶体 不透明胶体
试验表明辅剂蔗糖对牛血清蛋白形成胶体或固体没有很强的抑制作用。
表34-甲酰-1，3-苯二磺酸的影响
  试样/成份   1   2   3   4
  [BSA]，mg/ml   175   175   175   175
  [丙二酸]，pH 6.2，mM   25   25   25   25
  [4-甲酰-1，3-苯二磺酸]，mg/ml 0 28.8 14.4 7.1
  观察结果65℃，60分钟 固体 溶液 溶液 溶液
表44-甲酰苯甲酸对热诱导下牛血清蛋白聚集体生成的影响
  试样/成份   1   2   3   4
  [BSA]，mg/ml   175   175   175   175
  [丙二酸]，pH 6.2，mM   25   25   25   25
  [4-甲酰苯甲酸]，mg/ml   0   37.5   18.8   9.4
  试样/成份   1   2   3   4
  观察结果65℃，60分钟 固体 溶液 溶液 溶液
表5苯乙醛酸对热诱导下牛血清蛋白聚集体生成的影响
  试样/成份   1   2   3   4
  [BSA]，mg/ml   175   175   175   175
  [丙二酸]，pH 6.2，mM   25   25   25   25
  [苯乙醛酸]，mg/ml   0   37.5   18.8   9.4
  观察结果65℃，60分钟 固体 溶液 溶液 溶液
表6乙醛酸对热诱导下牛血清蛋白聚集体生成的影响
  试样/成份   1   2   3   4
  [BSA]，mg/ml   175   175   175   175
  [丙二酸]，pH 6.2，mM   25   25   25   25
  [乙醛酸]，mg/ml   0   23   11.5   5.8
  观察结果65℃，60分钟 固体 溶液 溶液 溶液
从表3至表6可以看出，即使在低浓度，以上四种辅剂对于牛血清蛋白形成胶体或固体都有很强的抑制作用
实施例6抑制热诱导肌红蛋白聚集体的生成(65℃)
将肌红蛋白(马骨骼肌，Sigma)溶解于碳酸氢钠缓冲溶液(100mM，pH 9.0)配制成浓度为10mg/ml的备用溶液。500微升该蛋白溶液与100微升的各种辅剂混合制成一系列蛋白浓度相同、辅剂浓度不同的试样。这些在密封试管中的试样被同时放进预热至65℃的加热装置中加热，持续孵育一段时间，并观察纤维状沉淀(PPT)的形成情况。试验结果表明4-甲酰-1，3-苯二磺酸最能阻止肌红蛋白形成纤维状沉淀。
表7辅剂对减缓热诱导下马肌红蛋白聚集体生成的影响
Figure GPA00001094852600131
实施例7磷酸吡哆醛抑制胰岛素纤维化(pH 7.4)
用磷酸缓冲液(50mM，pH7.4，无氯化钠)配制无锌牛胰岛素溶液(浓度为1.2mg/ml)。两份2.0毫升无锌牛胰岛素溶液分别转移到两个玻璃试管(沸水消毒)，其中一个试管加入0.10毫升的水，另一个试管加入0.10毫升磷酸吡哆醛(100毫克/毫升，水溶液，pH 7.4)。两个试管加盖后放在旋转器上并移到39℃的恒温箱里让试管上下颠翻(每分钟十二次)。不含磷酸吡哆醛的试样在三小时后变的浑浊，而含磷酸吡哆醛的试样在五星期后仍然十分澄清。
实施例8磷酸吡哆醛抑制胰岛素纤维化(pH 7.0)
用磷酸缓冲液(50mM，pH7.4，无氯化钠)配制无锌牛胰岛素溶液(浓度为1.2mg/ml)。两份2.0毫升无锌牛胰岛素溶液分别转移到两个玻璃试管(沸水消毒)，然后分别再加入0.10ml水。另取4.0毫升无锌牛胰岛素溶液，加入0.2毫升磷酸吡哆醛(100毫克/毫升，pH 7.4)，调至pH 7.0，再平分到两支玻璃试管(沸水消毒)。将此四个试样加盖后放在旋转器上并移到39℃的恒温箱里让试管上下颠翻(每分钟十二次)。不含磷酸吡哆醛的两个试样在五小时后就变的浑浊，而含磷酸吡哆醛的两个试样在四星期后仍保持清澈溶液状。
实施例9不同浓度磷酸吡哆醛抑制胰岛素纤维化(pH 7.4)
取无锌牛胰岛素(50毫克)溶于0.5毫升稀盐酸(0.10N)，并用0.1N的NaOH中和直至变的浑浊，再重新澄清。然后在胰岛素溶液中加入0.667毫升磷酸吡哆醛溶液(167毫克/毫升，pH 7.0，水溶液)，用稀NaOH调pH至7.4，再加水(HPLC级)至2.5毫升。取此少量溶液用水稀释成胰岛素浓度为2.0毫克/毫升、5.0毫克/毫升、10毫克/毫升、15毫克/毫升的四个1.0毫升样品溶液，再加最后剩余的0.5ml胰岛素-磷酸吡哆醛(20毫克/毫升)，共五个试样。将此五个试样加盖后放在旋转器上并移到39℃的恒温箱里让试管上下颠翻(每分钟十二次)。所有试样在三星期后仍保持清澈溶液状。
实施例10三种含有新辅剂的无锌重组人胰岛素制剂的动物研究
取无锌重组人胰岛素(27毫克)，溶于含有0.1毫升盐酸(0.10N)的1.0毫升水(HPLC级)。在此溶液中加入2.4毫升磷酸钠缓冲液(0.10M，pH 7.0)，另加3滴氢氧化钠(0.05N)后成清澈溶液，加水至9.0毫升。将此溶液分成三份A、B、C，每份3毫升。A份与0.166毫升4-甲酰-1，3-苯二磺酸(0.36M，pH 6.7)，调pH至6.9，并加水至6.0毫升。B份与0.60毫升乙醛酸(0.10M，pH 7.0)混合，调pH至6.9，并加水至6.0毫升。C份与0.60毫升3-甲酰-4-羟基苯甲酸(0.10M，pH 6.8)和几滴氢氧化钠(0.05N)混合，调pH至6.9，并加水至6.0毫升。所有三份制剂(制剂A，B，C)都经过0.2微米过滤膜，并室温保存，用诺和灵(Novolin，整个试验中储存于2-8℃)和生理盐水作为对照进行动物试验。
这三个新制剂(制剂A，B，C)和诺和灵R在给药前用生理盐水稀释至0.91单位/毫升，给药剂量为9.1单位/公斤。每个药剂给八只小鼠进行背部皮下注射，注射前取血和注射后不同时间点取血样，保用标准Monroe方法测定血糖浓度(mM)。
表8制剂室温保存初始的降糖活性(血糖浓度，mM)
  取血时间(分钟) 0min 20min 40min 60min 80min 120min
  制剂A   0.64   0.46   0.11   0.11   0.01   0.01
  制剂B   0.84   0.08   0.16   0.04   0.07   0.04
  制剂C   1.00   0.19   0.16   0.08   0.07   0.07
  诺和灵R   1.04   0.05   0.07   0.01   0.05   0.03
  生理盐水   1.22   0.91   2.80   3.19   1.84   4.93
表9制剂室温保存一周后的降糖活性(血糖浓度，mM)
  取血时间(分钟) 0 20 60 120 180
  制剂A   2.28   0.26   0.49   0.35   2.84
  制剂B   3.08   0.56   0.80   0.39   4.39
  制剂C   2.92   0.57   0.88   0.21   2.44
  诺和灵R   3.38   0.71   0.68   1.04   5.22
  生理盐水   2.45   3.75   4.10   3.50   7.17
表10制剂室温保存两周后的降糖活性(血糖浓度，mM)
  取血时间(分钟) 0 20 120 180
  制剂A   3.16   0.34   0.58   2.82
  制剂B   2.97   0.27   1.37   3.50
  制剂C   3.17   0.29   1.31   3.70
  诺和灵R   3.89   0.28   0.88   6.21
  生理盐水   3.02   4.10   4.51   4.71
表11制剂室温保存四周后的降糖活性(血糖浓度，mM)
  取血时间(分钟) 0 20 60 120 180
  制剂A   3.23   0.36   0.26   1.09   2.91
  制剂B   1.98   0.41   0.45   2.21   6.57
  制剂C   2.74   0.33   0.42   0.62   5.93
  诺和灵R   3.89   0.24   0.23   0.25   3.38
  生理盐水   2.04   3.09   3.30   3.80   5.90
表12制剂室温保存六周后的降糖活性(血糖浓度，mM)
  取血时间(分钟) 0 20 60 120 180
  制剂A   1.30   0.14   0.20   0.15   1.81
  制剂B   1.20   0.19   0.10   0.43   4.81
  制剂C   1.85   0.28   0.07   0.13   2.71
  取血时间(分钟) 0 20 60 120 180
  诺和灵R   1.93   0.13   0.05   0.19   2.85
  生理盐水   1.37   2.48   3.70   4.48   5.48
实施例11乙醛酸抑制胰岛素纤维化
用磷酸缓冲液(50mM，pH7.0，无氯化钠)配制无锌重组人胰岛素溶液，浓度为1.0mg/ml，其中一个试样含有20mM的乙醛酸)。用磷酸钠缓冲液稀释医用诺和锐(NovoRapid，Novo Nordisk，100单位/毫升)至25单位/毫升，另配相同稀释医用诺和锐试样但另加乙醛酸(20mM)。取医用优泌乐25(Humalog 25，共100单位/毫升，Eli Lilly)离心收集上清液(约含赖脯胰岛素25单位/毫升)，再用水和乙醛酸混合成约含赖脯胰岛素20单位/毫升，乙醛酸为0和20mM的两个试样。每一份样品(1.0ml)转移到带盖的10ml试管，然后放在旋转器上在室温让试管上下颠翻(每分钟十二次)。不含乙醛酸的三个试样在两天内都变浑浊，而含乙醛酸的三个试样在四星期后仍保持清澈溶液状。
实施例12乙醛酸抑制含锌胰岛素纤维化
如同实施例11，但采用医用优泌林R(100单位/毫升)，在旋转器上，不含乙醛酸的试样在两天内都有明显沉淀，而含乙醛酸的试样在六天后才变混浊。

Claims (17)

1.一种减少或防止蛋白质聚集体产生的方法，包括将带有电荷或大体积基团的羰基化合物与蛋白质进行反应并与蛋白质表面的氨基形成可逆的席夫键的步骤。
2.一类具有分子式I的化合物：
Figure FPA00001094852500011
其中：
R1在生理pH值或临近该pH值的条件下带有正电荷或负电荷；或者R1为含有一个或多个羰基的基团、糖、聚乙二醇、肽、核酸、无美拉德反应效力的多羟基基团中的一种；
m为1，或2，或3，或4，或5；
X为含碳的直链、或环、或芳香基团、或化学键；
R2在生理pH值或临近该pH值的条件下带有正电荷或负电荷；或者R2或为含有一个或多个羰基的基团、糖、聚乙二醇、肽、核酸、无美拉德反应效力的多羟基基团、烃基、芳香基、氢原子中的一种；
n是1，或2，或3。
3.一种蛋白质制剂的生产方法，包括将权利要求2所述的化合物与蛋白质反应的步骤。
4.如权利要求3所述的蛋白质制剂的生产方法，还包括用结晶、沉淀、喷雾烘干、喷雾冻干、冻干制备固体蛋白质制剂的步骤。
5.一种蛋白质制剂的生产方法，包括将蛋白质与多种权利要求2所述的化合物进行反应或者将蛋白质与一种或多种权利要求2所述的化合物和其它适合的辅剂同时进行反应的步骤。
6.一种或多种权利要求2所述的化合物在保护治疗性蛋白药物或延长治疗性蛋白药物的保质期中的应用。
7.一种或多种权利要求2所述的化合物在蛋白质的纯化或蛋白质制剂的生产中的应用。
8.一种或多种权利要求2所述的化合物在蛋白质制剂的大批量保存中的应用。
9.一种或多种权利要求2所述的化合物在降低蛋白质溶液粘度、减少蛋白质溶液泡沫、蛋白质溶液重新配制中的应用。
10.一种含有蛋白质和一种或多种权利要求2所述的化合物的稳定的蛋白质制剂，其中，所述的制剂在冷冻和非冷冻条件下长时间保持稳定。
11.一种含有蛋白质和一种或多种权利要求2所述的化合物的稳定的蛋白质制剂，其中，所述的蛋白质是可溶的或难溶的。
12.一种或多种权利要求2所述的化合物在药物临用前将固体制剂重新配置成液体制剂中的应用。
13.一种稳定的蛋白质制剂，含有有锌胰岛素、无锌胰岛素、有锌或无锌的胰岛素类似物中的一种，还含有一种或多种权利要求2所述的化合物，其中，所述制剂为液体或固体。
14.如权利要求13所述的稳定的蛋白质制剂，其中，制剂的给药方式包括鼻腔喷雾、肺吸喷雾、肺吸粉剂、注射。
15.一种稳定的胰岛素液体制剂，含有胰岛素和一种或多种权利要求2所述的化合物，其中，所述的胰岛素液体制剂在冷冻和非冷冻条件下长时间保持稳定。
16.一种稳定的胰岛素固体制剂，含有胰岛素和一种或多种权利要求2所述的化合物，其中，所述的胰岛素液体制剂在冷冻和非冷冻条件下长时间保持稳定。
17.一种或多种权利要求2所述的化合物在临用前将胰岛素固体制剂重新配置成液体制剂中的应用。
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