CN107974461A

CN107974461A - 一种高效表达anti-hEGFR基因的真核表达载体构建方法

Info

Publication number: CN107974461A
Application number: CN201810048426.2A
Authority: CN
Inventors: 任桂萍; 李德山; 刘春香; 王宇阳
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2018-01-18
Filing date: 2018-01-18
Publication date: 2018-05-01

Abstract

本发明公开了一种高效表达anti‑hEGFR基因的真核表达载体构建方法，属于分子生物学领域。针对重组人表皮生长因子受体抗体(anti‑hEGFR)基因的克隆及高效真核表达载体构建，以含anti‑hEGFR全长基因的质粒为模板，设计引物克隆抗体轻链及重链，在真核表达载体上插入了IgKappa Leader和IRES EGFP来增强蛋白表达及方便后续分选实验，经过上述方式成功获得真核表达的蛋白anti‑hEGFR，其将在治疗EGFR过表达引起的癌症方面发挥显著效果。

Description

一种高效表达anti-hEGFR基因的真核表达载体构建方法

技术领域

本发明涉及一种高效表达anti-hEGFR基因的真核表达载体构建方法，属于分子生物学领域。

背景技术

近年来，恶性肿瘤一直作为一种顽固性疾病危害着人类健康，全球每年约有1400万多人患有癌症，并且有820万人死于癌症。其中，中国的患癌人数为307万人，并有约220万人死亡。目前，癌症的治疗主要还是以放疗和化疗为主，但放化疗给人体带来的损伤往往是不可修复的，如放射性肝、肺纤维化等。表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor，EGFR)作为一类酪氨酸激酶受体，能够进行细胞信号传递，已有研究证实，EGFR过度表达与某些肿瘤，如非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌、乳腺癌等密切相关。在癌症患者中，通过人为干预使EGFR降低后，可以明显改善癌症患者的病情。人源化的EGFR抗体可以对皮肤鳞癌细胞(A431)表面的EGFR配体结合位点进行封闭，从而削弱或阻断EGFR下游的信号传导，达到抑制肿瘤的生长和侵袭，促进细胞凋亡的目的。这就使anti-hEGFR在治疗EGFR过表达引起的癌症方面具有很大的应用价值，为以EGFR为药物作用靶点的癌症治疗提供了一个新的思路。

本研究以抗EGFR人源化抗体基因为模板，通过分子克隆技术克隆出anti-hEGFR的全长重链和全长轻链，将克隆好的基因连接到peedual真核表达载体，以期获得真核表达的重组人表皮生长因子受体抗体用于癌症的治疗。

发明内容

本发明提供了一种高效表达anti-hEGFR基因的真核表达载体构建方法，得到真核蛋白表达载体Peedual-IRES-EGFP-hEGFR质粒，结构如图11所述。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

1.hEGFR抗体重链及轻链基因的克隆。

2.将hEGFR抗体轻链和重链PCR产物胶回收纯化后与pMD18-T simple克隆载体的连接。

3.转化重组克隆载体并分别提取轻链及重链重组克隆质粒pK-LC和pK-HC。

4.LC、HC、IRES EGFP基因片段及pKlight、pee12.4、pee6.4载体的酶切制备。

5.Pee12.4-LC、pee6.4-HC-IRES EGFP重组载体的构建。

6.Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建。

7.去内毒素的peedual-IRES-EGFP-hEGFR质粒的抽提及浓度测定。

附图说明

图1为peedual-IRES-EGFP-hEGFR重组载体的构建方案简图。

图2为hEGFR重链和轻链PCR结果图。

图3为LC、HC片段的PCR纯化产物。

图4为LC-T、HC-T重组质粒的酶切及PCR鉴定结果图。

图5为LC、HC、IRES EGFP基因片段及pKlight、pee12.4、pee6.4载体的酶切制备产物回收结果。

图6为PK-LC、PK-HC重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定。

图7为各重组质粒的双酶切产物回收结果。

图8为pee12.4-LC、pee6.4-HC-IRES EGFP酶切及PCR鉴定。

图9为peedual-IRES-EGFP-hEGFR酶切及PCR鉴定。

图10为anti-hEGFR的表达SDS-PAGE分析

图11真核蛋白表达载体Peedual-IRES-EGFP-hEGFR质粒结构图

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。大肠杆菌E.coil DH5α，CHO-K1细胞株、真核表达载体pKlight、pee6.4(本实验室保存)，IRES-EGFP、pee12.4(购自美国Clontech)，anti-EGFR抗体LC、HC基因片段(本实验室保存)。

实施例1、hEGFR抗体重链及轻链基因的克隆：

以含anti-hEGFR全长基因的质粒为模板，应用pl1、pl2，ph1、ph2两对引物分别进行抗体轻链和重链基因的PCR扩增。

PCR扩增轻链反应体系(25μL体系)如下：

PCR扩增重链反应体系(25μL体系)如下：

各成分混合均匀后进行PCR反应，扩增参数为：95℃预变性7min，95℃ 45s，60℃30s，72℃ 45s，15个循环后，72℃终延伸10min。扩增结束后，取2μL PCR产物120V电压下进行琼脂糖凝胶电泳，观察片段大小，结果见图2，如图可知，进行抗体轻链和重链基因的PCR扩增，分别得到约为650bp和1 400bp大小的特异性目的条带，与预期的648bp和1350bp大小相符，初步确定为LC、HC基因。

实施例2、PCR产物的纯化及与克隆载体的连接

分别取分子量正确的PCR扩增产物(浓度约为100ng/μL)20μL进行1％琼脂糖凝胶电泳回收，电压设定为80V。胶回收步骤参照OMEGA胶回收试剂盒说明书，结果见图3。将纯化后的产物各取1μL进行电泳，观察纯化结果。将纯化后的轻链和重链分别与pMD18-T simple克隆载体相连，连接体系(10μL体系)如下：

PMD18-T simple 1ul

纯化的PCR产物 4ul

Solution I 5ul

混合均匀后，于16℃恒温水浴中连接过夜。

实施例3、重组克隆载体的转化及质粒的提取

将所得的连接产物转化到E.coil DH5α感受态细胞中，将转化完成的LB平板于37℃的条件下培养12～14h。具体过程如下：

取出三管冻存的感受态细胞，冰上融化。将轻链、重链与pMD18-T载体的连接产物各5μL分别加入其中两管感受态细胞中，命名为LC-T和HC-T。另一管不加任何物质作为阴性对照。冰浴25～35min后，42℃水浴热激1min，移置冰中，放置2min。每管中加入300μL无菌LB液体培养基，37℃摇床中温和复苏1h后分别涂布于含有100μg/mL Amp的LB固体平板培养基上，37℃恒温培养12～14h。

从LC-T和HC-T两块平板中随机各挑取3个大小适中的单一菌落，分别接种到含100μg/mL Amp的10mL LB液体培养基中，在恒温摇床中以220rpm、37℃的条件下培养过夜。收集菌体，质粒提取步骤参照OMEGA公司的质粒DNA小提试剂盒说明书。

实施例4、阳性重组子的鉴定

LC-T重组质粒用限制性内切酶Bgl II/EcoR I进行酶切鉴定，同时做PCR鉴定。

Bgl II、EcoR I酶切鉴定体系如下：

共10μL体系，37℃水浴酶切2h。1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

PCR鉴定体系如下：

共10μL体系，循环参数同实施例1。1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

HC-T重组质粒用限制性内切酶BamH I、Nhe I进行双酶切鉴定，应用10×Hbuffer，酶切体系同上。HC-T重组质粒的PCR鉴定应用引物Ph1和Ph2，鉴定体系同上，循环参数同实施例1。结果见图4，从图可知阳性重组质粒LC-T用Bgl II/EcoR I进行双酶切鉴定，酶切后获得两条片段，分别为约2 700bp的pMD18-T simple载体和约650bp的抗体轻链基因，与预期的条带大小相符。以pl1、pl2为引物，重组质粒LC-T为模板，进行PCR鉴定，得到一条约650bp的条带，与预期的648bp大小相符。阳性重组质粒HC-T用BamH I/Nhe I进行双酶切鉴定，得两条片段，分别为约2 700bp的pMD18-T simple载体和约1 400bp的抗体重链基因，与预期的条带大小相符。以ph1、ph2为引物，重组质粒HC-T为模板，进行PCR鉴定，得到一条约1 400bp的条带，与预期的1 350bp大小相符。

实施例5、hEGFR抗体轻链、重链基因序列的测定及分析

将PCR、酶切鉴定都正确的轻链和重链重组质粒由上海英骏公司进行序列测定。采用DNAMAN生物学软件对基因的测序结果进行分析。结果显示：克隆获得的基因开放阅读框分别为648bp和1 350bp，分别编码215和449个氨基酸，未发生基因突变。

实施例6、LC、HC、IRES EGFP基因片段及pKlight、pee12.4、pee6.4载体的酶切制备

将测序正确的LC-T、HC-T以及实验室保存的pee12.4-IRES EGFP、pKlight、pee12.4、pee6.4转化大肠杆菌E.coil DH5α感受态细胞中，次日分别挑取单一菌落，并接种于含有100μg/mL Amp的10mL LB液体培养基中，在恒温摇床中以220rpm、37℃的条件下培养10～12h后提取质粒，质粒提取步骤参照OMEGA公司的质粒DNA小提试剂盒说明书。

用Bgl II/EcoR I双酶切处理LC-T，制备LC基因片段(Bgl II与BamH I为同尾酶)。

Bgl II/EcoR I双酶切体系如下：

共100μL体系，37℃水浴酶切3h。

用BamH I/Nhe I双酶切分别处理HC-T和pKlight载体，应用10×M buffer；BamHI/EcoR I双酶切处理pKlight载体，10×K buffer；Hind III/EcoR I双酶切分别处理pee12.4和pee6.4载体，10×M buffer；Nhe I/EcoR I双酶切处理pee12.4-IRES EGFP制备IRES EGFP片段，10×M buffer。所有酶切体系同上。

上述所有酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳分别回收LC、HC、IRES EGFP片段和pKlight、pee12.4和pee6.4载体，电压设定为80V。胶回收步骤参照OMEGA胶回收试剂盒说明书。

结果见图5，可知用Bgl II/EcoR I双酶切处理重组载体LC-T，胶回收得到约650bp的LC片段，与预期大小相符；用BamH I/Nhe I双酶切分别处理重组载体HC-T和pKlight载体，胶回收分别得到约1 400bp的HC片段和约6500bp的pKlight载体片段，结果均与预期大小相符。用BamH I/EcoR I双酶切处理pKlight载体，胶回收获得约6 300bp的pKlight载体片段，与预期大小相符；Hind III/EcoR I双酶切分别处理pee12.4和pee6.4载体，胶回收分别得到约7 500bp和约5 000bp的载体片段与预期大小相符。

实施例7、Pee12.4-LC、pee6.4-HC-IRES EGFP重组载体的构建

将回收后的LC(Bgl II/EcoR I)片段与pKlight(BamH I/EcoR I)载体，HC(BamHI/Nhe I)片段与pKlight(BamH I/Nhe I)载体用T4DNA连接酶连接，体系(10μL)如下：

分别将LC、HC与pKlight载体连接的产物转化到大肠杆菌DH5α中，提取质粒pK-LC、pK-HC，提取步骤参照OMEGA公司的质粒DNA小提试剂盒说明书。提取质粒后用Hind III/EcoR I双酶切pK-LC和pK-HC载体回收含有IgKappa Leader的片段，IgK-LC(Hind III/EcoRI)、IgK-HC(Hind III/EcoR I)。37°C酶切3h，体系(100μL)如下：

胶回收片段IgK-LC(Hind III/EcoR I)、IgK-HC(Hind III/EcoR I)，具体操作步骤参照OMEGA胶回收试剂盒说明书。回收得到IgK-HC(Hind III/EcoR I)后再用Nhe I单酶切得到IgK-HC(Hind III/Nhe I)。37℃酶切3h，体系(50μL)如下：

胶回收片段IgK-HC(Hind III/Nhe I)并与IRES-EGFP(Nhe I/EcoR I)、pEE6.4(Hind III/Nhe I)载体三个片段相连。IgK-LC(Hind III/EcoR I)与pEE12.4(Hind III/EcoR I)载体相连。16℃连接过夜，连接体系(10μL)如下：

分别将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，提取质粒Pee12.4-LC、Pee6.4-HC-IRES-EGFP，提取步骤参照OMEGA公司的质粒DNA小提试剂盒说明书。

结果见图6：pK-LC、pK-HC重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定，可知用Hind III/EcoRI双酶切鉴定pK-LC重组质粒，得到约710bp的含IgKappa Leader的LC片段和两条大小约为5000bp和1 200bp的pKlight载体片段；用BamH I/Nhe I双酶切鉴定pK-HC重组质粒，分别得到约6 500bp的pKlight载体片段和约1 350bp的含IgKappa Leader的HC片段，得到两种片段与预期大小相符。分别应用引物pl1、pl2和ph1、ph2对重组载体pK-LC和pK-HC进行PCR鉴定，最终得到一条约650bp的LC片段和约1 400bp的HC片段，与预期大小相符。初步确认为pK-LC、pK-HC构建成功。

结果见图7：各重组质粒的双酶切产物回收结果。可知用Hind III/EcoR I对pK-LC进行双酶切，回收含有LC的片段，用Nhe I/EcoR I双酶切处理pee12.4-IRES EGFP，得到约1300bp的IRES EGFP片段；用Hind III/EcoR I对pK-HC进行双酶切，回收含有HC(Hind III/EcoR I)的片段，再用Nhe I单酶切含有HC的片段，回收HC(Hind III/Nhe I)。

结果图8：pee12.4-LC、pee6.4-HC-IRES EGFP酶切及PCR鉴定。分别用Hind III/EcoR I对pee12.4-LC、pee6.4-HC-IRES EGFP进行双酶切鉴定，pee12.4-LC酶切后得到大约7 500bp的pEE12.4载体片段和约710bp的含IgKappa Leader的LC片段，大小与预期相符；pee6.4-HC-IRES EGFP酶切后得到片段由大到小依次是：约5 000bp的pEE6.4载体片段、约1600bp的含IRES上游部分的Ig-HC(含IgKappa Leader的HC片段)、约1 070bp的含IRES下游部分的EGFP片段，各片段大小与预期相符。分别应用引物pl1、pl2和ph1、ph2对重组载体pee12.4-LC、pee6.4-HC-IRES EGFP进行PCR鉴定，最终得到一条约650bp的LC片段和约1400bp的HC片段，与预期大小相符。初步确定重组质粒pee12.4-LC、pee6.4-HC-IRES EGFP构建成功。

实施例8、Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建

将鉴定正确的Pee12.4-LC、Pee6.4-HC-IRES-EGFP质粒用Not I/Sal I进行双酶切。37℃酶切3h，体系(100μL)如下：

胶回收含有LC和HC-IRES-EGFP的片段，用T4DNA连接酶连接，连接体系(10μL)如下：

将最终连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，提取peedual-IRES-EGFP-hEGFR质粒，提取步骤提取步骤参照OMEGA公司的质粒DNA小提试剂盒说明书。提取质粒后用Not I/Sal I进行双酶切鉴定，同时用Hind III/EcoR I进行双酶切鉴定，大小均与预期相符实验结果见图9。说明peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体构建成功。

实施例9、去内毒素的peedual-IRES-EGFP-hEGFR质粒的抽提及浓度测定

将含有peedual-IRES-EGFP-hEGFR质粒的E.coil DH5α阳性菌液接种于含100μg/mL Amp的20mL LB培养基中，220rpm、37℃恒温摇床培养12～14h活化阳性菌，然后将活化好的菌液全部接种于400mL含有100μg/mL Amp的LB培养基中活化8～12h。收集菌体，按照OMEGA公司的去内毒素质粒提取试剂盒说明书进行抽提质粒，将所提质粒用紫外分光光度计(ND 1000)测定浓度并保存于-20℃冰箱，用于细胞转染。

实施例10、peedual-IRES-EGFP-hEGFR质粒的电转及anti-hEGFR的表达分析

取对数生长期的CHO-K1细胞以1:3的浓度传代，于37℃，5％CO2培养箱中培养直至汇合度为70～80％，用0.25％胰蛋白酶消化，以1 000r/min离心3min后用PBS洗细胞一次，将细胞用无血清培养基稀释计数，使其浓度达1×10⁷个/mL。取纯化后且不含内毒素的peedual-IRES-EGFP-hEGFR质粒DNA 20μg加入400μL细胞悬液中，250V、1 000Ω、1 000μF参数下进行电转。将转染后的细胞转入含有10％FBS的完全培养基中复苏培养。

电转24-30h后更换含50μM MSX的筛选培养基进行加压培养，只有转入该载体的细胞才可以存活，加压过程中应用荧光倒置显微镜进行阳性细胞观察。收集细胞培养上清进行anti-hEGFR的表达分析(图10)。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种高效表达anti-hEGFR基因的真核表达载体构建方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 798

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(798)

<400> 1

atg gtg agc aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc atc ctg 48

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

gtc gag ctg gac ggc gac gta aac ggc cac aag ttc agc gtg tcc ggc 96

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

gag ggc gag ggc gat gcc acc tac ggc aag ctg acc ctg aag ttc atc 144

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc ctc gtg acc acc 192

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

ctg acc tac ggc gtg cag tgc ttc agc cgc tac ccc gac cac atg aag 240

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag 288

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

cgc acc atc ttc ttc aag gac gac ggc aac tac aag acc cgc gcc gag 336

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc atc gag ctg aag ggc 384

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg cac aag ctg gag tac 432

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

aac tac aac agc cac aac gtc tat atc atg gcc gac aag cag aag aac 480

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

ggc atc aag gtg aac ttc aag atc cgc cac aac atc gag gac ggc agc 528

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

gtg cag ctc gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc 576

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg agc acc cag tcc gcc ctg 624

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

agc aaa gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc 672

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

gtg acc gcc gcc ggg atc act ctc ggc atg gac gag ctg tac aag tcc 720

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser

225 230 235 240

gga ctc aga tct cga gct caa gct tcg aat tct gca gtc gac ggt acc 768

Gly Leu Arg Ser Arg Ala Gln Ala Ser Asn Ser Ala Val Asp Gly Thr

245 250 255

gcg ggc ccg gga tcc acc gga tct aga taa 798

Ala Gly Pro Gly Ser Thr Gly Ser Arg

260 265

<210> 2

<211> 275

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 2

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Glu

65 70 75 80

Thr Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Glu Thr Pro Glu Gly

85 90 95

Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys

100 105 110

Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile

115 120 125

Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His

130 135 140

Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Glu Thr

145 150 155 160

Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His

165 170 175

Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu

195 200 205

Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His

210 215 220

Met Glu Thr Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu

225 230 235 240

Gly Met Glu Thr Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Gly Leu Arg Ser Arg Ala

245 250 255

Gln Ala Ser Asn Ser Ala Val Asp Gly Thr Ala Gly Pro Gly Ser Thr

260 265 270

Gly Ser Arg

275

<210> 3

<211> 1385

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60

gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120

ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180

gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240

aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300

tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360

acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420

aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480

gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540

gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gatatatggc cacaaccatg gtgagcaagg 600

gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg 660

gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc 720

tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc 780

tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct 840

tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg 900

gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg 960

agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca 1020

actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga 1080

acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc 1140

agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc 1200

agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg 1260

tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtccgga ctcagatctc 1320

gagctcaagc ttcgaattct gcagtcgacg gtaccgcggg cccgggatcc accggatcta 1380

gataa 1385

<210> 4

<211> 645

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(645)

<400> 4

gac atc ttg ctg acc cag tct cca gtc atc ctg tcc gtg agt cca gga 48

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

gaa aga gtc agt ttc tcc tgc agg gcc agt cag agt att ggc aca aac 96

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

ata cac tgg tat cag caa aga aca aat ggt tct cca agg ctt ctc ata 144

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

aag tat gct tct gag tct atc tct ggg atc cct tcc agg ttt agt ggc 192

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

agt gga tca ggg aca gat ttt act ctt agc atc aac agt gtg gag tct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

gaa gat att gca gat tat tac tgt caa caa aat aat aac tgg cca acc 288

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

acg ttc ggt gct ggc acc aag ctg gag ctg aag cga act gtg gct gca 336

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

cca tct gtc ttc atc ttc cct cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga 384

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc 432

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

aaa gtg cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcc ggt aac tcc cag 480

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc 528

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac 576

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tct ccc gtc aca aag agc 624

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

ttc aac agg gga gag tgt tga 645

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 5

<211> 214

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 5

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 6

<211> 1350

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1350)

<400> 6

cag gtg cag ctg aag cag tca gga cct ggc ctc gtg cag ccc tca cag 48

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

agc ctg tcc atc acc tgc aca gtc tct ggt ttc tca tta act aac tat 96

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

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Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

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Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

tcc aga ctg agc atc aac aag gac aat tcc aag agc caa gtt ttc ttt 240

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

aaa atg aac agt ctg caa tct aat gac aca gcc ata tat tac tgt gcc 288

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

aga gcc ctc acc tac tat gat tac gag ttt gct tac tgg ggc caa ggg 336

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

act ctg gtc act gtc tct gca gcc tcc acc aag ggc cca tcc gtc ttc 384

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcc gcc ctg 432

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa cct gtg acg gtg tcc tgg 480

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc ctc 528

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc 576

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc 624

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

agc aac acc aag gtg gac aag cgc gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa 672

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

act cac aca tgc cca cct tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga cct 720

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc 768

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac 816

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat 864

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

gcc aag aca aag cct cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg 912

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag 960

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa 1008

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc 1056

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc 1104

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag 1152

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

agc aat ggg cag ccc gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg 1200

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag 1248

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag 1296

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccc ggt 1344

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

aaa tga 1350

Lys

<210> 7

<211> 457

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 7

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Glu Thr Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Glu Thr Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Glu Thr Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Met Glu Thr His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(60)

<400> 8

gct cga gcc acc atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg 48

Ala Arg Ala Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu

1 5 10 15

ctc tgg gtt cca 60

Leu Trp Val Pro

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 9

Ala Arg Ala Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu

1 5 10 15

Leu Trp Val Pro

20

Claims

1.一种高效表达anti-hEGFR基因的真核表达载体构建方法，其特征在于以下步骤：

(1)hEGFR抗体重链及轻链基因的克隆：

以含anti-hEGFR全长基因的质粒为模板，设计引物pl1、pl2，ph1、ph2两对引物分别进行全长抗体轻链和重链基因的PCR扩增；

(2)Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建：

将轻链和重链插入到pKlight载体，得到质粒pK-LC和pK-HC。将pK-LC质粒经酶切后连接到pee12.4真核表达载体中；将pK-HC质粒及IRES EGFP经酶切后连接到pee6.4载体。重组后的pee6.4和pee12.4载体均用Sal I/Not I双酶切，回收大片段并使之相连，构建出同时具有抗体轻链和重链的双顺反子真核表达载体，命名为peedual-IRES-EGFP-hEGFR；

(3)提取去内毒素的peedual-IRES-EGFP-hEGFR质粒。

2.根据权利要求1步骤(1)所述的hEGFR抗体重链及轻链基因的克隆，其特征在于：设计引物为

3.根据权利要求1步骤(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建，其特征在于：连接轻链及pKlight载体时，先经限制性内切酶Bgl II、EcoR I分别酶切后用T4连接酶连接，得到质粒pK-LC。

4.根据权利要求1步骤(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建，其特征在于：连接重链及pKlight载体时，先经限制性内切酶BamH I、Nhe I分别酶切后用T4连接酶连接，得到质粒pK-HC。

5.根据权利要求1步骤(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建，其特征在于：pKlight载体中含有IgKappa Leader。IgKappa Leader编码基因序列为SEQ IDNO:8所示，氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示。

6.根据权利要求1步骤(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建，其特征在于：将pK-LC经Hind III、EcoRI酶切得到含IgKappa Leader的轻链片段IgK-LC后连接到pee12.4真核表达载体中，得到质粒Pee12.4-LC。

7.根据权利要求1步骤(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建，其特征在于：将pK-HC质粒经Hind III/EcoR I双酶切后，得到含IgKappa Leader的重链片段IgK-HC。

8.根据权利要求7所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建，其特征在于：将IgK-HC用Nhe I单酶切后得到片段IgK-HC(Hind III/Nhe I)用于后续连接。

9.根据权利要求1步骤(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建，其特征在于：pee12.4载体和pee6.4载体经Hind III、EcoRI酶切处理后用于连接。

10.根据权利要求1步骤(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建，其特征在于：用Nhe I/EcoR I双酶切处理pee12.4-IRES EGFP制备IRES EGFP片段，用于载体构建。IRES EGFP片段编码基因序列为SEQ ID NO:3所示。

11.根据权利要求1步骤(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建，其特征在于：IgK-HC(Hind III/Nhe I)与IRES EGFP片段、pEE6.4连接得到质粒Pee6.4-HC-IRES-EGFP。

12.根据权利要求1步骤(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建，其特征在于：将Pee12.4-LC、Pee6.4-HC-IRES-EGFP质粒用Not I/Sal I进行双酶切后连接，得到质粒Peedual-IRES-EGFP-hEGFR。其中LC编码基因序列为SEQ ID NO:4所示，氨基酸序列为SEQ ID NO:5所示；HC编码基因序列为SEQ ID NO:6所示，氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示。

13.根据权利要求1步骤(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建，其特征在于：在重链基因和EGFP基因之间引入内部核糖体进入位点(IRES)，IRES来自脑心肌炎病毒，其功能类似于真核细胞mRNA上的5'帽子结构，主要是招募核糖体进入并使其上游及下游的两个转录子同时翻译。

14.根据权利要求1步骤(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表达载体的构建，其特征在于：在轻链的下游引入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因，能够直观的监测及分选阳性细胞。其中EGFP编码基因序列为SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。