CN106520766B - 一种海藻内源组成型启动子及其应用 - Google Patents
一种海藻内源组成型启动子及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于海藻基因工程技术领域，涉及一种海藻内源组成型启动子及其应用。启动子为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列；对SEQ ID NO:1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加所获得；或，与序列表中SEQ ID No:1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有转录起始作用的核苷酸序列。本发明采用染色体步移、基因克隆、DNA测序等技术得到浒苔肌动蛋白基因(actin)启动子，具有SEQ ID NO:1所示的序列；在此基础上将克隆的肌动蛋白基因启动子插入报告基因GUS上游，构建转化载体导入浒苔叶状体检测到GUS基因高效表达。该技术可以提高浒苔转基因效率和生物安全性，对藻种的品种改良以及基因工程产品开发都具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于海藻基因工程技术领域，涉及一种海藻内源组成型启动子及其应用。
背景技术
大型海藻属于低等植物，主要包括绿藻、褐藻与红藻。其中许多经济种类已实现规模化人工栽培，例如绿藻类的浒苔、石莼与礁膜，褐藻类的海带、裙带菜、羊栖菜，以及红藻类的紫菜、红毛菜、江蓠、石花菜和麒麟菜。目前全球大型海藻栽培总面积超过三百万亩，年产量超过600万吨鲜重，除部分作为营养食品外，也用于碘、甘露醇、藻胶等重要化工原料、以及海洋药物与蛋白试剂的提取原料，具有很高的经济价值。
近年来，栽培海藻在新能源(如发酵产乙醇、甲烷)、新材料(如海藻多糖纺织纤维)、新型表达系统(重组制备蛋白类药物)等领域也表现出突出的应用潜力。为了实现海藻快速定向育种的需要，迫切需要发展高效、安全的海藻基因工程技术与全套方法。其中，针对导入基因的高效表达，启动子是一个重要的载体元件。
启动子是基因的一个组成部分，是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子就像"开关"，其本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的蛋白质结合而控制基因的转录。目前，以海带、裙带菜、紫菜为代表的海藻遗传转化体系已经初步建立，导入外源功能基因在海藻中已经可以实现稳定表达。但是，由于使用的启动子元件多是来自陆地生物，由此也存在很多不足。例如，在高等植物中使用广泛的CaMV35S高效启动子(来自花椰菜花叶病毒)，在海藻中驱动外源基因表达的效率普遍较低；另外，海藻中使用最广泛的SV40启动子系来自灵长类猿猴空泡病毒，因此，外源启动子的使用带来大型海藻转基因低效表达与存在安全隐患两个突出问题。
发明内容
针对海藻基因工程对藻类自身来源组成型启动子的需求，本发明的目的是提供一种海藻内源组成型启动子及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种海藻内源组成型启动子，浒苔肌动蛋白基因(actin)启动子为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列；
对SEQ ID NO:1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加所获得；
或，与序列表中SEQ ID No:1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有转录起始作用的核苷酸序列。
优选，所述浒苔肌动蛋白基因(actin)启动子为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
所述启动子系从海洋绿藻中获得。
所述启动子系从石莼属(Ulva)植物中获得。
进一步的说，利用分子生物学的染色体步移(genome walking)技术、基因克隆技术、DNA测序技术克隆一种浒苔内源组成型肌动蛋白基因启动子pUpActin并测定其序列；在此基础上，利用克隆技术将所克隆的pUpActin启动子序列分别插入到β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因、加强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)基因、以及除草剂草丁膦抗性基因(bar)的上游，构建了系列浒苔转化载体，经转化，可实现导入外源基因的高效表达。
海藻内源组成型启动子的应用，所述启动子在浒苔遗传育种中的应用。
所述启动子在海藻品质改良和构建海藻表达系统中的应用。
本发明提供的肌动蛋白(Actin)基因是生物界普遍存在的一种组成型表达基因，本发明所提供的浒苔肌动蛋白基因(actin)启动子名称为pUpActin，来源于大型经济绿藻——浒苔(Ulva prolifera)。
与现有方法相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明通过染色体步移技术(Genome Walking)得到浒苔肌动蛋白基因上游片段，经启动子功能验证后进一步设计了特异性扩增引物，可有效获得浒苔肌动蛋白启动子。
2.在海藻转基因研究或应用中使用浒苔内源的肌动蛋白基因启动子，可以替代目前使用的动物病毒(如SV40、CMV)以及高等植物病毒(CaMV35S、AMT)来源的启动子，完全避免病毒核酸序列的引入，具有更高的生物安全性，有利于将来转基因海藻的应用。
3.肌动蛋白是一个高水平组成型表达的蛋白，肌动蛋白基因启动子是一个高效表达的调控元件，用浒苔肌动蛋白基因启动子构建海藻转基因载体，其驱动外源基因的表达效率会显著提高。
4.使用浒苔肌动蛋白基因启动子驱动选择标记基因(如除草剂草丁膦抗性基因bar)表达，通过提高抗性基因的表达水平，可以加大筛选试剂浓度(如草丁膦)，从而降低耐性克隆(假阳性)的产生，增加转基因抗性克隆(真阳性)比率，有效提高筛选效率。
附图说明
图1为本发明实施例提供的浒苔肌动蛋白基因5’上游序列生物信息学分析图。
图2为本发明实施例提供的浒苔转化载体pUPA1-GUS示意图。
图3为本发明实施例提供的浒苔转化pUPA1-GUS的定量检测结果。
图4为本发明实施例提供的缘管浒苔转化pUPA1-GUS的定量检测结果。
图5为本发明实施例提供的孔石莼转化pUPA1-GUS的定量检测结果。
图6为本发明实施例提供的浒苔转化载体pUpActin-EGFP构建示意图。
图7为本发明实施例提供的浒苔转化pUpActin-EGFP的荧光显微镜检测结果。
图8为本发明实施例提供的浒苔转化载体pUpActin-bar构建示意图。
图9为本发明实施例提供的浒苔转化pUpActin-bar的草丁膦抗性藻株的PCR检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的元件及该元件所达到的效果作进一步详细说明。
本发明浒苔内源组成型肌动蛋白基因启动子序列及其在获得转基因海藻中的应用；可有效提高转基因效率和生物安全性，对藻种的品种改良以及基因工程产品开发具有重要意义。
实施例1：浒苔(U.prolifera)内源组成型肌动蛋白基因启动子pUpActin的克隆、测序与生物信息学分析
1.浒苔肌动蛋白基因5’上游序列的克隆与测序
利用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒按照常规方式制备浒苔总DNA模板，经0.8％的琼脂糖电泳检测，提取的浒苔基因组DNA条带清晰完整，可以满足PCR扩增需要。利用TaKaRa公司的(Genome Walking Kit)染色体步移试剂盒，针对浒苔内源组成型肌动蛋白基因的5’上游序列，设计三条特异性引物(SP1:5’-CAAGGCAATCAGTAATGGACACG-3’；SP2:5’-GTGCCGAGGTCTGCCAACGATT-3’；SP3:5’-CCCGCAACAATCATCCTTCAAAA-3’)，根据试剂盒说明书进行染色体步移，将扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶回收、TA克隆连接并进行核苷酸序列测定，获得肌动蛋白基因的5’上游序列共1941bp。
2.浒苔肌动蛋白基因5’上游序列的生物信息学分析
利用植物顺式作用元件的在线分析工具PLANTCARE(网址http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)，经生物信息学分析发现，浒苔肌动蛋白基因5’上游序列存在TATA-Box、CAAT-Box及一些可能的启动子调控元件(见图1)，可以初步认定该序列具有启动子的功能。
实施例2：浒苔肌动蛋白基因启动子pUpActin驱动报告基因GUS在海藻中表达
1.浒苔肌动蛋白基因启动子片段的克隆与pUPA1-GUS载体构建
根据实施例1获得的浒苔肌动蛋白基因5’上游序列，针对生物信息学预测的具有启动子活性的区域，设计浒苔肌动蛋白基因启动子pUpActin特异性引物(actin1-F13B-HindIII:5’-TGATTACGCCAAGCTTtgttagggagggtgtctatgcg-3’，其中斜体字母代表限制性内切酶Hind III的识别位点；actin1-R13B-SmaI:5’-AGGGACTGACCACCCGGGtctccaggtttagacgtctac-3’，其中斜体字母代表限制性内切酶Sma I的识别位点.大写字母代表后续使用HD Cloning Kit无缝连接克隆试剂盒构建载体所需要的与载体末端同源的片段)，进行PCR扩增，扩增片段经琼脂糖凝胶回收、TA克隆连接并进行核苷酸序列测定，获得SEQ ID No:1序列。
以Clontech公司的商业化载体pBI221(CaMV35S启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶GUS基因)为出发载体，使用限制性内切酶Hind III和Sma I对其进行双酶切，将GUS基因上游原CaMV35S启动子切掉，经1％琼脂糖凝胶电泳，使用OMEGAGel Extraction Kit对酶切大片段(携带GUS基因)进行回收。使用TaKaRa高保真PCR酶Max DNAPolymerase对上述测序无误的引物对actin1-F13B-HindⅢ/actin1-R13B-SmaⅠ扩增片段单克隆进行PCR扩增，使用HD Cloning Kit无缝连接克隆试剂盒将获得的PCR产物与pBI221的Hind III和Sma I双酶切大片段进行连接。然后将连接产物转化到大肠杆菌Top10菌株感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性转化子。阳性转化子扩大培养并提取质粒，对质粒进行双酶切鉴定(Hind III和Sma I)，酶切结果无误的质粒送测序公司测序。由此获得海藻转化载体pUPA1-GUS(见图2)，由浒苔肌动蛋白基因启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶GUS基因转录。
另外，根据实施例1获得的浒苔肌动蛋白基因5’上游序列，设计特异引物(actin1-F13:5’-TGTTAGGGAGGGTGTCTATGCG-3’；actin1-R18:5’-TCTCCAGGTTTAGACGTCTACTTTTTCGGCGAACAATTGACCTCACCG-3’)进行PCR扩增，获得了截短的浒苔肌动蛋白基因上游序列，该序列缺失浒苔肌动蛋白基因起始密码子ATG上游-172至-27位共146个bp。进一步使用前述特异引物actin1-F13B-HindIII和actin1-R13B-SmaI，对该片段进行PCR扩增，与pUPA1-GUS同法构建启动子截短的载体pUPA1N1-GUS。
SEQ ID NO.1pUpActin
TGTTAGGGAGGGTGTCTATGCGAGTTAACGGGTAAGTGTTGTTAATCGTGTTCTCATTGAGGTATCTAAAGTCAATGCACAATCCGTCAGTTTGCCCCCCGGTTTGGGTGCAAATAACATTCGAGGCCCATGGGGATAATGAAGGTGTTACTCATCCCATGTCAAGCACGTGTTGTAATTGTTTCTCAAGTTCTAAGGATTCTCTGGGAGTGAGGCAATACTGTCTGGCCGCCTTTGGTCATGCACCTGGTAGCAGCTCAATGTCCATTTCGAATCTGTTGCGAAAGTGTTGGTTGGTGTTGCCCAGGTTGCCGCTTGCAGCCTAATGCTTGGTGATGACCTCCTGAAGGACACACATCGCGGGCCTATGAGGACCATCAAACAAATCATATCAGCACGTGCACGCAGATAGCATCTACGTGCTGAAGCCGCTGATGACGTGGCGTTTGTCCATCAGAACAACTGCACACAGAACAGTTACCAGACTAAATATTAGCTCCAATAGGGATCCGTGTGTCTGAATCTCCGTGCGTTGTGATGTGCACCATACTCAACTGGAGTATCTTGCAAGCATTTCATGCCTCACATCTGTGCACAGCTGCCATCTGTATCATGACCACCCAAGCTCAGCCAGTCATCTTGAGGTGCAAAACGAAACAACATTGCCTGACCAGAGATTGTATCTTCCCGAAGTCCGGGAGTGCAATTTTCGCAGCATGGGATACAGCCAGTTGGCAGGCCTCAACATCCACGTCACGCTGCCTTCGACATCGGGGTCAGTCGGGAAGTACACACGTCCCCGAACTCGGGATTACCACCAGGTTGCAGAGCCCTTAGTCGAGACAAATTCGTGAAGCGGTTCAGTTGGCGTCGGGTTTGGCTCGAGTTCTCGGCCTTTGTACACAACGGTCCAGAATATGAATCCCATGCCCAAAGTACGTCGCGCATGGTTCGTCGATCGAGCAGAAGCATGCGAAATGTTGTTGACGTGGTCCTTGAAGAATGAGACAAACCCTGGCAAGCTGCAGCTGAGAAACTGTTAGGTATTATTCCTGACAAGAGAACCCGGTGCAAAATTTAGATTGTCGTAATGTGCATAATTCCTGCGAGAGGCATGAGGGCATGAAGCCCAACAGCATGTCAAGCAACAGATGGAACTGTCATGCAAGCGCAAGTCGAAATTGTTTGTTTGTGAATCTCCTACTTTGCTTAGTCATGTTGAGACCTTCTGGAACATTCATTGGCGTTCTGAGCGCAGTCTGGCAGCGCGTTTGACCGACCGCTCGATGAACTCGGAGACACCTGCACCTGCATATAACATGATTCTATGCCAACCCCATTTTGCTCAACCAAACATTTTTCGGATCCGTACAATATTGCTTCTGAAAAGTCAACGGCTGTTCGACATTAGCACTCGGCCGCAACGGTGAGGTCAATTGTTCGCCGGTAAAGCGTTCCTTGCCGATCGTGAGATATGCCGTGCCGCAGACTCATCAATGGCGGATTTCATATGCCTTTTGAAGGATGATTGTTGCGGGTGTTTGTGTGGCATGTTCGTGTTCATTCATGGGAGTTCAGATGGGTGCATGCAGAAAAAGTAGACGTCTAAACCTGGAGA
(a)序列特征：
*长度：1618碱基对
*类型：核苷酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：浒苔(Ulva prolifera)
2.基因枪转化浒苔
1)基因枪微粒子的制备
称取60mg金粉(美国Bio-Rad公司基因枪配套耗材，直径1.0μm)，加入1ml无水乙醇，剧烈振荡1分钟；10000转/分离心10秒，除去上清液；加入1ml无菌水重新悬浮、离心分离去上清液，共重复3次，最后将金粉悬浮于1ml无菌水中，按每份50μl进行分装，4℃存放备用。
转化时取1份金粉悬液(1份是50μl)转移到1.5ml离心管进行振荡，连续振荡过程中依次加入5μl DNA(即上述步骤1获得转化载体，包括pUPA1-GUS和pBI221两种，1μg/μl)、50μl CaCl2(2.5mol/L)、20μl亚精胺(0.1mol/L)，振荡3分钟；10000转/分离心10秒，弃上清液；250μl乙醇漂洗，离心去上清，重复1次；60μl无水乙醇重悬金粉。
2)基因枪轰击海藻
取培养的浒苔(U.prolifera)叶状体，以及野外采集的缘管浒苔(U.linza)与孔石莼(U.pertusa)叶状体，分别用无菌手术剪剪成2cm长的藻段，转化时用圆形无菌筛绢(400目，直径4cm)做为藻段的承载体，将藻段均匀平铺于中央，形成直径约2cm的圆形有效轰击范围，作为样品。每个样品轰击一次，每次轰击约用12μl金粉悬浮液。转化用高压氦气式基因枪(型号：PDS1000/He)为美国Bio-Rad公司产品，轰击过程在无菌室或超净台中进行；操作台面、基因枪表面及内部均用70％乙醇擦拭消毒，轰击用耗材为可裂膜(Rupture disk)、DNA载片(Macrocarrier)与阻挡网(Stopping screen)，预先在70％无水乙醇中浸泡20分钟，紫外灯下晾干待用；转化参数为：受体细胞距离阻挡网6.0cm，真空度28(英寸汞柱)。试验设置用pBI221质粒轰击的阳性对照组，另设用不含质粒DNA的裸金粉轰击的空白对照组，操作方法相同。
3.GUS基因的定量检测
转化后，将转化组和对照组的海藻材料转入VSE培养液(VSE培养液采用消毒海水配制，含NaNO3 0.5mmol/L；Na2HPO4 0.03mmol/L；Na2EDTA 0.01mmol/L；FeSO4 1umol/L；MnCl2 0.1μmol/L；VB1 0.2mg/L；生物素1μg/L；VB12 1μg/L)，培养温度15.0±0.5℃，光暗周期12h/12h，光强约为50mmol·m-2·s-1。GUS酶能将没有荧光的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(4-MUG)催化分解为具有荧光的4-甲基伞形酮(4-MU)，基于上述原理和标准方法，能对转基因海藻中重组表达GUS酶的活力进行定量测定，从而反映出不同启动子的启动子活性。
具体操作步骤如下：转化48h后，将转基因的海藻叶状体经液氮冷冻后研磨成粉末，加入1ml的蛋白提取缓冲液(蛋白提取缓冲液为50mM Na2HPO4(pH 7.0),10mM Na2EDTA(pH 8.0),0.1％Triton X-100,10mMβ-巯基乙醇)，混匀后，4℃10000g离心15min，取上清，冰浴存放待用。使用天根公司的Bradford蛋白质定量试剂盒检测上清液中可溶蛋白的浓度取60μl上清液加入到540μl 37℃预热的反应液(反应液为50mM Na2HPO4(pH 7.0),10mMNa2EDTA(pH8.0),0.1％Triton X-100,10mMβ-巯基乙醇,2mM 4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷)中，分别在0、5、15、30、60min时取出100μl反应液到900μl反应终止液(0.2M Na2CO3)中，使用酶标仪在365nm激发光下检测455nm处的荧光值，并计算GUS酶活力，单位为nM MUmin-1(mg protein)-1。检测结果表明，在三种海藻材料中，浒苔肌动蛋白基因启动子pUpActin与高等植物中的高效启动子CaMV35S均可驱动GUS基因表达，但前者效率约是后者的两倍(见图3-5)。另外，向浒苔中转化启动子截短后的载体pUPA1N1-GUS，结果显示，其启动活力较启动子全长未受很大影响(见图3)。
上述结果证明扩增得到的浒苔内源组成型肌动蛋白基因5’上游序列具有启动子功能，可高效驱动外源基因在多种海藻中实现高效表达。
实施例3：浒苔肌动蛋白基因启动子pUpActin驱动报告基因EGFP在浒苔中表达
1.浒苔肌动蛋白基因启动子片段的克隆与pUPA1-EGFP载体构建
根据实施例1获得的浒苔肌动蛋白基因5’上游序列，针对生物信息学预测的具有启动子活性的区域，设计浒苔肌动蛋白基因启动子pUpActin特异性引物(actin1-F13B-Hind III：5’-TGATTACGCCAAGCTTtgttagggagggtgtc tatgcg-3’，其中斜体字母代表限制性内切酶HindⅢ的识别位点；actin1-R14B-Sma I:5’-ACCATGGTGGCGCCCGGGtctccaggtttagacgtctac-3’，其中斜体字母代表限制性内切酶Sma I的识别位点；大写字母代表后续使用HD Cloning Kit无缝连接克隆试剂盒构建载体所需要的与载体末端同源的片段)进行PCR扩增，扩增片段经琼脂糖凝胶回收、TA克隆连接并进行核苷酸序列测定，获得与SEQ ID No:1序列相同的片段。
以实验室自己构建的载体p35S-EGFP(CaMV35S启动子驱动加强型绿色荧光蛋白EGFP基因)为出发载体，使用限制性内切酶Hind III和Sma I对其进行双酶切，将egfp基因前CaMV35S启动子切掉，经1％琼脂糖凝胶电泳后，使用OMEGAGel ExtractionKit对酶切大片段进行回收。使用TaKaRa高保真PCR酶Max DNA Polymerase对上述测序无误的actin1-F13B-HindⅢ和actin1-R14B-SmaⅠ片段单克隆进行PCR扩增，使用HD Cloning Kit无缝连接克隆试剂盒将获得的PCR产物与p35S-EGFP的HindIII和Sma I双酶切大片段进行连接。然后将连接产物转化到大肠杆菌Top10菌株感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性转化子。阳性转化子扩大培养并提取质粒，对质粒进行双酶切鉴定(Hind III和Sma I)，酶切结果无误的质粒送测序公司测序。由此获得海藻转化载体pUPA1-EGFP(见图6)，由浒苔肌动蛋白基因启动子驱动EGFP基因转录。
2.基因枪转化浒苔
参照实施例2中步骤2。
3.EGFP基因的检测
转化后48小时，利用荧光显微镜(Zeiss Axio Imager A2)，设置488nm激发光，镜检浒苔藻体，发现野生型浒苔细胞的叶绿体具强烈的红色自发荧光，同时检测到具有黄绿色荧光的浒苔阳性细胞(见图7)，证明浒苔肌动蛋白基因启动子可以成功驱动EGFP报告基因的转录与表达，且具有较高的表达效率，能够抵消叶绿体红色自发荧光的强烈干扰。在阴性对照中未检测到本底。
实施例4：浒苔肌动蛋白基因启动子pUpActin驱动选择标记基因bar在浒苔中表达
1.浒苔肌动蛋白基因启动子片段的克隆与pUPA1-bar载体构建
根据实施例1获得的浒苔肌动蛋白基因5’上游序列，针对生物信息学预测的具有启动子活性的区域，设计浒苔肌动蛋白基因启动子pUpActin特异性引物(actin1-F13B-PstI：5’-TGATTACGCCCTGCAGtgttagggagggtgtctat gcg-3’，其中斜体字母代表限制性内切酶Pst I的识别位点；actin1-R15B-SmaI：5’-TTCTGGGCTCATCCCGGGtctccaggtttagacgtctac-3’，其中斜体字母代表限制性内切酶Sma I的识别位点；大写字母代表后续使用HD Cloning Kit无缝连接克隆试剂盒构建载体所需要的与载体末端同源的片段)，进行PCR扩增，扩增片段经琼脂糖凝胶回收、TA克隆连接并进行核苷酸序列测定，获得与SEQ ID No:1序列相同的片段。
以实验室自己构建的载体p35S-bar(CaMV35S启动子驱动除草剂草丁膦抗性基因bar)为出发载体，使用限制性内切酶Pst I和Sma I对其进行双酶切，将bar基因前CaMV35S启动子切掉，经1％琼脂糖凝胶电泳后，使用OMEGAGel Extraction Kit对酶切大片段进行回收。使用TaKaRa高保真PCR酶Max DNA Polymerase对上述测序无误的actin1-F13B-PstI和actin1-R15B-SmaI片段单克隆进行PCR扩增，使用HD Cloning Kit无缝连接克隆试剂盒将获得的PCR产物与p35S-bar的Pst I和Sma I双酶切大片段进行连接。然后将连接产物转化到大肠杆菌Top10菌株感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性转化子。阳性转化子扩大培养并提取质粒，对质粒进行双酶切鉴定(Pst I和Sma I)，酶切结果无误的质粒送测序公司测序。由此获得海藻转化载体pUPA1-bar(见图8)，由浒苔肌动蛋白基因启动子驱动bar基因转录。
2.基因枪转化浒苔
参照实施例2中步骤2。
3.bar基因的检测
转化后48h，诱导转基因藻体形成并放散生殖细胞，诱导时间约为2-3d，放散后的生殖细胞经稀释后转入VSE培养液培养，待幼苗长度大于1cm时向培养液中加入除草剂草丁膦，使其有效成分PPT的终浓度为40μg/ml，筛选时间为一周，筛选过程重复3-4次，最后挑出抗性藻株单克隆进行扩大培养。待具有足够生物量时，制备其基因组总DNA模板，并根据pUPA1-bar载体的bar基因区域设计特异引物(bar1-F：5’-TCTGCACCATCGTCAACCACTACA-3’；bar1-R：5’-TCAAATCTCGGTGACGGGCA GGAC-3’)进行PCR检测，野生型藻株PCR结果为阴性，而抗性藻株呈现阳性，说明pUPA1-bar载体成功整合到抗性藻株基因组中(见图9)。
上述结果证明，在除草剂草丁膦的高剂量选择压力下，浒苔肌动蛋白基因启动子可以成功驱动bar基因的转录与表达，使得阳性转化藻株成功获得对草丁膦的抗性，可用于稳定表达系统的构建和工程藻株的获得。
Claims (4)
1.一种海藻内源组成型启动子，其特征在于：浒苔肌动蛋白基因（actin）启动子如SEQID NO:1所示。
2.按权利要求1所述的海藻内源组成型启动子，其特征在于：所述启动子系从浒苔中获得。
3.权利要求1所述的海藻内源组成型启动子的应用，其特征在于：所述启动子在浒苔遗传育种中的应用。
4.权利要求1所述的海藻内源组成型启动子的应用，其特征在于：所述启动子在海藻品质改良和构建海藻表达系统中的应用。
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Legal Events
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20191210 |