CN107937437B - 一种昆虫细胞的光控表达载体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种昆虫细胞的光控表达载体及应用，申请人基于VP‑EL222光控转录激活系统，在昆虫细胞表达载体pMIB/V5‑HisA上成功构建阳性质粒pMIB‑C120‑mCherry‑GFP‑EL222和对照质粒pMIB‑C120‑mCherry‑GFP；转染Sf9细胞后，绿色荧光蛋白表达而红色荧光蛋白不表达。经蓝光照射刺激后，红色荧光蛋白表达；对照质粒pMIB‑C120‑mCherry‑GFP转染Sf9细胞后，绿色荧光蛋白表达而红色荧光蛋白不表达。经蓝光照射刺激，由于没有EL222转录因子，红色荧光蛋白仍然不表达。所述光控诱导表达系统首次成功运用到昆虫细胞上，拓展了该技术的应用范围。本发明所构建的验证方法质粒也为利用光控诱导表达技术提供了灵活和易用的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种昆虫细胞的光控表达载体及应用。
背景技术
随着转基因技术的发展，可控的基因表达调控系统成为生物医学研究及生物技术中不可或缺的工具。过去的几十年，化学调控的基因表达系统被广泛用于从时间上调控基因的表达。但是，由于这些小分子诱导物可以自由地扩散，难以消除以及对细胞功能潜在的脱靶效应，所以很难在空间和时间上精确地控制基因的表达。然而，光是一种理想的基因表达诱导物，可控强，没有毒性，并且可以实现对目的基因表达的时间、空间双重精确控制。因此，光控基因表达系统成为了精确控制基因表达的前途光明的工具。尽管如此，当前主要的光控表达系统仍有很多弱点限制着它的应用，比如：蛋白本身的毒性、狭窄的调控范围以及反应缓慢的激活和去激活作用。在我们这里将展示一个新的光控表达系统，它没有前述的缺点，且已在哺乳动物细胞及模式动物斑马鱼中被证明广泛的适用性。该系统不仅将可为对细胞生物学、发育生物学、神经生物学等生命科学基础研究提供创新性的工具，还可广泛用于生物工程、人类疾病的诊疗等应用领域。
该光控系统是以C120DNA结合序列与EL222转录因子为基础的光调控基因表达系统(Motta-Mena et al.,2014；Rivera-Cancel,G et al.,2012)。EL222转录因子，最初源于一个细菌的光-氧-压蛋白，被蓝光照射时就会二聚化结合到C120DNA上。这个系统的光依赖转录激活作用只需少量元件，一个光敏结构域LOV，一个螺旋-转角-螺旋(H-T-H)DNA结合结构域。黑暗时LOV结构域结合着HTH结构域，覆盖了对于成为二聚体而结合到DNA所必需的HTH4α位点。蓝光照射会触发光化学反应：LOV结构域中的黄素蛋白复合物打断了LOV和HTH的相互作用，使EL222二聚化，从而发挥DNA结合蛋白活性。这些反应在黑暗中又会反过来进行，其逆反应在停止蓝光照射后将很快发生，这是快速去激活作用的基础。这个系统对控制表达的目标蛋白很大的可调表达范围，敏捷的激活和去激活作用，以及与光强度有足够高的线性相关性。总之，各项研究表明C120-EL222系统宽广的通用性以及它作为光遗传学工具的优势。
目前，以C120-EL222为基础的光控系统在哺乳动物细胞中得到了广泛的应用，在时间和空间的操控方面表现出光控系统明显的优势(Nash et al.,2011；Motta-Mena etal.,2014)。进一步，科学家尝试在斑马鱼中验证了该光控系统的可行性，虽然可以实现光控表达，但是由于表现出一定的毒性，限制了该系统在斑马鱼中的应用。接下来，通过基因工程改造，科学家优化出了更加适用于斑马鱼的光控系统，即TAEL(TA4-EL222)系统(Reade,A.et al.,2017)。C120-EL222系统从哺乳动物细胞到斑马鱼的跨越，扩展了该光控系统的应用范围，同时也为鱼类的研究提供了一个有力的工具。
基于此，申请人在Sf9昆虫细胞中建立了一个以VP-EL222为基础的光控基因表达系统，将C120-EL222光控系统的元件和荧光蛋白报告基因巧妙地整合到一个昆虫细胞表达载体上，从而使光控系统效能的测试更加快速而稳定，使昆虫细胞中外源蛋白表达的调控更加灵活。我们首次在昆虫细胞中成功实现了C120-EL222系统的光控表达，扩展了该光控系统适用范围。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种应用于昆虫细胞的光控表达载体pMIB-C120-MCS-GFP-EL222，所述载体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该载体巧妙地整合了C120-EL222光控系统的调控元件和荧光蛋白报告基因，利用opIE1组成性启动子调控GFP报告基因串联EL222转录因子的表达；利用光控调节启动子C120DNA序列调控外源基因的表达，提高了这种光控系统的灵活性和易操作性。同时，该载体还保留了杀稻瘟菌素抗性基因，可用于筛选光控表达的稳定细胞系，新引入了GFP报告基因，便于实时监控载体的转染效率，以及通过基于绿色荧光标记的流式细胞仪快速高效分选光控表达的稳定细胞系。
本发明的另一个目的在于提供了一种昆虫细胞的光控表达载体的应用，将外源蛋白插入pMIB-C120-MCS-GFP-EL222中后，转染至昆虫细胞Sf9，可实现功能蛋白的光控表达。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种带有外源蛋白的昆虫细胞的光控表达载体的制备方法，包括：
1)外源基因通过EcoR1和Xba1酶切位点置换pC120-Luc质粒中的Luc基因，得到pC120-外源基因质粒；
2)以pC120-外源基因质粒为模板，扩增C120-外源基因片段，插入pMIB/V5-his载体的BspH1和Age1酶切位点中，得到pMIB-C120-外源基因质粒；
3)人工合成SEQ ID NO.2所示核苷酸片段，克隆置于psimple-T载体中，得到psimple-T/PFT2AN载体，通过psimple-T/PFT2AN中的Nhe1酶切位点引入荧光蛋白报告基因，再通过psimple-T/PFT2AN中的BsiwI酶切位点引入EL222基因，得到psimple-T/荧光蛋白-EL222质粒；
4)将psimple-T/荧光蛋白-EL222质粒中的荧光蛋白-EL222片段，通过PvuII和BglII酶切位点插入到pMIB-C120-外源基因质粒中，得到pMIB-C120-外源基因-荧光蛋白-EL222质粒载体；
所述的pMIB/V5-his载体为pMIB/V5-his A或pMIB/V5-his B或pMIB/V5-his C。
本领域技术人员可根据实际情况，根据上述的方法，制备表达不同外源蛋白的昆虫细胞光控表达载体；或是直接将外源蛋白插入光控表达载体pMIB-C120-MCS-GFP-EL222中(C120后的MCS携带多种酶切位点，供外源基因的插入)中，来制备携带外源蛋白的昆虫细胞光控表达载体。
一种昆虫细胞的光控表达载体的应用，包括利用该光控表达载体构建昆虫细胞的光控表达平台，或是利用该载体控制蛋白的表达。
以上所述的方案中，具体的，是将pMIB-C120-外源基因-GFP-EL222质粒载体转染至昆虫细胞中，然后按照需要进行蓝光照射或是黑暗处理，来控制外源蛋白的表达。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.将C120-EL222光控系统的元件巧妙地整合到一个昆虫细胞表达载体，提供了一种质粒构建的范式。
2首次在昆虫细胞中实现了该C120-EL222光控系统的光控表达应用，扩展了该光控系统新的适用范围。
3.将原C120-EL222光控系统的元件由多质粒携载简化为单质粒携载，极大提高了转染后效应细胞的阳性比率，也使得该光控系统的测试更加快速而稳定。本光控系统工作的测试指标为：蓝光诱导后，在有绿色荧光蛋白GFP表达的Sf9细胞中，可通过检测红色荧光蛋白mCherry的表达来反映光控元件的工作效能。
4.在光控质粒中引入组成型表达GFP报告基因，便于通过绿色荧光标签的流式细胞仪进行阳性细胞筛选，大大提高了筛选稳定光控细胞系的效率。
附图说明
图1昆虫细胞表达载体pMIB/V5-His图谱。
图2为基于C120-EL222的光控表达系统原理图。
图3为昆虫细胞光控表达载体pMIB-C120-mCherry-GFP-EL222构建基本流程图。
图4构建载体的酶切鉴定电泳谱图。
图5昆虫细胞光控表达载体在sf9昆虫细胞中的功能验证示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
昆虫细胞表达载体pMIB-C120-mCherry-GFP-EL222的构建
1.实验材料
| pMIB/v5-hisA载体 | Invitrogen公司 |
| pC120-Luc质粒 | Kevin HGardner教授馈赠(Motta-Mena et al.,2014) |
| pVP-EL222质粒 | Kevin HGardner教授馈赠(Motta-Mena et al.,2014) |
| Gel Extraction kit胶回收试剂盒 | OMEGA bio-tek公司 |
| Plasmid mini kit质粒回收试剂盒 | OMEGA bio-tek公司 |
| E.coli DH-5α感受态 | ATCC |
| 限制性内切酶 | NEB公司 |
| CIP | NEB公司 |
| T4DNA ligase | NEB公司 |
| 凝胶成像仪 | BioRad公司 |
质粒克隆使用的引物列表：
2.实验方法
1)以pLV-mCherry(购买于Addgene)载体为模板，利用引物E-mch-F和X-mch-R扩增mcherry基因片段，通过EcoR1和Xba1酶切位点置换pC120-Luc质粒中的Luc基因，得到pC120-mcherry质粒。
2)以pC120-mcherry质粒为模板，利用引物BspH-C120-F和Age-Mch-R扩增C120-mcherry片段，插入pMIB/V5-hisA载体的BspH1和Age1酶切位点中，得到pMIB-C120-mcherry质粒。
3)为了便于多元件整合载体质粒的构建，人工合成一段DNA片段PFT2AN，该片段由457个碱基对组成(SEQ ID NO.2所示)，克隆置于psimple-T载体中，获得质粒psimple-T/PFT2AN。利用引物Nhe-GFP-F和GFP-Nhe-R，以pEGFP-N1(购买于Clontech)载体为模板，扩增GFP基因，通过psimple-T/PFT2AN中的Nhe1酶切位点引入GFP报告基因，利用引物Bsiw-EL-F和EL-Bsiw-R扩增EL222基因，通过psimple-T/PFT2AN中的BsiwI酶切位点引入EL222基因，得到psimple-T/GFP-EL222质粒。
4)将psimple-T/GFP-EL222质粒中的GFP-EL222片段，通过PvuII和BglII酶切位点插入到pMIB-C120-mcherry质粒中，得到pMIB-C120-mCherry-GFP-EL222质粒载体
5)直接使用BsiwI酶对载体pMIB-C120-mCherry-GFP-EL222进行单酶切。纯化后经连接转化获得pMIB-C120-mCherry-GFP质粒，作为EL222功能缺失的阴性对照质粒；
按照图3的载体构建策略，构建阳性质粒pMIB-C120-mCherry-GFP-EL222和阴性对照质粒pMIB-C120-mCherry-GFP，经酶切验证完全正确(如图4)。pMIB-C120-mCherry-GFP-EL222功能载体的EcoRI/XbaI酶切放出750bp左右条带为mCherry带，BsiwI的酶切放出放出900bp左右EL222条带，；pMIB-C120-mCherry-GFP对照载体的EcoRI/XbaI放出750bp左右条带为mCherry带，BsiwI的酶切无条带。鉴定结果符合预期，所有克隆质粒都测序验证，序列正确。
以上载体构建的每一步均采用常规的分子克隆方法：
1)设计特异引物通过PCR扩增获得末端含有特定酶切位点的片段；同时对载体和片段分别酶切，并纯化酶切产物；使用T4连接酶，16℃连接载体片段过夜；
2)转化、摇菌、涂平板(实验中使用的都是氨苄抗性平板)，平板于37℃烘箱中过夜；挑斑摇菌，菌体浓度增大后用相应引物菌液PCR鉴定，扩大培养鉴定为阳性的菌；保存菌种(菌种保存在10％-15％甘油溶液中，-20℃)。
3)用质粒小提试剂盒抽提质粒，并测定浓度；利用合理的限制酶对所提质粒进行酶切鉴定；挑取阳性质粒测序，测序正确后将质粒用于下一步使用。质粒需保存在-20℃。
本实施例是以报告基因mCherry作为外源基因为例，对本发明提供的光控表达载体进行说明，本领域技术人员可根据实际情况，根据上述的方法，制备表达不同外源蛋白的昆虫细胞光控表达载体；或是直接将外源蛋白插入光控表达载体pMIB-C120-MCS-GFP-EL222中(C120后的MCS携带多种酶切位点，供外源基因的插入)，来制备携带外源蛋白的昆虫细胞光控表达载体。
实施例2：
昆虫细胞光控表达载体pMIB-C120-mCherry-GFP-EL222在Sf9昆虫细胞中的功能验证：1.实验材料
2.实验方法与结果
2.1Sf9细胞的传代培养：使用Grace’s Insect Cell Medium加血清及双抗的培养基，在28℃细胞培养箱中贴壁培养Sf9细胞，当细胞生长至90％左右，直接将细胞轻轻吹起进行传代。
2.2昆虫细胞光控表达载体转染Sf9昆虫细胞。本次实验需要转染的质粒有两个：pMIB-C120-mCherry-GFP-EL222(功能质粒)和pMIB-C120-mCherry-GFP(阴性对照质粒)。
1)提前24小时将Sf9细胞按8×105个细胞/孔接种于6孔板中，当细胞汇合度达到70～80％时，进行转染。转染前准备10ml平板培养基：1.5ml Grace细胞培养液(含10％FBS)+8.5ml Grace细胞培养液(不含FBS)。平板培养基中不可有抗生素。
2)放置待转染的6孔板中Sf9细胞于超净台上，吸除6孔板细胞中的培养基，加入2ml上述新鲜的平板培养基。
3)稀释2～6μl转染试剂(
II Reagent)于100μl Grace’s培养基。稀释1～3μg目标质粒于100μl Grace’s培养基。
4)将稀释后的DNA和转染试剂混合均匀，室温孵育15-30min。
5)加210μl质粒和转染试剂的混合液于待转染细胞中，28℃孵育4～6h。
6)吸除转染试剂混合液，加入2ml Sf9细胞完全培养液(含双抗及10％FBS)，28℃培养箱继续培养，24h后跟踪细胞状态。根据不同需求，给予培养细胞不同的光照条件。
本次一共设计了四组转染实验，转染阳性质粒pMIB-C120-mCherry-GFP-EL222的光照与黑暗两组，转染阴性对照质粒pMIB-C120-mCherry-GFP的光照与黑暗两组。蓝光照射条件为：照射20s、黑暗60s为一个循环。
2.3质粒pMIB-C120-mCherry-GFP-EL222和pMIB-C120-mCherry-GFP转染Sf9细胞后，28℃培养箱中培养，转染后24h再施以蓝光照射与黑暗两种条件，分别在蓝光照射刺激24h和48h后在荧光显微镜下观察红色荧光表达情况(图5)。
1)功能质粒pMIB-C120-mCherry-GFP-EL222转染sf9后，设置蓝光照射与黑暗条件培养两组，转染24小时后施与光照(蓝光照射20s停60s为一个循环)与黑暗两种条件，光照24小时后于荧光显微镜下观察，得到结果(图5中A)。结果显示转染后绿色荧光蛋白GFP有持续性表达，经过蓝光照射后GFP阳性细胞中有较强红色荧光蛋白mCherry的表达。上述结果证明该C120-EL222光控系统能够在Sf9细胞中具有特异性的高效功能活性。
2)阴性对照质粒pMIB-C120-mCherry-GFP转染Sf9后，同样设置蓝光照射与黑暗条件培养两组，转染24小时后给予光照(蓝光照射20s停60s为一个循环)与黑暗两种条件，光照24小时后于荧光显微镜下观察，得到结果(图5中B)。结果显示：转染后绿色荧光蛋白GFP有持续性表达，但在无EL222光控转录因子存在时，蓝光照射和黑暗条件下都没有红色荧光蛋白mCherry的表达。上述结果证明该C120-EL222光控系统在Sf9细胞中具有高度的转录激活特异性和严谨性，基本无泄漏表达。
3)质粒pMIB-C120-mCherry-GFP-EL222转染Sf9后，设置蓝光照射与黑暗条件培养两组，转染24小时后施与光照(蓝光照射20s停60s为一个循环)与黑暗两种条件，光照48小时后于荧光显微镜下观察，得到结果(图5中C)。蓝光额外照射24h会略微增加红色荧光细胞的数量，但增加不是很明显。上述结果证明在Sf9细胞中，C120-EL222光控系统在蓝光照射24h后，红色荧光蛋白mCherry的表达就达到了较高水平，继续光照诱导后红色荧光蛋白mCherry表达有所增加，并能维持较高水平。
综上所述，该C120-EL222光控系统能够在Sf9细胞中具有特异性的高效功能活性和高度的严谨性，能够持续激活表达外源目的蛋白。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院武汉物理与数学研究所
<120> 一种昆虫细胞的光控表达载体及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5000
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catgatcgct agcctcgagt aggtagcctt tagtccatgc gttataggta gcctttagtc 60
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tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga 2700
acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt 2760
ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga 2820
ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa ggctagcgag ggcagaggaa 2880
gtctgctaac atgcggtgac gtcgaggaga atcctggccc acgtacgatg ggccctaaaa 2940
agaagcgtaa agtcgccccc ccgaccgatg tcagcctggg ggacgagctc cacttagacg 3000
gcgaggacgt ggcgatggcg catgccgacg cgctagacga tttcgatctg gacatgttgg 3060
gggacgggga ttccccgggg ccgggattta ccccccacga ctccgccccc tacggcgctc 3120
tggatatggc cgacttcgag tttgagcaga tgtttaccga tgcccttgga attgacgagt 3180
acggtgggga attcggggca gacgacacac gcgttgaggt gcaaccgccg gcgcagtggg 3240
tcctcgacct gatcgaggcc agcccgatcg catcggtcgt gtccgatccg cgtctcgccg 3300
acaatccgct gatcgccatc aaccaggcct tcaccgacct gaccggctat tccgaagaag 3360
aatgcgtcgg ccgcaattgc cgattcctgg caggttccgg caccgagccg tggctgaccg 3420
acaagatccg ccaaggcgtg cgcgagcaca agccggtgct ggtcgagatc ctgaactaca 3480
agaaggacgg cacgccgttc cgcaatgccg tgctcgttgc accgatctac gatgacgacg 3540
acgagcttct ctatttcctc ggcagccagg tcgaagtcga cgacgaccag cccaacatgg 3600
gcatggcgcg ccgcgaacgc gccgcggaaa tgctcaggac gctgtcgccg cgccagctcg 3660
aggttacgac gctggtggca tcgggcttgc gcaacaagga agtggcggcc cggctcggcc 3720
tgtcggagaa aaccgtcaag atgcaccgcg ggctggtgat ggaaaagctc aacctgaaga 3780
ccagtgccga tctggtgcgc attgccgtcg aagccggaat ctaacgtacg cgaaacttgt 3840
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 3900
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 3960
tctgagatct gcatgtctac taaactcaca aattagagct tcaatttaat tatatcagtt 4020
attacccatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 4080
ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 4140
gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt 4200
aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 4260
ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 4320
atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg 4380
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actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat 4680
aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa 4740
tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag 4800
ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat 4860
agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt 4920
tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg 4980
aagatccttt ttgataatct 5000
<210> 2
<211> 457
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagctggcaa cctgacttgt atcgtcgcga tcggaaatga gaacaggggc atcttgagcc 60
cctgcggacg gtgccgacag gttcttctcg atctgcatcc tgggatcaaa gccatagtga 120
aggacagtga tggacagccg acggcagttg ggattcgtga attgctgccc tctggttatg 180
tgtgggaggg ccagactttg aattttgacc ttctcaagtt ggcgggagac gtggagtcca 240
acccagggcc cgctagcgag ggcagaggaa gtctgctaac atgcggtgac gtcgaggaga 300
atcctggccc acgtacgcga aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 360
atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 420
ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct gacatct 457
Claims (4)
1.一种应用于昆虫细胞的光控表达载体，所述载体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.一种带有外源基因的昆虫细胞的光控表达载体的制备方法，包括：
1)外源基因通过EcoR1和Xba1酶切位点置换pC120-Luc质粒中的Luc基因，得到pC120-外源基因质粒；
2)以pC120-外源基因质粒为模板，扩增C120-外源基因片段，插入pMIB/V5-his载体的Bsp H1和Age1酶切位点中，得到pMIB-C120-外源基因质粒；
3)人工合成SEQ ID NO.2所示核苷酸片段，克隆置于psimple-T载体中，得到psimple-T/PF T2AN载体，通过psimple-T/PFT2AN中的NheⅠ 酶切位点引入荧光蛋白报告基因，再通过psi mple-T/PFT2AN中的BsiwI酶切位点引入EL222基因，得到psimple-T/荧光蛋白-EL222质粒；
4)将psimple-T/荧光蛋白-EL222质粒中的荧光蛋白-EL222片段，通过PvuII和BglII酶切位点插入到pMIB-C120-外源基因质粒中，即得。
3.权利要求1所述的载体或权利要求2所述方法制备的载体在构建昆虫细胞的光控表达平台中的应用。
4.权利要求1所述的载体或权利要求2所述方法制备的载体在控制蛋白的表达中的应用。
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