CN107936111B - 一种hip/pap蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HIP/PAP蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)设计目的蛋白的基因序列；(2)合成用于表达HIP/PAP蛋白的基因片段FHIP/PAP；(3)构建表达载体；(4)转染；(5)目的蛋白的纯化；(6)目的蛋白的活性测定。本方法为可溶性表达，克服了常规的大肠杆菌不能可溶性表达HIP/PAP，只能包涵体表达的局限；本发明制备HIP/PAP蛋白的方法具有操作简单，不需要复性，并且活性显著高于常规包涵体表达等优点，具有广阔的应用前景。

Description

一种HIP/PAP蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种HIP/PAP蛋白的制备方法。

背景技术

人HIP/PAP蛋白(Hepatocarcinoma-Intestine-Pancreas/Pancreatitis-Associated Protein)，又称再生蛋白3α(Regenerating islet-derived protein III-alpha)，是由胰腺分泌的165个氨基酸组成的蛋白质。

1984年，KEIM等人首次在大鼠急性胰腺炎模型胰液中发现了一种新的分泌性蛋白质，由于这种蛋白质与急性胰腺炎的发生发展密切相关，故将其称为胰腺炎相关蛋白(pancreatitis-associated protein，PAP)。LASSERE等人通过对人肝细胞癌cDNA文库的研究，成功克隆出肝肿瘤-肠道-胰腺基因(hepatocarcinoma-intestine-pancreas，HIP)，且证实HIP基因和PAP基因为同源基因，称之为HIP/PAP。HIP/PAP能防御肝细胞免于肿瘤坏死因子介导的程序性死亡，同时也是一种促有丝分裂剂，能促进肝细胞有丝分裂，从而促进肝细胞再生。同时，HIP/PAP参与细胞免疫、细胞增殖分化、抗细胞凋亡、炎症、抗菌等多种生理或病理过程，有希望用于急性肝衰竭、溃疡性结肠炎等多种疾病的治疗。HIP/PAP蛋白还参与多种生理和病理代谢，目前已发现其在炎症、糖尿病、肿瘤等疾病组织中均有表达。

目前重组表达HIP/PAP蛋白的主要方式为大肠杆菌包涵体表达，刘彤等人描述了在大肠杆菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中以包涵体形式表达HIP/PAP蛋白，然后通过复性、阳离子交换柱和凝胶过滤柱纯化重组蛋白(重组抗菌蛋白Reg3γ的表达、纯化及鉴定.中国实验诊断学，2016年，20(4)：536-539)。US20110229435A1记载了可以用大肠杆菌作为宿主细胞表达HIP/PAP蛋白，HIP/PAP蛋白表达为包涵体形式，并通过复性和阳离子交换柱纯化重组蛋白。之所以采用无活性的包涵体表达形式，是由于HIP/PAP蛋白本身具有抗菌活性，若采用可溶形式表达会对宿主大肠杆菌产生毒性。但包涵体表达具有操作复杂、复性效率低、蛋白活性差等缺点。CN1835764B公开了在转基因小鼠的乳汁中产生并纯化HIP/PAP蛋白，但在转基因动物中表达具有操作繁琐、产量低、成本高等缺点。迄今为止，本领域尚没有关于用哺乳动物细胞为宿主重组表达HIP/PAP蛋白的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HIP/PAP蛋白的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种HIP/PAP蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计目的蛋白的基因序列：根据HIP/PAP蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和哺乳动物的密码子偏好，通过密码子优化得到编码HIP/PAP蛋白的核苷酸序列，并据此设计用于表达HIP/PAP蛋白的基因片段F_HIP/PAP(SEQ ID NO：2)；

(2)合成用于表达HIP/PAP蛋白的基因片段F_HIP/PAP；

(3)构建表达载体：将合成的用于表达HIP/PAP蛋白的基因片段FHIP/PAP利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，插入同样双酶切的pTT5质粒，构建表达载体pTT5-HIP/PAP；

(4)转染：将表达载体pTT5-HIP/PAP转染哺乳动物细胞，获得培养上清；

(5)目的蛋白的纯化：离心后获得表达上清，采用离子交换色谱法进行纯化；

(6)目的蛋白的活性测定：采用试剂盒，检测目的蛋白的抗凋亡活性。

作为本发明进一步的方案：步骤(1)中所述基因片段F_HIP/PAP包括EcoRI位点-Kozak序列-信号肽-HIP/PAP(SEQ ID NO：2)-终止密码子-HindIII位点。

作为本发明进一步的方案：步骤(4)中所述哺乳动物细胞是CHO细胞，优选的是CHO3E7细胞。

作为本发明进一步的方案：步骤(4)中所述转染包括瞬时转染和稳定转染。

作为本发明进一步的方案：步骤(5)中所述离子交换色谱法使用离子交换色谱层析QSepharose。

作为本发明进一步的方案：步骤(6)中所述试剂盒是Caspase Glo 3/7试剂盒。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明建立了一种HIP/PAP蛋白的制备方法，哺乳动物细胞表达系统能够指导蛋白质的正确折叠和糖基化修饰，因而表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方便最接近天然的HIP/PAP蛋白。胞外分泌型表达是目前最先进的适于工业化生产的表达方式，细胞外表达可以避免蛋白再细胞内聚集形成包涵体，使目的蛋白的下游纯化更加简便，便于大规模的工业化生产。本发明的优点在于制备方法操作简便，不需要对表达产物进行复性，并且表达量高，采用无血清培养基和胞外分泌形式表达易于纯化，只需要利用一次离子交换色谱纯化，产品纯度即达到94％以上，并且因为采用无血清培养基，所以产品免疫原性低，而且得到的HIP/PAP蛋白与原核表达的HIP/PAP蛋白相比，具有显著更高的生物学活性。

附图说明

图1为转染后，细胞培养上清液中目的蛋白的表达情况示意图，泳道“M”为蛋白Marker，泳道“D1-D6”为转染后第1-6天的表达上清，泳道“CHO空”为未转染的CHO表达上清。

图2为目的蛋白经Q Sepharose纯化后的SDS-PAGE分析示图，泳道“M”为蛋白Marker，泳道1为4μg纯化后HIP/PAP蛋白，泳道2为2μg纯化后HIP/PAP蛋白，泳道3为1μg纯化后HIP/PAP蛋白，泳道4为0.5μg纯化后HIP/PAP蛋白。

图3为不同来源的HIP/PAP蛋白的抗细胞凋亡活性比较图，HIP/PAP-E表示大肠杆菌表达的HIP/PAP蛋白，HIP/PAP-C表示利用本发明方法制备的HIP/PAP蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何方式限制本发明。应当指出的，对本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以做出许多变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。

一种HIP/PAP蛋白的制备方法，包括以下步骤：

一、设计HIP/PAP蛋白的表达序列

设计目的蛋白的基因序列：根据HIP/PAP蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和哺乳动物的密码子偏好，通过密码子优化得到编码HIP/PAP蛋白的核苷酸序列，并据此设计用于表达HIP/PAP蛋白的基因片段F_HIP/PAP(SEQ ID NO：2)；其包括EcoRI位点-Kozak序列-信号肽-HIP/PAP(SEQ ID NO：2)-终止密码子-HindIII位点，具体如下所示：

F_HIP/PAP

其中：

斜体

为EcoRI位点，

粗体

为Kozak序列，

ATG为起始密码子，

单下划线“”标示的为信号肽序列，

双下划线

标示的为HIP/PAP核苷酸序列，

TGATAA为终止密码子，

斜体

为HindIII位点。

二、合成用于表达HIP/PAP蛋白的基因片段F_HIP/PAP；所述基因片段F_HIP/PAP(SEQ IDNO：2)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

三、表达载体的构建

将合成的用于表达HIP/PAP蛋白的基因片段和pTT5质粒同时以EcoRI和HindIII进行双酶切，酶切片段经回收后以T4 DNA连接酶进行连接，获得表达载体pTT5-HIP/PAP。

四、CHO细胞的培养

CHO 3E7细胞(购自ATCC)以无血清表达培养基FreeStyle^TM CHO ExpressionMedium(Life Technologies)培养于锥形瓶中(Corning)中，并在37℃、5％CO ₂培养条件下，于轨道振荡器(VWR Scientific)上振荡培养。

五、HIP/PAP的转染，包括瞬时转染和稳定转染；

在转染前一天，以适当的密度接种CHO 3E7细胞，使其在转染当天的细胞密度接近90％。在转染当天，3μl转染试剂lipofectamine 2000(Thermo Fisher)以50μl无血清培养基稀释，1μg表达载体pTT5-HIP/PAP以50μl无血清培养基稀释，将稀释的表达载体和稀释的转染试剂混合，然后加入包含待转染细胞的烧瓶中，培养6天，每天收集50μl培养物，进行SDS-PAGE电泳，检测目的蛋白的表达情况，并于第6天收集所有细胞培养物上清液用于分析和纯化。

目的蛋白的表达情况见图1，可以看出，使用本发明方法，成功实现了HIP/PAP蛋白在CHO细胞中的表达，且表达量随着表达时间增加而增加，转染6天后，表达量为22mg/L。

六、IP/PAP蛋白的纯化

离心：培养6天后，培养物于4℃以15000rpm离心30min，获得培养上清，上清以0.22μm滤膜过滤，除去不溶性杂质和颗粒。

纯化系统：采用离子交换色谱进行HIP/PAP蛋白的纯化，其相应的色谱柱及缓冲液如下：

色谱柱：Q Sepharose FF(GE)，5ml；

Buffer A：50mM Gly-NaOH，8M尿素，10mM DTT，pH9.0；

Buffer B1：50mM Gly-NaOH，8M尿素，10mM DTT，200mM NaCl，pH9.0；

Buffer B2：50mM Gly-NaOH，8M尿素，10mM DTT，2M NaCl，pH9.0。

上样：将离心后的培养上清浓缩后以100％Buffer A上样。

梯度洗脱：100％Buffer A洗脱15个柱体积，75％Buffer A+25％Buffer B1洗脱12个柱体积、75-0％Buffer A+25-100％Buffer B1洗脱10个柱体积，100％Buffer B1洗脱5个柱体积，100％Buffer B2洗脱4个柱体积，洗脱液分管收集，将纯化的HIP/PAP蛋白进行SDS-PAGE分析。

纯化结果见图2，分子量约为16kD处为目的蛋白，1、2、3、4泳道分别为4、2、1、0.5μg纯化的HIP/PAP蛋白，经灰度扫描软件分析，纯化后蛋白纯度为94.51％。

七、HIP/PAP蛋白的活性测定

大鼠原代肝细胞的分离与培养：购买6周龄SD大鼠，处死后分离肝脏，转移至含有抗生素的L15培养基中，肝脏研磨后以70uM尼龙膜过滤，并以600rpm离心2min。细胞以L15培养基清洗，并以台盼蓝进行细胞活力测定。将分离的原代肝细胞转移至10％FCS培养基，确保细胞数为每孔3万个，加入到96孔板进行贴壁培养。3-4小时后更换为无血清培养基，进行悬浮培养，并每日换液。

诱导凋亡：培养的肝细胞以20ng/mL Act D(放线菌素D)+80ng/ml TNF-α(肿瘤坏死因子α)处理24h，建立细胞凋亡模型。

抗凋亡活性测定：为比较本发明方法制备的HIP/PAP蛋白与大肠杆菌表达的HIP/PAP蛋白的活性差异，购买商用的大肠杆菌表达的HIP/PAP蛋白(购自ProSpec公司)。为示区别，将大肠杆菌表达的HIP/PAP蛋白表示为HIP/PAP-E，而本发明方法制备的HIP/PAP(实施例5获得的HIP/PAP蛋白)表示为HIP/PAP-C。分别以不同浓度的HIP/PAP-C和HIP/PAP-E(0、250、500、1000、2000、4000ng/ml)处理凋亡细胞模型18小时，每个处理设6个平行重复孔。之后采用Caspase Glo 3/7试剂盒测定HIP/PAP-C和HIP/PAP-E抗细胞凋亡活性，确定各自的IC₅₀。

检测结果见图3，从图中可以看出，本发明方法制备的HIP/PAP-C的IC₅₀为62.2ng/ml，而大肠杆菌表达的HIP/PAP-E的IC₅₀为153.3ng/ml，本发明方法制备的HIP/PAP活性显著高于常规大肠杆菌表达的HIP/PAP(P＜0.05)。

本发明建立了一种HIP/PAP蛋白的制备方法，哺乳动物细胞表达系统能够指导蛋白质的正确折叠和糖基化修饰，因而表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方便最接近天然的HIP/PAP蛋白。胞外分泌型表达是目前最先进的适于工业化生产的表达方式，细胞外表达可以避免蛋白再细胞内聚集形成包涵体，使目的蛋白的下游纯化更加简便，便于大规模的工业化生产。本发明的优点在于制备方法操作简便，不需要对表达产物进行复性，并且表达量高，采用无血清培养基和胞外分泌形式表达易于纯化，只需要利用一次离子交换色谱纯化，产品纯度即达到94％以上，并且因为采用无血清培养基，所以产品免疫原性低，而且得到的HIP/PAP蛋白与原核表达的HIP/PAP蛋白相比，具有显著更高的生物学活性。

上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。

序列表

<110> 广州安辰新药研究院有限公司

<120> 一种高活性HIP/PAP蛋白的制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Glu Pro Gln Arg Glu Leu Pro Ser Ala Arg Ile Arg Cys Pro

1 5 10 15

Lys Gly Ser Lys Ala Tyr Gly Ser His Cys Tyr Ala Leu Phe Leu Ser

20 25 30

Pro Lys Ser Trp Thr Asp Ala Asp Leu Ala Cys Gln Lys Arg Pro Ser

35 40 45

Gly Asn Leu Val Ser Val Leu Ser Gly Ala Glu Gly Ser Phe Val Ser

50 55 60

Ser Leu Val Lys Ser Ile Gly Asn Ser Tyr Ser Tyr Val Trp Ile Gly

65 70 75 80

Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Glu Gly Trp Glu

85 90 95

Trp Ser Ser Ser Asp Val Met Asn Tyr Phe Ala Trp Glu Arg Asn Pro

100 105 110

Ser Thr Ile Ser Ser Pro Gly His Cys Ala Ser Leu Ser Arg Ser Thr

115 120 125

Ala Phe Leu Arg Trp Lys Asp Tyr Asn Cys Asn Val Arg Leu Pro Tyr

130 135 140

Val Cys Lys Phe Thr Asp

145 150

<210> 2

<211> 531

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaattcccgc cgccaccatg ggttggtcct gtatcatcct gtttctggtc gccactgcca 60

ctggggtcca ctccgaagag cctcagcgtg aactgccctc agcaaggatc cggtgcccaa 120

agggaagcaa ggcctacggc tctcactgtt atgctctgtt cctgtcccct aagagctgga 180

ccgacgccga tctggcttgc cagaagaggc catctggcaa cctggtgtct gtgctgtccg 240

gagctgaggg ctccttcgtg tcctccctgg tgaagagcat cggcaacagc tactcttacg 300

tgtggatcgg cctgcacgac ccaacccagg gaacagagcc taatggcgag ggctgggagt 360

ggtcttccag cgatgtgatg aactacttcg cttgggagag aaatccatcc accatctctt 420

ccccaggaca ttgtgcctcc ctgagccgct ctacagcttt tctgaggtgg aaggactata 480

actgtaatgt gcggctgccc tatgtctgta aattcactga ctgataagct t 531

Claims (5)

1.一种HIP/PAP蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)设计目的蛋白的基因序列：根据HIP/PAP蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO：1和哺乳动物的密码子偏好，通过密码子优化得到编码HIP/PAP蛋白的核苷酸序列，并据此设计用于表达HIP/PAP蛋白的基因片段F_HIP/PAP SEQ ID NO：2；

(2)合成用于表达HIP/PAP蛋白的基因片段F_HIP/PAP；

(3)构建表达载体：将合成的用于表达HIP/PAP蛋白的基因片段F_HIP/PAP利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，插入同样双酶切的pTT5质粒，构建表达载体pTT5-HIP/PAP；

(4)转染：将表达载体pTT5-HIP/PAP转染哺乳动物细胞，获得培养上清；

(5)目的蛋白的纯化：离心后获得表达上清，采用离子交换色谱法进行纯化；

(6)目的蛋白的活性测定：采用试剂盒，检测目的蛋白的抗凋亡活性；

步骤(4)中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。

2.根据权利要求1的HIP/PAP蛋白的制备方法，其特征在于，所述CHO细胞是CHO 3E7细胞。

3.根据权利要求1所述的HIP/PAP蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述转染包括瞬时转染和稳定转染。

4.根据权利要求2所述的HIP/PAP蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述离子交换色谱法使用离子交换色谱层析Q Sepharose。

5.根据权利要求3所述的HIP/PAP蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述试剂盒是Caspase Glo 3/7试剂盒。

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