CN107889492B

CN107889492B - 对cd3特异性的人源化抗体或其片段

Info

Publication number: CN107889492B
Application number: CN201680026258.6A
Authority: CN
Inventors: V·诺尔; H·希; A·凯泽
Original assignee: Meitianshi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Meitianshi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-05-08
Filing date: 2016-05-06
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2036-05-06
Also published as: EP3294766A1; US20180112000A1; WO2016180721A1; EP3294766B1; EP3294766C0; JP6987640B2; EP3091032A1; ES2954183T3; CA2985251A1; CN107889492A; JP2018516554A

Abstract

本发明提供了对抗原CD3特异性的人源化抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含含有CDR1区SEQ ID NO:1、CDR2区SEQ ID NO:2以及CDR3区SEQ ID NO:3的重链可变域和含有CDR1区SEQ ID NO:4、CDR2区SEQ ID NO:5以及CDR3区SEQ ID NO:6的轻链可变域。此外，本发明提供了一种用于T细胞的多克隆刺激的方法，其包括将T细胞群体与所述抗‑CD3抗体，任选地与抗‑CD28抗体接触，其中所述抗‑CD3抗体和任选地所述抗‑CD28抗体与颗粒相连接。此外，所述抗‑CD3抗体可用于细胞的可逆标记。

Description

对CD3特异性的人源化抗体或其片段

技术领域

本发明涉及人源化抗体或其片段的领域，特别涉及对抗原CD3特异性的抗体或其片段及其用途。

背景技术

克隆OKT3是对人细胞表面标志物CD3(T细胞表面糖蛋白CD3，T细胞受体的信号转导共受体，其包含亚基γ、δ、ε和ζ)特异性的小鼠单克隆IgG2a抗体，其识别CD3ε的非典型小区域。OKT3最初被描述于US4658019和Kung等人(1979)Science 206,347-349中。对于使用抗-CD3全长抗体对人类T细胞的刺激，众所周知OKT3是T细胞活化和增殖的有效刺激物(US6406696；US6143297；US6113901；Yannelly等(1990)J.Immunol.Meth 130，91-100)。通过抗-CD3抗体的T细胞激活涉及复杂的分子相互作用。可溶性抗-CD3抗体在不存在Fc受体携带细胞的情况下不能在体外诱导T细胞的激活；且已经表明这种激活依赖于在T细胞表面上的T细胞受体(TCR)/CD3复合物交联，其由连接T细胞(通过其可变区)和Fc受体携带细胞(通过其Fc部分)两者的抗-CD3抗体OKT3介导(Ceuppens等人(1985)J Immunol.135,3882-3886；Bohua等人(2005)Immunology 116,487-498)。OKT3的单价Fab片段比亲本IgG的效力低约100倍(Van Wauve等(1980)J Immunol.124,2708-2713)。

Geppert和Lipsky(J.Immunol.(1987)138,1660-1666)报道了使用固定的抗-CD3单克隆抗体来诱导纯化的T细胞群体的增殖。作者发现，固定的OKT3在刺激T细胞增殖方面不是很有效。抗-CD3抗体也被描述为与抗-CD28抗体组合使用以诱导T细胞增殖的试剂(US6352694)。克隆15E8、CD28.3和Leu-28是对人CD28抗原特异性的小鼠单克隆抗体的实例。具有不同结合特性的抗-CD28抗体诱导T细胞激活的能力不同(Nunès等(1993)IntImmunol.5,311-315)。在WO9429436A1中，公开了用于诱导T细胞群体增殖的体外方法，其包括使T细胞的群体与固相表面接触，该其上直接固定有：(a)向T细胞提供主激活信号的第一试剂(常规地抗-CD3抗体)，从而激活T细胞；和(b)刺激T细胞表面上的辅助分子的第二试剂(常规地抗-CD28抗体)，从而刺激活化的T细胞，该第一和第二试剂由此诱导T细胞增殖。允许T细胞的多克隆刺激的试剂如抗-CD3和抗-CD28抗体也可以连接到可移动聚合物链基质上，如WO2014048920中所公开的。

可以刺激T细胞以提高转导效率(例如慢病毒转导)。静止T细胞的转导效率通常非常低，因为该细胞不表达转导所需的受体(例如在水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白假型慢病毒载体的情况下的LDL受体)。抗-CD3抗体单独或与抗-CD28抗体结合对T细胞的刺激导致这些受体的表达，和因此导致更高的转导效率(Amirache等(2014)Blood 123,1422-1424)。

不幸的是，鼠OKT3抗体显示出低稳定性。WO 1998052975公开了含有根据Kabat编号系统的交换位置H100A的鼠抗-CD3抗体OKT3的突变scFv变体。使用重组表达系统产生突变的OKT3scFv，且WO 1998052975提出在延长的保存期间突变的抗-CD3scFv比亲本OKT3抗体更稳定。

人源化的抗体或其片段可用于临床和细胞治疗目的，因为与非人源化的抗体或其片段(例如鼠抗体或其片段)相比，它们在施用于人类患者时的免疫原性较低。用于非人抗体人源化的技术是本领域已知的，并且包含移植到人或人源化框架中的互补决定区(CDR)，其中所述移植的CDR通常来自啮齿动物抗体。CDR是抗体或其片段中的可变区的部分，其中这些分子与其特异性抗原结合。它们被嵌入到比CDR变异性低得多的框架区中。US6750325、US5885573、US7381803、US20040052783和US20040202657公开了结合特异性从OKT3转移到人框架中。WO2002051871公开了从由杂交瘤CNCM 1-2582产生的CD28.3的可变区获得的人源化抗体。CD28.3几乎不能诱导IL-2释放/T细胞激活(Nunès等人(1993)Int Immunol.5，311-315)。

本领域需要人源化的抗-CD3抗体或其片段，其比鼠亲本OKT3抗体更稳定，并且其例如可以单独地或与人源化的抗-CD28抗体或其片段组合用于T细胞的多克隆刺激。

发明内容

我们惊奇地发现，当在大肠杆菌中表达时，抗-CD3抗体克隆OKT3的CDR-突变的Fab变体的表达水平比非CDR-突变的Fab变体的水平高40至70倍，并且抗-CD28抗体克隆15E8的人源化Fab变体的表达水平比非人源化Fab变体的水平高10倍。在OKT3的情况下，CDR突变的和人源化的变体显示出最高的表达水平，其中CDR突变包含在重链可变域的CDR3中根据IMGT命名法的114位的半胱氨酸至丝氨酸的氨基酸置换。

其次，与非CDR突变的Fab变体和与鼠亲本全长OKT3抗体相比，得到的CDR突变的OKT3变体的Fab分子(人源化的以及非人源化的)令人惊奇地显示出增加的稳定性。检测到游离的Fab分子以及标记的Fab分子的稳定性增加。

第三，出人意料地发现，Fab形式中的CDR突变的OKT3变体(人源化的以及非人源化的)能够在结合到可移动聚合物链基质上时刺激T细胞，和甚至更令人惊奇的是它们作为全长OKT3抗体更有效。这完全与预期相反，因为T细胞表面上的交联被认为不仅由可变区介导，而且还被OKT3的Fc部分介导。

第四，出人意料地发现，当与可移动聚合物链基质结合时，对抗原CD28特异性的Fab形式的人源化15E8变体能够与鼠OKT3抗体或CDR突变的OKT3Fab变体(人源化的和非人源化的)组合刺激T细胞，至少与鼠15E8抗体一样有效。这也与因为缺失Fab的Fc部分的预期相反。OKT3的人源化的和CDR突变的抗-CD3Fab变体与15E8的人源化的抗-CD28Fab变体(其各自与可移动聚合物链基质结合)的组合在活化的T细胞的高频率加T细胞的高增殖率方面给出最好的结果。

抗-CD3抗体克隆OKT3的CDR(根据IMGT命名法)对于重链可变域被描述于SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中且对于轻链可变域被描述于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中(关于IMGT命名法，参见图2A和图2B)。用于OKT3的人源化的框架是基于Adair等人(1994)Hum Antibodies Hybridoma 5,41-47中公布的序列。抗-CD28抗体克隆15E8的CDR(根据IMGT命名法)对于重链可变域被描述于SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQID NO:9中，且对于轻链可变域被描述于SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中。用于15E8的人源化的框架是基于人种系框架序列。

除了本文公开的抗体或其片段外，本发明还包含编码所述抗体或其片段的分离的多核苷酸，包含所述多核苷酸的表达载体，包含所述多核苷酸的表达系统和表达所述抗体或其片段的宿主细胞，包含所述多核苷酸的宿主细胞，所述抗体或其片段用于刺激T细胞的用途，以及所述抗体或其片段用于细胞可逆标记(tagging)的用途。

附图说明

图1：亲本鼠抗-CD3抗体克隆OKT3重链(VH，图1A)和轻链(VL，图1B)可变域和抗-CD28抗体克隆15E8重链(VH，图1C)和轻链(VL，图1D)可变域的计算机聚集预测。对于每个氨基酸残基(此处由位置号给出)，使用本领域已知的用于预测蛋白质聚集趋势的标准软件计算数值评分。较高的评分代表增加的聚集倾向。最小评分为0(不易于聚集)，和最大评分为100(高度易聚集)。

图2：使用对CD28抗原特异性的亲本鼠15E8抗体的重链(图2A)和轻链(图2B)可变域作为实例来定义框架区FR1、FR2、FR3、FR4及CDR区CDR1、CDR2和CDR3。编号是根据IMGT。

图3：用于在大肠杆菌中表达对CD3抗原特异性并且对CD28抗原特异性的Fab片段的原核载体的质粒图谱。LC，轻链；HC，重链；VL，轻链可变域；VH，重链可变域；CL轻链恒定域；CH1(hIgG1)，人IgG1的CH1结构域；RBS，核糖体结合位点；聚-HIS，多组氨酸序列；Kan，卡那霉素抗性基因；lacIq，lac阻遏物基因；ori，复制起点；PhoA，信号肽PhoA；PelB，信号肽PelB；kBps，千碱基对。

图4：通过金属螯合亲和色谱和离子交换色谱的Fab变体“huCD3_mut”的不同纯化步骤的样品的考马斯染色SDS凝胶。M，从上至下170、130、100、70、55、40、35、25、15和10kDa大小的分子量标志。泳道1：周质提取物；泳道2：金属螯合流通级分；泳道3-4：洗涤级分；泳道5-8：洗脱液组分；泳道9：离子交换流通级分；泳道10：洗涤级分；泳道11-12：洗脱液组分。

图5：使用直接抗体缀合物或间接使用Fab与抗多组氨酸抗体组合染色的PBMC的流式细胞术分析。5A-5D：抗-CD3染色的点图；5A：阳性对照，OKT3-PE缀合物；5B：阴性对照，抗多组氨酸-PE缀合物；5C：chCD3_mut Fab；5D：huCD3_mut Fab。5E-5J：抗-CD28染色的点图；5E：阳性对照，15E8-PE缀合物；5F：阴性对照，抗多组氨酸-PE缀合物；5G：huCD28_v1Fab；5H：huCD28_v2Fab；5I：huCD28_v3Fab；5J：huCD28_v4Fab。FSC：前向散射。PE：藻红蛋白。FITC：异硫氰酸荧光素。抗HIS-PE：抗多组氨酸-藻红蛋白。x轴的范围为从0至1000，和y轴范围为从1E-01至1E+03。

图6：通过包含对CD3和CD28特异性的抗体或其片段的纳米基质的不同组合刺激T细胞。6A：48小时刺激后表达早期激活标志物CD25和CD69两者的T细胞频率(％)。6B：一周刺激后T细胞的增殖率(％)。每个点代表一个供体的样品。水平线表示相应的中位值。“mAb”表示全长鼠亲本抗体(对于CD3的OKT3和对于CD28的15E8)。

图7：在25℃下储存26周后，纯化的亲本鼠抗体克隆OKT3(抗-CD3)和15E8(抗-CD28)的SEC-HPLC结果。7A：聚集抗体的量(％)，三角形：OKT3，菱形：15E8；7B：二聚化抗体的量(％)，实心三角形：OKT3，空心正方形：15E8。

图8：使用热应激(thermally stressed)抗-CD3Fab的PBMC染色。8A：染色细胞的中值荧光强度(％)；空心柱：使用非孵育的Fab，每组设置至100％(基准)；实心柱：使用在37℃下孵育一周后的Fab。8B-E：流式细胞术分析；8B的点图：非孵育的chCD3Fab，8C：孵育的(应激的)chCD3Fab，8D：非孵育的huCD3_mut Fab，8E：孵育的(应激的)huCD3_mut Fab。FSC：前向散射。抗HIS-PE：抗多组氨酸-藻红蛋白。x轴的范围为从0至1000，且y轴范围为从1E-01至1E+03。

图9：使用包含抗体或其片段的热应激纳米基质刺激T细胞。空心柱：使用非孵育的纳米基质(基准)；实心柱：使用在37℃下孵育一周后的纳米基质。9A：48小时刺激后表达早期激活标志物CD25和CD69两者的T细胞频率(％)。9B：一周刺激后T细胞的增殖率(％)。“mAb”表示全长鼠亲本抗体OKT3(对于CD3)。

图10：使用对于CD3和CD28特异性的Fab与抗多组氨酸-荧光团缀合物组合的PBMC的可逆标记，其通过流式细胞术进行分析。A，B：CD3的点图；D-F：CD28的点图。A、C、E：洗涤前的标记细胞；B、D、F：细胞后洗涤移除标记。抗HIS-APC：抗多组氨酸-别藻蓝蛋白。FSC：前向散射。x轴的范围为从0至1000，且y轴范围为从1E-01至1E+03。

具体实施方式

在第一方面中，本发明提供了对抗原CD3特异性的人源化抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含含有SEQ ID NO:1的CDR1区、SEQ ID NO:2的CDR2区和SEQ ID NO:3的CDR3区的重链可变域，以及含有SEQ ID NO:4的CDR1区、SEQ ID NO:5的CDR2区和SEQ IDNO:6的CDR3区的轻链可变域。本文公开了所述人源化抗体或其片段的不同实施方式。所述CDR可以被嵌入到包含区域FR1、FR2、FR3和FR4的框架序列中。序列的顺序可以是FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。所述人源化抗体或其片段的重链可变域可以包含框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中所述框架区FR1、FR2、FR3和FR4是与SEQ ID NO:16的框架区FR1、FR2、FR3和FR4具有至少70％，更优选至少80％，最优选至少90％的同一性的氨基酸序列。所述人源化抗体或其片段的轻链可变域可以包含框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中所述框架区FR1、FR2、FR3和FR4是与SEQ ID NO:17的框架区FR1、FR2、FR3和FR4具有至少70％，更优选至少80％，最优选至少90％的同一性的氨基酸序列。

所述重链可变域和所述轻链可变域的框架区可以包含氨基酸置换(回复突变)以增加抗体或其片段的亲和力(相比于不含回复突变的人源化变体)。此外，回复突变可以影响可通过使蛋白质结构稳定化或去稳定而制造的抗体的量。优选地，所述重链可变域包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，和所述轻链可变域包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。优选地，该抗体或其片段以与亲本鼠抗-CD3抗体克隆OKT3或其片段相比时至少20％、30％、50％、70％、90％、100％或超过100％的对于CD3抗原的亲和力特异性结合CD3抗原。

在另一方面中，本发明提供了一种T细胞的多克隆刺激的方法，其包括使T细胞的群体与人源化的抗-CD3抗体或其片段接触，其中所述人源化的抗-CD3抗体或其片段包含含有CDR1区SEQ ID NO:1、CDR2区SEQ ID NO:2和CDR3区SEQ ID NO:3的重链可变域，以及含有CDR1区SEQ ID NO:4、CDR2区SEQ ID NO:5和CDR3区SEQ ID NO:6的轻链可变域，并且其中所述抗体或其片段与颗粒连接。所述颗粒可以是具有固相表面的珠粒，其尺寸范围在500nm至10μm之间。或者，所述颗粒可以是纳米基质，所述纳米基质包含a)可移动聚合物链基质，和b)附接到所述可移动聚合物链的基质上的所述抗体或其片段，其中所述纳米基质尺寸为1至500nm。

所述抗-CD3抗体或其片段可以与抗-CD28抗体或其片段组合使用。所述抗-CD28抗体或其片段可以是人源化的。所述抗-CD28抗体或其片段可以是本文公开的人源化的克隆15E8。所述抗-CD28抗体或其片段可包含含有CDR1区SEQ ID NO:7、CDR2区SEQ ID NO:8和CDR3区SEQ ID NO:9的人源化重链可变域，以及含有CDR1区SEQ ID NO:10、CDR2区SEQ IDNO:11和CDR3区SEQ ID NO:12的人源化轻链可变域。所述抗-CD28抗体或其片段可以连接到颗粒。

所述抗-CD28抗体或其片段的CDR可以嵌入包含区域FR1、FR2、FR3和FR4的框架序列中。序列的顺序可以是FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。所述人源化抗体或其片段的人源化重链可变域可以包含框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中所述框架区FR1、FR2、FR3和FR4是具有与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:24的框架区FR1、FR2、FR3和FR4至少70％，更优选至少80％，最优选至少90％的同一性的氨基酸序列。

所述人源化的抗-CD28抗体或其片段的人源化轻链可变域可以包含框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中所述框架区FR1、FR2、FR3和FR4是与SEQ ID NO:25的框架区FR1、FR2、FR3和FR4具有至少70％，更优选至少80％，最优选至少90％的同一性的氨基酸序列。

所述人源化的抗-CD28重链可变域和所述人源化的抗-CD28轻链可变域的框架区可以包含氨基酸置换(回复突变)以与没有回复突变的人源化的变体相比增加抗体或其片段的亲和力。此外，回复突变可以影响可通过使蛋白质结构稳定化或去稳定而制造的抗体的量。优选地，该轻链可变域包含氨基酸置换D74A(天冬氨酸-74至丙氨酸)和S93P(丝氨酸-93至脯氨酸，根据IMGT命名法)作为回复突变。优选地，所述人源化的重链可变域包含SEQID NO:26或SEQ ID NO:24的氨基酸序列，并且所述人源化轻链可变域包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。优选地，该抗体或其片段以与亲本鼠抗-CD28抗体克隆15E8或其片段相比时至少20％、30％、50％、70％、90％、100％或超过100％的对CD28抗原的亲和力与CD28特异性结合。

作为纳米基质的组分，分别对CD3和CD28特异性的抗体或其片段可以连接到相同的或不同的可移动聚合物链的基质：它们可以位于相同的基质上(例如，携带对CD3和CD28特异性的抗体或其片段两者的基质)或在不同的基质上(例如，携带对CD3特异性的抗体或其片段的一种基质，和携带对CD28特异性的抗体或片段的另一种基质)。当位于相同的基质上时，对于CD3和CD28特异性的抗体或其片段的摩尔比可以变化，例如100：1、10：1、3：1、1：1、1：3、1：10和1：100(抗-CD3：抗-CD28)比率可能是有用的。

所述T细胞多克隆刺激的方法可以在封闭的和无菌的细胞培养系统(封闭的细胞样品处理系统)中进行。

在另一方面中，本发明提供了通过本发明的方法获得的用于治疗用途的细胞组合物。

在进一步的方面中，本发明提供了抗-CD3抗体或其片段用于细胞的可逆标记的用途，其中所述抗-CD3抗体或其片段包含含有CDR1区SEQ ID NO:1、CDR2区SEQ ID NO:2和CDR3区SEQ ID NO:3的人源化重链可变域，以及含有CDR1区SEQ ID NO:4、CDR2区SEQ IDNO:5和CDR3区SEQ ID NO:6的人源化轻链可变域，且其中所述抗体或其片段与标签连接。

本发明还提供了所述抗-CD3抗体或其片段与抗-CD28抗体或其片段组合用于细胞的可逆标记的用途，其中所述抗-CD28抗体或其片段包含含有CDR1区SEQ ID NO:7、CDR2区SEQ ID NO:8和CDR3区SEQ ID NO:9的人源化重链可变域，以及含有CDR1区SEQ ID NO:10、CDR2区SEQ ID NO:11和CDR3区SEQ ID NO:12的人源化轻链可变域，并且其中所述抗体或其片段与标签连接。

所述标签可以是颗粒(例如珠粒)、标记物(例如荧光染料、同位素标记或磁性实体)、分子(例如核酸、蛋白质或肽)或表面(例如培养皿或微量滴定板)。可以通过使所述抗体或其片段与其抗原的单价结合而使标记消解，从而导致抗体-抗原复合物由于该抗体或其片段的动力学特性而解离。

分别对CD3或CD28特异性的抗体或其片段可以是融合蛋白。融合物的实例包括聚组氨酸序列、生物素化序列、生物素模拟肽、荧光蛋白、接头序列(如聚甘氨酸-丝氨酸)和嵌合抗原受体。

分别对CD3或CD28特异性的抗体或其片段可以含有氨基酸置换、插入和缺失。分别对CD3或CD28特异性的抗体或其片段可以进行化学修饰。实例包括与荧光染料、蛋白质和磁性颗粒的偶联以及本领域中已知的化学修饰如生物素化。

在一个方面中，本发明提供了编码本文公开的对CD3抗原特异性的人源化抗体或其片段的分离的多核苷酸。

在另一方面中，本发明提供了包含编码本文公开的对CD3抗原特异性的抗体或其片段的多核苷酸的表达系统，和表达所述抗体或其片段的宿主细胞。

在进一步的方面中，本发明提供了包含编码本文公开的抗体或其片段的多核苷酸的宿主细胞。

定义

除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文所用的术语“抗体”以最广泛的含义使用以涵盖各种形式的抗体结构，包括但不限于单克隆和多克隆抗体(包括全长抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、免疫粘附素和抗体免疫粘附素嵌合体，其特异性地识别(即结合)靶抗原。根据本发明的抗体优选为人源化的抗体、嵌合抗体或进一步遗传工程化的抗体，只要保留根据本发明的特征性质即可。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选其可变域，或至少其抗原结合位点。抗体片段的实例包括Fab(抗原结合片段)、scFv(单链可变片段)、单结构域抗体、双链抗体、dsFv、Fab'、双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。scFv抗体例如描述于Ahmad等人(2012)Clin Dev Immunol.2012,980250中。术语“人源化抗体”是指其中与亲本免疫球蛋白相比，框架和/或CDR已被修饰为包含不同物种的免疫球蛋白的CDR的抗体。在优选的实施方式中，将啮齿动物(例如，小鼠)CDR移植到人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”(实例在Riechmann等人(1988)Nature 332,332-327中给出)。人源化的抗体与提供CDR的供体抗体结合相同或相似的抗原。人源化免疫球蛋白的接受体框架可以具有有限数量的由获自供体框架的氨基酸的置换。人源化分子可以具有对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响的另外的保守氨基酸置换。保守置换通常维持(a)置换的区域中多肽骨架的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)在目标位点处的分子电荷或疏水性，和/或(c)侧链的体积。

如本文所用，关于抗体序列的术语“亲本”和“亲本的”是指待人源化的抗体序列。因此，亲本抗体是待人源化的非人抗体克隆，通常为啮齿动物来源的。本发明的对CD3抗原特异性的鼠抗体克隆OKT3是亲本抗体的实例。

如本文所用，术语“抗原”旨在包括引起一种或多种抗体产生的物质。每种抗体通过类似于锁和钥匙之间的配合的相互作用方式结合于特定抗原。物质可以来自外部环境或在身体内形成。术语“抗原”包括但不限于蛋白质、肽、多肽、寡肽、脂质、碳水化合物及其组合，例如糖基化蛋白质或糖脂。抗原可以是在细胞表面上或细胞内。优选地，抗原在细胞的细胞表面上。优选地，CD3抗原是哺乳动物CD3抗原。最优选地，CD3抗原是人CD3抗原。优选地，CD28抗原是哺乳动物CD28抗原。最优选的是，CD28抗原是人CD28抗原。

关于抗体或其片段的抗原结合结构域的术语“特异性地结合于”或“对…特异性的”是指识别并结合特定抗原的抗原结合结构域，即在抗-CD3抗体或其片段情况下的CD3，但基本上不识别或结合样品中的其他抗原。与来自一个物种的抗原特异性地结合的抗原结合结构域也可以与来自另一物种的该抗原结合。这种物种间交叉反应性与该抗原结合结构域为特异性的定义并不违背。特异性地结合抗原的抗原结合结构域也可以结合抗原的不同等位基因形式(等位基因变体、剪接变体、异形体等)。这种交叉反应性与该抗原结合结构域为特异性的定义并不违背。

术语“结构域”是指独立于蛋白质的其余部分保持其三级结构的蛋白质结构。在某些情况下，结构域具有离散的功能性质，并且可以添加、移除或转移到另一种蛋白质而不丧失功能。

术语“亲和力”是指分子的单一结合位点(例如抗体的结合臂)与其结合伴体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗原结合蛋白和其抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对于其伴体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法(例如，Biacore^TM测量法)测量。

本文所用的“可变域”或“可变区”(轻链的可变域(VL)，重链的可变域(VH)))表示直接参与抗体与抗原的结合的轻链和重链结构域对中的每一个。术语“可变域”是指κ型的免疫球蛋白轻链的可变域和λ型的免疫球蛋白轻链的可变域两者。

本文使用的“恒定域”或“恒定区”(轻链的恒定域(CL)，重链的恒定域(CH))表示包含抗体的CL结构域(在轻链的情况下)和CH1、铰链、CH2、CH3和/或CH4结构域(在重链的情况下)的结构域。重链的恒定区在不同同种型的抗体中不同。在重组抗体或其片段中，可以组合不同同种型的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4结构域及其片段。CH1、铰链、CH2、CH3和CH4结构域也可以选自不同的物种。在人源化Fab片段中，恒定域优选是人恒定域，更优选人CL和人IgG1CH1。

可变轻链和重链结构域具有相同的一般结构，和每个结构域包含通过三个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接的其序列普遍保守的四个框架区(FR)。抗体的轻链和重链可变域从N-至C-末端包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每条链中的CDR通过框架区保持它们的三维结构，并与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。根据IMGT定义(http://www.imgt.org)(也称为FR-IMGT和CDR-IMGT)确定CDR和FR区域在本文所用抗体序列上的指定。还具有根据例如Kabat和Chothia的对FR和CDR区域的其它定义，其可以导致在FR和CDR区域的连接处氨基酸位置的略微不同的指定，且因此导致稍微不同的CDR长度。根据本发明的抗体可以包含人来源的Fc部分，其选自亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。优选地人来源的Fc部分是IgG1或IgG4亚类的。Fc部分可以含有氨基酸置换、插入和删除。例如，参与Fcγ受体结合的氨基酸残基可以用其它氨基酸残基置换以增加、最小化或消除这种相互作用。

根据本发明的抗体可以是其片段。抗体片段可以含有氨基酸置换、插入和删除。例如，可以将聚组氨酸序列插入或添加到任何Fab片段链，其允许使用抗组氨酸抗体利用亲和色谱和/或免疫检测的纯化。根据本发明的抗体优选特征在于恒定域是人来源的。这样的恒定域是本领域中公知的，且例如由Kabat所描述。

如本文所用，术语“CD3抗原”是指CD3蛋白，也称为T细胞表面糖蛋白CD3，且术语“CD28抗原”是指CD28蛋白，也称为T细胞特异性表面糖蛋白CD28。

如本文所用，术语“IMGT命名法”描述了根据IMGT的抗体序列的编号方案(ImMunoGeneTics Information

www.imgt.org；Giudicelli等(2005)NucleicAcids Res.33，D256-D261)。图2A和2B示例性地示出了抗-CD28抗体的重链和轻链可变域的IMGT命名法。

如本文所用，术语“IGKV”用作免疫球蛋白κ可变区基因的缩写。术语“IGHV”用作免疫球蛋白重链可变区基因的缩写。

本文使用的术语“CDR移植”是指获取一个抗体或其片段的CDR区并将其转移到第二抗体或其片段的框架中的方法，其中接收框架(接受体框架)与第一抗体的框架(供体框架)不相同。

如本文所用，术语“框架”和“框架区”是指包含重链和轻链可变区两者的结构域FR1、FR2、FR3和FR4的抗体或其片段的氨基酸序列，即，不具有CDR区的可变结构域。因此，术语“种系框架”和“种系框架区”是指由人种系抗体基因编码的没有CDR区的可变抗体结构域。

如本文所用，关于氨基酸序列的术语(蛋白质和多肽的)“同一性”用于蛋白质链的比较。两个序列之间的“序列同一性”的计算如下进行。将序列以达到最佳比较的目的而比对(例如，可以在第一和第二氨基酸序列中的一个或两个中引入空位用于最佳比对，并且为了比较目的可以忽略非同源序列)。最佳比对确定为使用FASTA36软件包(http://faculty.virginia.edu/wrpearson/fasta/)中的“ssearch36”程序的最佳分数，其使用Blossum 50评分矩阵及-10的空位开放罚分和-2的空位延伸罚分。然后比较相应氨基酸位置处的氨基酸残基。当第一序列中的位置被第二序列中相应位置处的相同氨基酸残基占据时，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数。如本文所用，术语“回复突变”是指在人源化抗体序列的框架区中的氨基酸置换。这通常用于在人源化后增加抗体对其抗原的亲和力。用于回复突变的候选残基包括例如，在CDR移植后的人源化抗体和亲本非人源化抗体中具有不同氨基酸的位置，以及在CDR移植后的人源化抗体和抗体共有序列中具有不同氨基酸的位置。通常候选残基位于对抗体的结合特性重要的和/或确定抗原结合环的主链构象的框架区位点。

与CDR中不同，可以在结构框架区(FR)中进行更大量的变化而不会不利地影响抗体的结合性质。对FR的改变包括但不限于对非人来源的框架人源化或对于对抗原接触或稳定结合位点重要的某些框架残基工程化，例如改变恒定区的类或亚类，改变可能改变效应子功能如Fc受体结合的特定氨基酸残基(Lund等人(1991)J.Immunol.147,2657-2662；Morgan等人(1995)Immunology 86,319-324)，或改变恒定区所来源的物种。

本发明的抗体通常是重组表达的多肽。抗体可以是嵌合多肽，其中术语“嵌合多肽”是指通过将两个或更多个肽片段并置(其在另外的情况下不是邻接存在的)而产生的人造(非天然存在的)多肽。在Fab分子的情况下，术语“嵌合Fab”是指不同来源的可变区和恒定区的组合，例如鼠来源的可变区和人来源的恒定区的组合。Fab变体“chCD3_mut Fab”是嵌合Fab的实例。

如本文所用，术语“细胞的正向选择”和“细胞的富集”在本文中具有可互换的含义，并且是指从细胞群体(包括组织)分离细胞亚群。适合于细胞正向选择的方法包括离心、过滤、磁性细胞分选和荧光细胞分选。

如本文所用，本文所用的术语“细胞耗竭”是指将期望的细胞与不想要的细胞分离的负向选择的过程。本文使用的细胞样品可以包含血液来源的细胞(例如PBMC)、细胞培养物来源的细胞或组织来源(例如可以在使用前分离的脑或骨)的细胞。适合细胞耗竭的方法包括离心、过滤、磁性细胞分选和荧光细胞分选。本文所用的术语“CD3表达的”和“CD3阳性的”(CD3+)细胞具有可互换的含义并描述表达CD3抗原的细胞。因此，本文所用的术语“非CD3表达的”和“CD3-阴性的”(CD3-)细胞具有可互换的含义并且描述不以可检测的方式表达CD3抗原的细胞。

SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6中分别给出了人源化重链可变域的CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列以及人源化轻链可变域的CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列。SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中分别给出了重链可变域和轻链可变域的氨基酸序列。

根据本发明的抗体或其片段优选通过重组方法产生。这些方法在现有技术中是众所周知的，并且包括原核和真核细胞中，优选在非哺乳动物细胞中的蛋白质表达，随后分离抗体多肽(全抗体或其片段)。抗体多肽的纯化可以进行达到药学上可接受的纯度。对于蛋白质表达，可以通过标准方法将编码轻链和重链或其片段的核酸插入到表达载体或病毒转导载体中。在适当的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母、芽孢杆菌或大肠杆菌细胞中进行表达，并从细胞中回收抗体(从上清液或在完全或部分细胞裂解后)。抗体的重组产生在现有技术中是众所周知的。

术语“治疗有效量”是指提供治疗益处的量。

术语“分离的”是指从自然状态改变或移除。例如，分离的细胞群体意味着这类细胞的富集和与通常在其天然存在状态下与所述分离的细胞相关联的其它细胞的分离。分离的细胞群体意味着基本上纯化的细胞群体，其是同质的细胞群体。

本文使用的术语“T细胞刺激”和“T细胞激活”具有可互换的含义，并且是指以T细胞增殖和早期T细胞激活标志物，特别是CD25和CD69的表达为特征的细胞反应。

本文所用的术语“CDR突变的变体”是指在六个CDR区之一内包含至少一个氨基酸置换、插入或删除的抗体或其片段的变体。CDR突变的变体的一个实例是抗-CD3克隆OKT3的重链可变域的CDR3中位置114处(IMGT命名法)半胱氨酸至丝氨酸的氨基酸置换。因此，本文所用的术语“非CDR突变的变体”是指在六个CDR区之一内不包含氨基酸置换、插入或删除的抗体或其片段的变体(即，使用原始CDR区域)。

本文所用的术语“标签”是指抗原结合分子(例如，抗体或其片段)与其他分子(例如颗粒、荧光团、半抗原如生物素或更大的表面如培养皿和微量滴定板)的偶联。在一些情况下，偶联导致抗原结合分子的直接固定，例如，如果抗原结合分子与培养皿的较大表面偶联。在其他情况下，这种偶联导致间接固定，例如，如果磁珠保持在磁场中，则直接或间接(通过例如生物素)与该磁珠偶联的抗原结合分子被固定。在另外的情况下，抗原结合分子与其它分子的偶联不会导致直接或间接的固定，而是允许根据本发明富集、分开、分离和检测细胞，例如，如果抗原结合分子与荧光团偶联，其然后允许区分更强标记的细胞、较弱标记的细胞和非标记的细胞，例如，通过流式细胞方法，如FACSorting，或荧光显微镜。

本文所用的术语“颗粒”是指如胶体颗粒、微球、纳米颗粒或珠粒的固相。产生这类颗粒的方法在本领域是众所周知的。颗粒可以是磁性颗粒。颗粒可以在溶液或悬浮液中，或者它们可以在本发明中使用之前处于冻干状态。然后冻干的颗粒在接触关于本发明待加工的样品之前在方便的缓冲液中重构。

本文所用的术语“可移动聚合物链基质”和“可移动基质”具有可互换的含义。这些聚合物由可移动的(能动的)，优选高度可移动的(能动的)链组成，因此该基质的特征在于缺少作为用于刺激剂如抗体或其片段的附接点的固体表面，并且其与当前使用的通常具有不灵活的、不动的、刚性的表面的珠粒或微球形成强烈的对比。结果，包含可移动聚合物链基质的纳米基质是柔性的并且可以调整为细胞表面的形式。此外，结果是纳米基质是其中水性溶液中大多数(即大于50％)，优选大于80％，更优选大于90％，最优选大于99％的纳米基质总体积由可移动聚合物链组成的纳米基质。

该基质由对细胞无毒的聚合物，优选生物可降解或生物相容的惰性物质组成。优选地，该基质由亲水性聚合物链组成，其由于链的水合而在水溶液中获得最大的移动性。可移动基质是纳米基质的唯一或至少主要的成分，除了与其附接的试剂。

可移动基质可以是胶原、纯化蛋白质、纯化肽、多糖、糖胺聚糖或细胞外基质组合物的。多糖可以包括例如纤维素醚、淀粉、阿拉伯胶、琼脂糖、琼脂糖凝胶、葡聚糖、壳聚糖、透明质酸、果胶、黄原胶、瓜尔胶，淀粉或藻酸。其它聚合物可包括聚酯、聚醚、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚胺、聚乙烯亚胺、聚季铵聚合物、聚磷腈，聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、嵌段共聚物或聚氨酯。优选地，该可移动基质是葡聚糖的聚合物。

可以通过本领域已知的和可获得的各种方法将试剂连接或偶联到可移动基质。连接可以是共价的或非共价的、静电的或疏水的，并且可以通过各种连接方式实现，包括例如化学、机械、酶学或其它方式，由此试剂能够刺激细胞。例如，首先将针对细胞表面结构的抗体连接到基质上，或者抗生物素蛋白或链霉亲合素可以连接到基质上以与生物素化试剂结合。针对细胞表面结构的抗体可以直接或间接地连接到基质上，例如，通过抗同种型抗体。另一个实例包括使用与基质连接的蛋白A或蛋白G或者其它非特异性抗体结合分子以结合抗体。用于间接连接的另一个实例包括包含聚组氨酸标签的抗体或片段与携带抗组氨酸抗体或其片段或能够结合聚组氨酸标签的金属螯合基团的颗粒组合的融合蛋白。或者，试剂可以通过化学方法附接到基质上，例如与基质的交联。

本文所用的“磁性颗粒”中的术语“磁性”是指可以用本领域技术人员熟知的方法制备的磁性颗粒的所有亚型，特别是铁磁颗粒、超顺磁性颗粒和顺磁性颗粒。“铁磁”材料对磁场强烈敏感，并且当磁场被移除时能够保持磁性。“顺磁”材料只有弱的磁感受性，且当磁场被移除时，很快失去其弱磁性。“超顺磁”材料是高度磁感受性的，即当放置在磁场中时它们变为强磁性的，但像顺磁材料一样，它们快速失去其磁性。

本文所用的术语“标记物”是指直接或间接附接于靶标的可检测分子，且其可用于例如检测、追踪、分开、分离、消耗或定量靶标。靶标可以是单细胞或细胞群体、细胞表面结构、碳水化合物、蛋白质和肽。标记物的实例包括荧光、磁性和同位素标记物。在某些情况下，标记物可能是靶标本身的部分。

本文所用的术语“细胞的可逆标记”是指其中细胞首先使用诸如标记物或颗粒的标签来标记的方法。在某些情况下，可以使用标签的组合。然后可以处理细胞，例如培养、活化、扩增、分选、分离或分析。之后，标签从细胞移除。在抗体及其片段的情况下，标签可以通过在该步骤中允许所述抗体或其片段与其抗原的单价结合来去除或消解，导致多价结合的丧失和抗原和标记的抗体由于抗体或其片段的动力学性质而解离。

术语“封闭的细胞样品处理系统”和“封闭的和无菌的(细胞培养)系统”可以互换使用。本文所用的术语“封闭的细胞样品处理系统”是指任何封闭系统，其降低细胞培养污染的风险而同时进行培养过程，如引入新材料，例如转化和转导，以及进行细胞培养步骤，例如细胞的增殖、分化、活化和/或分离。这样的系统允许在GMP或GMP样条件(“无菌”)下操作，产生可临床应用的细胞组合物。在此示例性地将CliniMACS

(MiltenyiBiotec GmbH，Germany)用作封闭的细胞样品处理系统。该系统在WO2009/072003中公开。其不是旨在将本发明的方法的使用限制于

Prodigy。

实施方式

本发明的抗体或其片段可以在本文公开的各种实施方式中呈现并在前面章节中详细描述。对抗原CD3特异性的人源化抗体或其片段的所有这些实施方式的共同之处在于分别在人源化的重链和轻链可变域中如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中给出的CDR1至CDR6的存在。

在本发明的一个实施方式中，抗体或其片段具有不同于亲本抗体克隆OKT3的CDR序列(例如，IMGT、Chothia或Kabat CDR)。不同于鼠亲本抗体克隆的CDR序列包括氨基酸变化，例如，在CDR长度为3-4个氨基酸的情况中1或2个氨基酸的置换，或在CDR长度为5-7个氨基酸的情况中1、2、3或4个氨基酸的置换，或在CDR的长度为10个氨基酸或更大的情况中，CDR序列中的1、2、3、4、5、6或7个氨基酸的置换。被置换的氨基酸可以具有相似的电荷、疏水性或立体化学特性。在本发明的一些实施方式中，氨基酸置换是保守置换。在本发明的其它实施方式中，氨基酸置换是非保守置换。这样的置换在技术人员的普通技能范围内。可以筛选含有置换的CDR的抗体或其抗体片段以鉴定与CD3抗原结合的抗体。在本发明的一个实施方式中，本文公开的人源化抗体或其片段可用于从包含CD3表达细胞的样品中富集(正向选择)CD3表达(CD3+)细胞。在优选的实施方式中，样品包含CD3表达细胞和非CD3表达细胞(其他细胞)。适合于富集的方法是本领域公知的，且包括但不限于流式细胞术如

或磁性细胞分离如

富集的CD3表达细胞可用于进一步的各种分析，例如细胞因子表达或受体信号传导，或可用于包含这些CD3表达细胞的药物组合物中。在施用于有需要的患者之前，可以将富集的CD3表达细胞在体外扩增至治疗有效量。

在本发明的一个实施方式中，本文公开的人源化抗体或其片段可用于从含有CD3表达细胞的样品耗竭CD3表达细胞。在优选的实施方式中，样品包含CD3表达细胞和非CD3表达细胞(其他细胞)。适合于耗竭的方法是本领域熟知的，且包括但不限于流式细胞术如

或磁性细胞分离如

本文示例性地描述了

分离的原理(Miltenyi Biotec GmbH，Germany)：对CD3抗原特异性的抗体或其片段可用于淋巴细胞亚集的直接或间接磁性标记。CD3抗原在T细胞和胸腺细胞上表达。首先，用CD3微珠(MicroBesds)(即与磁性颗粒缀合的CD3抗体或其片段)对CD3表达细胞进行磁性标记。然后将细胞悬浮液加载在置于

分离器的磁场中的

柱上。磁性标记的CD3表达细胞保留在柱上。未标记的细胞运行穿过，该细胞部分耗尽CD3+细胞。从磁场中移除柱后，磁性保留的CD3+细胞可以作为正向选择的细胞级分洗脱。

使用如本文所公开的抗体或其片段富集(正向选择)和耗竭细胞的情况下的应用的一些实例可以是：(a)从外周血或淋巴组织耗竭人CD3+细胞用于同种异体干细胞移植，或用于制备T细胞耗尽的移植物，或用于随后富集非CD3表达细胞(例如无NKT细胞的NK细胞)；(b)从外周血、淋巴组织或组织匀浆(例如肿瘤组织)正向选择人CD3+细胞用于分析目的，用于随后的富集或用于过继细胞转移治疗(例如供体白细胞输注或基因修饰的T细胞，分别为同种异体的或自体的转移)。

对于CD3+T细胞亚集的正向选择，可以例如将对CD3特异性的抗体或其片段与对于抗原如CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD45R0、CD56、CD62L、CD95、CCR7、CD127、CD137、CD279、Tim-3和/或LAG-3特异性的抗体或其片段组合。在一个实施方式中，对于CD3特异性的抗体或其片段可以例如与膜联蛋白V蛋白和/或与对表面抗原CD19和/或CD14和/或CD56特异性的抗体或其片段组合，以确保只有活CD3+T细胞被分离。

在本发明的一个实施方式中，本文公开的对CD3特异性的人源化抗体或其片段可用于原始调节性T细胞的正向选择以用于临床应用。使用外周血或淋巴组织，人源化CD3抗体或其片段与对CD4、CD25、CD45RA和CD127特异性的抗体或其片段组合，以分离原始调节性T细胞(以CD3+、CD4+、CD25hi、CD45RA+、CD127dim为特征)。

对于CD3+T细胞和其他细胞的综合耗竭，可以例如将对CD3特异性的抗体或其片段与对抗原如CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD38、CD43、CD44、CD56、CD133、和/或CD271特异性的抗体或其片段组合。

在本发明的一个实施方式中，T细胞之外的但也具有T细胞受体或抗原受体的其它细胞也可以通过单独的对CD3特异性的抗体或其片段或与对CD28特异性的抗体或其片段组合进行刺激。在优选的实施方式中，这些细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或外源性T细胞受体(TCR)。表达CAR和/或TCR的细胞的实例包括T细胞、树突状细胞、间充质干细胞、NKT细胞和NK细胞。CAR和/或TCR的靶分子的实例包括细胞表面标志物CD19、CD20和CD22。在本发明的一个实施方式中，通过单独的如本文所公开的抗-CD3抗体或其片段或与如本文所公开的抗-CD28抗体或其片段的组合刺激T细胞，例如以提高转导效率(例如慢病毒转导)。对CD3特异性和对CD28特异性的抗体或其片段可以分别与颗粒连接。

在本发明的一个实施方式中，使用诸如CliniMACS

(MiltenyiBiotec)的封闭的细胞样品处理系统来耗竭CD3+T细胞。例如，通过无菌焊接将8E+09总细胞的白细胞去除连接到安装在ClinicMACS

上的管道组上。细胞进行洗涤并用与磁性颗粒偶联的CD3特异性的抗体或其片段标记。标记的T细胞使用装配到可控磁场中的柱(即管道组的部分)通过磁力富集而特异性地且自动地与其余细胞分离。分离的T细胞可以被富集(阳性部分)或丢弃(阴性部分)，并进一步用于临床应用。

在本发明的一个实施方式中，本文公开的对CD3抗原特异性的人源化抗体或其片段可以与标签偶联。所述标签可以是磁性颗粒或荧光团。在本发明的一个实施方式中，本文公开的对CD3特异性的人源化抗体或其片段可用于荧光标记表达CD3的细胞。这可以在体外(例如在细胞培养物中)或在体内(例如在身体内)完成。荧光标记物可以直接(例如通过化学偶联)或间接(例如通过人源化的抗体或其片段的生物素化和生物素化抗体与链霉亲和素荧光染料缀合物的结合)连接到抗体或其片段上。在一些变型中，对CD3特异性的所述人源化抗体或其片段可以与本文公开的对CD28特异性的人源化抗体或其片段组合使用。

在本发明的一个实施方式中，本文公开的人源化抗体或其片段可用于在体外或体内鉴定和监测CD3+T细胞。

在一些变型中，对CD3特异性的所述人源化抗体或其片段可以与本文公开的对CD28特异性的人源化抗体或其片段组合使用。

在本发明的一个实施方式中，本文公开的人源化的抗体或其片段可用于细胞的可逆标记。所述抗体或其片段可以与标记物(例如荧光染料或颗粒)缀合。细胞通过与标签偶联的所述抗体或其片段的多价结合来标记。标签通过将所述抗体或其片段从多价结合转换为单价结合而从细胞除去。与抗原结合的所述抗体或其片段的解离取决于合适的动力学性质，例如K_D(平衡解离常数)和/或K_off(“解离速率常数”)值，从而允许单价结合的抗体或片段从细胞释放。将所述抗体或其片段从多价结合转换为单价结合的方法包括从标签(例如颗粒或标记物)移除抗体或其片段，例如通过使用特异性切割位点或结构的酶促切割，或通过添加过量的能够置换标签或者抗体或其片段的物质(例如置换与针对靶抗原如CD3的生物素化的抗体或其片段结合的抗生物素抗体荧光染料偶联物的生物素，其中生物素化的抗体或片段通过抗生物素抗体荧光染料偶联物进行交联)而从抗体或其片段竞争性置换该标签。

通过使用本文公开的抗体或其片段富集和/或分离的细胞组合物可以单独或作为与稀释剂和/或其它组分如细胞因子组合的药物组合物施用。简而言之，本发明的药物组合物可以包含通过使用本文公开的抗体或其片段而富集和/或分离的细胞组合物，其与一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包含缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(如氢氧化铝)；和防腐剂。

优选地，将本发明的组合物配制用于静脉内施用。可以用本领域已知的任何方便的方式将细胞组合物向受试者进行施用。

可以使用适合于待治疗的疾病的方式施用本发明的药物组合物。可以通过临床试验来确定适当的剂量。但是，施用的量和频率也通过如病人状况以及病人疾病的类型和严重程度等因素确定并受其影响。

实施例

实施例1：亲本鼠抗体OT3和15E8的计算机聚集分析。

使用本领域已知的算法分析抗CD3抗体克隆OKT3和抗CD28抗体克隆15E8的重链和轻链可变域的氨基酸序列，以预测易于聚集的序列区。已知这样的区域可能干扰蛋白质的重组表达，其导致低蛋白质表达水平。有用的算法包括例如PASTA(Walsh等人(2014)Nucleic Acids Res.42，W301-307)、WALTZ(Maurer-Stroh等人(2010)Nature Methods 7,237-242)和AGGRESACN(Conchillo-Sole等人(2007)BMC Bioinformatics 8,65-81)。算法通常为每个氨基酸分配数值评分，其中该评分是聚集潜力的指标。图1显示了对于鼠亲本CD3抗体克隆OKT3的重链可变域(SEQ ID NO：13，图1A)和轻链可变域(SEQ ID NO：14，图1B)以及鼠亲本抗CD28抗体克隆15E8的重链可变域(SEQ ID NO：18，图1C)和轻链可变域(SEQID NO：19，图1D)分配的这种评分。评分0表示无形成聚集体的趋势，约>20的评分表示聚集体的中等趋势，和约>50的评分表示形成聚集体的高趋势。在抗CD3OKT3的情况下，没有检测到易发生聚集的区域。因此，预期抗CD3抗体克隆OKT3的重组表达不会受到蛋白质聚集的阻碍，且因此预期正常的表达水平和产物滴度。在抗CD2815E8的情况下，预测轻链具有增加的聚集风险，这可能导致较低的表达水平和产物滴度。如表2中所示的抗CD28的人源化变体也预计具有增加的聚集风险，至少与亲本抗CD28序列一样强。

实施例2：通过CDR移植到人种系框架序列中的抗CD28抗体克隆15E8的人源化。

通过将亲本鼠抗CD28抗体克隆15E8的重链和轻链序列提交到IMGT“DomainGapAlign”工具来确定CDR和根据IMGT命名法的氨基酸残基的编号。所得的编号方案和CDR定义如图2A和图2B中所示，和CDR也在SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：12中描述。在下一步骤中，将亲本鼠抗CD28抗体克隆15E8的轻链和重链的氨基酸序列与人种系V区(多肽序列)的参考数据库进行比较。IMGT人IG基准目录集的当前版本(2014年8月)用作参考数据库。这些序列包括FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3，而不包括CDR3和FR4。重链的CDR3主要由V片段的小部分，整个D片段和J片段的小部分组装。轻链的CDR3主要由V片段的小部分和J片段的小部分组装。FR4源自J片段。在进一步处理之前，从IMGT基准集除去假基因和重复序列。为了鉴定与原始非人重链和轻链可变域的框架区具有高同一性的人种系序列，通过使用在作为FASTA36包(http://faculty.virginia.edu/wrpearson fasta/)的部分的ssearch36程序中实现的Smith-Waterman算法，在氨基酸水平将框架区FR1、FR2和FR3以及CDR1和CDR2的同一性与处理的IMGT基准集进行比较。对于重链，选择V片段的等位基因IGHV4-4*08(SEQID NO：27)作为用于CDR移植的合适模板。对于轻链可变域，选择V片段的等位基因IGKV4-1*01(SEQ ID NO：28)作为用于CDR移植的合适模板。对于FR-4，使用对于重链的等位基因IGHJ4*01(SEQ ID NO：33)和对于轻链可变域的IGKJ4*01(SEQ ID NO：34)作为模板。此外，使用abYsis网页服务器(http://www.bioinf.org.uk/abysis/index.html)将抗CD28抗体序列与包含IMGT基准集，NCBI种系序列和V-BASE的组合序列数据库进行比较。上述模板序列的选择确认该方式。最后，将选择的人种系模板序列IGHV4-4*08和IGKV4-1*01的CDR(根据IMGT定义)由亲本鼠抗CD28抗体克隆15E8的CDR(SEQ ID NO：7-12)取代，得到“抗CD28移植VH_final_IMGT”(SEQ ID NO：29)和“抗CD28移植VL_final_IMGT”(SEQ ID NO：30)。

实施例3：对CD28特异性的人源化抗体变体的结构建模和用于回复突变的氨基酸残基的鉴定。

为了鉴定CDR移植的人种系序列(SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30)的构架区FR1、FR2和FR3中与亲本鼠抗CD28抗体克隆15E8(SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19)不同的氨基酸残基，使用LALIGN程序产生这些序列之间的成对比对。与CDR区域内的氨基酸残基(“微调残基”)物理相互作用(通过氢键、静电、疏水或其他相互作用)并且在亲本鼠抗CD28抗体克隆15E8和人模板种系序列之间不同的框架区内的氨基酸残基对于人源化抗体的抗原结合和结构完整性可能是至关重要的。那些残基必须回复突变，即CDR移植序列中的相应氨基酸残基必须被亲本鼠抗CD28抗体克隆15E8内相同位置处的相应氨基酸所替代。鉴定适合回复突变的氨基酸残基需要关于待修饰抗体的三维结构的知识。由于没有可用的亲本鼠抗CD28抗体克隆15E8的结构数据，所以使用与亲本鼠抗CD28抗体克隆15E8具有高序列同一性的替代抗体。为此目的，进行15E8的轻链和重链序列针对PDB蛋白质数据库(http://www.pdb.org)的BLAST搜索，并分别对于轻链和重链选择具有显示最高比特评分和最低E-值的相应肽序列的结构。分别地，对于重链选择结构1GIG(链A)和对于轻链选择结构4BKL(链C)。对于基于结构的分析，使用公开可得的软件“Discovery Studio 4.0”(Accelrys)。首先，根据IMGT命名法的CDR被定义在结构内，并且鉴定在CDR的

半径内的所有框架原子。随后，检查通过该过程鉴定的每个框架氨基酸在人模板和亲本鼠抗CD28抗体克隆15E8之间的保守性。使用该过程，鉴定与CDR特异性地相互作用并可能稳定其结构的氨基酸和在相应的人CDR移植的种系序列中回复突变。设计了四种不同的人源化变体：包含SEQ ID NO：20和21的“huCD28_v1”、包含SEQ ID NO：22和23的“huCD28_v2”、包含SEQ ID NO：24和25的“huCD28_v3”和包含SEQ ID NO：26和25的“huCD28_v4”。huCD28v3和huCD28v4与huCD28vl和huCD28v2的主要区别是轻链可变域中的两个回复突变，即氨基酸置换D74A和S93P(IMGT命名法)。

实施例4：DNA载体的克隆和大肠杆菌的转化。

为了在大肠杆菌中表达分别对于CD3和CD28特异性的非人源化和人源化的Fab片段，使用标准软件工具设计分别编码抗CD3克隆OKT3(SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14组合；SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:14组合；SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:17组合)或抗CD28克隆15E8(SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19组合；SEQ ID NO:20与SEQ ID NO:21组合；SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:23组合；SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:25组合；SEQ ID NO:26与SEQ ID NO:25组合)的非人源化和人源化重链和轻链可变域(称为VH和VL)，编码人κ轻链恒定区(命名为CL，SEQ ID NO:32)和编码人IgG1重链恒定区CH1(SEQ ID NO:31)的合成基因。将相容的侧翼限制性位点添加到合成基因序列中以便于直接克隆到大肠杆菌表达载体中。基因合成由服务提供者外部进行。编码Fab片段的轻链(LC)可变域(VL和CL)的基因序列包含用于轻链的周质易位的phoA信号序列。编码Fab片段的重链(HC)可变域(VH和CH1，任选地接着是聚组氨酸标签)的基因序列包含用于重链的周质易位的pelB信号序列。使用本领域已知的标准技术进行克隆。得到的大肠杆菌表达载体显示在图3中。通过DNA测序验证受到克隆程序影响的所有载体区域。

实施例5：Fab片段在大肠杆菌中的表达。

为了产生CD3特异性和CD28特异性的Fab，用合适的表达载体，例如编码具有如SEQID NO:16和SEQ ID NO:17中所述的重链(VH)和轻链(VL)可变域的人源化Fab变体“huCD3_mut”的“pOPE313huCD3_mut”，转化大肠杆菌W3110细胞。转化的大肠杆菌的预培养物在37℃下摇瓶中在复合培养基(含有大豆蛋白胨，酵母提取物和NaCl，补充有葡萄糖)中生长过夜。第二天早上，将含有复合培养基(含大豆蛋白胨，酵母提取物和NaCl，补充有葡萄糖作为碳源)的可搅拌实验室规模生物反应器(3L)使用预培养物接种至600nm的最终光密度为0.05。细胞在28℃和pH 7.0下生长，其中pO₂至少为30％。在诱导前，将生物反应器冷却至25℃，和随后通过加入0.2mM IPTG诱导靶蛋白表达。在25℃下继续培养至少20小时。恒定地加入葡萄糖作为碳源，pH值保持在7.0。通过在6000xg下离心1小时进行细胞收获。将收获的细胞沉淀物储存在-20℃下待进一步处理。

实施例6：Fab片段的纯化。

通过周质提取步骤，然后进行色谱纯化步骤，从实施例5的发酵的大肠杆菌细胞纯化对CD3和CD28特异性的重组Fab。对于细胞提取，将冷冻的大肠杆菌沉淀物重悬浮于每1g细胞沉淀(湿重)10mL的周质提取缓冲液(100mM Tris，10mM EDTA)中，并在37℃下伴随恒温搅拌孵育至少16小时。然后将悬浮液以6000xg离心1小时。上清液含有大肠杆菌的周质部分，其含有Fab。丢弃细胞沉淀。将上清液过滤并施加到填充有IMAC树脂(例如ProCatchHisResin，Miltenyi Biotec)的合适色谱柱上以用于在FPLC系统(AKTA)上金属螯合亲和色谱的第一亲和捕获纯化步骤。使用含咪唑的缓冲液(5mM)清洗掉杂质。使用含有至少50mM的增加浓度的咪唑的缓冲液洗脱目标蛋白。合并洗脱的级分并施加到阳离子交换基质(例如SP琼脂糖凝胶)上。使用基于磷酸盐(25mM)的缓冲液进行洗脱，其pH范围为6.0-7.4，含有0.3-0.5M的NaCl。汇集含有Fab的洗脱液，并通过BCA分析和UV吸收(A₂₈₀纳米)来测定蛋白质含量。将对CD3特异性的纯化Fab和对CD28特异性的纯化Fab的等分试样储存在-70℃下直到使用。在某些情况下，将Fab重新缓冲到例如PBS/EDTA中。作为实例，图4示出了以Fab变体“huCD3_mut”的纯化过程的不同步骤的样品的考马斯染色SDS凝胶。表1和表2列出了来自100g大肠杆菌细胞沉淀物的纯化Fab的量。因为对于所有变体的表达和纯化过程几乎相同，所以纯化的Fab的量是Fab变体的个体表达水平的良好指标。对于CD3，对于人源化Fab变体“huCD3_mut”发现纯化后最高的蛋白质量，这表明变体“huCD3_mut”的表达水平也是所有测试变体中最高的。对于CD28，对于人源化Fab变体“huCD28_v3”发现纯化后最高的蛋白质量，这表明变体“huCD28_v3”的表达水平也是所有测试变体中最高的。

表1

变体	SEQ ID NO	产量(mg)	产率(％)
				chCD3Fab(嵌合的)	13+14	0.5	100
chCD3_mut Fab(嵌合的)	15+14	20	4000
				huCD3_mut Fab(人源化)	16+17	36	7200

表1显示了对CD3抗原特异性的纯化的Fab变体的产量(来自100g大肠杆菌细胞沉淀)。Fab变体“chCD3”的产率设定为100％。SEQ ID NO分别指重链和轻链可变域的序列。

表2

表2显示了对于CD28抗原特异性的纯化的Fab变体的产量(来自100g大肠杆菌细胞沉淀)。Fab变体“chCD28”的产率设定为100％。SEQ ID NO分别指重链和轻链可变域的序列。

实施例7：使用重组CD28抗原测定Fab变体的动力学常数。

通过表面等离子体共振谱(Biacore)分析对CD28抗原特异性的实施例6的Fab变体。因此，通过标准胺偶联将重组CD28抗原(细胞外结构域，在哺乳动物细胞中表达)固定在CM5芯片上。将Fab变体以50μg/mL的浓度用作HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4,0.15MNaCl，3mM EDTA，0.005％v/v表面活性剂P20)中的分析物。利用BIAeval Software使用1：1结合质量传递模型进行评估。表3显示了确定的动力学常数：五种Fab变体的速率常数“k_(on)”和“k_(0ff)”以及平衡解离常数“K_D”。

表3

变体	K<sub>(on)</sub>[1/Ms]	K<sub>(off)</sub>[1/s]	K<sub>D</sub>[M]	亲和力[％]
					chCD28Fab	1.0E+06	3.2E-02	3.2E-08	100
huCD28_v1Fab	1.9E+06	8.0E-02	4.2E-08	76
					huCD28_v2Fab	0.6E+06	5.5E-02	9.2E-08	35
huCD28_v3Fab	0.5E+06	2.6E-02	5.2E-08	62
					huCD28_v4Fab	0.4E+06	2.1E-02	5.3E-08	60

表3显示纯化的Fab变体的动力学常数。Fab变体“chCD28”对CD28抗原的亲和力(按照以[M]计的K_D值确定)设定为100％。M，摩尔；s，秒。

实施例8：表达CD3或CD28抗原的细胞的染色。

分析实施例6的抗-CD3Fab变体与CD3+细胞的结合和染色。将PBMC(外周血单核细胞)与2.5μg/mL的Fab变体chCD3_mut或humCD3_mut一起孵育。将OKT3-PE缀合物(1.5μg/mL)用作阳性对照。用抗多组氨酸-PE缀合物孵育后检测与细胞结合的Fab。仅通过抗多组氨酸-PE缀合物染色而不进一步通过Fab孵育的细胞用作阴性对照。图5A-D显示了CD3变体的流式细胞分析的点图。对实施例6的抗-CD28Fab变体进行结合/染色CD28+细胞的类似分析。将PBMC(外周血单核细胞)与5μg/mL的Fab变体huCD28_v1、huCD28_v2、huCD28_v3或huCD28_v4一起孵育。将15E8-PE缀合物(3.0μg/mL)用作阳性对照。此外，细胞与抗-CD3-FITC缀合物一起孵育。用抗多组氨酸-PE缀合物孵育后检测与细胞结合的Fab。仅通过抗多组氨酸-PE缀合物染色而不进一步通过Fab孵育的细胞作为阴性对照。图5E-J显示CD28变体的流式细胞分析的点图。所有Fab变体是功能性的，显示与其鼠亲本抗体相似的染色模式。

实施例9：产生包含抗-CD3Fab、亲本OT3抗体、抗-CD28Fab和亲本15E8抗体的纳米基质。

将实施例6的Fab变体和分别对CD3和CD28特异性的纯化亲本鼠抗体用于产生纳米基质。使用葡聚糖作为可移动聚合物链。在这个实例中，产生了磁性纳米颗粒，且因此使用了Molday和MacKenzie的改进程序。将10克葡聚糖T40(GE Healthcare)、1.5g FeCl₃ 6H₂O和0.64g FeCl₂ 4H₂O溶于20ml H₂O中，加热至40℃。搅拌下，缓慢加入10ml 4N NaOH，并将溶液加热至70℃持续5分钟。用乙酸中和颗粒悬浮液。为了除去聚集体，将悬浮液以2,000xg离心10分钟，并通过0.22μm孔径的过滤器(Millex G V，Millipore)过滤。通过在高梯度磁场(HGMF)中洗涤去除未结合的葡聚糖。磁性纳米基质的HGMF洗涤在如下所述制成的钢棉柱中进行，并置于约0.6特斯拉(MACS永磁体，Miltenyi Biotec)的磁场中。将10毫升纳米基质悬浮液施加到2g钢棉的15×40mm柱。加载的柱用30ml 0.05M乙酸钠洗涤。在柱从外部磁场中移除后，用0.05M乙酸钠洗脱磁性纳米基质。纳米基质形成棕色悬浮液。相对颗粒浓度以450nm的光密度给出。通过电子显微镜和动态光散射确定纳米基质的尺寸为30±20nm(e.m.)和65±20nm(DLS)。如通过磁化率测量确定的，纳米基质表现出超顺磁性。捕获的铁素体微晶的尺寸由磁测量确定为约10nm。通过标准生物偶联化学(BioconjugateTechniques，2nd Edition，By Greg T.Hermanson，Published by Academic Press，Inc.，2008)，将抗体和Fab与单独的纳米基质偶联。无菌过滤后，将所得纳米基质在-70℃下储存在PBS缓冲液/0.3％泊洛沙姆188中。结果，产生以下纳米基质：包含亲本抗-CD3抗体OKT8的纳米基质、包含亲本抗-CD28抗体15E8的纳米基质、包含抗-CD3Fab变体chCD3_mut的纳米基质、包含抗-CD3Fab变体huCD3_mut的纳米基质、包含抗-CD28Fab变体huCD_v3的纳米基质以及包含抗-CD28Fab变体huCD3_v4的纳米基质。

实施例10：通过单独的包含抗-CD3蛋白质的纳米基质或与含抗-CD28蛋白的纳米基质组合刺激T细胞。

使用包含实施例9的抗体和Fab变体的纳米基质来刺激T细胞。因此，使用Pan T细胞分离试剂盒，人(Miltenyi Biotec)从PBMC分离Pan T细胞。然后，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞，并以1E+06细胞/cm²的密度在补充有200IU/mL MACS GMP IL-2(Miltenyi Biotec)的TexMACS GMP培养基(Miltenyi Biotec)中培养。包含抗-CD3Fab变体或全长抗体(OKT3)的纳米基质单独地或在分别与包含抗-CD28Fab变体或全长抗体(15E8)的纳米基质的不同组合中使用。T细胞刺激期间的最终浓度分别为对于每种抗-CD3和抗-CD28全长抗体的500ng蛋白/mL及对于每种抗-CD3和抗-CD28Fab变体的333ng蛋白/mL。细胞培养48小时后使用检测早期激活标志物CD25和CD69(在活T细胞中)的流式细胞术测定纳米基质的刺激能力。然后将细胞再培养5天，并通过流式细胞探测测定增殖率(活细胞中)。图6A显示刺激后表达CD25和CD69两者的T细胞的频率，图6B显示刺激的T细胞的增殖率。每个点表示一个供体的样品，其中水平线表示中位值。对于单独的抗-CD3，包含人源化FabhuCD3_mut的纳米基质导致比包含亲本OKT3抗体的纳米基质更高数量的表达早期活化标志物的细胞以及更高的增殖率。如所预期的，在没有含抗-CD3蛋白质的纳米基质的情况下使用的包含抗-CD28蛋白的纳米基质并不导致CD25和CD69的可检测的表达或增加的细胞增殖。与包含抗-CD28抗体15E8的纳米基质组合，包含huCD3_mut Fab的纳米基质导致与包含OKT3抗体的纳米基质相比更高的活化和相似的增殖率。与包含抗-CD3抗体OKT3的纳米基质组合，包含huCD28_v3或huCD28_v4Fab的两种纳米基质显示出比包含15E8抗体的纳米基团更高的激活和更高的增殖率，并且这些结果是非常稳定的和可再现的。包含Fab变体huCD3_mut的纳米基质与包含Fab变体huCD28_v3或huCD28_v4的纳米基质的组合在稳定诱导活化细胞的高频率加高增殖率方面得到最好的结果。

实施例11：鼠亲本OT3和15E8抗体的聚集和二聚体形成。

分别以1.0mg/mL和0.2mg/mL浓度的纯化OKT3(抗-CD3)和15E8(抗-CD28)抗体在25℃和40％相对湿度下在气候室中的封闭玻璃小瓶中储存26周的时间。在几个时间点，通过分析型SEC-HPLC分析存储的抗体样品以区分单体、二聚体和聚集的抗体。如图7A中所示，在15E8的情况下，储存开始时仅存在少量的聚集体形成。对于OKT3，检测到线性至指数的聚集体形成，26周后达到1％的聚集体含量。在抗体二聚体(即两个抗体的二聚体)的形成中可以看到类似的趋势：而对于15E8(图7B)，二聚体含量在储存期间在3-5％的范围内保持稳定，26周后二聚体含量OKT3相继地增加至最高9％。在该时间点，OKT3单体的含量降至90％以下。

实施例12：纯化的抗-CD3Fab的稳定性。

将PBS/ETDA缓冲液中0.2mg/mL浓度的实施例6的Fab变体在37℃下孵育1周。使用1μg/mL的滴度用这些Fab以及非孵育的Fab(基准)对PBMC进行染色。用抗多组氨酸-PE缀合物孵育后检测与细胞结合的Fab。示出了chCD3Fab(图8B+C)和huCD3_mut Fab(图8D+E)的示例性点图。图8B+D表示非孵育(未应激)Fab，图8C+E表示孵育的(应激的)Fab。染色细胞的中值荧光强度(MFI，以％计)如图8A所示。对于非孵育的Fab，将每个MFI设定为100％。可以看出，非-CDR-突变的变体的MFI在Fab的热应激后降低35％，而两个CDR突变变体(人源化的和非人源化的)的MFI值的降低小得多(11-12％)。孵育的和非孵育的Fab分子也通过非还原性SDS-PAGE进行分析。不可检测到差异，所有样品在热应激后都显示相同的蛋白质条带而没有任何可见的变化。没有可见的蛋白质聚集体或降解产物。

实施例13：包含抗-CD3蛋白质的纳米基质的稳定性。

为了测试包含抗-CD3蛋白质的纳米基质的稳定性，将实施例9的纳米基质在37℃下孵育一周。然后，如实施例10所述，将这些孵育的样品以及未孵育的基准样品用于刺激T细胞。再次，分析刺激48小时后早期激活标志物CD25和CD69的表达以及刺激一周后T细胞的增殖率。图9示出了包含Fab变体chCD3_mut或huCD3_mut的纳米基质与包含鼠亲本OKT3抗体的纳米基质相比增加的稳定性：在包含OKT3的纳米基质的情况下，在热应激后早期激活标志物的表达和T细胞的增殖率均降低，而包含Fab变体之一的两种纳米基质在热应激后受影响小得多。包含Fab变体huCD3_mut的纳米基质显示出最佳结果，在高效刺激T细胞的能力方面没有或仅有最小损失。

实施例14：用抗-CD3和抗-CD28Fab对细胞的可逆标记。

将实施例6的Fab变体用于细胞的可逆标记。因此，1μg/ml的Fab变体huCD3_mut、huCD28_v3或huCD28_v4分别与磷酸盐/EDTA缓冲液中的PBMC在4℃下孵育10分钟。之后，将样品分割。一部分在4℃下与能够结合Fab变体的抗多组氨酸-APC缀合物(MiltenyiBiotec，按照制造商说明书的滴度)孵育10分钟。加入磷酸盐/EDTA缓冲液，且将标记的细胞以300×g离心5分钟，和然后通过流式细胞术分析。另一部分首先用磷酸盐/EDTA缓冲液洗涤，然后与抗多聚组氨酸-APC缀合物一起孵育，和如上所述通过流式细胞术分析。图10A和10B显示抗-CD3变体的流式细胞术分析的点图，图10C-10F是抗-CD28变体的点图。所有Fab变体能够标记细胞(图10A、10C和10E)，其中标签包含抗多组氨酸荧光染料缀合物。标记是可逆的，并且可以通过洗涤细胞来移除(图10B、10D和10F)。结果还表明，Fab的动力学性质在对于细胞的特异性和可逆标记有用的范围内。

Claims

1.一种用于T细胞的多克隆刺激的体外方法，其包括使T细胞的群体与人源化抗-CD3抗体Fab片段接触，其中所述抗体Fab片段包含含有SEQ ID NO:16的序列的重链可变域，以及含有SEQ ID NO:17的序列的轻链可变域，并且其中所述抗-CD3抗体Fab片段连接于颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞群体另外地与人源化的抗-CD28抗体片段接触，其中所述抗-CD28抗体片段包含含有CDR1区SEQ ID NO:7、CDR2区SEQ ID NO:8和CDR3区SEQ ID NO:9的重链可变域，以及含有CDR1区SEQ ID NO:10、CDR2区SEQ ID NO:11和CDR3区SEQ ID NO:12的轻链可变域，并且其中所述抗-CD28抗体片段连接到相对于所述抗-CD3抗体Fab片段所连接的颗粒相同的或不同的颗粒。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述颗粒是尺寸范围在500nm至10μm之间的具有固相表面的珠粒。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述颗粒是包含可移动聚合物链的纳米基质，且其中所述纳米基质的尺寸为1至500nm。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法在封闭且无菌的细胞培养系统中进行。