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CN107849105B - Tau结合抗体 - Google Patents

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CN107849105B CN201680039813.9A CN201680039813A CN107849105B CN 107849105 B CN107849105 B CN 107849105B CN 201680039813 A CN201680039813 A CN 201680039813A CN 107849105 B CN107849105 B CN 107849105B
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Abstract

本发明涉及Tau结合抗体及其结合片段。

Description

TAU结合抗体
发明领域
本发明尤其是涉及治疗性和诊断性Tau结合抗体和其结合片段、制备此类抗体的方法以及其用于治疗和/或诊断Tau蛋白病的用途，诸如阿尔茨海默氏病；肌肉萎缩性侧索硬化/帕金森氏症-痴呆综合症；嗜银颗粒疾病；慢性创伤性脑病变；皮质基底核退化症；弥漫性神经原纤维缠结伴钙化；唐氏症候群；英国家族性痴呆症；丹麦家族性痴呆症；与MAPT突变所产生的染色体17关联的额颞叶型痴呆症和帕金森氏症；格斯曼-斯陶思勒-谢恩克尔疾病；瓜德罗普岛帕金森氏症；肌紧张性营养不良；神经退化伴脑铁积聚；C型尼曼-匹克疾病；非关岛运动神经元疾病伴神经原纤维缠结；匹克疾病；脑炎后帕金森氏症；朊病毒蛋白质大脑淀粉样蛋白血管病变；渐进性皮层下神经胶样变性；进行性核上麻痹；SLC9A6相关智力迟钝；亚急性硬化性全脑炎；唯缠结型痴呆症；出现球状神经胶质包裹体的白质Tau蛋白病(Clavaguera等人，Brain Pathology 23(2013)342-349)。本发明还涉及治疗罹患或怀疑易患上述Tau蛋白病(具体地，诸如阿尔茨海默氏病和进行性核上麻痹的Tau蛋白病)的人受试者的方法。
阿尔茨海默氏病(AD)和渐进性核上麻痹(PSP)是医学需要未得到高度满足、对于社会健康系统而言成本较高且对所影响家庭的负担较重的神经退化性疾病。AD临床症状包括记忆、认知、推理、判断和情感稳定性的降低以及最终死亡。PSP包括严重和渐进性步态控制和平衡问题、摔倒、垂直眼球运动障碍、认知问题、抑郁症、无表情和轻度痴呆症。后期症状包括视力模糊、眼球运动不可控、言语不清、吞咽困难和死亡。
对于超过十年的AD疾病而言，改良规划已经通过各种机制靶向淀粉样蛋白-β肽。相比之下，解决细胞内Tau病理学(AD的第二大标志)的进展小得多。含有过磷酸化Tau聚集物的神经原纤维包裹体或缠结界定AD病理学特征和多种其他Tau蛋白病，包括PSP。
在此等疾病中，症状进展与神经内Tau聚集物水平和分布之间存在强相关性。在AD神经元中，Tau缠结首先出现于经内嗅皮层中，其从经内嗅皮层散布至海马体和新皮层中。AD神经元中所观测到的缠结是由过磷酸化的不溶性Tau聚集物组成。已提出病理性Tau物质的直接毒性作用和/或轴突传输损失(由于功能Tau螯合成过磷酸化的聚集形式，其不再能够支持轴突传输)导致疾病。
Tau在其非病理性状态下为高度可溶性细胞质微管结合蛋白，由于可变剪接，其以长度范围为352至441个氨基酸的6种主要亚型出现于人中枢神经系统(CNS)中。此等亚型可具有零、一或二个N端插入序列(0N、1N、2N)，和三或四个C端“重复”序列(3R或4R)。这些30至32个氨基酸C端重复序列R1、R2、R3和R4一起构成Tau微管结合区(MTBR)。实际上，Tau的主要作用据信为组装和稳定化轴突微管。微管形成用于轴突传输的轨道和用于细胞生长的细胞骨架组件(Clavaguera等人，Brain Pathology 23(2013)342-349)。三种Tau亚型已证明含有三个微管结合区(MTBR)：
-亚型4，也称为3R0N，NCBI参考序列NP_058525.1(352个氨基酸)，
-亚型7，也称为3R1N，NCBI参考序列NP_001190180.1(381个氨基酸)
-亚型8，也称为3R2N，NCBI参考序列NP_001190181.1(410个氨基酸)。
而其他三种Tau亚型含有四个MTBR：
-亚型2，也称为4R2N，NCBI参考序列NP_005901.2(441个氨基酸)，
-亚型3，也称为4R0N，NCBI参考序列NP_058518.1(383个氨基酸)，和
亚型5，也称为4R1N，NCBI参考序列NP_001116539.1(412个氨基酸)。
Tau含有85个潜在丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)磷酸化位点。在Tau的脯氨酸富集域(侧接微管结合域)中发现Tau上的许多磷酸化残基。所有六种Tau亚型均存在于人正常成熟脑中，且在此阶段，Tau磷酸化相对减少(Noble等人，2013Front Neurol.2013；4：83)。在各种Tau蛋白病中，病理性病变中的沉积Tau总是高度磷酸化的。磷酸化丝氨酸202和磷酸化苏氨酸205已在获自PSP和AD患者的脑样品和脑脊髓液的Tau聚集物中检测到(Buée等人，Brain Research Reviews 33(2000)95-130；Wray等人，J Neurochem.2008年6月1日；105(6)：2343-52；Hanger等人，J Biol Chem.2007年8月10日；282(32)：23645-54；Maccioni等人，Neurobiol Aging.2006Feb；27(2)：237-44)。
当前可用于这些疾病的唯一症状疗法功效轻微或无功效。当前不存在可用于减缓或理想地中止疾病发展的疗法。因此，现有技术中仍需要适用于治疗Tau蛋白病的新化合物和组合物。
发明目的和概述
本发明的目标尤其为提供用于治疗或诊断Tau蛋白病(诸如阿尔茨海默氏病(AD)或进行性核上麻痹(PSP))的药剂。另外，本发明的目标尤其为提供治疗或诊断Tau蛋白病(诸如阿尔茨海默氏病(AD)或进行性核上麻痹(PSP))的方法。
这些和其他目标(由下文的描述，其将变得明显)通过独立权利要求的主题实现。本发明所涵盖的一些特定方面和其实施方案形成从属权利要求的主题。本发明所涵盖的其他方面和其实施方案可自接下来的描述获得。
在第一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含：
轻链可变区，其包含选自SEQ ID No.：1或与其至少90％同一的序列的CDR1、选自SEQ ID No.：2或与其至少90％同一的序列的CDR2和选自SEQ ID No.：3或与其至少90％同一的序列的CDR3；和/或
重链可变区，其包含选自SEQ ID No.：4或与其至少90％同一的序列的CDR1、选自SEQ ID No.：5或与其至少90％同一的序列的CDR2和选自SEQ ID No.：6或与其至少90％同一的序列的CDR3。
在第二方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含：
轻链可变区，其包含SEQ ID No.：7或与其至少80％同一的序列，和/或
重链可变区，其包含SEQ ID No.：8或与其至少80％同一的序列。
在第三方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含：
轻链可变区，其包含SEQ ID No.：9或与其至少80％同一的序列，和/或
重链可变区，其包含SEQ ID No.：10或与其至少80％同一的序列。
在第四方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含：
轻链可变区，其包含SEQ ID No.：13或与其至少80％同一的序列，和/或
重链可变区，其包含SEQ ID No.：16或与其至少80％同一的序列。
在第五方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或结合片段结合包含SEQ ID NO：55的氨基酸197至206的磷酸化Tau片段。
作为第一和第五方面的一个实施方案，本公开内容提供的抗体或其结合片段可为嵌合、人源化或完全人抗体或其结合片段。
作为第二或第三方面的一个实施方案，本公开内容提供的抗体或其结合片段可为嵌合抗体或其结合片段。
作为第四方面的一个实施方案，本公开内容提供的抗体或其结合片段可为人源化抗体或其结合片段。
在第六方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段与第一至第四方面和其实施方案中的任一个的Tau结合抗体或其结合片段竞争结合Tau。
在第七方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段与第一至第五方面和其实施方案中任一个的Tau结合抗体或其结合片段结合基本上相同的Tau表位。
作为第六和第七方面的一个实施方案，本公开内容提供单克隆抗体或其结合片段，其为人源化抗体或其结合片段。
第一至第七方面和其实施方案的抗体和其结合片段能够结合人Tau的可溶形式、人Tau的配对螺旋丝(paired helical filaments；PHF)，或结合人Tau的可溶形式与人Tau的配对螺旋丝(PHF)，其包含SEQ ID NO：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域。
在第八方面中，本公开内容提供包含核酸序列(诸如编码第一至第七方面和其实施方案的抗体或结合片段的重链和/或轻链的DNA序列)的核酸分子。
在第九方面中，本公开内容提供包含这些前述核酸分子的克隆或表达载体。
在第十方面中，本公开内容提供包含这些前述核酸分子、克隆载体或表达载体的宿主细胞。
在第十一方面中，本公开内容提供制造第一至第七方面和其实施方案的抗体和其结合片段的方法。
本公开内容的第十二方面是关于第一至第七方面和其实施方案的抗体和其结合片段用于治疗Tau蛋白病(特定而言，诸如AD和PSP)的用途。
本公开内容的另一方面是关于第一至第七方面和其实施方案的抗体和其结合片段用于诊断Tau蛋白病(特定而言，诸如AD和PSP)的用途。
附图说明
图1：在实验2.3的ELISA分析中，具有SEQ ID No.：7的兔VL序列(VL_AB1)和SEQ IDNo.：8的兔VH序列(VH_AB1)的AB1对生物素化T197肽的结合相对于对生物素化肽T174、T211、T230和T396的结合。
图2：说明实验3.1的细胞聚集分析的图。
图3：在使用自人PSP患者回收的人Tau病理性原纤维(PSP-PHF8)作为晶种的细胞Tau聚集分析中，具有SEQ ID No.：17的轻链和SEQ ID No.：20的重链的Tau结合抗体(A)和具有SEQ ID No.：17的轻链和SEQ ID No.：21的重链的Tau结合抗体(B)或阴性对照IgG4抗体A33(C)的功效。
图4：Wes tern印迹，其显示具有SEQ ID No.：9的轻链和SEQ ID No.：10的重链的Tau结合抗体AB1针对获自人AD或PSP的含Tau裂解物的结合特性。
图5：A)描绘SEQ ID No.：7的AB1的供体VL(VL_AB1)，其中CDR1(SEQ ID No.：1)、CDR 2(SEQ ID No.：2)和CDR 3(SEQ ID No.：53)加有下划线。B)描绘SEQ ID No.：44的人受体区域IGKV1-39的VL序列，其中受体CDR 1、CDR 2和CDR 3加有下划线。C)描绘SEQ No.：11的CDR移植序列gVL4_AB1，其中CDR 1(SEQ ID No.：1)、CDR 2(SEQ ID No.：2)和CDR 3(SEQID No.：53)加有下划线。D)描绘SEQ No.：12的CDR移植序列gVL9_AB1，其中CDR 1(SEQ IDNo.：1)、CDR 2(SEQ ID No.：2)和CDR 3(SEQ ID No.：54)加有下划线；相较于VL_AB1，CDR3包含A91突变。
图6：A)描绘SEQ ID No.：8的AB1的供体VH(VH_AB1)，其中CDR1(SEQ ID No.：4)、CDR 2(SEQ ID No.：5)和CDR 3(SEQ ID No.：48)加有下划线。B)描绘SEQ ID No.：45的人受体区域IGHV4-39的VH序列，其中受体CDR 1、CDR 2和CDR 3加有下划线。C)描绘SEQ No.：14的CDR移植序列gVH41_AB1，其中CDR 1(SEQ ID No.：4)、CDR 2(SEQ ID No.：5)和CDR 3(SEQID No.：49)加有下划线。供体残基是以斜体和粗体显示：K71和V78。构架中的突变突出显示(E1)。相较于VH_AB1，CDR3包含N100Q取代。D)描绘SEQ No.：15的CDR移植序列gVH49_AB1，其中CDR 1(SEQ ID No.：4)、CDR 2(SEQ ID No.：5)和CDR 3(SEQ ID No.：50)加有下划线。供体残基是以斜体和粗体显示(K71和V78)。构架中的突变突出显示(E1)。相较于VH_AB1，CDR3包含N100A取代。
图7：在使用自人AD患者回收的人Tau病理性原纤维作为晶种的细胞Tau聚集分析中，具有SEQ ID No.：9的轻链和SEQ ID No.：10的重链的Tau结合抗体，和文献中所述的结合包含SEQ ID NO：55的磷酸化残基202和205的表位的Tau结合抗体AT8，或阴性对照抗体101.4的功效。
图8：在使用自人AD患者或人PSP患者或人FTD患者回收的人Tau病理性原纤维作为晶种的细胞Tau聚集分析中，具有SEQ ID NO：17的轻链和SEQ ID NO：20的重链的Tau结合抗体的功效。
发明详述
下文说明性描述的本公开内容可在本文未具体公开的任一组件或多个组件、限制或多个限制缺乏的情况下适合地实施。
本公开内容将根据特定方面和其实施方案且参照某些附图和实施例来描述，但本发明不受其限制。
除非另外指明，否则技术术语是根据其常见含义使用。若向某些术语赋予特定含义，则下文在使用术语的上下文中提供术语定义。
若本发明说明书和权利要求书中使用术语“包含”，其不排除其他组件。出于本公开内容的目的，术语“由……组成(consisting of)”视为术语“包含(comprising of)”的优选实施方案。若下文中将群组定义为包含至少一定数目的实施方案，则此还理解为公开优选仅由这些实施方案组成的群组。
出于本公开内容的目的，术语“获得”视为术语“可获得”的优选实施方案。若在下文中，例如抗体定义为可获自特定来源，则此还应理解为公开抗体获自此来源。
当提及单数名词时，若使用不定冠词或定冠词，例如“一(a)”、“一(an)”或“所述(the)”，则此包括复数个所述名词，除非另外特别地指明。术语“约”或“大约”表示本领域技术人员将理解仍确保相关特征的技术效果的准确度区间。该术语通常指示相对于指定数值偏离±10％，且优选偏离±5％。
应理解，任何提及Tau结合抗体或其结合片段作为各种方面的优选实施方案均涵盖单克隆Tau结合抗体或其结合片段。
在各种方面中，本公开内容提及包含相应轻链和/或重链区域的CDR和可变区的抗体和其结合片段。仅包含轻链可变区或重链可变区的抗体或其结合片段可适用于例如制造方法，或适用于例如筛选可有效地与相应其他可变区缔合的可变区。然而，应理解，每当提及包含相应轻链和/或重链区域的CDR和可变区的抗体和其结合片段时，其总是考虑为包含相应轻链和重链区域的CDR和可变区的优选实施方案抗体和其结合片段。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”和其类似术语是指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可具预防性，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不良影响而言可具治疗性。因此疗法涵盖哺乳动物、尤其人的疾病的任何疗法，且包括：(a)预防可能易患所述疾病、但尚未诊断出患有所述疾病的受试者中出现所述疾病；(b)抑制所述疾病，即阻滞其发展；以及(c)缓解所述疾病，即促使所述疾病消退。
将Tau结合抗体或其结合片段称为“治疗活性剂”是指Tau结合抗体或其结合片段用于治疗疾病的用途。
“治疗有效量”是指Tau结合抗体或其结合片段的量，当施用至哺乳动物或其他受试者用于治疗疾病时，所述量足以对所述疾病实现这样的治疗。治疗有效量将视以下而变化：Tau结合抗体或其结合片段、疾病和其严重度以及待治疗受试者的年龄、体重等。
将Tau结合抗体或其结合片段称为“诊断活性剂”是指Tau结合抗体或其结合片段用于诊断疾病的用途。
“诊断有效量”是指Tau结合抗体或其结合片段的量，当用于对生物样品进行诊断测试时，所述量足以允许鉴别疾病或作为监测治疗性干预的功效的手段来监测疾病组织的量。
本申请部分地基于结合人Tau的抗体(名称为AB1)的鉴别。如本领域中所惯用的，本文中的Tau残基编号是指SEQ ID No.：55的Tau亚型2(NCBI参考序列：NP_005901.2)。如下文中所展示，AB1自免疫兔中分离且识别SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域。
实施例证实，AB1能够结合人Tau的配对螺旋丝(PHF)(参见实施例2.4)且AB1能够检测人样品冷冻切片中的神经元内神经原纤维缠结(NFT)、神经元外NFT、神经炎斑样结构和神经纤维网丝(参见实施例3.2)。假定此行为至少部分地由AB1的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)中的互补决定区(CDR)介导似乎为合理的。
针对此背景，本公开内容提供包含AB1的VL区域(SEQ ID No.：7)的CDR或特异性决定残基和/或AB1的VH区域(SEQ ID No.：8)的CDR的Tau结合抗体或其结合片段。
抗体可变结构域中的残基常规地根据Kabat等人所设计的系统编号。此系统阐述于Kabat等人，1987,in Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDepartment of Health and Human Services,NIH,USA(下文称“Kabat等人(同上)”。本说明书中使用此编号系统，除非其中另有说明。
Kabat残基名称不总是直接与氨基酸残基的线性编号对应。对应于基本可变结构域结构的结构组分(构架或互补决定区(CDR))的缩短或向其中的插入，实际线性氨基酸序列含有的氨基酸可比严格Kabat编号少或含有其他氨基酸。就指定抗体而言，可通过将抗体序列中的同源残基与“标准”Kabat编号序列比对来确定残基的正确Kabat编号。然而，根据Chothia(Chothia,C.and Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))，等效于CDR-H1的环自残基26延伸至残基32。
因此鉴别出AB1的VL中的CDR1、CDR2和CDR3分别对应于SEQ ID NO.：1、2和53。因此鉴别出AB1的VH中的CDR1、CDR2和CDR3分别对应于SEQ ID NO.：4、5和48。本领域技术人员可容易测试氨基酸取代、添加和/或缺失对CDR的影响，例如通过使用实施例中所述的方法来测试。在VH的最初鉴别的CDR3(CDRH3)(即SEQ ID No.：48)中，鉴别例如潜在的天冬酰胺去酰胺化位点且通过谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸或丝氨酸置换天冬酰胺残基来修饰。CDRH3由此分别产生序列SEQ ID No.：49、50、51和52。为了简洁起见，将CDRH3的三个序列(即SEQID NO.：48、49、50、51和52)组合为SEQ ID No.：6。类似地，在VL的CDR3(CDRL3)中，鉴别潜在的谷氨酰胺去酰胺化位点且通过丙氨酸置换相邻的甘氨酸来修饰。由此产生序列SEQ IDNO：54。为了简洁起见，将CDRL3的两个序列(即SEQ ID NO：53和54)组合为SEQ ID NO：3。
应理解，可进一步修饰CDR，诸如取代、添加和/或缺失，而不会实质性改变例如结合特性(相较于AB1)。此主要可通过例如用相似氨基酸置换CDR中的氨基酸来达成。如本文所用，“相似性”表示在所比对序列中的任何特定位置，氨基酸残基的类型在序列之间相似。举例而言，可用亮氨酸取代异亮氨酸或缬氨酸。彼此间通常可取代的其他氨基酸包括(但不限于)：
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)；
-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；以及
-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
针对此背景，本公开内容在一个方面中提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含：
轻链可变区，其包含选自SEQ ID No.：1或与其至少90％同一的序列的CDR1、选自SEQ ID No.：2或与其至少90％同一的序列的CDR2和选自SEQ ID No.：3或与其至少90％同一的序列的CDR3；和/或
重链可变区，其包含选自SEQ ID No.：4或与其至少90％同一的序列的CDR1、选自SEQ ID No.：5或与其至少90％同一的序列的CDR2和/或选自SEQ ID No.：6或与其至少90％同一的序列的CDR3。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含：
轻链，其包含选自SEQ ID No.：1或与其至少90％同一的序列的CDR1、选自SEQ IDNo.：2或与其至少90％同一的序列的CDR2和选自SEQ ID No.：3或与其至少90％同一的序列的CDR3；和
重链。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含：
轻链；和
重链可变区，其包含选自SEQ ID No.：4或与其至少90％同一的序列的CDR1、选自SEQ ID No.：5或与其至少90％同一的序列的CDR2和/或选自SEQ ID No.：6或与其至少90％同一的序列的CDR3。
如本文所用，“同一性”表示在所比对序列的任何特定位置，序列之间的氨基酸残基相同。同一性程度可容易使用例如获自NCBI的BLASTTM软件计算(Altschul,S.F.等人，1990,J.Mol.Biol.215：403-410；Gish,W&States,D.J.1993,Nature Genet.3：266-272.Madden,T.L.等人，1996,Meth.Enzymol.266：131-141；Al tschul,S.F.等人，1997,Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.k.Madden,T.L.1997,Genome Res.7：649-656)。
CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和CDRH3分别与SEQ ID NO.：1、2、3、4、5和6的同一性可为至少90％，但也可为更高的，诸如至少95％、96％、97％、98％或99％，视情况优选较高的同一性。不同的同一性位置可根据相似性考虑因素选择。
在此上下文中，本公开内容特别地考虑了Tau结合抗体或其结合片段，其包含具有分别为SEQ ID No：1、2、3的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和6的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH。本公开内容还考虑包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、53的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和6的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ IDNo.：1、2、54的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和6的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、3的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和48的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、3的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和49的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、3的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和50的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、3的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和50的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、3的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和51的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；和包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、3的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和52的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH。包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、53的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和48的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、53的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和49的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、53的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和50的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、53的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和51的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；和包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、53的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和52的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ IDNo.：1、2、54的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和48的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、54的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和49的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、54的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和50的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、54的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQ ID No：4、5和51的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH；和包含以下的Tau结合抗体或其结合片段：具有分别为SEQ ID No.：1、2、54的CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL和具有分别为SEQID No：4、5和52的CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH。
所述第一方面所涵盖的Tau结合抗体或其结合片段可包含嵌入不同来源的构架区中的这些CDR。因此，CDR可包含于AB1的原始构架区(即SEQ ID No.：7的兔VL区域和SEQ IDNo.：8的兔VH区域)内。然而，CDR也可嵌入不同物种来源的构架区(诸如小鼠或人构架区)中。视可与这样的构架区组合的构架区和恒定区的来源而定，可获得嵌合、鼠源化或人源化Tau结合抗体或其结合片段。
嵌合Tau结合抗体或其结合片段将在与来自不同物种(诸如鼠或人来源)的恒定区组合的非人来源的构架区内包含CDR。鼠源化Tau结合抗体或其结合片段将在与鼠来源的恒定区组合的鼠来源的构架区内包含CDR。人源化Tau结合抗体或其结合片段将在与人来源的恒定区组合的人来源的构架区内包含CDR。
针对此背景，本公开内容在另一个方面中提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含：
轻链可变区，其包含SEQ ID No.：7或与其至少80％同一的序列，和/或
重链可变区，其包含SEQ ID No.：8或与其至少80％同一的序列。
VL和VH分别与SEQ ID No.：7和8的同一性可为至少80％，但也可为更高的，诸如至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，视情况优选较高同一性。不同的同一性位置可根据相似性考虑因素选择。应理解，就同一性而言，构架区相对于CDR可存在更大灵活性。
在此上下文中，本发明特定地考虑包含SEQ ID No.：7的VL和SEQ ID No.：8的VH的Tau结合抗体或其结合片段。
本公开内容尤其涵盖人源化Tau结合抗体或其结合片段。
为此目的，可将CDR移植至人构架区上。应理解，这样的人源化的CDR移植的Tau结合抗体或其结合片段的鉴别可利用本领域中已确立的方法实现。当移植CDR或特异性决定残基时，可使用与CDR所来源的供体抗体类别/类型相关的任何适当受体人可变区构架序列(参见例如Boss等人，美国专利第4,816,397号；Boss等人，欧洲专利第0,120,694B1号；Neuberger,M.S.等人，WO 86/01533；Neuberger,M.S.等人，欧洲专利第0,194,276B1号；Winter，美国专利第5,225,539号；Winter，欧洲专利第0,239,400B1号；Padlan,E.A.等人，欧洲专利申请第0,519,596A1号)。
另外，在本公开内容的CDR移植的抗体可变区中，构架区无需具有与受体抗体的序列完全相同的序列。从而可移植具有或不具有构架变化的CDR。根据供体可变区构架区与受体构架区之间的比较来引入构架变化可允许保持例如抗体亲和力，否则作为人源化的结果，可能会使抗体亲和力降低。举例而言，可将异常残基改变为受体链类别或类型中较频繁存在的残基。或者，可改变受体构架区中的所选残基，使得其对应于供体抗体中的相同位置所发现的残基(参见Riechmann等人，1998,Nature,332,323-324)。这样的变化应减少至为恢复供体抗体亲和力所必需的最小程度。可使用Adair等人(1991)(Humanisedantibodies.WO91/09967)概述的方案选择供改变的残基。在本公开内容的CDR移植抗体中，受体重链和轻链不必来源于相同抗体且必要时可包含具有来源于不同链的构架区的复合链。
可用于本公开内容的人受体构架实例为KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人，同上)。举例而言，KOL和NEWM可用于重链，REI可用于轻链且EU、LAY和POM可用于重链与轻链。或者，可使用人生殖系序列；这些序列可获得于：(http：//vbase.mrc-ce.cam.ac.uk/，或http：//www.imgt.org)。本发明特别地考虑使用人V区IGKV1-39+JK4J区SEQ ID No.：44(IMGT，http：//www.imgt.org/)作为轻链CDR的受体构架区和人V区IGHV4-39+JH4J区SEQ ID No.：45(IMGT，http：//www.imgt.org/)作为重链CDR的受体构架区。在SEQ ID No.：45中，可考虑例如位置1、73和80进行构架区中的残基变化。位置1的谷氨酰胺残基可变为谷氨酸。位置73中的缬氨酸残基可变为赖氨酸。位置80的苯丙氨酸可变为缬氨酸。SEQ ID No.：45中的用于进行构架区中的残基变化的其他位置可为位置39和/或75。举例而言，SEQ ID NO：45的位置39的异亮氨酸残基可变为缬氨酸。位置75的苏氨酸残基可变为丝氨酸。SEQ ID No.：44中用于进行构架区中的残基变化的位置可为位置2和/或63。举例而言，SEQ ID No.：44的位置2中的异亮氨酸残基可变为缬氨酸。SEQ ID No.：44的位置63的丝氨酸残基可变为赖氨酸。
针对此背景，本公开内容在另一个方面中提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含：轻链可变区，其包含SEQ ID No.：9或与其至少80％同一的序列，和/或重链可变区，其包含SEQ ID No.：10或与其至少80％同一的序列。
在另一方面中，本公开内容进一步提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含：轻链可变区，其包含SEQ ID No.：13或与其至少80％同一的序列，和/或重链可变区，其包含SEQ ID No.：16或与其至少80％同一的序列。
这样的经分离的Tau结合抗体或其结合片段可包含：轻链可变区，其包含SEQ IDNo.：13或与其至少80％同一的序列，和/或重链可变区，其包含SEQ ID No.：14、15或与其至少80％同一的序列。
另外，这样的经分离的Tau结合抗体或其结合片段可包含：轻链可变区，其包含SEQID No.：11、12或与其至少80％同一的序列，和/或重链可变区，其包含SEQ ID No.：16或与其至少80％同一的序列。
这样的经分离的Tau结合抗体或其结合片段可包含：轻链可变区，其包含SEQ IDNo.：11或与其至少80％同一的序列，和/或重链可变区，包含SEQ ID No.：14、15或与其至少80％同一的序列。
这样的经分离的Tau结合抗体或其结合片段可包含：轻链可变区，其包含SEQ IDNo.：12或与其至少80％同一的序列，和/或重链可变区，其包含SEQ ID No.：14、15或与其至少80％同一的序列。
VL和VH分别与SEQ ID No.：13和16的同一性可为至少80％，但也可为较高的，诸如至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，视情况优选较高同一性。不同的同一性位置可根据相似性考虑因素选择。应理解，就同一性而言，构架区相对于CDR可存在更大灵活性。
在此上下文中，本申请特别地考虑包含SEQ ID No.：11的VL和SEQ ID No.：14的VH的Tau结合抗体或其结合片段；包含SEQ ID No.：11的VL和SEQ ID No.：15的VH的Tau结合抗体或其结合片段；包含SEQ ID No.：12的VL和SEQ ID No.：14的VH的Tau结合抗体或其结合片段；以及包含SEQ ID No.：12的VL和SEQ ID No.：15的VH的Tau结合抗体或其结合片段。
人源化的CDR移植的Tau结合抗体或其结合片段可包含人来源的恒定区。抗体或免疫球蛋白视其重链的恒定区氨基酸序列而定，分成以下类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且其中几个可进一步分成亚类(亚型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1和IgA2。特定而言，当抗体分子意欲用于治疗用途且需要抗体效应功能时，可使用人IgG恒定区结构域，尤其IgG1和IgG3同种型。或者，当抗体分子意欲用于治疗目的且不需要抗体效应功能时，可使用IgG2和IgG4同种型。本发明特别地考虑IgG1和IgG4亚型的人源化抗体。
应理解也可使用这些恒定区结构域的序列修饰。举例而言，抗体恒定域中也可进行一或多个氨基酸(诸如1或2个氨基酸)取代、添加和/或缺失，而不会显著改变抗体结合Tau的能力。也可使用其中位置241的丝氨酸已变成脯氨酸的IgG4分子，如Angal等人，Molecular Immunology,1993,30(I),105-108中所述。
抗体效应功能包括ADCC和CDC。ADCC是指抗体依赖性细胞的细胞毒性。为了判定抗体原则上是否能够介导ADDC，可通过例如所谓的Cr51、Eu和S35释放分析来测量ADCC。含有所关注的抗原(即Tau)的靶细胞可用这些化合物标记。治疗抗体结合之后，洗涤细胞且将表达Fc受体(诸如FcγRIII)的效应细胞与经抗体标记的靶细胞一起共孵育且可根据标记的释放来监测靶细胞的溶解。另一种方法是利用所谓的aCella TOXTM分析。CDC是指补体依赖性细胞的细胞毒性。为了判定抗体原则上是否能够介导CDC，可如例如以下文献中所述来体外测量CDC：Delobel A等人，Methods Mol Biol.(2013)；988：115-43或Current Protocolsin Immunology，第13章Complement(Print ISSN：1934-3671)。
针对此背景，本公开内容在另一个方面中提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含：轻链，其包含SEQ ID No.：19或与其至少70％同一的序列，和/或重链，其包含SEQ ID No.：22或与其至少70％同一的序列。
这样的经分离的Tau结合抗体或其结合片段可包含：轻链，其包含SEQ ID No.：19或与其至少70％同一的序列，和/或重链，其包含SEQ ID No.：20、21或与其至少80％同一的序列。
这样的经分离的Tau结合抗体或其结合片段可包含：轻链，其包含SEQ ID No.：17、18或与其至少70％同一的序列，和/或重链，其包含SEQ ID No.：22或与其至少80％同一的序列。
这样的经分离的Tau结合抗体或其结合片段可包含：轻链，其包含SEQ ID No.：17、18或与其至少70％同一的序列，和/或重链，其包含SEQ ID No.：20、21或与其至少80％同一的序列。
轻链和重链分别与SEQ ID No.：19和22的同一性可为至少70％，但也可为较高的，诸如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，视情况优选较高同一性。不同的同一性位置可根据相似性考虑因素选择。应理解，就同一性而言，构架区相对于CDR可存在更多灵活性且恒定区可存在甚至更多的灵活性。
在此上下文中，本申请特别地考虑包含SEQ ID No.：17的轻链和SEQ ID No.：20的重链的Tau结合抗体或其结合片段、包含SEQ ID No.：17的轻链和SEQ ID No.：21的重链的Tau结合抗体或其结合片段、包含SEQ ID No.：18的轻链和SEQ ID No.：20的重链的Tau结合抗体或其结合片段，和包含SEQ ID No.：18的轻链和SEQ ID No.：21的重链的Tau结合抗体或其结合片段。
另外，本发明在另一方面中提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含：轻链，其包含SEQ ID No.：19或与其至少70％同一的序列，和/或重链，其包含SEQ ID No.：25或与其至少70％同一的序列。
这样的经分离的Tau结合抗体或其结合片段可包含：轻链，其包含SEQ ID No.：19或与其至少70％同一的序列，和/或重链，其包含SEQ ID No.：23或SEQ ID No.：24或与其至少70％同一的序列。
这样的经分离的Tau结合抗体或其结合片段可包含：轻链，其包含SEQ ID No.：19或与其至少70％同一的序列，和/或重链，其包含SEQ ID No.：23或SEQ ID No.：24或与其至少80％同一的序列。
这样的经分离的Tau结合抗体或其结合片段可包含：轻链，其包含SEQ ID No.：17、18或与其至少70％同一的序列，和/或重链，其包含SEQ ID No.：23或SEQ ID No.：24或与其至少80％同一的序列。
在此上下文中，本申请特别地考虑包含SEQ ID No.：17的轻链和SEQ ID No.：23的重链的Tau结合抗体或其结合片段、包含SEQ ID No.：17的轻链和SEQ ID No.：24的重链的Tau结合抗体或其结合片段、包含SEQ ID No.：18的轻链和SEQ ID No.：23的重链的Tau结合抗体或其结合片段，和包含SEQ ID No.：18的轻链和SEQ ID No.：24的重链的Tau结合抗体或其结合片段。
轻链和重链分别与SEQ ID No.：19和SEQ ID No.：23或24的同一性可为至少70％，但也可为较高的，诸如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，视情况优选较高同一性。不同的同一性位置可根据相似性考虑因素选择。应理解，就同一性而言，构架区相对于CDR可存在更多灵活性且恒定区可存在甚至更多的灵活性。
本公开内容还提供人Tau的特异性区域或表位，其被本公开内容所提供的抗体或其结合片段结合，特定而言，包含以下中的任一个的抗体或其结合片段：CDR-H1(SEQ IDNo.：4)、CDR-H2(SEQ ID No.：5)、CDR-H3(SEQ ID No.：6)、CDR-L1(SEQ ID No.：1)、CDR-L2(SEQ ID No.：2)或CDR-L3(SEQ ID No.：3)，例如包含SEQ ID No.：7的VL和SEQ ID No.：8的VL的抗体。
本公开内容进一步提供人Tau的特异性区域或表位，具体地，SEQ ID No.：55的氨基酸197-206内的磷酸化Tau区域，其被本公开内容中所提供的抗体或其结合片段所结合，具体地，包含SEQ ID No.：7的VL和SEQ ID No.：8的VH的抗体或其结合片段。
SEQ ID No.：55的197至206内的Tau区域包含四个可能的磷酸化位点，其对应于位置198(S198)、199(S199)、202(S202)的丝氨酸残基和位置205的苏氨酸残基(T205)。
术语“SEQ ID No.：55的氨基酸197-206内的磷酸化Tau区域”是指SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的Tau区域，其包含选自S198、S199、S202和T205的至少一个磷酸化残基。如本领域技术人员所知，磷酸化残基也可称为例如Ser(PO3H2)或Thr(PO3H2)。
Tau结合抗体对Tau的此特异性区域或表位的结合可通过本领域中已知的任何适合的表位定位方法与本公开内容所提供的任一种抗体的组合来鉴别。这样的方法的实例包括：利用能特异性结合抗体的含有由Tau结合抗体或其结合片段识别的表位的序列的最小片段筛选用于结合本公开内容的Tau结合抗体或其结合片段的来源于SEQ ID No.：55的不同长度的肽。若中枢神经系统中存在不同的Tau亚型，则应理解本文详述的方法中可使用任何这样的亚型。在特定实例中，可使用Tau的最长亚型，即如SEQ ID No.：55中所定义的亚型2。SEQ ID No.：55的Tau肽可以重组方式、合成方式或通过蛋白分解消化Tau多肽来产生。结合抗体的肽可通过例如Western印迹或质谱分析来鉴别。在另一实例中，NMR光谱法或X射线结晶学可用于鉴别Tau结合抗体或其结合片段所结合的表位。一旦鉴别，结合本公开内容的抗体的表位片段必要时可用作免疫原以获得结合相同表位的其他抗体。另外，结合本公开内容的抗体的表位片段可用于获得结合相同表位的蛋白质，且必要时至少抑制Tau聚集，诸如包含超过10个氨基酸的蛋白质或多肽化合物，所述氨基酸是基于来源于例如以下的蛋白质骨架：脂质运载蛋白(“抗运载蛋白”)、纤维结合蛋白(“阿德奈汀(adnectins)，特林奈汀(trinectins)”、昆尼兹域、C型凝集素、转铁蛋白、γ-结晶体、半胱氨酸-nots、锚蛋白重复(“DARPins”)或蛋白质A(“亲和抗体”)，如本领域中所知(Tomlinson,2004；Mosavi等人，2004；Gill和Damle,2006；Nilsson和Tolmachev,2007；Binz等人，2004)。另外，结合相同表位的分子包括其他有机分子，包括包含不超过10个氨基酸的肽和环肽，以及肽模拟物。肽模拟物为基于在蛋白质-蛋白质相互作用位点所发现的氨基酸序列且在本领域中已知的化合物(Sillerud和Larson,2005)。
针对此背景，本公开内容在另一方面中提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域。
这样的抗体可为嵌合、鼠源化、人源化或完全人单克隆抗体或可用于获得嵌合、鼠源化、人源化或完全人单克隆抗体。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少一个选自S198、S199、S202和T205的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少一个选自S198和S199的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少一个选自S202和T205的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少一个包含S198的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少一个包含S199的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少一个包含S202的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少一个包含T205的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少两个选自S198、S199、S202和T205的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少两个包含S198和S199的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少两个包含S199和S202的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少两个包含S202和T205的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少两个包含S198和T205的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少两个包含S198和S202的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少两个包含S199和T205的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少三个选自S198、S199、S202和T205的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少三个包含S198和S199的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少三个包含S199和S202的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少三个包含S202和T205的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少三个包含S198和T205的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少三个包含S198和S202的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含至少三个包含S199和T205的磷酸化残基。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域，其中所述磷酸化Tau区域包含以下四个磷酸化残基S198、S199、S202和T205。
这样的抗体可为嵌合、鼠源化、人源化或完全人单克隆抗体或可用于获得嵌合、鼠源化、人源化或完全人单克隆抗体。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的中和Tau结合抗体或其结合片段，其中所述中和Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：35的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域。
这样的抗体可为嵌合、鼠源化、人源化或完全人单克隆抗体或可用于获得嵌合、鼠源化、人源化或完全人单克隆抗体。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段与上述Tau结合抗体或其结合片段结合基本上相同的Tau表位。对表位的结合可如针对表位定位所述，使用例如包含SEQ ID No.：7的VL和SEQ ID No.：8的VH的Tau结合抗体或其结合片段作为参考物来测定。
这样的抗体可为嵌合、鼠源化、人源化或完全人单克隆抗体或可用于获得嵌合、鼠源化、人源化或完全人单克隆抗体。
在另一方面中，本公开内容提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段与上述Tau结合抗体竞争结合Tau。
在此上下文中，本发明特别地涵盖经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段与包含SEQ ID No.：7的VL和SEQ ID No.：8的VH的Tau结合抗体或其结合片段竞争结合Tau。
这样的抗体可为嵌合、鼠源化、人源化或完全人单克隆抗体或可用于获得嵌合、鼠源化、人源化或完全人单克隆抗体。
对Tau的竞争结合可根据在可包含SEQ ID No.：7的VL和SEQ ID No.：8的VH或SEQID No.：9的VL和SEQ ID No.：10的VH的参考抗体或其结合片段存在下，抗体或其结合片段对Tau的结合减少至少约50％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％或约100％来确定。结合可使用表面等离子体共振(使用
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设备)、各种荧光检测技术(例如荧光相关光谱法、荧光交叉关联法、荧光寿命测量等)或各种类型的放射免疫分析或用于追踪结合靶标分子的抗体的其他分析来测量。
术语“Tau结合抗体或其结合片段”意谓抗体或其结合片段借助于其可变区特异性结合Tau，即结合Tau抗原的亲和力大于不为Tau同源物的其他抗原。“Tau结合抗体或其结合片段”借助于其可变区结合Tau的亲和力是不为Tau同源物的其他抗原的至少两倍、至少五倍、至少10、20、100、103、104、105或至少106倍。应理解，Tau结合抗体和其结合片段然而也可经由与Tau结合抗体和其结合片段的可变区外部序列的相互作用而与其他蛋白质(例如金黄色葡萄球菌蛋白质A或ELISA技术中的其他抗体)发生相互作用。术语“Tau结合抗体或其结合片段”不意欲涵盖这样的后者结合特性，这些特性是由Tau结合抗体和其结合片段的可变区外部的序列介导且具体地，是由Tau结合抗体和其结合片段的恒定区介导。测定抗体结合特异性的筛选分析已熟知且在本领域中常规地实施。就抗体(或其结合片段)结合其抗原的亲和力而言，Tau结合抗体或其结合片段可具有纳摩尔浓度范围内的平衡解离常数(KD)。因此，KD可低于约1*10-6，例如低于约5*10-7，诸如约2*10-7或低于2*10-7，且可使用例如表面等离子体共振和BIAcore装置测量，如实施例中所述。
如上所述，本公开内容提供Tau结合抗体或其结合片段。全长抗体包括恒定域和可变区。恒定区在抗体的抗原结合片段中可不一定以其全长形式存在。然而应理解，每当本申请考虑使用抗体介导的ADCC和/或CDC时，结合片段必须包含长度仍足以能够介导ADCC和/或CDC的恒定区。
如上所述，本发明还涉及人Tau结合抗体或其结合片段，其可作为人源化的替代方案产生。举例而言，免疫接种后能够在不产生内源鼠抗体的情况下产生人抗体的完整库的转基因动物(例如小鼠)在本领域中已知。举例而言，已描述嵌合和生殖系突变小鼠中的抗体重链接合区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生被完全抑制。将人生殖系免疫球蛋白基因阵列转移至这样的生殖系突变型小鼠中将产生特异性针对特定抗原的人抗体(用所述抗原免疫接种携带人生殖系免疫球蛋白基因的转基因动物后)。用于产生这样的转基因动物的技术和自这样的转基因动物中分离和产生人抗体的技术在本领域中已知(Lonberg,2005；Green,1999；Kel lermann和Green,2002；Nichol son等人，1999)。或者，在转基因动物(例如小鼠)中，只有编码小鼠抗体的可变区的免疫球蛋白基因用相应的人可变免疫球蛋白基因序列置换。编码抗体恒定区的小鼠生殖系免疫球蛋白基因保持不变。以此方式，转基因小鼠的免疫系统中的抗体效应功能和因此B细胞发育基本上不变，从而可在活体内抗原攻击后使得抗体反应改善。一旦编码所关注的特定抗体的基因已自这样的转基因动物中分离，则编码恒定区的基因可用人恒定区基因置换以便获得完全人抗体。用于体外获得人抗体的抗体片段的其他方法是基于展示技术，诸如噬菌体展示或核糖体展示技术，其中使用至少部分地以人工方式或从供体的免疫球蛋白可变(V)域基因库产生的重组DNA文库。用于产生人抗体的噬菌体和核糖体展示技术在本领域中已熟知(Winter等人，1994；Hoogenboom,2002；Kretzschmar和von Ruden,2002；Groves和Osbourn,2005；Dufner等人，2006)。
人抗体也可自经分离的人B细胞中产生，所述人B细胞用所关注的抗原离体免疫且随后融合而产生杂交瘤，接着可筛选这些杂交瘤以产生最佳人抗体(Grasso等人，2004；Li等人，2006)。
如本文所用，术语“中和Tau结合抗体”是指结合Tau且抑制Tau的至少一种生物活性的抗体。在一个特定实施方案中，如本文所用，“中和Tau结合抗体”是指体外分析中，诸如下文实验3.1所述的体外分析中，结合Tau且抑制Tau聚集的抗体。
如本文所用，术语‘抗体’基本上是指完整(完全，全长)抗体，即包含两条重链和两条轻链的组件。抗体可包含其他结合结构域，例如WO 2007/024715中所公开的分子DVD-Ig，或WO2011/030107中所述的所谓(FabFv)2Fc。因此，如本文所使用的抗体包括二价、三价或四价全长抗体。
抗体结合片段包括单链抗体(即全长重链和轻链)；Fab、经修饰的Fab、Fab’、经修饰的Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、Fab-scFv、Fab-scFc、二硫键稳定化Fab-scFv、单域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、scFv-scFc、dsscFv、dsscFv-scFc、二价、三价或四价抗体、双scFv、双功能抗体、三功能抗体、三功能抗体、四功能抗体；结构域抗体(dAbs)，诸如sdAb；VHH和VNAR片段，和上述任一个的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson,2005,Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online2(3),209-217)。用于产生和制造这些抗体片段的方法在本领域中已熟知(参见例如Verma等人，1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181)。Fab-Fv形式首次公开于WO2009/040562中且其二硫化物稳定型Fab-dsFv首次公开于WO2010/035012中。Fab-scFv的二硫化物稳定化形式描述于WO2013/068571中。包含scFc形式的抗体形式首次描述于WO2008/012543中。用于本公开内容中的其他抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中所述的Fab和Fab’片段。
多价抗体可包含多特异性，例如双特异性，或可具单特异性(参见例如WO92/22583和WO05/113605)。后者的一个实例为如WO92/22583中所述的Tri-Fab(或TFM)。
在一个实施方案中，提供Fab片段。
在一个实施方案中，提供Fab’片段。
典型Fab’分子包含重链和轻链对，其中重链包含可变区VH、恒定域CH1和天然或经修饰的铰链区且轻链包含可变区VL和恒定域CL。
在一个实施方案中，提供根据本公开内容的Fab’的二聚物以产生F(ab’)2，例如可经由铰链发生二聚化。
在一个实施方案中，抗体或其结合片段包含结合结构域。结合结构域通常将包含6个CDR，三个来自重链且三个来自轻链。在一个实施方案中，CDR位于一个构架中且一起形成可变区。因此，在一个实施方案中，抗体或结合片段包含特异于抗原的结合结构域，其包含轻链可变区和重链可变区。
应理解，本公开内容所提供的Tau结合抗体或其结合片段的亲和力可使用本领域中已知的适合方法改变。本公开内容因此还涉及本公开内容的抗体分子的变体，其对Tau具有改良的亲和力。这样的变体可通过多种亲和力成熟方案获得，包括使CDR发生突变(Yang等人，J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、链改组(Marks等人，Bio/Technology,10,779-783,1992)、使用大肠杆菌突变菌株(Low等人，J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改组(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(Thompson等人，J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等人，Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等人(同上)论述这些亲和力成熟方法。
Tau结合抗体和其结合片段因此也可涵盖例如具有一或多个保守取代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个保守取代)的前文特定提及的轻链或重链氨基酸序列中的任一个。可确定氨基酸序列中的位置作为保守取代的候选位置，且可选择合成和天然存在的氨基酸来实现任何特定氨基酸的保守取代。用于选择保守取代的考虑因素包括产生任何特定氨基酸取代的背景、侧链的疏水性或极性、侧链的一般尺寸，和在生理学条件下具有酸性或碱性特征的侧链的pK值。举例而言，赖氨酸、精氨酸和组氨酸彼此间取代通常为适合的。如本领域中所知，这是因为全部三种氨基酸具有碱性侧链，然而与组氨酸(约6)相比，赖氨酸和精氨酸的侧链的pK值彼此间更接近(约10和12)。类似地，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸彼此间的取代通常为适合的，其限制条件为甘氨酸不宜频繁地取代群组中的其他成员。彼此间适宜频繁取代的其他氨基酸群组包括(但不限于)由谷氨酸和天冬氨酸组成的群；由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸组成的群；和由丝氨酸、苏氨酸和视情况存在的酪氨酸组成的群。
如在本公开内容的上下文中提及的Tau结合抗体和其结合片段可涵盖本文公开的例示性抗体、片段和序列的衍生物。“衍生物”包括已经化学修饰的Tau结合抗体和其结合片段。化学修饰的实例包括共价连接一或多个聚合物，诸如水溶性聚合物、N连接或O连接型碳水化合物、糖类、磷酸盐和/或其他这样的分子，诸如可检测标记，诸如荧光团。
必要时，用于本公开内容中的Tau结合抗体或其结合片段因此可与一个或多个效应分子结合。应理解效应分子可包含单个效应分子或两个或多于两个如此连接以形成可连接至本发明抗体的单一部分的这样的分子。在需要获得连接至效应分子的抗体片段的情况下，这可通过其中抗体片段直接或经由偶合剂连接至效应分子的标准化学或重组DNA程序来制备。用于这样的效应分子与抗体结合的技术在本领域中已熟知(参见Hellstrom等人，Controlled Drug Delivery，第2版，Robinson等人编，1987，第623-53页；Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.,62：119-58和Dubowchik等人，1999,Pharmacology andTherapeutics,83,67-123)。用于结合效应分子的这些技术可包括位点特异性结合或非位点特异性或随机结合。特定化学程序包括例如WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO89/01476和WO 03/031581中所述的程序。或者，在效应分子为蛋白质或多肽的情况下，可使用重组DNA程序，例如如WO 86/01533和EP0392745中所述来实现键联。或者，效应分子中的特定连接位点可工程改造成本公开内容的抗体或其抗原结合片段，例如如WO2008/038024中所述。另外，可利用偶合剂使效应分子与本公开内容的抗体或其抗原结合片段连接，例如如WO 2005/113605中所述。本领域技术人员应理解，上述可能性可单独或组合使用。
如本文所用，术语效应分子包括例如药物、毒素、生物学活性蛋白质(例如酶)、其他抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸和其片段(例如DNA、RNA和其片段)、放射性核素(尤其放射性碘)、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报告基团，诸如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱法检测的化合物。如本文所用，效应分子还包括治疗剂，诸如化学治疗剂、治疗多肽、纳米颗粒、脂质体或治疗性核酸。
其他效应分子可包括螯合放射性核素，诸如111In和90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188；或药物，诸如(但不限于)烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、类紫杉醇和苏拉明(suramin)。
其他效应分子包括蛋白质、肽和酶。所关注的酶包括(但不限于)蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。所关注的蛋白质、多肽和肽包括(但不限于)免疫球蛋白；毒素，诸如相思子毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，诸如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板源生长因子或组织纤维蛋白溶酶原活化因子；血栓药剂或抗血管生成剂，例如血管生长抑素或内皮生长抑素；或生物反应调节剂，诸如淋巴激素、白细胞介素-1(IL-I)、白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞群落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其他生长因子和免疫球蛋白，或包含超过10个氨基酸的其他蛋白质或多肽化合物，所述氨基酸是基于来自例如以下的蛋白质骨架：脂质运载蛋白(“抗运载蛋白”)、纤维结合蛋白(“阿德奈汀”，特林奈汀)、昆尼兹域、C型凝集素、转铁蛋白、γ-结晶体、半胱氨酸结、锚蛋白重复(“DARPins”)、Fyn SH3域(“非诺莫(fynomers)”)或蛋白质A(“亲和抗体”)，如本领域中所知(Tomlinson,2004；Mosavi等人，2004；Gill和Damle,2006；Nilsson和Tolmachev,2007；Binz等人，2004；Silacci等人，2014)。
其他效应分子包括增强或促进血脑屏障渗透的肽和蛋白质。举例而言，WO2010/043047、WO2010/063122、WO2010/063123或WO2011/041897描述可充当能够传输治疗分子跨越血脑屏障的载体的肽或多肽和使其与治疗分子结合的方法。在血脑屏障渗透的情形下，所关注的肽和蛋白质包括(但不限于)结合血脑屏障受体(诸如转铁蛋白受体、葡萄糖受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白8、低密度脂蛋白受体相关蛋白1和肝素结合表皮生长因子样生长因子)的肽和蛋白质。或者，效应分子为特异性结合上述血脑屏障受体的一的抗体片段，诸如域抗体、骆驼科抗体或鲨鱼源抗体(VNAR)。
其他效应分子可包括适用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性核素、正电子发射金属(诸如可用于正电子发射断层摄影术或单光子发射计算机化断层摄影术中)和非放射性顺磁金属离子。关于适用于诊断学中的可与抗体结合的金属离子，一般参见美国专利第4,741,900号。适合的酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基包括抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白和生物素；适合的荧光物质包括伞酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和藻红素；适合的发光物质包括鲁米诺(luminol)；适合的生物发光物质包括荧光素酶、荧光素和水母素；且适合的放射性核素包括124I、125I、131I、111In、99Tc、89Zr、90Y、64Cu、68Ga和18F。作为可检测物质适用于诊断的效应分子的特定类型包括缺电子四嗪和反-环辛烯(TCO)，如Wyffels等人，2014,Nuclear Medicine andbiology 41(2014)：513-523中所述，其中可施用至连接至四嗪的本发明的Tau结合抗体且使其达到最大吸收和自非靶标位点足够清除，接着随后施用至经适合放射性核素标记的TCO或优化TCO类似物，使得TCO共价结合本公开内容的Tau结合抗体上的四嗪，且通过例如正电子发射断层摄影术或单光子发射计算机化断层摄影术实现其检测。
在一个实施方案中，提供连接至放射性核素或连接至四嗪的Tau结合Fab、Fab’或scFv。连接至放射性核素或连接至四嗪可经由位于抗体片段中的任何可利用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能基(例如任何游离胺基、亚胺基、硫醇、羟基或羧基)、借助于连接来实现。这样的氨基酸可天然存在于抗体片段中或可使用重组DNA方法经工程改造至片段中(参见例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971、WO2008/038024)。在一个实施例中，本公开内容的Tau结合抗体或其结合片段为经修饰的Fab片段，其中所述修饰为向其重链的C末端添加一个或多个氨基酸以实现效应分子的连接。适合的是，其他氨基酸形成经修饰的铰链区，其含有一个或多个可连接至效应分子的半胱氨酸残基。在一个实施方案中，若放射性核素为金属离子，诸如111In、99Tc、89Zr、90Y、64Cu或68Ga，则其可被巨环螯合剂结合，例如如Turner等人(Br.J.Cancer,1994,70：35-41；Comparative biodistribution of indium-111-labelled macrocycle chimeric B72.3antibody conjugates in tumour-bearingmice)所述，其中后者又共价连接至抗体或抗体片段之前述氨基酸侧链或末端氨基酸官能基。在另一个实施方案中，结合放射性核素之后者巨环螯合剂可为WO05/113605中所述的效应分子，所述效应分子为连接两个或超过两个抗Tau抗体或其片段的交联剂的一部分。
在另一实例中，效应分子可延长抗体的活体内半衰期，和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体跨越上皮屏障传送至免疫系统。适合的这样的型效应分子的实例包括聚合物、白蛋白和白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，诸如WO05/117984中所述的那些。
在效应分子为聚合物的情况下，其一般可为合成或天然存在的聚合物，例如视情况经取代的直链或分支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧亚烷基聚合物或分支链或非分支链多醣(例如均多醣或杂多醣)。
可视情况存在于上述合成聚合物上的特定取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。
合成聚合物的特定实施例包括视情况经取代的直链或分支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其视情况经取代的聚(乙二醇)，诸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
天然存在的特定聚合物包括乳糖、直链淀粉、聚葡萄糖、糖原或其衍生物。
在一个实施方案中，效应分子为白蛋白或其片段，诸如人血清白蛋白或其片段。
聚合物尺寸可根据需要变化，但平均分子量通常在500Da至50000Da的范围内，例如5000Da至40000Da，诸如20000Da至40000Da。聚合物尺寸尤其可基于产品的预定用途来选择，例如局限于某些组织(诸如脑)中或延长循环半衰期的能力(关于综述，参见Chapman,2002,Advanced Drug Del ivery Reviews,54,531-545)。因此，举例而言，希望产物离开循环且渗入组织中。
适合的聚合物包括聚亚烷基聚合物，诸如聚(乙二醇)或尤其甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其分子量在约15000Da至约40000Da范围内。
在一个实施例中，用于本公开内容中的抗体连接至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一个特定实例中，抗体为Tau结合抗体或其结合片段且PEG分子可经由位于抗体片段中的任何可利用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能基连接，例如任何游离氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基。这样的氨基酸可天然存在于抗体片段中或可使用重组DNA方法经工程改造至片段中(参见例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971、WO2008/038024)。在一个实例中，本公开内容的Tau结合抗体或其结合片段为经修饰的Fab片段，其中所述修饰为向其重链的C末端添加一个或多个氨基酸以实现效应分子的连接。适合的是，其他氨基酸形成经修饰的铰链区，其含有一个或多个可连接至效应分子的半胱氨酸残基。可利用多个位点连接两个或超过两个PEG分子。
PEG分子适宜经由位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基共价连接。连接至经修饰的抗体片段的每个聚合物分子可共价连接至位于片段中的半胱氨酸残基的硫原子。共价键一般为二硫键或尤其硫-碳键。在巯基用作连接点的情况下，可使用适当活化的效应分子，例如巯基选择性衍生物，诸如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。活化聚合物可用作起始物质来制备如上所述的经聚合物修饰的抗体片段。活化聚合物可为含有硫醇反应基的任何聚合物，诸如α-卤基羧酸或酯，例如碘乙酰胺、酰亚胺(例如马来酰亚胺)、乙烯基砜或二硫化物。这样的起始物质可市购(例如购自Nektar，前身为Shearwater PolymersInc.,Huntsville,AL,USA)或可使用常规化学程序由市售起始物质制备。特定PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可获自Nektar，前身为Shearwater；Rapp Polymere；以及SunBio)和M-PEG-SPA(可获自Nektar，前身为Shearwater)。
在另一方面中，本公开内容提供包含编码Tau结合抗体和其结合片段的核酸序列的核酸分子；包含编码其可变轻链和/或重链的核酸序列的核酸分子；和包含编码其可变轻链和/或重链的CDR1、CDR2和/或CDR3的核酸序列的核酸分子。
举例而言，AB1(SEQ ID No.：7)的VL可由SEQ ID No.：26编码。AB1(SEQ ID No.：8)的VH可由SEQ ID No.：27编码。
SEQ ID No.：11的人源化VL可由SEQ ID No.：30编码。SEQ ID No.：12的人源化VL可由SEQ ID No.：31编码。SEQ ID No.：14的人源化VH可由SEQ ID No.：32编码且SEQ IDNo.：15的人源化VH可由SEQ ID No.：33编码。
SEQ ID No.：17的人源化轻链可由SEQ ID No.：34编码。SEQ ID No.：18的人源化轻链可由SEQ ID No.：35编码。SEQ ID No.：20的人源化重链可由SEQ ID No.：36编码且SEQID No.：21的人源化重链可由SEQ ID No.：37编码。SEQ ID No.：23的人源化重链可由SEQID No.：38编码且SEQ ID No.：24的人源化重链可由SEQ ID No.：39编码。
Tau结合抗体和其结合片段可由单一核酸(例如包含编码抗体的轻链和重链多肽的核苷酸序列的单一核酸)编码，或由两个或超过两个分开的核酸编码(各编码抗体或抗体片段的不同部分)。就此而言，本公开内容提供一个或多个编码任一种前述抗体或结合片段的核酸。核酸分子可为DNA、cDNA、RNA和其类似物。
举例而言，编码抗体重链和轻链的一部分或全部的DNA序列可根据需要自经测定的DNA序列或基于相应氨基酸序列来合成。编码受体构架序列的DNA可由本领域技术人员广泛获得且容易基于其已知氨基酸序列合成。
可利用标准分子生物学技术制备编码本公开内容的抗体分子的DNA序列。期望DNA序列可使用寡核苷酸合成技术完全或部分地合成。适当时可使用定点突变诱发和聚合酶链反应(PCR)技术。
优选地，编码核酸序列可操作地连接至表达控制序列，从而允许在原核或真核细胞中表达。所述聚核苷酸的表达包含将聚核苷酸转录成可翻译mRNA。确保在真核细胞(优选为哺乳动物细胞)中实现表达的调控元件已为本领域技术人员熟知。其通常包含确保转录起始的调控序列且视情况包含确保转录终止和转录物稳定化的聚A信号。其他调控元件可包括转录以及翻译增强子，和/或天然相关的或异质启动子区域。
因此，本公开内容在另一方面中提供包含编码Tau结合抗体和其结合片段的这样的核酸序列的克隆或表达载体。
“载体”是能够将核酸序列运载至适合宿主细胞(例如其中可发生所编码多肽的合成)中的任何分子或组合物。通常且优选地，载体为一种核酸，其已使用在本领域中已知可并入期望核酸序列(例如本公开内容的核酸)的重组DNA技术工程改造。表达载体通常含有以下组分中的一个或多个(如果其未由核酸分子提供)：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、用于分泌的前导序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的核酸的多接头区域，和选择性标记物元件。
通常选择在使用载体(所述载体与宿主细胞机构兼容，使得可发生基因扩增和/或基因表达)的宿主细胞中发挥作用的载体。
本公开内容因此在另一方面中提供包含如上文所述的克隆或表达载体的宿主细胞和/或编码如上文所述的Tau结合抗体和其结合片段的核酸序列。
宿主细胞可以是能够经核酸或载体转化以便产生由其编码的Tau结合抗体或其结合片段的任何细胞类型。包含核酸或载体的宿主细胞可用于产生Tau结合抗体或其结合片段，或其部分(例如由核酸或载体编码的重链序列或轻链序列)。将核酸或载体引入细胞中之后，在适合于表达所编码序列的条件下培养细胞。接着可自细胞中分离抗体、抗原结合片段或所述抗体的一部分。
宿主细胞可以是原核宿主细胞(诸如大肠杆菌)或真核宿主细胞(诸如酵母细胞、昆虫细胞或脊椎动物细胞)。在适当条件培养下培养时，宿主细胞表达抗体或其结合片段，随后可自培养基收集(如果宿主细胞将抗体或其结合片段分泌至培养基中)或直接自产生抗体或其结合片段的宿主细胞收集(如果不分泌抗体或其结合片段)。适当宿主细胞的选择将视多种因素而定，诸如所需表达量、活性所需或必需的多肽修饰(诸如糖基化或磷酸化)和折叠成生物学活性分子的容易性。宿主细胞的选择部分地取决于抗体或其结合片段是否经转录后修饰(例如糖基化和/或磷酸化)。若如此，则酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞是优选的。
适合的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。适用于本公开内容中的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)的类型可包括CHO和CHO-K1细胞，包括dhfr-CHO，诸如可结合DHFR选择性标记物使用的CHO-DG44细胞和CHODXB11细胞或可结合谷氨酰胺合成酶选择性标记物使用的CHOKI-SV细胞。许多可获自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection；ATCC),Manassas,Va。实例包括哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(ATCC第CCL61号)、人胚肾(HEK)293或293T细胞(ATCC第CRL1573号)、3T3细胞(ATCC第CCL92号)或PER.C6细胞。用于表达抗体的其他细胞类型包括淋巴细胞性细胞系，例如NSO骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞。
本公开内容的另一方面提供一种产生Tau结合抗体或其结合片段的方法，所述方法包含在适合于从例如编码Tau结合抗体或其结合片段的DNA表达Tau结合抗体或其结合片段的条件下培养含有例如载体的宿主细胞和分离抗体分子。
Tau结合抗体或其结合片段可仅包含重链或轻链多肽，在此情况下仅需使用重链或轻链多肽编码序列转染宿主细胞。为产生包含重链与轻链的产物，细胞系可经两种载体转染，第一载体编码轻链多肽且第二载体编码重链多肽。或者，可使用单一载体，载体包括编码轻链和重链多肽的序列。
Tau结合抗体或其结合片段(根据本公开内容的抗体和片段)在宿主细胞中得到高量的表达。因此，抗体和/或片段的特性有助于商业加工。
因此，提供一种培养宿主细胞且表达Tau结合抗体或其结合片段、分离后者且视情况纯化其以提供经分离的Tau结合抗体或其结合片段的方法。在一个实施方案中，所述方法进一步包含使效应分子与经分离的抗体或片段结合(例如与尤其如本文所述的PEG聚合物结合)的步骤。
Tau结合抗体或其结合片段可配制成组合物，尤其药物或诊断组合物。药物组合物包含治疗或预防有效量的Tau结合抗体或其结合片段与适合的载剂(例如药学上可接受的药剂)的混合物。诊断组合物包含诊断有效量的Tau结合抗体或其结合片段与适合载剂(例如诊断学上可接受的药剂)的混合物。
本发明药物组合物中使用的药学上可接受的药剂包括载剂、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、增积剂、缓冲液、递送媒介物、张力剂、共溶剂、湿润剂、络合剂、缓冲剂、抗微生物剂和表面活性剂。
组合物可呈液体形式或呈冻干或冷冻干燥形式且可包括一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或增积剂(参见例如美国专利6,685,940、6,566,329和6,372,716)。
组合物可适于肠胃外施用。例示性组合物适合于通过可供本领域技术人员使用的任何路径注射或输注至动物中，诸如关节内、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内或病灶内途径。肠胃外配制物通常为无菌、无热原质的等张水溶液，其视情况含有药学上可接受的防腐剂。
非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载剂包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer’s dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些)，和其类似物。也可存在防腐剂和其他添加剂，诸如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体和其类似物。一般参见Remington’s Pharmaceutical Science，第16版，Mack编，1980，所述文献以引用的方式并入本文中。
本文所述的药物组合物可以以在特定局部环境中提供产物的局部浓度和/或增加稳定性或半衰期的方式(例如推注、储集式作用)配制成用于受控或持续递送。组合物可包括本公开内容的抗体、结合片段、核酸或载体与以下的配制物：聚合物化合物(诸如聚乳酸、聚乙醇酸等)的微粒制剂，以及诸如以下的药剂：生物可降解基质、可注射微球体、微胶囊颗粒、微胶囊、生物溶蚀性颗粒珠粒、脂质体，和提供活性剂的受控或持续释放、接着可以储集式注射递送的可植入传送装置。
或者或另外，组合物可通过将已吸收或囊封有本公开内容的抗体、结合片段、核酸或载体的膜、海绵或其他适当材料植入到所影响区域中来局部施用。在使用植入装置的情况下，可将装置植入任何适合组织或器官中，且本公开内容的抗体、结合片段、核酸或载体可直接经由所述装置，通过推注或通过连续施用或通过使用连续输注的导管来递送。
包含Tau结合抗体或其结合片段的药物组合物可配制成用于吸入，诸如干粉形式。吸入溶液也可配制于液化推进剂中用于气溶胶递送。在又另一个配制物中，溶液可雾化。
本公开内容的一个方面涉及Tau结合抗体和其结合片段作为治疗活性剂治疗疾病的用途。
本公开内容的另一方面涉及Tau结合抗体和其结合片段用于治疗Tau蛋白病的用途。已描述含有Tau包裹体(Clavaguera等人，Brain Pathology 23(2013)342-349)的Tau蛋白病包括阿尔茨海默氏病(AD)；肌肉萎缩性侧索硬化/帕金森氏症-痴呆综合症；嗜银颗粒疾病；慢性创伤性脑病变；皮质基底核退化症；弥漫性神经原纤维缠结伴钙化；唐氏症候群；英国家族性痴呆症；丹麦家族性痴呆症；与MAPT突变所引起的染色体17关联的额颞叶型痴呆症和帕金森氏症；格斯曼-斯陶思勒-谢恩克尔疾病；瓜德罗普岛帕金森氏症；肌紧张性营养不良；出现脑铁积聚的神经退化；C型尼曼-匹克疾病；非关岛运动神经元疾病伴神经原纤维缠结；匹克疾病；脑炎后帕金森氏症；朊病毒蛋白大脑淀粉样蛋白血管病变；渐进性皮层下神经胶样变性；进行性核上麻痹(PSP)；SLC9A6相关智力迟钝；亚急性硬化性全脑炎；仅缠结痴呆症；和出现球状神经胶质包裹体的白质tau蛋白病。
本公开内容的另一方面因此涉及Tau结合抗体和其结合片段用于治疗阿尔茨海默氏病和/或进行性核上麻痹的用途。
相应地，本发明还涉及通过向有需要的受试者施用治疗活性量的Tau结合抗体或其结合片段来治疗Tau蛋白病(特定而言，阿尔茨海默氏病和/或进行性核上麻痹)的方法。
本发明还涉及Tau结合抗体或其结合片段用于制造用于治疗Tau蛋白病(具体地，阿尔茨海默氏病和/或进行性核上麻痹)的药剂的用途。
在本公开内容的另一方面中，Tau结合抗体或其结合片段可单独或与其他药剂组合使用以用于治疗。举例而言，Tau结合抗体或其结合片段可与至少一种其他治疗剂共施用。在某些方面中，其他治疗剂是当使用Tau结合抗体或其结合片段治疗时有效治疗相同或不同病症的治疗剂。例示性其他治疗剂包括(但不限于)：胆碱酯酶抑制剂(诸如多奈哌齐(donepezil)、加兰他敏(galantamine)、卡巴拉汀(rovastigmine)和他可林(tacrine))、NMDA受体拮抗剂(诸如美金刚(memantine))、淀粉样蛋白β肽聚集抑制剂、抗氧化剂、γ分泌酶调节剂、神经生长因子(NGF)模拟物或NGF基因疗法、PPARy激动剂、HMS-CoA还原酶抑制剂(抑制素)、安目帕克(ampakines)、钙离子通道阻断剂、GABA受体拮抗剂、糖原合成酶激酶抑制剂、静脉内免疫球蛋白、蕈毒碱受体激动剂、烟碱受体调节剂、主动或被动淀粉样蛋白β肽免疫接种、磷酸二酯酶抑制剂、血清素受体拮抗剂和抗淀粉样蛋白β肽抗体或其他抗Tau抗体。其他例示性神经学药物可选自生长激素或神经营养因子；实例包括(但不限于)脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养素-4/5、纤维母细胞生长因子(FGF)-2和其他FGF、神经营养素(NT)-3、红血球生成素(EPO)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)-α、TGF-β、血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-lra)、睫毛神经营养因子(CNTF)、神经胶质源神经营养因子(GDNF)、neurturin、血小板源生长因子(PDGF)、海瑞古林(heregulin)、神经调节蛋白、青蒿琥酯(artemin)、珀瑟芬(persephin)、白细胞介素、神经胶质细胞系源神经营养因子(GFR)、粒细胞群落刺激因子(CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF、轴突导向因子(netrins)、心营养素-1、刺猬蛋白(hedgehogs)、白血病抑制因子(LIF)、中期因子(midkine)、多效生长因子(pleiotrophin)、骨形态发生蛋白(BMP)、轴突导向因子、皂角素(saposins)、信号素(semaphorins)和干细胞因子(SCF)。在某些实施方案中，选择能够缓解神经学药物的一种或多种副作用的至少一种其他治疗剂。上文提及的这样的组合疗法涵盖组合施用(其中两种或超过两种治疗剂包括于相同或分开的配制物中)和分别施用，在此情况下，Tau结合抗体或其结合片段的施用可在其他治疗剂和/或佐剂施用之前、同时和/或之后进行。Tau结合抗体或其结合片段也可与其他干预疗法组合使用，诸如(但不限于)辐射疗法、行为疗法，或本领域中已知且适于治疗或预防神经病症的其他疗法。
本公开内容的另一方面涉及Tau结合抗体和其结合片段用作诊断活性剂的用途。
本公开内容的一个方面还涉及Tau结合抗体和其结合片段用于诊断Tau蛋白病(特定而言，阿尔茨海默氏病和/或进行性核上麻痹)的用途。
这样的诊断测试优选可针对生物样品进行。“生物样品”涵盖获自受试者的多种样品类型且可用于诊断或监测分析。定义涵盖脑脊髓液、血液和生物学来源的其他液体样品、实体组织样品(诸如活检试样)或组织培养基或来源于其的细胞和其子代。定义还包括在获取之后已以任何方式操控的样品，诸如通过试剂处理、增溶，或富集某些组分，诸如聚核苷酸。术语“生物样品”涵盖临床样品且还包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物体液和组织样品。术语“生物样品”包括尿液、唾液、脑脊髓液、血液部分(诸如血浆和血清)，和其类似物。
诊断测试优选可针对不与人或动物身体接触的生物样品进行。这样的诊断测试也称为体外测试。
体外诊断测试可依赖于体外检测已获自受试者的生物样品中的Tau的方法，所述方法包含以下步骤：i)使生物样品与如本文所述的Tau结合抗体或其结合片段接触；和ii)检测如本文所述的Tau结合抗体或其结合片段对Tau的结合。通过比较所检测的Tau水平与适合的对照，接着可诊断tau蛋白病(诸如阿尔茨海默氏病和/或进行性核上麻痹)的存在或存在可能性。因此可使用这样的检测方法判定受试者是否患有tau蛋白病(包括确定tau蛋白病的阶段(严重度))或处于出现tau蛋白病的风险中。
本公开内容因此提供体外诊断受试者中的tau蛋白病(诸如阿尔茨海默氏病和/或进行性核上麻痹)的方法，所述方法包含以下步骤：i)通过使用如本文所述的Tau结合抗体或其结合片段评估自受试者获得的生物样品中的Tau水平或状态；和ii)将Tau水平或状态与指示正常对照受试者中的Tau水平或状态的参考值、标准值或或正常对照值进行比较。生物样品中的Tau多肽水平和/或状态与正常对照值之间的显著差异表示受试者患有tau蛋白病，诸如阿尔茨海默氏病和/或进行性核上麻痹。
根据本文已描述的这些各种方面和实施方案，本公开内容尤其涵盖：
1.一种经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含
轻链可变区，其包含选自SEQ ID No.：1或与其至少90％同一的序列的CDR1、选自SEQ ID No.：2或与其至少90％同一的序列的CDR2和选自SEQ ID No.：3或与其至少90％同一的序列的CDR3；和/或
重链可变区，其包含选自SEQ ID No.：4或与其至少90％同一的序列的CDR1、选自SEQ ID No.：5或与其至少90％同一的序列的CDR2和/或选自SEQ ID No.：6或与其至少90％同一的序列的CDR3。
2.如实施方案1的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含
轻链可变区，其包含选自SEQ ID No.：1的CDR1、选自SEQ ID No.：2的CDR2和选自SEQ ID No.：3的CDR3；和
重链可变区，其包含选自SEQ ID No.：4的CDR1、选自SEQ ID No.：5的CDR2和/或选自SEQ ID No.：6的CDR3。
3.如实施方案1或2的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：3中的X1为A。
4.如实施方案1或2的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：3中的X1为G。
5.如实施方案1或2的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：6中的X2为A。
6.如实施方案1或2的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：6中的X2为Q。
7.如实施方案1或2的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：6中的X2为N。
8.如实施方案1或2的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：6中的X2为D。
9.如实施方案1或2的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：6中的X2为S。
10.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为单克隆抗体。
11.如实施方案10的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为嵌合、人源化或完全人抗体。
12.如实施方案11的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为IgG1或IgG4亚型的人源化抗体。
13.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197-206内的磷酸化Tau区域。
14.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或结合片段结合人Tau的可溶形式、人Tau的配对螺旋丝(PHF)，或结合人Tau的可溶形式与人Tau的配对螺旋丝(PHF)二者。
15.一种经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含
轻链可变区，其包含SEQ ID No.：7或与其至少80％同一的序列，和/或
重链可变区，其包含SEQ ID No.：8或与其至少80％同一的序列。
16.如实施方案15的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含
包含SEQ ID NO：7的轻链可变区，和
包含SEQ ID No.：8的重链可变区。
17.如实施方案15或16的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：7中的X1为A。
18.如实施方案15或16的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：7中的X1为G。
19.如实施方案15或16的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：8中的X2为A。
20.如实施方案15或16的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：8中的X2为Q。
21.如实施方案15或16的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：8中的X2为N。
22.如实施方案15或16的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：8中的X2为D。
23.如实施方案15或16的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：8中的X2为S。
24.如实施方案15、16、17、18、19、20、21、22或23中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为单克隆抗体。
25.如实施方案24的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为嵌合抗体。
26.如实施方案15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197至206内的磷酸化Tau区域。
27.如实施方案15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或结合片段结合人Tau的可溶形式、人Tau的配对螺旋丝(PHF)，或结合人Tau的可溶形式与人Tau的配对螺旋丝(PHF)二者。
28.一种经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含
轻链可变区，其包含SEQ ID No.：9或与其至少80％同一的序列，和/或
重链可变区，其包含SEQ ID No.：10或与其至少80％同一的序列。
29.一种经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含
轻链可变区，其包含SEQ ID No.：13或与其至少80％同一的序列，和/或
重链可变区，其包含SEQ ID No.：16或与其至少80％同一的序列。
30.如实施方案29的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含
包含SEQ ID NO：13的轻链可变区，和
包含SEQ ID No.：16的重链可变区。
31.如实施方案29或30的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：13中的X1为A。
32.如实施方案29或30的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：13中的X1为G。
33.如实施方案29或30的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：16中的X2为A。
34.如实施方案29或30的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：16中的X2为Q。
35.如实施方案29或30的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：16中的X2为N。
36.如实施方案29或30的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：16中的X2为D。
37.如实施方案29或30的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：16中的X2为S。
38.如实施方案29的Tau结合抗体或其结合片段，其中重链可变区包含SEQ IDNo.：14或15。
39.如实施方案29的Tau结合抗体或其结合片段，其中轻链可变区包含SEQ IDNo.：11或12。
40.如实施方案29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为单克隆抗体。
41.如实施方案40的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为人源化抗体。
42.如实施方案41的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段具有IgG1或IgG4亚型。
43.如实施方案29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197-206内的磷酸化Tau区域。
44.如实施方案29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或结合片段结合人Tau的可溶形式、人Tau的配对螺旋丝(PHF)，或结合人Tau的可溶形式与人Tau的配对螺旋丝(PHF)二者。
45.一种经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含
轻链，其包含SEQ ID No.：19或与其至少70％同一的序列，和/或
重链，其包含SEQ ID No.：22或与其至少70％同一的序列。
46.如实施方案45的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段包含
包含SEQ ID No.：19的轻链，和
包含SEQ ID No.：22的重链。
47.如实施方案45或46的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：19中的X1为A。
48.如实施方案45或46的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：19中的X1为G。
49.如实施方案45或46的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：22中的X2为A。
50.如实施方案45或46的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：22中的X2为Q。
51.如实施方案45或46的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：22中的X2为N。
52.如实施方案45或46的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：22中的X2为D。
53.如实施方案45或46的Tau结合抗体或其结合片段，其中SEQ ID No.：22中的X2为S。
54.如实施方案45的Tau结合抗体或其结合片段，其中重链可变区包含SEQ IDNo.：14或15。
55.如实施方案45的Tau结合抗体或其结合片段，其中轻链可变区包含SEQ IDNo.：11或12。
56.如实施方案45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为单克隆人源化抗体。
57.如实施方案56的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段具有IgG1或IgG4亚型。
58.如实施方案45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197-206内所含的磷酸化Tau区域。
59.如实施方案45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或结合片段结合人Tau的可溶形式、人Tau的配对螺旋丝(PHF)，或结合人Tau的可溶形式与人Tau的配对螺旋丝(PHF)二者。
60.一种经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197-206内所含的磷酸化Tau区域。
61.如实施方案60的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为单克隆抗体。
62.如实施方案60或61的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为嵌合、人源化或完全人抗体。
63.如实施方案62的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为IgG1或IgG4亚型的单克隆人源化抗体或其结合片段。
64.如实施方案60、61、62或63中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或结合片段结合人Tau的可溶形式、人Tau的配对螺旋丝(PHF)，或结合人Tau的可溶形式与人Tau的配对螺旋丝(PHF)二者。
65.一种经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段与实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64中任一项的Tau结合抗体或其结合片段竞争结合Tau。
66.如实施方案65的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段与包含以下的Tau结合抗体或结合片段竞争结合Tau：包含SEQ ID NO：11或12的轻链可变区，和包含SEQ ID No.：14或15的重链可变区。
67.一种经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段与实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66或67中任一项的Tau结合抗体或其结合片段竞争结合基本上相同的Tau表位。
68.如实施方案67的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段与包含以下的Tau结合抗体或结合片段结合基本上相同的Tau表位：包含SEQ ID NO：11或12的轻链可变区，和包含SEQ ID No.：14或15的重链可变区。
69.如实施方案65、66、67或68中任一项的经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为单克隆抗体。
70.如实施方案69的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为嵌合、人源化或完全人抗体。
71.如实施方案70的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为IgG1或IgG4亚型的人源化抗体。
72.如实施方案65、66、67、68、69、70或71中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段结合SEQ ID No.：55的氨基酸197-206内的磷酸化Tau区域。
73.如实施方案65、66、67、68、69、70、71或72中任一项的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或结合片段结合人Tau的可溶形式、人Tau的配对螺旋丝(PHF)，或结合人Tau的可溶形式与人Tau的配对螺旋丝(PHF)二者。
74.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72或73中任一项的经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述Tau结合抗体或其结合片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd和Fv、scFv、Fab-Fv、Fab-scFv、Fab-dsFv、Fab-scFc、scFv-scFc、dsscFv、dsscFv-scFc、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、线性抗体或含VHH抗体。
75.一种经分离的核酸分子，其编码如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中任一项的Tau结合抗体或其结合片段的轻链和/或重链。
76.一种克隆或表达载体，其包含一种或多种如实施方案75的核酸序列。
77.一种宿主细胞，其包含一种或多种如实施方案75的核酸序列或一种或多种如实施方案76的克隆或表达载体。
78.如实施方案77的宿主细胞，其不为人胚胎干细胞。
79.一种制造如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中任一项的Tau结合抗体或其结合片段的方法，所述方法至少包含以下步骤：a)培养如实施方案77或78的宿主细胞，和b)分离所述Tau结合抗体或其结合片段。
80.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中任一项的经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其用作治疗活性剂。
81.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中任一项的经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其用于治疗tau蛋白病。
82.如实施方案81使用的经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau蛋白病为阿尔茨海默氏病。
83.如实施方案81使用的经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau蛋白病为进行性核上麻痹。
84.一种治疗tau蛋白病的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用至如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中任一项的Tau结合抗体或其结合片段的步骤。
85.如实施方案84的方法，其中所述tau蛋白病为阿尔茨海默氏病。
86.如实施方案85的方法，其中所述tau蛋白病为进行性核上麻痹。
87.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中任一项的经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其用作诊断剂。
88.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中任一项的经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其用于诊断tau蛋白病。
89.如实施方案88使用的经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau蛋白病为阿尔茨海默氏病。
90.如实施方案88使用的经分离的Tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau蛋白病为进行性核上麻痹。
本发明现根据一些实施例加以描述，然而，所述实施例不应理解为具限制性。
实验
实验1-Tau结合抗体的产生
1.1Tau肽设计和产生
肽和免疫原是由Pept ide Protein Research Ltd.,Bishop’s Wal tham,U.K.供应，且根据Atherton和Sheppard的方法、通过Fmoc固相肽化学技术合成。(参考：Atherton,E.；Sheppard,R.C.(1989).Sol id Phase pept ide synthes is：a pract icalapproach.Oxford,England：IRL Press)。使用经Fmoc保护的前体Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH、Fmoc-Thr(PO(OBzl)OH)-OH、Fmoc-Tyr(3-NO2)-OH和Fmoc-Lys(Ac)-OH合成含有磷酸化丝氨酸(pSer)、磷酸化苏氨酸(pThr)、3-硝基酪氨酸(nTyr)和N-ε-乙酰基赖氨酸(aLys)的肽。
设计肽并用于产生识别所有Tau亚型的Tau结合抗体，所述Tau亚型经磷酸化丝氨酸(pSer)、磷酸化苏氨酸(pThr)和/或亚硝基酪氨酸(nTyr)进行了翻译后修饰；其表示残基197至206，如与Tau亚型2(SEQ ID NO：55，Uniprot代码：P10636-8，NCBI参考编号：NP_005901.2)所比对：N-乙酰基-nTyr pSer pSer Pro Cys*pSer Pro Gly pThr Pro-酰胺
(肽称为T197，且定义于SEQ ID NO：56中)。
N和C肽末端分别用乙酰基和酰胺基团封端且cys*表示半胱氨酸侧链巯基为连接至载体蛋白质或生物素的结合点以便分别制备免疫原或分析试剂，如下详述。用于监测抗血清效价的分析试剂是通过相等质量的马来酰亚胺基-PEG-生物素与肽发生反应来制备。三种不同免疫原是通过肽与ε-氨基赖氨酸侧链上已经马来酰亚胺基团取代的以下载体蛋白质的反应来制备：钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)和卵白蛋白(OVA)。
1.2免疫接种
使用注射器，使用通过剧烈混合所得的于等体积的完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的500μg总肽混合物(T197和T211)将2只雌性新西兰白兔(>2kg)皮下免疫。设计与KLH、OVA和BSA结合的肽且交替地免疫。使用不完全弗氏佐剂(IFA)，以21天时间间隔给予兔2次追加注射，免疫后第14天从耳放血。最后一次追加免疫后14天终止，制备脾脏、骨髓和外周血液单核细胞的单一细胞悬浮液并于10％DMSO/FCS中在-80℃冷冻。
1.3B细胞培养
使用类似于Zubler等人(1985)所述的方法制备B细胞培养物。简言之，来自免疫兔的PBMC源B细胞以每孔约3000个细胞的密度在条形码编码的96孔组织培养板中、在37℃、在5％CO2氛围中培养七天，所述组织培养板具有每孔200μl RPMI 1640培养基(Gibco BRL)，所述培养基补充有10％FCS(PAA laboratories ltd)、2％HEPES(Sigma Aldrich)、1％L-谷氨酰胺(Gibco BRL)、1％青霉素/链霉素溶液(Gibco BRL)、0.1％β-巯基乙醇(Gibco BRL)、3％活化脾细胞培养物上清液和γ照射突变型EL4鼠胸腺瘤细胞(5x104/孔)。总共获取约1.2×107个B细胞样品。
1.4初始筛选
使用基于荧光的均质结合分析，使用涂有生物素化T197肽的SuperavidinTM珠粒(Bangs Laboratories)作为靶抗原来源，测定B细胞培养物上清液中的T197肽特异性抗体的存在。筛选包括使用Matrix Platemate液体处置器，从条形码编码的96孔组织培养板转移10ul上清液置于条形码编码的384孔黑壁分析板中，所述384孔分析板含有固定于珠粒上的T197(10ul/孔)。结合经由山羊抗兔IgG Fcγ特异性Cy-5缀合物(Jackson)展现。在Applied Biosystems 8200细胞检测系统上读板。
1.5二次筛选
初始筛选之后，使用Aviso Onyx拣选机器人将阳性上清液合并于条形码编码的96孔母液板上且将细胞培养板中的B细胞在-80℃冷冻。接着在ELISA分析中，针对T197肽以及单独地抗生蛋白链菌素筛选母液板。这是为了测定各孔的肽特异性，和排除对Superavidin珠粒显示非特异性结合的假阳性孔。ELISA分析包括将生物素化T197捕捉于384孔Maxisorp板(ThermoScientific/Nunc)上，所述Maxisorp板经含有抗生蛋白链菌素的碳酸盐涂布缓冲液(dH2O+0.16％Na2CO3+0.3％NaHCO3)涂布。培养板用1％w/v PEG/PBS封闭且接着与每孔10ul B细胞培养物上清液(用封闭缓冲液1：1稀释)一起孵育。向板中添加HRP缀合的山羊抗兔IgG fc二抗(Stratech Scient ific Ltd/Jackson ImmunoResearch)，随后利用TMB底物(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，获自EMD Millipore；10μl/孔)显示结合。使用BioTek Synergy2微定量板式读取器，在630nM测量光密度。初始结合分析鉴别出880个成功结果且在ELISA筛选之后，其中406个显示特异性结合T197。选择对T197展现特异性的B细胞上清液用于进一步通过Biacore分析，以鉴别具有最佳亲和力的那些。
1.6可变区复原
为了允许从所关注的选择孔复原抗体可变区基因，必须进行解褶积步骤以能够在含有异质B细胞群的指定孔中鉴别出抗原特异性B细胞。这通过使用荧光焦点方法(Clargo等人，2014)实现。简言之，将获自阳性孔的分泌免疫球蛋白的B细胞与涂有生物素化T197肽的抗生蛋白链菌素珠粒(New England Biolabs)和1：1200最后稀释的山羊抗兔Fcγ片段特异性FITC缀合物(Jackson)混合。在37℃静态孵育1小时之后，由于在所述B细胞周围存在荧光光环而可鉴别出抗原特异性B细胞。接着利用Eppendorf微操作器挑选多个使用Olympus显微镜所鉴别的这些个别B细胞克隆且沉积至PCR管中。
使用重链和轻链可变区特异性引物，通过逆转录(RT)-PCR从单细胞中复原抗体可变区基因。在Aviso Onyx液体处置机器人上进行两轮PCR，巢式2°PCR在3’端和5’端引入了限制性酶切位点，从而允许将可变区克隆入兔IgG(VH)或兔κ(VL)哺乳动物表达载体中。将获自31个不同孔的抗T197抗体基因成功地克隆入表达载体中。使用Fectin293(Invitrogen)将重链和轻链构建体共转染至HEK-293细胞中且在125ml锥形瓶(Erlenmeyerflask)中以30ml体积表达重组抗体。5-7天表达之后，收集上清液且使用亲和层析纯化。
实验2-进一步筛选所鉴别的抗体
2.1在大肠杆菌中产生Tau
以合成方式产生编码不同Tau亚型的基因且将密码子优化以便在大肠杆菌中表达。使用标准分子生物学技术亚克隆入经修饰的pET32载体中，所述载体经工程改造以产生具有N端6His-TEV标记的Tau。
大肠杆菌BL 21(DE3)细胞经上述载体转化，且使用标准技术表达蛋白质。
接着通过离心回收大肠杆菌细胞，裂解且通过使用NiNTA(Qiagen)的亲和层析从可溶级分中捕获Tau蛋白。使用TEV蛋白酶移除6His标记，随后进行第二NiNTA层析步骤。取决于应用，经纯化的Tau于合适的缓冲液中进行缓冲交换。为了免疫而产生的样品经使用Proteus NoEndoTM管柱(Vivaproducts)移除内毒素。
产生同位素标记的Tau用于核磁共振(NMR)研究：如上文所述进行蛋白质表达，但其中使用最小限度培养基将15N、13C和2H并入蛋白质中。裂解大肠杆菌细胞沉淀且使用NiNTA(Qiagen)亲和层析步骤纯化Tau蛋白，利用TEV蛋白酶移除6His标记且接着通过凝胶过滤、使用Superdex 200单元(GE-Healthcare)纯化Tau蛋白。
2.2在HEK293中产生Tau
使用野生型DNA序列，以合成方式产生编码Tau亚型2的基因。使用标准分子生物学技术将其亚克隆入表达载体pMV-10HisTEV(含有CMV启动子)中，其经工程改造以产生具有N端10His-TEV标记的Tau。
所得载体使用Expi293TM表达系统(Invi trogen)、依据制造商方案转染。此系统是使用来源于HEK293细胞系的Expi293F人细胞。
Tau蛋白聚积于培养基中，使用固定金属离子亲和层析Ni Sepharose Excel(GEHealthcare)从其中回收。接着使用TEV蛋白酶移除10His标记，随后再施加至Ni Sepharose管柱上且收集流过的经切割的Tau。经纯化的Tau于合适的缓冲液中进行缓冲交换，这取决于应用。
2.3利用人脑样品制备PHF Tau原纤维
根据Ks iezak-Reding和Wal l公开的方案(Neurobiology of Aging 15,11-19,1994)，从获自患有阿尔茨海默氏病(AD)或进行性核上麻痹(PSP)或额颞叶型痴呆症(FTD)的供者的脑样品中纯化配对螺旋丝(PHF)-Tau蛋白。回收先前已描述的PHF-Tau富集的级分8(等效于此参考文献中的蔗糖梯度离心之前的粗PHF-Tau)和级分11(等效于级分A2，如此参考文献中所述的SDS可溶PHF)且用于实验3的BIAcore分析和细胞分析。
2.4ELISA筛选
接着通过ELISA和通过Biacore对纯化抗体进行进一步筛选，以证实重组抗体的活性和选择最高亲和力和最具特异性的抗体。ELISA分析再次包括将生物素化T197捕获于384孔Maxisorp板(ThermoScientific/Nunc)上，所述Maxisorp板经含有抗生蛋白链菌素的碳酸盐涂布缓冲液(dH2O+0.16％Na2CO3+0.3％NaHCO3)涂布。单独的板还涂有不同Tau肽，所述肽映射至Tau分子的替代区域以检查仅结合T197序列的特异性。板用1％w/v PEG/PBS封闭且接着与纯化的短暂上清液的若干稀释液一起孵育。向板中添加HRP缀合的山羊抗兔IgGfc二抗(Stratech Scientific Ltd/Jackson ImmunoResearch)，随后利用TMB底物(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，获自EMD Millipore；10μl/孔)显示结合。使用BioTek Synergy 2微定量板式读取器，在630nM测量光密度。所选抗体(具有SEQ ID No.：7的兔VL和SEQ ID No.：8的兔VH的AB1)的数据显示于图1中。如可见，AB1仅对T197显示高度选择性结合，而对对应于Tau分子的其他区域的四种肽未显示高度选择性结合：
-T174N-乙酰基-C*K pT P P A P K pT P P酰胺(SEQ ID No.：62)；
-T211N-乙酰基-R pT P pS L P pT P C*酰胺(SEQ ID No.：63)；
-T230N-乙酰基-R pT P P K pS P pS SC*酰胺(SEQ ID No.：57)；和
-T396N-乙酰基-C*pS P V V pS G D pT pS酰胺(SEQ ID No.：64)；
*生物素结合的位置。
2.5BIAcore筛选
瞬时表达所选的兔抗Tau IgG抗体克隆，纯化且使用SPR Biacore T200平台分析。首先使用固定的山羊F(ab’)2抗兔Fcγ试剂将抗体捕获于CM5感测芯片上。流动池2、3和4显示5600-6100RU之间的固定水平，而经封闭的流动池1(仅聚葡萄糖)充当参考物。经纯化的IgG于获自GE Healthcare的HBS-EP+缓冲液中稀释至0.5μg/ml且以10μl/min的流速捕获于芯片上。每个捕获步骤之后，注射180秒具有肽/抗生蛋白链菌素复合物、缓冲对照物和去磷酸化肽/抗生蛋白链菌素复合物的分析物。使用10μl 100μM肽于含有3mM EDTA和1％DMSO的HBS-EP+中的溶液使肽发生去磷酸化，将其在含有0.3mM EDTA的HBS-N缓冲液(GEHealthcare)1：10稀释且用2μl 0.5M MgCl2在EDTA中达到饱和。添加2μl小牛肠碱性磷酸酶(NEB，目录号M0290S)1：10稀释液(于HBS-N)中且在37℃孵育一小时，接着在4℃储存。通过添加1μl 0.5M EDTA至混合物中来抑制磷酸酶反应。溶液用于制备去磷酸化肽/抗生蛋白链菌素复合物。对于具有SEQ ID No.：7的VL区域和SEQ ID No.：8的VH的兔抗体而言，使用获自具有氨基酸序列SEQ ID No.：57的Tau区域230-238的肽T230作为阴性对照物。用二价分析物模型拟合数据。
表1显示此抗体当结合T197和T230磷酸化和去磷酸化肽/抗生蛋白链菌素复合物时所测量的亲和力值。
表1：
Figure BDA0001539763080000571
所选单克隆Fab片段(mFab)是使用Pierce Ficin裂解试剂盒(目录号44980，Thermo Scientific)、根据制造商方案，由具有SEQ ID No.：58的轻链和SEQ ID No.：59的重链的鼠源化mAB1抗体制备。在Biacore分析中使用280nm吸光度测定Fab储备溶液的浓度。将获自阿尔茨海默氏病患者的不溶性Tau蛋白制剂(AD-PHF，级分11)、HEK源Tau亚型-2单体(氨基酸1-441)和大肠杆菌中所表达的亚型-2单体用胺固定至CM5芯片上，且使用BiacoreT200仪器测量抗Tau mFab的结合。使用获自GE Healthcare的缓冲液HBS-EP进行固定，但其中AD-PHF使用10mM乙酸(pH 3.0)。HBS-EP+缓冲液补充有300mM NaCl和1.25％CM-Dextran(Sigma)且用作分析缓冲液。虽然使用流动池(Fc)1作为参考物，但针对Fc2-4获得以下RU值：5ug/ml大肠杆菌Tau为44RU，5ug/ml HEK Tau为56RU，且AD-PHF物质的1：20稀释溶液为500RU。使用两个60秒10mM甘氨酸(pH1.7)循环进行再生。使用10ul/min流速进行固定和再生，而使用30ul/min流速进行分析物结合。对于AD-PHF而言，应用多次人工注射以达到500RU，包括EDC/NHS和EtoA封端。使用90ul分析物注射180秒或300秒用于解离，每个mFab样品或缓冲液对照物应用五个启动循环和12个循环。各mFab使用600nM溶液的11个1：3稀释液与缓冲液。
表2.来自mAB和对照抗体101.4的mFab与大肠杆菌、哺乳动物HEK293细胞中表达的单体Tau亚型2和来自阿尔茨海默氏症患者的分离的Tau PHF原纤维的结合
Figure BDA0001539763080000581
2.6通过BIAcore进行的表位定位
使用Biacore 3000仪器和HBS-EP(GE Healthcare)作为操作缓冲液，将自HEK细胞表达和纯化的重组Tau亚型-2单体(氨基酸1-441)和从阿尔茨海默氏病患者脑中分离的呈配对螺旋丝制备物形式的不溶性Tau蛋白(AD-PHF)经胺固定至CM5芯片上。通过以10μl/min的流速注射50mM N-羟基丁二酰亚胺与200mM 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺的70μl新鲜混合物来活化这些流动池和参考流动池的羧甲基聚葡萄糖表面之后，前者分别与流动池2和流动池4发生胺偶合。通过注射160μl 50μg/ml 10mM乙酸盐pH 5.0缓冲液实现tau单体的固定，而通过注射二十个160μl 2μg/ml等分试样(于10mM乙酸中)(pH3.0)来使AD-PHF固定。使用50μl 1M乙醇胺.HCl pH 8.5的脉冲使测试和对照流动池表面去活化。
通过具有SEQ ID NO：17的轻链和SEQ ID NO：20的重链的Tau结合人源化抗体(L17H20)的预孵育溶液和测试肽或缓冲液对照物(于操作缓冲液中分别以200nM和5000nM制备)进行表位定位。通过在参考池、tau单体和AD-PHF流动池上注射50μl，在10μl/min的恒定流速下，在一系列感测图谱循环中分别测试这些。在每次注射结束之后15秒所取的报导点记录抗体结合的反应单位，作为测试流动池与参考流动池的差值。每一个循环结束时，通过两次注射20μl含有1.5M胍的磷酸盐缓冲盐水来使芯片再生。
表3：缩略语：nY是硝基酪氨酸，pS是磷酸-丝氨酸；pT是磷酸苏氨酸；N.S.在95％的置信水平下不显著。
Figure BDA0001539763080000591
Figure BDA0001539763080000601
根据结合固定的tau单体或结合AD-PHF的抗体的百分比抑制水平(相对于根据对照循环所计算的平均抗体结合值)来显示抗体对所指定测试肽的反应性。
基于含有Tau蛋白的残基196至206的肽(SEQ ID NO：65)来制备和分析测试肽，且如表3所定义来分析磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸和/或亚硝基酪氨酸的翻译后修饰的作用。
基于此分析，总结出最小表位为通过SEQ ID NO：55的氨基酸201至206定义的磷酸化Tau区域(对应于基序Gly pSer Pro Gly pThr Pro)，并且此表位必须需要SEQ ID NO：55的位置205上磷酸化苏氨酸的存在和SEQ ID NO：55的位置202上磷酸化丝氨酸的存在。
实验3-所鉴别的抗体的进一步表征
3.1细胞分析
利用Tau转基因小鼠制备粗可溶性和不溶性级分以诱导Tau聚集
在这些实验中，使用表达人Tau P301S(Allen等人，2002J.Neurosci.22(21)：9340-51)和表达人Tau P301L(Lewis等人，2000Nat Genet.(4)：402-5.；
Figure BDA0001539763080000602
J等人，2001J Biol Chem.276(1)：529-34)的转基因小鼠。
粗可溶性和不溶性级分是由P301S和P301L Tau转基因小鼠的脑通过差速离心来制备。简言之，使用手持式均质器Pellet Pestle Motor(Kontes)，在1.5ml微量离心管中，在冰上，将获自P301S(脊髓和脑干)和P301L(中脑和脑干)Tau转基因小鼠的脑组织在冰冷TBS(Fisher Scientific)中均质化。接着，使匀浆(H)在4℃下以4,000g离心10分钟以移除组织残渣。所得上清液(S0)在4℃下以20,000g离心20分钟，以提供对应于粗可溶性级分(S1)的上清液。将剩余沉淀(P1)再悬浮于1ml于TBS中制备的1％十二烷基肌酸钠(sarkosyl)溶液中，在室温下孵育1小时，且接着在4℃下以100,000g离心1小时。舍弃上清液(S2)。沉淀(P2)用5ml冰冷TBS洗涤，且接着再悬浮于TBS中以提供粗不溶性级分(P2’)。
制备表达具有P301S突变的人Tau的HEK-293-F细胞
使用293fectin(Life Technologies)，根据制造商说明书，用表达具有P301S突变的人Tau亚型2的pcDNA3.1(+)载体转染HEK-293-F细胞(Life Technologies)。经转染的细胞的等分试样于液氮中储存。
诱导Tau聚集
图2说明用于表征Tau治疗抗体的活性的细胞聚集分析的不同步骤。第1天，使表达具有P301S突变的人Tau亚型2(P301S-tau)的HEK-293-F细胞在37℃解冻且在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素(FFBS)的293表达培养基(Life Technologies)中稀释。使用自动细胞计数器(Vi-CELL XR,Beckman Coulter)对细胞计数，且接着以每孔25,000个活细胞的密度涂铺于聚-D-赖氨酸预涂的96孔板(Greiner Bio-One)中。使细胞在37℃、5％CO2中维持。同日，在4℃下，在温和搅拌下，将获自患有阿尔茨海默氏病(AD-PHF，级分8)或进行性核上麻痹(PSP-PHF，级分8)或额颞叶型痴呆症(FTD-PHF)的患者的经超声处理的人不溶性Tau或获自P301S或P301L转基因小鼠大脑的脑级分(作为晶种用于诱导Tau聚集)与抗Tau抗体一起或不与抗Tau抗体一起在FFBS培养基中孵育隔夜。对于AD和PSP样品而言，AD-PHF(级分8)分别在80ng/μl和60ng/μl使用；获自转基因小鼠P301S和P301L的可溶性脑级分分别在0.1μg/μl和1.2μg/μl使用。第2天，将晶种或晶种/抗体混合物施加至细胞中维持24小时。第3天，培养基用含有抗体的新鲜FFBS培养基置换，且使细胞在培养物中再维持24小时。第4天，使用Tau聚集分析试剂盒(Cisbio)，基于均质时差式荧光能量转移(HTRF)，根据制造商说明书测量Tau聚集。利用SpectraMax Paradigm(Molecular Devices)测量荧光。聚集是作为相对于对照(-)的聚集百分比来报告，对照对应于不存在抗体的情况下，外源性原纤维或级分所诱导的最大聚集反应。
测试AB1和现有技术的其他Tau结合抗体对所诱导的Tau聚集的影响。现有技术抗体为WO2014/028777A2的IPN002、WO2013/096380A2的PT3、WO2010/142423A2的mAb2.10.3和WO 2014/008404的HJ8.5。
此分析的结果概述于表3和图3中。
表4概述具有SEQ ID NO：9的鼠源化VL和SEQ ID No.：10的鼠源化VH的AB1(VL9VH10)、具有SEQ ID No.：17的轻链和SEQ ID No.：23的重链的Tau结合抗体(L17H23)、具有SEQ ID No.：17的轻链和SEQ ID No.：24的重链的Tau结合抗体(L17H24)、具有SEQ IDNo.：17的轻链和SEQ ID No.：20的重链的Tau结合抗体(L17H20)、具有SEQ ID No.：17的轻链和SEQ ID No.：21的重链的Tau结合抗体(L17H21)以及针对一系列获自各种脑提取物的Tau晶种的竞争抗体的效力(IC50)和最大功效(Imax，300nM)。而图3显示具有SEQ ID No.：17的轻链和SEQ ID No.：20的重链的Tau结合抗体(L17H20)和具有SEQ ID No.：17的轻链和SEQ ID No.：21的重链的Tau结合抗体(L17H21)的功效(在使用获自人PSP患者的人Tau病理性原纤维的细胞聚集分析中)。
表4
Figure BDA0001539763080000621
Figure BDA0001539763080000631
ND：未测定。
(*)100nM下的最大功效
在细胞分析中，使用获自P301L(n＝2)、AD(n＝3)和PSP(n＝3)的Tau晶种进行进一步实验以测定具有SEQ ID NO：9的鼠源化VL和SEQ ID No.：10的鼠源化VH的AB1(VL9VH10)的活性，得到的最终IC50值分别为15nM、27nM和70nM；Imax值分别为79％、68％和57％。
3.2组织学分析
分析具有SEQ ID NO：7的兔VL和SEQ ID No.：8的兔VH的AB1、具有SEQ ID No.：11的VL和SEQ ID No.：14的VH(VL11VH14)或SEQ ID No.：11的VL和SEQ ID No.：15的VH(VL11VH15)的人源化AB1以及现有技术的抗体IPN002、PT3和Mab2.10.3，且使用获自患有阿尔茨海默氏病的供者的人海马体的冷冻切片测定最佳浓度，所述供者先前已显示含有病理性Tau结构(使用AT8免疫染色)(诸如以下文献中所述：Braak和Braak,1995,NeurobiolAging；16(3)：271-8；和Porzig等人，2007Biochem Biophys Res Commun；358(2)：644-9)。除101.4(阴性对照抗体)的外，AB1和所有现有技术抗体展现特异性和浓度依赖性免疫反应性。根据这些资料，选择单一、最佳浓度的抗体且用于筛选一组六个人脑样品。三个样品来源于患有阿尔茨海默氏病的供者或来源于展现高程度Tau病理学(使用AT8免疫染色所检测的阳性Tau病理学)的年迈供者，且三个样品来源于无Tau病理学(使用AT8免疫染色检测到阴性Tau病理学)的供者。
AB1、VL11VH14、VL11VH15、PT3和Mab2.10.3显示AT8阳性样品中存在相似的免疫染色图案。在阳性Tau病理学样品的海马体和颞叶皮层内观测到神经原纤维缠结(神经元内NFT)、细胞质Tau、神经炎斑样结构和神经纤维网丝的特异性免疫染色。然而在AT8阴性组织中检测到的免疫染色少得多。此结果表明相较于非病理性Tau，这些抗体优先识别病理性Tau。
IPN002在阳性与阴性Tau病理学样品中均提供相似信号。
3.3Wes tern印迹
使用化学发光读出进行Western印迹法：将由人AD、PSP制备的裂解物装载至10％聚丙烯酰胺凝胶上(每个泳道20μg蛋白质)。通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离蛋白质且电转移至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上。膜于含有4％BSA(牛血清白蛋白)的TBST(50mM Tris、150mM NaCl、0.05％Tween 20，pH经HCl调节至pH 7.6)中封闭。膜在4℃与一级抗体或非免疫IgG对照抗体一起孵育隔夜，用TBST冲洗，与二级抗体(小鼠抗生物素)一起孵育1小时，用TBST冲洗，与三级抗体(抗小鼠IgG-过氧化酶)一起孵育1小时，用TBST冲洗，且使用ECL(增强式化学发光)显色。
具有SEQ ID NO：9的鼠源化VL和SEQ ID No.：10的鼠源化VH的mAB1结合来自人AD样品的病理性Tau，但对PSP的结合弱。参见图4。
实验4-所鉴别抗体的人源化
具有SEQ ID No.：7的VL和SEQ ID No.：8的VH的AB1通过将来自兔抗体V区的CDR移植至人生殖系抗体V区构架上来发生人源化。为复原抗体活性，来自兔V区的许多构架残基也保留在人源化序列中。可使用Adair等人(1991)(Humanised antibodies.WO91/09967)概述的方案选择这些残基。兔抗体(供体)V区序列与人生殖系(受体)V区序列的比对以及所设计的人源化序列显示于图5和图6中。自供体移植至受体序列的CDR如Kabat(Kabat等人，1987)所定义，但其中CDR-H1使用组合的Chothia/Kabat定义(参见Adair等人，1991Humanised ant ibodies.WO91/09967)。
选择人V区IGKV1-39与JK4J区(IMGT，http：//www.imgt.org/)作为抗体AB1轻链CDR的受体。移植物gL4和gL9中的轻链构架残基皆来自人生殖系基因。利用移植物gL9使CDRL3发生突变以修饰潜在去酰胺化位点。选择人V区IGHV4-39与JH4J区(IMGT，http：//www.imgt.org/)作为抗体AB1的重链CDR的受体。与多种兔抗体共同的是，抗体AB1的VH基因比所选人受体短。与人受体序列比对时，抗体AB1的VH区中的构架1缺乏人源化抗体中所保留的N端残基(图6)。AB1兔VH区中的构架3也缺乏位于β片股D与E之间的环中的两个残基(75和76)：在移植物gH41和gH49中，间隙填充有来自所选人受体序列的相应残基(赖氨酸75，K75；天冬酰胺76，N76)(图6)。移植物gH41和gH49中的重链构架残基皆来自人生殖系基因，但其中一个或多个残基选自包含残基71和78(Kabat编号)的群，其中分别保留供体残基赖氨酸(K71)和缬氨酸(V78)。残基K71和V78的保留为实现人源化抗体的完全效力所必需的。人构架位置1的谷氨酰胺残基经谷氨酸(E1)置换，以提供均质产物的表达和纯化：将抗体和抗体片段的N端的谷氨酰胺转化成焦谷氨酸已被广泛报导。利用移植物gH41和gH49使CDRH3发生突变，以修饰潜在去酰胺化位点。
设计编码各种抗体的许多变体重链和轻链V区序列的基因且通过DNA2.0Inc的自动化合成方法构建。重链和轻链V区的其他变体是通过寡核苷酸定点诱变修饰VH和VK基因来产生(在一些情况下，包括CDR内的突变以修饰潜在去酰胺化位点)。为了瞬时表达，将人源化轻链V区基因克隆入UCB人轻链表达载体pMhCK中，所述表达载体含有编码人κ链恒定区的DNA(Km3同种异型)。将人源化重链V区基因克隆入UCB人γ-4重链表达载体pMhγ4P FL中，所述表达载体含有编码具有铰链稳定化突变S241P的人γ-4重链恒定区的DNA(Angal等人，Mol Immunol.1993,30(1)：105-8)。或者，将人源化VH基因克隆入UCBγ-1重链表达载体pMhγ1FL中，所述表达载体含有编码人γ-1恒定区的DNA(G1m17，1个同种异型)。为了评估人源化抗体的单价结合动力学，还将人源化VH基因克隆入UCB人Fab-HIS表达载体pMhFab10HIS中，所述表达载体含有编码人γ-1CH1-铰链结构域的DNA，所述结构域具有十个组氨酸残基的C端标记：所述组氨酸标记有助于亲和层析纯化所表达的Fab。将所得重链和轻链载体共转染至HEK293悬浮细胞中是使用293Fect in(12347-019Invi trogen)实现，且使人源化重组抗体以人IgG4P、IgG1或Fab-HIS形式表达。
使变体人源化抗体链和其组合表达且评估其效力(相对于亲本抗体)、其生物物理学特性和用于下游处理的适合性。
为了使哺乳动物细胞稳定表达人源化重组抗体，使人源化轻链V区基因与编码人C-κ恒定区的DNA序列(Km3同种异型)连接，以产生相邻的轻链基因。使人源化重链基因与编码人γ-4P重链恒定区或人γ-1重链恒定区(G1m17，1个同种异型)的DNA连接，以产生相邻的重链基因。将重链和轻链基因克隆入哺乳动物表达载体中。
序列表
<110> UCB BIOPHARMA sprl
<120> TAU结合抗体
<130> PF0031-WO-PCT
<160> 65
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L1
<400> 1
Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L2
<400> 2
Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是A或G
<400> 3
Gln Gln Xaa Tyr Thr Arg Thr Asp Ile Asp Asn Thr
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 4
Gly Ile Asp Leu Ser Thr Trp Arg Met Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 5
Ile Ile Gly Thr Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是A, Q, N, D或S
<400> 6
Leu Gly Ala Asn Asn Xaa Gly Tyr Pro Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 7
<211> 110
<212> PRT
<213> 兔
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (91)..(91)
<223> Xaa可以是A或G
<400> 7
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Tyr Thr Arg Thr Asp
85 90 95
Ile Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
100 105 110
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 兔
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (100)..(100)
<223> Xaa可以是A, Q, N, D或S
<400> 8
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Thr Trp Arg
20 25 30
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Gly Thr Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Val Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Gly
85 90 95
Ala Asn Asn Xaa Gly Tyr Pro Leu Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源化
<400> 9
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Arg Thr Asp
85 90 95
Ile Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源化
<400> 10
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Thr Trp
20 25 30
Arg Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Thr Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Lys Asp Ser Thr Gln Val Phe Leu Lys Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Leu
85 90 95
Gly Ala Asn Asn Asn Gly Tyr Pro Leu Asp Leu Trp Gly Ala Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Arg Thr Asp
85 90 95
Ile Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 12
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Thr Arg Thr Asp
85 90 95
Ile Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 13
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (91)..(91)
<223> Xaa可以是A或G
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Tyr Thr Arg Thr Asp
85 90 95
Ile Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 14
Glu Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Thr Trp
20 25 30
Arg Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Thr Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Gly Ala Asn Asn Gln Gly Tyr Pro Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 15
Glu Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Thr Trp
20 25 30
Arg Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Thr Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Gly Ala Asn Asn Ala Gly Tyr Pro Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (103)..(103)
<223> Xaa可以是 A, Q, N, D或S
<400> 16
Glu Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Thr Trp
20 25 30
Arg Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Thr Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Gly Ala Asn Asn Xaa Gly Tyr Pro Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Arg Thr Asp
85 90 95
Ile Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 18
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Thr Arg Thr Asp
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Ile Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 19
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (91)..(91)
<223> Xaa可以是A或G
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Tyr Thr Arg Thr Asp
85 90 95
Ile Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
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Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
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Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
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Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
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Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 20
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 20
Glu Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Thr Trp
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Arg Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ile Ile Gly Thr Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
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Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Leu Gly Ala Asn Asn Gln Gly Tyr Pro Leu Asp Leu Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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<210> 21
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 21
Glu Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Thr Trp
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Arg Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Thr Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
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435 440 445
<210> 22
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (103)..(103)
<223> Xaa可以是 A, Q, N, D或S
<400> 22
Glu Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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435 440 445
<210> 23
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 23
Glu Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Thr Trp
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Arg Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ile Ile Gly Thr Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
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Arg Leu Gly Ala Asn Asn Gln Gly Tyr Pro Leu Asp Leu Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
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420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
<210> 24
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 24
Glu Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Thr Trp
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305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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435 440 445
Gly Lys
450
<210> 25
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (103)..(103)
<223> Xaa可以是A, Q, N, D或S
<400> 25
Glu Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Thr Trp
20 25 30
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115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
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355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 26
<211> 330
<212> DNA
<213> 兔
<400> 26
gatgttgtga tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtca gagcgttagt agttacttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct gatctatgct gcatcctatc tggcatccgg ggtcccatca 180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgatgctg ccacttatta ctgtcaacag ggttatacta ggactgatat tgataatact 300
ttcggcggag ggaccaaggt ggtggtcgaa 330
<210> 27
<211> 351
<212> DNA
<213> 兔
<400> 27
cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60
tgcacagtct ctggaatcga cctcagtact tggagaatga actgggtccg ccaggctcca 120
gggaaggggc tggaatggat cggaatcatt ggtactggtg gtagaacata ctacgcgaac 180
tgggcaaaag gccgattcac catctccaaa acctcgacca cggtggatct gaaggtcacc 240
agtccgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gattgggtgc taataataat 300
ggttatcctt tggacttgtg gggcccgggg accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 28
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源化
<400> 28
gatgtcgtga tgactcagtc acccgcaagc ctggctgtgt cgctgggaca gcgggctact 60
atctcgtgcc aagcgtccca gtctgtctcc tcgtacttgg cctggtatca gcagaagcca 120
ggacagccgc cgaaactcct catctacgcc gcctcatacc ttgcgtccgg agtgccttcg 180
agattcaaag gaagcggaag cggcactgag tttaccctga acatccaccc ggtggaagaa 240
gaggacgcag ccacgtacta ctgtcaacaa gggtacaccc gcaccgatat tgacaatacc 300
ttcggtggcg ggactaagct ggaaatcaag 330
<210> 29
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源化
<400> 29
caagtgcagc tgaaagaatc aggaccggga ctggtggcac caagccagtc cctgtcgatc 60
acctgtactg tgtccggaat cgacctctcc acctggcgca tgaattgggt ccggcagcct 120
cccggaaagg gcctcgaatg gattggcatc atcggtactg ggggcagaac ttactacgcc 180
aattgggcga aggggcgctt ctcaatctcg aaagactcga cccaagtgtt cttgaagatg 240
aacagccttc agaccgagga taccgctacc tacttttgcg cgaggctggg agccaacaac 300
aacggttacc cgctcgatct gtggggagcc ggaacgactg tgactgtctc gagc 354
<210> 30
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 30
gatatccaaa tgacccagtc cccatcctcc ctgtccgctt ctgtcggtga ccgcgtgacc 60
attacttgtc aagccagcca gtcggtgtcc tcatacctcg cctggtatca gcagaagccg 120
ggaaaggcgc ccaaactttt gatctacgcc gcctcgtacc tggcatccgg cgtgccgtca 180
agattcagcg ggtcgggctc cggaactgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagcct 240
gaggactttg ccacttacta ctgccagcag ggatacaccc ggaccgatat tgacaacacc 300
ttcggcgggg gaactaaggt cgaaatcaag 330
<210> 31
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 31
gatatccaaa tgacccagtc cccatcctcc ctgtccgctt ctgtcggtga ccgcgtgacc 60
attacttgtc aagccagcca gtcggtgtcc tcatacctcg cctggtatca gcagaagccg 120
ggaaaggcgc ccaaactttt gatctacgcc gcctcgtacc tggcatccgg cgtgccgtca 180
agattcagcg ggtcgggctc cggaactgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagcct 240
gaggactttg ccacttacta ctgccagcag gcctacaccc ggaccgatat tgacaacacc 300
ttcggcgggg gaactaaggt cgaaatcaag 330
<210> 32
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 32
gagctccaac tgcaagaatc cggccctggt ctggtcaagc cctccgaaac cctgagcctc 60
acctgtactg tgtccgggat cgacttgagc acctggagga tgaactggat tcgccagcca 120
ccgggaaagg gactggagtg gatcggcatt atcggtactg ggggacggac ctactacgcc 180
aattgggcaa agggcagagt gacgatttca aaggacacct cgaagaacca ggtgtccctg 240
aaactgtcct ccgtgactgc ggctgacacc gccgtgtact attgcgcccg gctgggagcc 300
aacaaccagg gctacccgct ggatctttgg ggacagggaa ccctcgtgac tgtctcgagt 360
<210> 33
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 33
gagctccaac tgcaagaatc cggccctggt ctggtcaagc cctccgaaac cctgagcctc 60
acctgtactg tgtccgggat cgacttgagc acctggagga tgaactggat tcgccagcca 120
ccgggaaagg gactggagtg gatcggcatt atcggtactg ggggacggac ctactacgcc 180
aattgggcaa agggcagagt gacgatttca aaggacacct cgaagaacca ggtgtccctg 240
aaactgtcct ccgtgactgc ggctgacacc gccgtgtact attgcgcccg gctgggagcc 300
aacaacgccg gctacccgct ggatctttgg ggacagggaa ccctcgtgac tgtctcgagt 360
<210> 34
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 34
gatatccaaa tgacccagtc cccatcctcc ctgtccgctt ctgtcggtga ccgcgtgacc 60
attacttgtc aagccagcca gtcggtgtcc tcatacctcg cctggtatca gcagaagccg 120
ggaaaggcgc ccaaactttt gatctacgcc gcctcgtacc tggcatccgg cgtgccgtca 180
agattcagcg ggtcgggctc cggaactgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagcct 240
gaggactttg ccacttacta ctgccagcag ggatacaccc ggaccgatat tgacaacacc 300
ttcggcgggg gaactaaggt cgaaatcaag cggaccgtgg ccgctccctc cgtgttcatc 360
ttcccaccct ccgacgagca gcttaagtcc ggcaccgcct ccgtcgtgtg cctgctgaac 420
aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc 480
aactcccagg aatccgtcac cgagcaggac tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc 540
accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc 600
caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag tccttcaacc ggggcgagtg c 651
<210> 35
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 35
gatatccaaa tgacccagtc cccatcctcc ctgtccgctt ctgtcggtga ccgcgtgacc 60
attacttgtc aagccagcca gtcggtgtcc tcatacctcg cctggtatca gcagaagccg 120
ggaaaggcgc ccaaactttt gatctacgcc gcctcgtacc tggcatccgg cgtgccgtca 180
agattcagcg ggtcgggctc cggaactgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagcct 240
gaggactttg ccacttacta ctgccagcag gcctacaccc ggaccgatat tgacaacacc 300
ttcggcgggg gaactaaggt cgaaatcaag cgtacggtag cggccccatc tgtcttcatc 360
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651
<210> 36
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 36
gagctccaac tgcaagaatc cggccctggt ctggtcaagc cctccgaaac cctgagcctc 60
acctgtactg tgtccgggat cgacttgagc acctggagga tgaactggat tcgccagcca 120
ccgggaaagg gactggagtg gatcggcatt atcggtactg ggggacggac ctactacgcc 180
aattgggcaa agggcagagt gacgatttca aaggacacct cgaagaacca ggtgtccctg 240
aaactgtcct ccgtgactgc ggctgacacc gccgtgtact attgcgcccg gctgggagcc 300
aacaaccagg gctacccgct ggatctttgg ggacagggaa ccctcgtgac tgtctcgagt 360
gcctccacca agggcccctc cgtgttccct ctggcccctt gctcccggtc cacctccgag 420
tctaccgccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 540
ggcctgtact ccctgtcctc cgtcgtgacc gtgccctcct ccagcctggg caccaagacc 600
tacacctgta acgtggacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660
aagtacggcc ctccctgccc cccctgccct gcccctgaat ttctgggcgg accttccgtg 720
ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 780
tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaagat cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac 840
ggcgtggaag tgcacaatgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa ctccacctac 900
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960
tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgccctcc agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1020
ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccta gccaggaaga gatgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgacctg tctggtcaag ggcttctacc cctccgacat tgccgtggaa 1140
tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200
gacggctcct tcttcctgta ctctcggctg accgtggaca agtcccggtg gcaggaaggc 1260
aacgtcttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320
ctgtccctga gcctgggcaa g 1341
<210> 37
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 37
gagctccaac tgcaagaatc cggccctggt ctggtcaagc cctccgaaac cctgagcctc 60
acctgtactg tgtccgggat cgacttgagc acctggagga tgaactggat tcgccagcca 120
ccgggaaagg gactggagtg gatcggcatt atcggtactg ggggacggac ctactacgcc 180
aattgggcaa agggcagagt gacgatttca aaggacacct cgaagaacca ggtgtccctg 240
aaactgtcct ccgtgactgc ggctgacacc gccgtgtact attgcgcccg gctgggagcc 300
aacaacgccg gctacccgct ggatctttgg ggacagggaa ccctcgtgac tgtctcgagt 360
gcctccacca agggcccctc cgtgttccct ctggcccctt gctcccggtc cacctccgag 420
tctaccgccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 540
ggcctgtact ccctgtcctc cgtcgtgacc gtgccctcct ccagcctggg caccaagacc 600
tacacctgta acgtggacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660
aagtacggcc ctccctgccc cccctgccct gcccctgaat ttctgggcgg accttccgtg 720
ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 780
tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaagat cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac 840
ggcgtggaag tgcacaatgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa ctccacctac 900
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960
tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgccctcc agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1020
ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccta gccaggaaga gatgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgacctg tctggtcaag ggcttctacc cctccgacat tgccgtggaa 1140
tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200
gacggctcct tcttcctgta ctctcggctg accgtggaca agtcccggtg gcaggaaggc 1260
aacgtcttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320
ctgtccctga gcctgggcaa g 1341
<210> 38
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 38
gagctccaac tgcaagaatc cggccctggt ctggtcaagc cctccgaaac cctgagcctc 60
acctgtactg tgtccgggat cgacttgagc acctggagga tgaactggat tcgccagcca 120
ccgggaaagg gactggagtg gatcggcatt atcggtactg ggggacggac ctactacgcc 180
aattgggcaa agggcagagt gacgatttca aaggacacct cgaagaacca ggtgtccctg 240
aaactgtcct ccgtgactgc ggctgacacc gccgtgtact attgcgcccg gctgggagcc 300
aacaaccagg gctacccgct ggatctttgg ggacagggaa ccctcgtgac tgtctcgagt 360
gcctccacca agggcccctc cgtgttcccg ctcgctccat catcgaagtc taccagcgga 420
ggcactgcgg ctctcggttg cctcgtgaag gactacttcc cggagccggt gaccgtgtcg 480
tggaacagcg gagccctgac cagcggggtg cacacctttc cggccgtctt gcagtcaagc 540
ggcctttact ccctgtcatc agtggtgact gtcccgtcca gctcattggg aacccaaacc 600
tacatctgca atgtgaatca caaacctagc aacaccaagg ttgacaagaa agtcgagccc 660
aaatcgtgtg acaagactca cacttgtccg ccgtgcccgg cacccgaact gctgggaggt 720
cccagcgtct ttctgttccc tccaaagccg aaagacacgc tgatgatctc ccgcaccccg 780
gaggtcactt gcgtggtcgt ggacgtgtca catgaggacc cagaggtgaa gttcaattgg 840
tacgtggatg gcgtcgaagt ccacaatgcc aaaactaagc ccagagaaga acagtacaat 900
tcgacctacc gcgtcgtgtc cgtgctcacg gtgttgcatc aggattggct gaacgggaag 960
gaatacaagt gcaaagtgtc caacaaggcg ctgccggcac cgatcgagaa aactatctcc 1020
aaagcgaagg gacagcctag ggaacctcaa gtctacacgc tgccaccatc acgggatgaa 1080
ctgactaaga atcaagtctc actgacttgt ctggtgaagg ggttttaccc tagcgacatt 1140
gccgtggagt gggaatccaa cggccagcca gagaacaact acaagactac ccctccagtg 1200
ctcgactcgg atggatcgtt cttcctttac tcgaagctca ccgtggataa gtcccggtgg 1260
cagcagggaa acgtgttctc ctgctcggtg atgcatgaag ccctccataa ccactatacc 1320
caaaagtcgc tgtccctgtc gccgggaaag 1350
<210> 39
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 39
gagctccaac tgcaagaatc cggccctggt ctggtcaagc cctccgaaac cctgagcctc 60
acctgtactg tgtccgggat cgacttgagc acctggagga tgaactggat tcgccagcca 120
ccgggaaagg gactggagtg gatcggcatt atcggtactg ggggacggac ctactacgcc 180
aattgggcaa agggcagagt gacgatttca aaggacacct cgaagaacca ggtgtccctg 240
aaactgtcct ccgtgactgc ggctgacacc gccgtgtact attgcgcccg gctgggagcc 300
aacaacgccg gctacccgct ggatctttgg ggacagggaa ccctcgtgac tgtctcgagt 360
gcctccacca agggcccctc cgtgttcccg ctcgctccat catcgaagtc taccagcgga 420
ggcactgcgg ctctcggttg cctcgtgaag gactacttcc cggagccggt gaccgtgtcg 480
tggaacagcg gagccctgac cagcggggtg cacacctttc cggccgtctt gcagtcaagc 540
ggcctttact ccctgtcatc agtggtgact gtcccgtcca gctcattggg aacccaaacc 600
tacatctgca atgtgaatca caaacctagc aacaccaagg ttgacaagaa agtcgagccc 660
aaatcgtgtg acaagactca cacttgtccg ccgtgcccgg cacccgaact gctgggaggt 720
cccagcgtct ttctgttccc tccaaagccg aaagacacgc tgatgatctc ccgcaccccg 780
gaggtcactt gcgtggtcgt ggacgtgtca catgaggacc cagaggtgaa gttcaattgg 840
tacgtggatg gcgtcgaagt ccacaatgcc aaaactaagc ccagagaaga acagtacaat 900
tcgacctacc gcgtcgtgtc cgtgctcacg gtgttgcatc aggattggct gaacgggaag 960
gaatacaagt gcaaagtgtc caacaaggcg ctgccggcac cgatcgagaa aactatctcc 1020
aaagcgaagg gacagcctag ggaacctcaa gtctacacgc tgccaccatc acgggatgaa 1080
ctgactaaga atcaagtctc actgacttgt ctggtgaagg ggttttaccc tagcgacatt 1140
gccgtggagt gggaatccaa cggccagcca gagaacaact acaagactac ccctccagtg 1200
ctcgactcgg atggatcgtt cttcctttac tcgaagctca ccgtggataa gtcccggtgg 1260
cagcagggaa acgtgttctc ctgctcggtg atgcatgaag ccctccataa ccactatacc 1320
caaaagtcgc tgtccctgtc gccgggaaag 1350
<210> 40
<211> 132
<212> PRT
<213> 兔
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(22)
<223> 信号序列
<400> 40
Met Asp Met Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser
20 25 30
Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Tyr Thr Arg Thr Asp Ile Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Val Val Val Glu
130
<210> 41
<211> 136
<212> PRT
<213> 兔
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> 信号序列
<400> 41
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser
35 40 45
Thr Trp Arg Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Ile Ile Gly Thr Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp
65 70 75 80
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
85 90 95
Lys Val Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Arg Leu Gly Ala Asn Asn Asn Gly Tyr Pro Leu Asp Leu Trp Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 42
<211> 396
<212> DNA
<213> 兔
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(66)
<223> 信号序列
<400> 42
atggacatga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgatg ttgtgatgac ccagactcca gcctccgtgg aggcagctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca agtgccaggc cagtcagagc gttagtagtt acttagcctg gtatcagcag 180
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tatgctgcat cctatctggc atccggggtc 240
ccatcacggt tcaaaggcag tggatctggg acagagttca ctctcaccat cagcgacctg 300
gagtgtgccg atgctgccac ttattactgt caacagggtt atactaggac tgatattgat 360
aatactttcg gcggagggac caaggtggtg gtcgaa 396
<210> 43
<211> 408
<212> DNA
<213> 兔
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(57)
<223> 信号序列
<400> 43
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcgctggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
acagtctctg gaatcgacct cagtacttgg agaatgaact gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatggatcgg aatcattggt actggtggta gaacatacta cgcgaactgg 240
gcaaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa ggtcaccagt 300
ccgacaaccg aggacacggc cacctatttc tgtgccagat tgggtgctaa taataatggt 360
tatcctttgg acttgtgggg cccggggacc ctggtcaccg tctcgagt 408
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 45
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 46
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 46
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 47
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人
<400> 47
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtagtagtt actactgggg ctggatccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct attatagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgca gacacggctg tgtattactg tgcgagatac 300
tttgactact ggggccaagg aaccctggtc accgtctcct ca 342
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> 兔
<400> 48
Leu Gly Ala Asn Asn Asn Gly Tyr Pro Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 49
Leu Gly Ala Asn Asn Gln Gly Tyr Pro Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 50
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 50
Leu Gly Ala Asn Asn Ala Gly Tyr Pro Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 51
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 51
Leu Gly Ala Asn Asn Asp Gly Tyr Pro Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 52
Leu Gly Ala Asn Asn Ser Gly Tyr Pro Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 53
<211> 12
<212> PRT
<213> 兔
<400> 53
Gln Gln Gly Tyr Thr Arg Thr Asp Ile Asp Asn Thr
1 5 10
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化
<400> 54
Gln Gln Ala Tyr Thr Arg Thr Asp Ile Asp Asn Thr
1 5 10
<210> 55
<211> 441
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305 310 315 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
325 330 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
370 375 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385 390 395 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
405 410 415
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
420 425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
435 440
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化和亚硝基化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 亚硝基化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> 生物素缀合位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 酰胺化
<400> 56
Tyr Ser Ser Pro Cys Ser Pro Gly Thr Pro
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 生物素缀合位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 酰胺化
<400> 57
Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Cys
1 5 10
<210> 58
<211> 217
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 58
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Arg Thr Asp
85 90 95
Ile Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn
145 150 155 160
Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His
180 185 190
Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile
195 200 205
Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 59
<211> 442
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 59
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Thr Trp
20 25 30
Arg Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Thr Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Lys Asp Ser Thr Gln Val Phe Leu Lys Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Leu
85 90 95
Gly Ala Asn Asn Asn Gly Tyr Pro Leu Asp Leu Trp Gly Ala Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
180 185 190
Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
210 215 220
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
260 265 270
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
305 310 315 320
Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
340 345 350
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe
355 360 365
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
370 375 380
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe
385 390 395 400
Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
405 410 415
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
420 425 430
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 60
<211> 651
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 60
gatgtcgtga tgactcagtc acccgcaagc ctggctgtgt cgctgggaca gcgggctact 60
atctcgtgcc aagcgtccca gtctgtctcc tcgtacttgg cctggtatca gcagaagcca 120
ggacagccgc cgaaactcct catctacgcc gcctcatacc ttgcgtccgg agtgccttcg 180
agattcaaag gaagcggaag cggcactgag tttaccctga acatccaccc ggtggaagaa 240
gaggacgcag ccacgtacta ctgtcaacaa gggtacaccc gcaccgatat tgacaatacc 300
ttcggtggcg ggactaagct ggaaatcaag cgtacggatg ctgcaccaac tgtatccatc 360
ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac 420
aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag tggaagattg atggcagtga acgacaaaat 480
ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac agcaaagaca gcacctacag catgagcagc 540
accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa cgacataaca gctatacctg tgaggccact 600
cacaagacat caacttcacc cattgtcaag agcttcaaca ggaatgagtg t 651
<210> 61
<211> 1326
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 61
caagtgcagc tgaaagaatc aggaccggga ctggtggcac caagccagtc cctgtcgatc 60
acctgtactg tgtccggaat cgacctctcc acctggcgca tgaattgggt ccggcagcct 120
cccggaaagg gcctcgaatg gattggcatc atcggtactg ggggcagaac ttactacgcc 180
aattgggcga aggggcgctt ctcaatctcg aaagactcga cccaagtgtt cttgaagatg 240
aacagccttc agaccgagga taccgctacc tacttttgcg cgaggctggg agccaacaac 300
aacggttacc cgctcgatct gtggggagcc ggaacgactg tgactgtctc gagtgccaaa 360
acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg 420
gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 480
tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 540
actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc 600
aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 660
ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 720
aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 780
atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 840
acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 900
cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 960
gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1020
ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1080
acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1140
cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc 1200
gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1260
tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1320
ggtaaa 1326
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> 生物素缀合位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> 酰胺化
<400> 62
Cys Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro
1 5 10
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 生物素缀合位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 酰胺化
<400> 63
Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Cys
1 5
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> 生物素缀合位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 酰胺化
<400> 64
Cys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser
1 5 10
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 65
Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro
1 5 10

Claims (13)

1.一种经分离的Tau结合抗体或其结合Tau的抗体片段，其中所述Tau结合抗体或其结合Tau的抗体片段包含
轻链可变区，其包含选自SEQ ID No：1的CDR1、选自SEQ ID No：2的CDR2和选自SEQ IDNo：53的CDR3；和
重链可变区，其包含选自SEQ ID No：4的CDR1、选自SEQ ID No：5的CDR2和选自SEQ IDNo：49的CDR3。
2.一种经分离的Tau结合抗体或其结合Tau的抗体片段，其中所述Tau结合抗体或其结合Tau的抗体片段包含
SEQ ID No：11所示的轻链可变区，和
SEQ ID No：14所示的重链可变区。
3.权利要求2的Tau结合抗体或其结合Tau的抗体片段，其中所述抗体或其结合Tau的抗体片段包含SEQ ID No：17的轻链和SEQ ID No：20的重链。
4.权利要求1、2或3中任一项的Tau结合抗体或其结合Tau的抗体片段，其中所述Tau结合抗体或其结合Tau的抗体片段为单克隆人源化抗体。
5.权利要求1、2或3中任一项的Tau结合抗体或其结合Tau的抗体片段，其中所述Tau结合抗体或其结合Tau的抗体片段结合人Tau的可溶形式、人Tau的配对螺旋丝(PHF)，或结合人Tau的可溶形式和人Tau的配对螺旋丝(PHF)二者。
6.一种或多种经分离的核酸分子，其编码权利要求1、2或3中任一项的Tau结合抗体或其结合Tau的抗体片段。
7.一种克隆或表达载体，其包含一种或多种权利要求6的核酸分子。
8.一种宿主细胞，其包含一种或多种权利要求6的核酸分子或一种或多种权利要求7的克隆或表达载体。
9.一种制造权利要求1、2或3中任一项的Tau结合抗体或其结合Tau的抗体片段的方法，所述方法至少包含以下步骤：
a)培养权利要求8的宿主细胞，和
b)分离所述Tau结合抗体或其结合Tau的抗体片段。
10.权利要求1、2或3中任一项的经分离的Tau结合抗体或其结合Tau的抗体片段在制备用于治疗tau蛋白病的药物中的用途。
11.权利要求10的用途，其中所述tau蛋白病为阿尔茨海默氏病或进行性核上麻痹。
12.权利要求1、2或3中任一项的经分离的Tau结合抗体或其结合Tau的抗体片段在制备用于诊断tau蛋白病的药物中的用途。
13.权利要求12的用途，其中所述tau蛋白病为阿尔茨海默氏病或进行性核上麻痹。
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