CN107810060A - 流体检测盒 - Google Patents

Abstract

一种用于检测核酸或执行其它化验的一次性盒子。在使用过程中，盒子可以被插入基座中。盒子具有许多特征以确保设备在重力作用下的正确操作，例如排气凹穴，该排气凹穴用于当排气凹穴开封时使样品流体从一个腔室流到下一个腔室。排气凹穴具有突起部，以帮助防止被意外地重新密封。盒子还可以具有垫圈，以确保敞开的排气凹穴之间的自由空气移动。具有设置在热稳定材料上的图案化的金属电气部件的柔性电路可以直接接触腔室中的流体并且具有与排气凹穴和腔室对齐的电阻加热元件。容纳横向流动检测条的检测室可以具有位于该检测条下方的空间，该空间具有足够的容量以在一定高度处容纳进入检测室的样品流体的全部体积，该高度使得流体能够在毛细管作用下向上流动到检测条上，而不会淹没或以其它方式绕过检测条的区域。上述空间还可以包含检测颗粒。盒通道或腔室中的凹槽可以具有例如脊部或凹部等结构，以引导流体流动，以促进设置在凹槽中的冻干试剂的再水化。腔室中的偏流器可以降低样品流体的流速并增大有效流体流路长度，从而能够更精确地控制盒子中的流体流动。

Description

流体检测盒

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年4月24日提交的发明名称为“Fluid Test Cassette(流体检测盒)”的美国临时专利申请No.62/152,724以及于2016年4月14日提交的发明名称为“Fluid Test Cassette(流体检测盒)”的美国临时专利申请No.62/322,738的优先权和权益，上述美国临时专利申请的说明书和权利要求书通过引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明的实施例涉及用于检测和鉴定核酸的集成设备以及相关的方法。该设备可以全部是一次性使用的，或者可以包括一次性使用部分和可重复使用部分。

背景技术

应该注意的是，以下论述可能涉及一些出版物和参考文献。本文中对这些出版物的论述只是为了更完整地介绍科学原理的背景，而不能认为承认这些出版物是用于专利性确定目的的现有技术。

随着传染病和新发疾病、生物威胁剂、遗传病和病原体环境库的公共卫生影响和意识增强，对更多信息量大的、敏感的且明确的使用点(point-of-use)的快速化验的需求已经使得对基于聚合酶链式反应(PCR)的工具的需求增加。利用例如基于PCR的扩增等方法执行基于核酸的分子检测非常敏感、明确且信息量大。遗憾的是，目前可用的核酸检测不适于现场使用或者现场实用性受到限制，这是因为它们需要复杂且昂贵的仪器、专门的实验室材料和/或依赖用户介入的多重操作。因此，大部分用于分子检测的样品都被运送到集中的实验室，结果导致漫长的周转时间来获得所需的信息。

为了满足对快速使用点的分子检测的需求，以前的工作集中在使用一次性检测盒和相对昂贵的相关器械的产品设计上。使用外部仪器来完成流体运动、扩增温度控制和检测简化了集成分子检测所需的多重过程所固有的许多工程难题。遗憾的是，对复杂器械的依赖性为小型诊所、地方和州政府以及执法机构施加了巨大的经济障碍。此外，依赖一小部分器械进行检测可能会在需求增加期间造成不必要的延误，例如发生在疑似生物战制剂释放或新兴流行病期间的情况。实际上，器械和一次性试剂盒模型在急需紧急应变能力和更大的生产量时会显示出潜在的重大瓶颈。此外，仪器依赖性尤其使得将检测设备分配到部署点的过程复杂化，其中，物流条件阻止了笨重的相关设备的运输，或者缺少基础设施(例如可靠的电源)。

重力已被描述为现有的微流体设备中使得流体运动的手段。然而，典型的设备不允许对这种流体运动或者两种以上的流体的混合进行编程或电子控制。另外，一些设备利用由下降的惰性或预包装流体产生的压降来引起轻微的真空，并且当竖直地取向时将反应物吸入处理室中，这样增大了储存和运输复杂性以确保预包装流体的稳定性。教导以多个不连续步骤移动流体的现有设备需要腔室之间的易碎密封件或阀，这使操作和制造复杂化。这些设备未教导为每个腔室使用分开的、位于远端的排气口。

典型的微流体设备使用比标准实验室程序中采用的更小的反应体积。通常在检测和研究实验室中使用5至100微升的反应体积进行PCR或其它核酸扩增反应(例如环介导的扩增(LAMP)、基于核酸的序列扩增(NASBA))以及其它等温和热循环方法。这些反应体积容纳足够的检测样品体积，以确保在稀释样品中检测到稀释的化验靶标。相对于在传统的实验室分子检测中采用的系统而言，减小了反应体积的微流体系统必然也会使可以加入到反应中的样品的体积减小。较小的反应体积的结果是，容量的减少以容纳如下样品体积：该样品体积足以确保稀释样品中或化验靶标稀少的地方的靶标的可检测量的存在。

发明内容

本发明是一种用于检测靶核酸的盒子，所述盒子包括多个腔室、连接到所述腔室的多个排气凹穴、以及用于密封所述排气凹穴中的一个或多个排气凹穴的热不稳定材料，其中，至少一个所述排气凹穴包括突起部。所述突起部优选地包括凹坑或凹凸部，并且优选地充分地防止熔化的热不稳定材料附接到邻近所述热不稳定材料设置的热稳定材料上，以免在所述热不稳定材料破裂之后所述排气凹穴被重新密封。

本发明还是一种用于检测靶核酸的盒子，所述盒子包括：多个腔室；连接到所述腔室的多个排气凹穴；用于密封所述排气凹穴中的一个或多个排气凹穴的热不稳定材料；热稳定材料；以及设置在所述热不稳定材料和所述热稳定材料之间的垫圈，所述垫圈包括开口，所述开口包围所述多个排气凹穴。所述垫圈优选地足够厚，以提供足够的空气体积以平衡压力并且确保敞开的排气凹穴之间的自由空气移动。所述盒子优选地包括柔性电路，所述柔性电路包括设置在所述热稳定材料上的图案化的金属电气部件。所述垫圈优选地包括第二开口或者尺寸受到限制，使得所述柔性电路直接接触所述腔室中的至少一个腔室中的流体。所述电气部件优选地包括电阻加热元件或导电迹线。所述电阻加热元件优选地与所述排气凹穴和所述腔室对齐。所述盒子优选地包括一个或多个环境温度传感器，用以调节所述腔室中的一个或多个腔室的加热温度、加热时间和/或加热速率。

本发明还是一种用于检测靶核酸的盒子，所述盒子包括：检测室，其竖直地取向；横向流动检测条，其设置在所述检测室内并且取向成使得所述检测条的样品接收端位于所述检测条的底端；以及所述检测室内的空间，所述空间位于所述横向流动检测条的下方，用以接收包括扩增靶核酸的流体，所述空间包括足够的容量以在一定高度处容纳所述流体的全部体积，所述高度使得所述流体能够通过毛细管作用向上流动到所述检测条上，而不会淹没或者以其它方式绕过检测条的区域。所述空间优选地包括检测颗粒，例如染料聚苯乙烯微球体、胶乳、胶体金、胶体纤维素、纳米金和半导体纳米晶体。所述检测颗粒优选地包括与所述扩增靶核酸的序列互补的寡核苷酸或能够结合到所述扩增靶核酸上的配体，例如生物素、链霉亲和素、半抗原或抗体。所述检测颗粒优选地已被烘干、冻干或作为载体(例如多糖、清洁剂或蛋白质)中的检测颗粒的干燥混合物存在于内表面的至少一部分上，以促进所述检测颗粒的再悬浮。优选地在所述空间中形成所述流体的毛细管池，以改善所述检测颗粒的混合(mixing)和分散，以促进所述检测颗粒和所述扩增靶核酸的混合(comingling)。所述盒子可选地执行体积小于约200μL以及优选地小于约60μL的化验。

本发明还是一种用于检测靶核酸的盒子，所述盒子包括：一个或多个凹槽，其用于容纳至少一种冻干或烘干的试剂，所述凹槽中的至少一个凹槽包括用于引导流体的一个或多个结构，以促进所述至少一种烘干或冻干的试剂的再水化，所述凹槽设置在连接到所述腔室的一个或多个通道中或者设置在所述通道中的一个或多个通道中。所述结构优选地包括脊部、凹部、凹坑或其组合。

本发明还是一种用于检测靶核酸的盒子，所述盒子包括至少一个腔室，所述腔室包括如下特征，所述特征用于防止竖直地进入所述腔室的顶部的流体直接流入所述腔室的出口。所述特征优选地使所述流体偏转到所述腔室的与所述出口相对的一侧。所形成的所述流体的流路优选地包括水平分量，从而使所述流路的有效长度充分地增大，并使所述流体的流速充分地减小，以限制离开所述出口的流体的量。所述特征优选地在所述腔室内产生流体的漩涡，由此促进所述流体中的试剂的混合。所述特征优选地呈三角形或梯形。所述出口可选地是渐缩形的。位于所述出口的下游的通道可选地包括转弯部，用以增大所述通道的有效长度。所述特征靠近所述腔室的底部，或位于所述腔室的底部，或靠近所述腔室的中部。

本发明还是一种对流经用于检测靶核酸的盒子中的腔室的流体的竖直流动进行控制的方法，所述方法包括：使进入所述腔室的顶部的流体的流动偏转，由此防止所述流体直接流入所述腔室的出口。所述方法优选地包括：降低所述流体的流速，以使所述流体停止之前所述流体沿着连接到所述出口的通道向下流动的距离减小。所述方法优选地包括：将流入所述腔室的流体流分成第一流体流和第二流体流，所述第一流体流接触所述腔室的壁并且被向上引导，所述第二流体流进入所述出口。所述第一流体流优选地在所述腔室中打旋，由此促进所述流体中的试剂的混合。所述第二流体优选地形成弯月面(meniscus)并且经由连接到所述出口的通道而前进，所述弯月面使所述流体的下游的通道中的封闭空气空间中的压力增大，直到所述压力使所述通道中的流体的流动停止。所述出口可选地呈渐缩形，由此增大所述出口的入口处的可压缩空气体积。所述方法可选地包括：在连接到所述出口的通道中设置转弯部，由此增大所述通道的有效路径长度并减小所述通道中的流体的流速。

本发明的目的、优点和新颖的特征以及进一步的应用范围将会在下面的详细描述中结合附图被部分地阐述，对本领域技术人员而言通过阅览下文将会部分地变得显而易见，或者可以通过实践本发明而被领会到。本发明的目的和优点可以通过随附的权利要求中特别地指出的手段和组合来实现和获得。

附图说明

附图并入说明书中并构成说明书的一部分，示出了本发明的实施例，并且与说明书一起用于解释本发明的原理。附图仅用于说明本发明的某些实施例的目的，而不应被解释为限制本发明。在附图中：

图1A是示出本发明的检测盒的实施例的图。

图1B是示出膨胀室的滑动密封件、样品端口、样品杯和内部区域的检测盒的一个实施例的分解图。

图2A是本发明的检测盒的一个实施例中的流体网络的示意图。

图2B至图2C是示出如下过程的示意图：在气密密封的检测盒的情况下，分别在排气口打开之前和排气口打开之后如何利用热触发的排气口来连通到膨胀室，以完成流体流动控制。

图2D是一次性检测盒的一个实施例的图，示出了包括电阻加热元件和温度传感器的印刷电路组件(PCA)的安置情况。

图2E是包括图2A中描述的特征的注塑成型塑料检测盒的照片。

图3A是膨胀室的实施例的操作原理的示意图。

图3B是在检测盒内的气体膨胀之前的基于活塞的膨胀室的横截面。

图3C是在检测盒内的气体膨胀之后的基于活塞的膨胀室的横截面。

图4A是形成膨胀室的方法的示意图，其中，使用可膨胀的气囊来提供膨胀的内部体积。

图4B是在检测盒内的气体膨胀之前的基于气囊的膨胀室的横截面。

图4C是在检测盒内的气体膨胀之后的基于气囊的膨胀室的横截面。

图5A是形成膨胀室的方法的示意图，其中，使用可膨胀的波纹膜(bellows)来提供膨胀的内部体积。

图5B是在检测盒内的气体膨胀之前的基于波纹膜的膨胀室的横截面。

图5C是在检测盒内的气体膨胀之后的基于波纹膜的膨胀室的横截面。

图6A示出半渗透性屏障、膜或材料的用法，该半渗透性屏障、膜或材料允许气体自由地通过，而诸如细菌、病毒等颗粒或者诸如DNA或RNA等大分子被保留在设备内。

图6B是半渗透性屏障的横截面，该屏障被用于代替膨胀室，以使内部压力与环境压力相等，或者使内部压力减小。

图7是检测盒设计方案的分解图，其中，由一层双向取向的聚苯乙烯(BOPS)膜之间的垫片形成膨胀室。

图8A是柔性电路的实施例的图，该柔性电路包括用于两个流体室、检测条室和三个排气口的电阻加热元件以及电接触垫。

图8B是柔性电路的实施例，该柔性电路包括用于两个流体室、检测条室和三个排气口的电阻加热元件以及为该电阻加热元件供电的电接触垫。

图8C是检测盒的实施例的分解图。

图8D是装配好的图8C的检测盒的视图。

图9描述了来自设备的横向流动条，其中，在横向流动条的样品接收端具有毛细管池或者不具有毛细管池。当存在毛细管池时，可以观测到整个横向流动条上的检测颗粒的更均匀的分布以及更均匀的信号。

图10是示出样品分割的分层方法的示意图。

图11是用于多路复用和样品细分的多重通道流体网络的示图，图中示出了用于每个检测的流体流路。附加的流路或通道可以合并到网络中，以使能够在单个一次性检测盒中同时执行的并行检测的数量进一步增加。

图12是本发明的检测盒的实施例中的流体网络的示意图，其中，样本在经由样本端口而被引入样品杯中之后被分割，以便能够在相同的输入样本上进行并行的、独立的检测。来自样品杯的分叉流路允许将样品溶液分配到两个检测盒的不同的流体通道或路径中，以允许在分割的样品上并行地进行同步检测。

图13A是装配好的样品制备子系统的图，示出了内部部件的布局。

图13B是样品制备子系统的分解图，示出了构造成与检测盒集成的核酸净化装置的部件。

图14是贯穿样品制备子系统的横截面图，示出了在处理样品的过程中发生的部件移动。

图15是样品制备子系统的分解图，该样品制备子系统具有气密密封部件、注塑成型的流体子系统、相应的盒背和PCA。

图16是具有集成的样品制备子系统的检测盒的实施例的照片。

图17A是示出具有气密密封部件和注塑成型的流体子系统设计方案的样品制备子系统的分解图。

图17B是检测盒的实施例的图，该检测盒具有被示出为与PCA连接的集成的样品制备子系统。

图17C是描述流路、连接的电子器件和样品制备部件的检测盒的实施例的剖视图。

图18A是本发明的对接单元的实施例的图，其中，盖子被示出为处于打开位置，并且检测盒被插入对接单元中。

图18B是对接单元的图，其中，盖子被示出处于关闭位置。

图19是对接单元的一个实施例的照片，其中，盖子被示出处于打开位置，并且检测盒被插入对接单元中。LCD显示器显示探测到了流感A/B检测盒已插入。

图20示出了本发明的盒密封机构的实施例。

图21A是在密封件处于打开位置的情况下插有检测盒的对接单元内的盒密封件传感器的安置情况的图。

图21B是在密封件处于打开位置的情况下插有检测盒的对接单元内的盒密封件传感器的安置情况的剖视图。

图21C是在密封件处于关闭位置的情况下插有检测盒的对接单元内的盒密封件传感器的安置情况的图。

图21D是在密封件处于关闭位置的情况下插有检测盒的对接单元内的盒密封件传感器的安置情况的剖视图。

图22是盒密封机构的实施例的图，其中，采用驱动齿轮来驱使用旋转阀的密封件关闭。

图23A是示出检测盒的实施例的图，其中，该盖子是包括O形密封环和用作膨胀室的空的空气体积的铰链盖子。在该图中，盖子处于打开位置。

图23B是示出盖子处于关闭位置的图，其中，O形环与样品端口的边缘形成气密密封。

图24A是形成检测盒接收子组件的对接单元的加热器板和检测盒保持器部件的分解图。

图24B是对接单元的检测盒接收子组件的实施例的图。

图25是处于接合位置和松开位置的检测盒保持器和加热器板安装系统的滑动视图。

图26是描绘对接单元的一个实施例中的红外线温度传感器的安置情况的图，该红外线温度传感器用于监测第一被加热流体室和第二被加热流体室的温度。

图27A是示出对接单元的实施例中的光学传感器的安置情况的图，该光学传感器允许读取位于检测盒的底部附近的条形码。

图27B是图27A的细节。

图28A和图28B分别是双加热器板构造的分解图和装配图，其中，检测盒被夹在两个加热器板装配件之间。

图29A和图29B分别是对接单元的实施例的实体图和透明图，其中，枢转门用于接收检测盒。枢转门关闭使得检测盒的后部接触安装在对接单元内的加热器板。

图30A和图30B分别是对接单元的内部部件的正剖视图和侧剖视图，该对接单元包括用于开动样品制备的伺服电机以及用于检测结果收集的光学系统。

图31A和图31B是用于包含检测阅读器的对接单元的实施例的光学子系统的正视图和侧视图照片。

图32A和图32B是对接单元的实施例的照片，其中，枢转式检测盒接收门分别处于打开位置和关闭位置。

图33示出了用于本发明的对接单元的可重复使用的子组件。

图34示出了本文描述的实例1中获得的检测结果。

图35示出了本文描述的实例2中获得的检测结果。

图36示出了本文描述的实例3中获得的检测结果。

图37A是包括三个腔室的检测盒的透视图。

图37B是图37A的检测盒的分解图。

图38是示出流体特征的图37A的检测盒的透明图。

图39示出了本发明的腔室的实施例，该腔室包括三角形突出流动特征和渐缩形出口。

图40示出了本发明的腔室的实施例，该腔室包括三角形突出流动特征和平行出口。

图41示出了本发明的腔室的实施例，该腔室包括梯形突出流动特征和平行出口。

图42示出了本发明的腔室的实施例，该腔室包括堆叠的三角形流动特征和平行出口。

图43示出了本发明的腔室的实施例，该腔室包括约在腔室的中间处的突出流动特征。

图44示出了包括用于引导流体流动的内部特征的试剂凹槽。

图45示出了本发明的排气凹穴的实施例，该排气凹穴包括凹坑结构。

具体实施例

本发明的实施例是用于检测靶核酸的、可密封的一次性平台，该一次性平台优选地包括：样品室，其用于接收包括靶核酸的样品；扩增室，其经由第一通道连接到样品室，并经由第二通道连接到第一排气凹穴；标记室，其经由第三通道连接到扩增室，并经由第四通道连接到第二排气凹穴；检测子系统，其经由第五通道连接到标记室，并经由第六通道连接到第三排气凹穴；多个电阻加热元件；以及一个或多个温度测量设备，其中，排气凹穴分别被位于一个或多个电阻加热元件附近的处于适当形态的热不稳定材料(例如薄膜、膜或塑料片)密封，而不与空气室连通。一次性平台可选地包括密封件，用以在检测化验启动之前密封所述平台。一次性平台优选地包括沿着腔室之间的通道的凹槽，以容纳被整合到一次性平台中的烘干或冻干的试剂。这些凹槽可选地包括位于面向试剂的一个或多个表面上的结构，以便(优选地利用毛细管作用或表面张力效应)辅助将流体引导到封闭的干燥试剂中，以促进烘干试剂的再水化。这些特征可以包括脊部(例如图44中的脊部7001)、凹部、凹坑或其它结构，以便在流体穿过凹槽时将流体引导到凹槽的内部空间中，或者以其它方式在流体流动期间辅助流体流动到凹槽的内部空间中。可替代地，凹槽可以直接位于一个(或多个)腔室内。

一次性平台可选地还包括样品制备台，样品制备台包括输出端，该输出端与样品室的输入端直接流体连接。扩增室的大致平坦表面的尺寸优选地和电阻加热元件的大致平坦表面(其与扩增室热接触)的尺寸大致相同。扩增室可选地容纳扩增溶液，并且从样品室到扩增室的通道中的凹槽可选地包括冻干的扩增试剂混合物，并且在从扩增室到标记室的通道中优选地存在凹槽，该凹槽包含烘干或冻干检测颗粒。扩增室和标记室优选地能够使用电阻加热元件加热。检测子系统优选地包括横向流动条，横向流动条包括检测颗粒。腔室、通道和排气凹穴优选地位于流体装配层上，并且设备的电子元件优选地位于包括印刷电路板的单独的层上，该单独的层结合到流体装配层或者通过对接单元安置成与流体装配层接触。检测子系统优选地位于流体装配层上或者可选地位于第二流体装配层上。至少一个腔室的体积优选地在约1微升和约150微升之间。一次性平台优选地还包括：连接器，其用于将一次性平台与对接单元对接；或者对接单元，其优选地将一次性平台保持在竖直或倾斜方向并且可选地提供电触头、部件和/或电源。

本发明的一个实施例是用于检测一种或多种靶核酸的方法，该方法优选地包括：将包含靶核酸的样品分配在一次性平台的样品室中；将一次性平台竖直地或倾斜地取向；将连接扩到增室的第一排气凹穴打开至封闭空气体积，从而使样品流入扩增室，使样品与位于样品室和扩增室之间的通道的凹槽中的预先冻干的扩增试剂混合物反应，使扩增室中的靶核酸扩增，打开连接到标记室的第二排气凹穴至封闭空气体积，从而使扩增靶核酸流入标记室中，使用在扩增室标记室之间的通道中的凹槽中的检测颗粒来标记扩增靶核酸，打开连接到检测子系统的第三排气凹穴至封闭空气体积，从而使标记的靶核酸流入检测子系统中，并检测扩增靶核酸。扩增步骤优选地包括：使用位于一次性平台内的扩增室附近的电阻加热元件来扩增靶核酸。该方法优选地还包括被动地冷却扩增室。该方法优选地还包括：在标记步骤期间，使用位于一次性平台内的标记室附近的电阻加热元件来加热标记室。该方法优选地还包括：通过使用不是外部器械的对接单元来控制一次性平台的操作。

本发明的实施例包括一次性平台，该一次性平台集成了执行核酸分子化验的所有必需步骤的不依赖外部器械的手段，并利用提供更多的信息量大且敏感的分析的新一代核酸检测手段来补充当前的免疫-横向流动快速化验。本发明的实施例促进了快速核酸检测在小诊所和严峻或偏远地区的更广泛的使用，在这些地方，传染病、生物威胁剂、农业和环境检测最有可能产生最大的影响。本发明的某些实施例是完全独立的和一次性的，这使得在需求增长的时候能够通过允许进行并行检测来实现“浪涌能力”，而没有外部器械强加的瓶颈。在那些优选地将低成本的一次性检测盒与廉价的电池供电的或交流适配器供电的对接单元相结合的应用领域中，使用简单对接单元的本发明的实施例通过将可重复使用的组件安置在可重复使用但廉价的基底中来进一步降低检测成本。本文公开的平台技术提供了如下所述的灵活的平台技术：该平台技术具有与基于实验室核酸扩增的方法类似的灵敏度、最小的用户介入和培训要求、由扩增和检测二者赋予的序列特异性、多重容量、稳定的试剂、与低成本大规模制造的兼容性，以允许在严峻的环境中使用的电池或太阳能供电操作，以及在不需要设备重新设计的情况下允许并入额外的或替代的生物标志物。

本发明的实施例提供了用于低成本的使用点的核酸检测和化验的系统和方法，该系统和方法适于在远离通常执行检测的实验室环境的位置处执行分析。有利的是，核酸扩增反应体积可以处于传统实验室检测中常用的相同体积范围(例如5-150μL)。因此，本发明实施例中所进行的反应可以直接与公认的实验室化验方法相当，并允许容纳通常在传统分子检测中使用的相同样品体积。此外，核酸的扩增优选地在气密密封的检测盒中进行，该检测盒优选地在扩增启动之前永久密封。在密封的系统中保留扩增的核酸可以防止扩增产物对检测环境和周围区域的污染，从而降低后续检测将产生假阳性结果的可能性。将密封的系统集成到检测盒中，使得能够在对接单元中使用对应的密封件接合系统来在化验启动时强制形成密封。在本发明的实施例中，采用齿条和小齿轮机构将检测盒集成密封机构滑动到适当位置，以确保密封件在扩增之前关闭。安置在对接单元中的传感器感测检测盒，以确认在启动检测反应之前已经形成了密封。

本发明的实施例可以使用注塑成型处理和超声波焊接来制造，以实现高产量制造和低成本的一次性部件。在一些实施例中，在流体部件中提供一个或多个凹槽，以便各自容纳干燥的试剂球体。在最后的装配期间，当可以使用超声波焊接而球体不会由于焊接期间引入系统中的任何能量而破裂时，凹槽使得冻干的或者以其它形式干燥的材料的使用可以存在于流体部件中。

本发明的实施方式可以用于检测样品中的靶核酸序列的存在。靶序列可以是例如染色体DNA或染色体外DNA(例如线粒体DNA、叶绿体DNA、质粒DNA等)等DNA或RNA(例如rRNA、mRNA、小RNA或病毒RNA)。类似地，本发明的实施例可以用于鉴别包括单核苷酸多态性、缺失、插入、染色体倒位和序列重复在内的核酸多态性。此外，本发明的实施例可以用于检测基因调节事件，例如在转录水平上的基因上调和下调。因此，本发明的实施例可以用于如下应用：1)在农业、临床、食品、环境和兽医样品中检测和鉴别病原体核酸；2)检测疾病的遗传生物标志物；以及3)通过检测疾病或代谢状态的相关生物标志物(例如响应于病原体、毒素、其它病原体、环境刺激或代谢状态的存在而发生的基因调节事件(mRNA上调或下调，或在疾病或代谢状态期间产生或抑制的小RNA或其它核酸分子的诱导))来诊断疾病或代谢状态的存在。

本发明的实施例包括在加入核酸样品时的靶核酸样品制备、扩增和检测的手段，包括流体控制、温度控制和试剂混合的所有方面。在本发明的一些实施例中，该设备提供使用例如电池的便携式电源执行核酸检测的手段，并且是完全一次性的。在本发明的其它实施例中，一次性核酸检测盒与简单的可重复使用的电子元件一起工作，所述电子元件可以执行实验室仪器的所有功能，例如通常核酸检测所需的外部器械，而不需要使用这种实验室仪器或外部器械。

本发明的实施例提供了一种核酸扩增和检测设备，该设备包括但不限于壳体、电路板和流体或微流体部件。在某些实施例中，电路板可能包含各种表面安装的部件，例如电阻、热敏电阻、发光二极管(LED)、光电二极管和微控制器。在某些实施例中，电路板可以包括柔性电路板，该柔性电路板包括聚酰亚胺等热稳定基板。在一些实施例中，柔性电路可以包括沉积在或结合到热稳定基板上的铜或其它导电涂层或层。这些涂层可以被蚀刻或以其它方式被图案化以便包括用于生化反应温度控制的电阻加热元件和/或导电迹线以容纳这样的加热器和/或表面安装组件，例如电阻器、热敏电阻器、发光二极管(LED)、光电二极管和微控制器。流体或微流体部件是接收、容纳和移动含水样品的设备部分并且可以由各种塑料和各种制造技术(包括超声波焊接、粘合、熔合或层压、激光切割、水射流切割和/或注射成型)制成。流体部件和电路板组件可逆地或不可逆地保持在一起，并且它们的热耦合可以通过导热材料或化合物来增强。壳体优选地部分地用作装饰品和保护性护套，隐藏微流体和电路板层的易碎组件，并且还可以用于促进样品输入、缓冲液释放、核酸洗脱、密封形成以及设备功能所需的流程的启动。例如，壳体可以包括样品输入端口、用于形成或接合密封件的机械系统、按钮或类似的机械特征以允许用户激活、缓冲液释放、样品流动启动、核酸洗脱以及电气部件和流体部件之间的热界面或其它物理界面的形成。

在本发明的一些实施例中，流体或微流体部件包括受控流体连通的一系列腔室，其中，腔室可选地受温度控制，从而使腔室中容纳的流体经受可编程的温度方案。在本发明的一些实施例中，流体或微流体部件包括五个腔室，优选地包括膨胀室、样品输入室、逆转录室、扩增室和检测室。样品输入室优选地包括：通向膨胀室的导管；样品输入孔，从中可以添加包含核酸的样品；第一凹槽，第一凹槽中可以在制造期间安置用于与输入样品混合的干燥材料；出口导管，其通向第二凹槽，第二凹槽中可以在制造期间安置烘干材料；以及通向逆转室的导管。在其它实施例中，两个或更多个腔室的功能被合并成单一室，从而能够使用更少的腔室。

第一凹槽和第二凹槽还可以包括冻干试剂，冻干试剂可以包括例如合适的缓冲剂、盐、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、寡核苷酸引物和酶(例如DNA聚合酶和逆转录酶)。这种冻干试剂优选地在核酸样品进入凹槽时溶解。在本发明的一些实施例中，第一凹槽包括用于溶解生物试剂和/或使输入样品中存在的核酸稳定的盐、化学制品和缓冲剂。在本发明的一些实施例中，输入样品在样品输入室中被加热以完成样品中存在的细胞或病毒的溶解。在本发明的一些实施例中，第二凹槽包括冻干试剂和酶(例如用于从RNA合成cDNA的逆转录酶)。在本发明的实施例中，第二凹槽与样品输入室充分地绝缘，以允许第二凹槽内的材料在加热期间保持比样品输入室的温度更低的温度。在本发明的一些实施例中，逆转录室包括导管，该导管包括第三凹槽，第三凹槽包括用于扩增核酸的冻干试剂。样品输入室、逆转录室、扩增室和检测室优选地定位成与加热器电路板上的加热器元件对准并充分地接近，以便当直接地或者通过将流体或微流体部件或检测盒插入到对接单元中而间接地安装到加热器板上时提供热传导性。类似地，加热器电路板上存在的电气部件优选地安置成与流体部件中的排气凹穴物理地接触或者接近流体部件中的排气凹穴，以便通过打开排气口来实现电子控制。加热器电路板物理布局被设计成与流体或微流体部件的元件对齐，使得用于溶解、逆转录、扩增、杂交和/或流体流动控制的加热器电路板的电阻加热元件定位成与流体部件的元件形成热界面，它们通过该热界面而相互作用。

在本发明的一些实施例中，流体或微流体部件优选地包括五个腔室，包括样品输入室、溶解室、逆转录室、扩增室和检测室以及定位成沿着每个腔室之间的通道的凹槽，该凹槽用于安置烘干或冻干试剂。在本实施例中，将RNA逆转录成cDNA以及cDNA的扩增过程发生在分开的腔室中。在本实施例中，定位成沿着从样品输入杯通向溶解室的导管的第一凹槽包括盐、化学制品(例如二硫苏糖醇)和用于溶解生物试剂和/或使输入样品中存在的核酸稳定的缓冲剂(例如稳定、增加或降低pH值)。在本发明的一些实施例中，输入样品在高温溶解室中被加热，该输入样品已经首先从样品输入杯流过第一凹槽；在第一凹槽中，样品已经可选地与组成第一凹槽的物质混合。在本发明的其它实施例中，溶解过程是通过由样品与第一个凹槽中的化学制品混合而引起的化学处理和在溶解室中的这些化学制品存在的情况下的样品的温育来完成的。

在溶解室中的处理基本完成处理之后，借助加热器的电子控制来非机械地破开排气口以释放样品溶液，以允许样品溶液经由通道流过第二凹槽并流入逆转录室中。第二凹槽可选地包括冻干试剂，冻干试剂可以包括合适的缓冲剂、盐、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、寡核苷酸引物以及酶(例如实现样品中的RNA逆转录成cDNA所需的DNA聚合酶和/或逆转录酶)。在逆转录反应基本完成之后，打开第二排气口以释放样品溶液流过通道和第三凹槽并进入扩增室，第三凹槽由核酸扩增所需的试剂组成，例如冻干试剂，其可以包括合适的缓冲剂、盐、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、寡核苷酸引物以及酶(如DNA聚合酶)。

在扩增室中的核酸扩增基本完成之后，打开第三排气口以将样品溶液释放到通向检测室的通道中。该通道可选地但优选地包括第四凹槽，第四凹槽包括用于在检测室中检测核酸的烘干或冻干检测剂(例如化学制品和/或检测颗粒轭合物)。检测室优选地包括毛细管池、用于检测扩增核酸的试剂以及横向流动检测条。毛细管池优选地提供足够容量的空间，以便在一定高度处将整个流体的体积容纳在检测室中，该高度使得流体能够通过毛细管作用向上流动到检测条，而不会淹没或以其它方式绕过检测条的区域；检测条的区域被设计为接收流体，以实现通向检测条的正确的毛细管迁移过程。在本发明的一些实施例中，检测剂是冻干试剂。在本发明的一些实施例中，检测剂包括染料聚苯乙烯微球体、胶体金、半导体纳米晶体或纤维素纳米颗粒。样品溶液与检测室内的检测剂混合，并借助毛细管作用向上流向检测条。与检测室对齐的微加热器可选地用于在溶液迁移到检测条时控制溶液的温度。

在本发明的一些实施例中，扩增反应是不对称扩增反应，其中，反应中每个引物对的一个引物以不同于给定对的另一个引物的浓度存在。不对称反应可以用于产生单链核酸以促进通过杂交的检测。不对称反应也可以用于在线性扩增反应中产生扩增子，从而允许对样品中的目标水平进行定量或半定量分析。

本发明的其它实施例包括与样品制备设备集成的核酸逆转录、扩增和检测设备。包括样品制备设备的实施例为样品制备子系统输出端口或阀与设备的流体或微流体部件的输入端口或端口之间的流体连通提供了一种手段。

本发明的其它实施例包括将输入样品分成流体或微流体部件中的两个或多个流路的装置。分割输入样品的装置包括分支通道，用以将输入流体输送到被设计成跨越多重流路划分流体的体积计量室。每个计量室包括通向排气凹穴的通道导管和通向流路中的下一个腔室(例如溶解室或逆转录室或扩增室)的通道导管。

除非另外定义，否则本文使用的所有专门名词、符号和其它科学术语旨在具有本发明所属的本领域的技术人员通常理解的含义。本文所描述或引用的技术和程序通常被本领域技术人员所了解并且本领域技术人员通常使用常规方法论来使用本文所描述或引用的技术和程序，例如在Sambrook等人编著的如下文献中描述的广泛使用的分子克隆方法论：Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3rd.edition(2001)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(分子克隆：实验室手册第3版(2001)冷泉港实验室出版社，冷泉港实验室，纽约)以及Current Protocols in Molecular Biology，Ausbel et al.，eds.，John Wiley&Sons，Inc.2001(当代分子生物学技术，Ausbel等人编著，John Wiley&Sons公司，2001)。除非另有说明，通常根据制造商定义的协议和/或参数适当进行涉及使用市场可买到的试剂盒和试剂的程序。

如在整个说明书和权利要求中所使用的，术语“靶核酸”或“模板核酸”是指意图检测的单链或双链DNA或RNA片段或序列。

如在整个说明书和权利要求中所使用的，术语“微粒”或“检测颗粒”是指用于标记在扩增反应过期间产生的核酸产物的任何化合物，包括对双链核酸特异的荧光染料、荧光修饰的寡核苷酸和共轭寡核苷酸量子点或固相元素例如聚苯乙烯、胶乳、纤维素或顺磁颗粒或微球体。

如在整个说明书和权利要求中所使用的，术语“腔室”是指流体驻留一段时间的流体室。例如，腔室可以是样品室、扩增室、标记室或检测室。

如在整个说明书和权利要求中所使用的，术语“盒子(cassette)”被定义为用于执行化验或其它化学或生物化学分析的一次性的或可消耗的检测盒、壳体、组件或盒子。检测盒可以被单次使用或多次使用。

如在整个说明书和权利要求中所使用的，术语“凹穴(pocket)”是指用作排气机构的隔室。凹穴优选地邻近或覆盖到电阻器或其它机构，以便打开凹穴。例如，与上述的流体室不同地，在检测盒的流体部件中形成的凹穴可以具有与PCA上的电阻器对准的一个敞开表面。该敞开表面优选地由薄膜、膜或其它材料覆盖以形成很容易通过使基础的电阻器通电而被破裂的密封腔。

如在整个说明书和权利要求中所使用的，术语“通道”是指流体装配件内通常连接两个或多个腔室和/或凹穴或其组合的窄导管，包括例如入口、出口或排气通道。在入口通道或出口通道的情况下，流体样品通过通道迁移。在排气通道的情况下，导管优选地保持不透流体并且将流体室连接到排气凹穴。

如在整个说明书和权利要求中所使用的，术语“外部器械”是指具有一个或多个如下特征的可重复使用的器械：除了密封检测盒之外，还在一次性化验或检测盒上执行机械动作，包括但不限于刺穿缓冲液封包和/或泵送或以其它方式主动提供用于流体的运输力；包括将部件移动到检测盒或一次性化验中的用于流体流动控制的控制阀和其它组件；除了通过选择性加热化验以外，控制流体流动；或者需要定期校准。

如在整个说明书和权利要求中所使用的，术语“对接单元(docking unit)”是指控制化验但不具有以上列出的用于外部器械的任何特征的可重复使用的设备。

本发明的实施例是用于低成本的使用点的核酸检测的适于在远离通常执行检测的实验室环境的位置处执行分析的设备。某些设备包括流体部件和电气部件或层，可选地被保护性壳体包围。在本发明的实施例中，流体部件由塑料组成并且包括一系列通过窄通道连接的腔室和凹穴，在流体部件中腔室在操作期间相对于彼此竖直取向。流体部件被覆盖或以其它方式安置成与电气部件物理接触，优选地经由微控制器控制，微控制器例如包含现成的表面安装设备(SMD)的印刷电路板和/或包括蚀刻的导电材料以形成电阻加热元件以及可选地包含SMD的柔性电路。在设备的一些实施例中，整个装配件是一次性的。在其它实施例中，流体层和物理结合的电子层是一次性的，而小型廉价的控制单元是可重复使用的。在另一个实施例中，流体部件是一次性的，并且小型控制对接单元或对接单元是可重复使用的。对于所有的实施例，本发明可以与核酸样品制备设备集成在一起，例如国际公开No.WO 2009/137059 A1中描述的发明名称为“Highly Simplified Lateral Flow-BasedNucleic Acid Sample Preparation and Passive Fluid Flow Control(高度简化的基于横向流动的核酸样品制备和被动流体流动控制)”(以引用的方式并入本文中)和/或其中描述的使用方法。

本发明的实施例包括一个可以用已经建立的制造过程廉价地制造的集成的核酸检测设备。本发明提供了分子检测数据，本发明提供了分子检测数据，同时保持了从广泛接受的手持免疫化验的终端用户角度的简单性，克服了在设备内调节流体温度、在连续步骤中运输小样品体积、试剂添加、试剂混合、检测核酸的挑战。在本发明的一些实施例中，用于收集、解释、报告和/或传送化验结果的子系统被合并到本发明中。本发明的实施例独特地适应于利用可由标准装配技术构造的现成电气部件并且不需要或很少需要移动部件。此外，流体层设计使得能够使用容易获得的塑料和制造技术。其结果是在不需要专用的实验室基础设施的情况下能够进行核酸隔离、扩增和检测的低廉、一次性和可靠的设备。

现有的核酸检测设备通常使用显著增加成本和/或需要专门的制造方法的复杂的加热元件，例如沉积膜加热器和珀耳帖设备。在本发明实施例中，反应溶液的加热优选地通过使用简单的电阻式表面安装设备来实现，该设备可以花几便士或更少的价格购买到并以通用制造标准进行装配和检测。通过在这些电阻元件和相关的传感器元件上层叠流体室，可以方便地调节反应溶液的流体温度。在电子工业中广泛使用SMD电阻器和柔性电路确保了本发明适用于完善的质量控制方法。在本发明的其它实施例中，电阻加热是使用通过在柔性电路基板的导电层中制作的图案形成的加热元件来实现的。许多核酸扩增技术(例如PCR)不仅需要快速加热反应溶液而且需要快速冷却。本发明中的反应室优选地在一侧加热，而在相反面上的环境温度用于帮助降低流体温度。另外，该设备的实施例的竖直方向允许通过被动对流比设备水平取向更快速地冷却，从而缩短了热循环周期，而无需使用昂贵的设备，例如珀耳帖设备。在本发明的一些实施例中，使用风扇来促进冷却。

流体控制是与低成本核酸检测设备设计相关的另一个挑战。本领域中已知的设备通常使用机电的、电动的或压电的泵送机构来在设备操作期间操纵流体。这些泵送元件同时增加了设备的复杂性和成本。类似地，使用复杂的微机械设计或活动件的阀会由于活动件故障或生物污染等复杂性而增加制造成本并降低可靠性。与先前描述的核酸检测设备不同，本发明的实施例利用微控制器控制下的静水压力以及毛细作用力和表面张力来操纵流体体积。本发明的某些实施例的竖直方向允许反应溶液在微控制器控制下从一个腔室到另一个腔室的倾泻以适应所需的化验操作。流体可以通过通道尺寸、静水压力和表面张力的平衡而保持在单独的反应室中，其中，表面张力和静水压力通过气体移位阻止流体前进。只有在微控制器控制下启动简单的排气机构之后，样品才能进入下部腔室。一旦打开，排气口通过提供随着流体进入用于转移空气从第二腔室逸出的路径允许流体从第一腔室移动到第二腔室。流体部件内的每个腔室(或腔室之间的每个通道)优选地通过狭窄的排气通道连接到密封的排气凹穴。排气凹穴最好用薄的、热不稳定的塑料薄膜或薄片密封在一个表面上，通过加热在薄膜或薄片的下方、接近或邻近薄膜或薄片的小的表面安装电阻器，薄膜或薄片容易被破裂。一旦下部腔室的排气口被打开，则即使在低静水压力下，流体也继续前进。

如下面更具体地描述的，在本发明的一些实施例中使用的流体或微流体排气口机构优选地采用与热不稳定密封件热接触和(可选的)物理接触的加热元件，以使得能够借助使较低高度的腔室排气，以允许来自较高高度的腔室的流体流入下部腔室，以实现流体运动的电子控制。在一个实施例中，使用广泛使用和完善的电子制造方法将电阻器安装在印刷电路板上，并将其与包含热不稳定材料的通道密封件物理接触。当通电时，表面安装电阻器产生足够的热量以使密封件破裂，这导致腔室的通气以允许流体正被移动的区域或腔室中的压力和通气之前流体驻留的腔室中的压力平衡。腔室之间压力的平衡允许流体从较高高度的腔室移动到较低高度的腔室。较高高度腔室和较低高度腔室之间的直接密封优选地不采用。通道和排气口密封可以位于远离流体室的位置，从而促进在用于高效制造的构造中的流体设备布局。密封材料可以包括任何能够密封排气通道并且如所描述的从加热中破裂的材料，例如薄塑料片。该装置中的流体运动控制方法得益于低材料成本，适用于使用已建立的制造技术的制造，同时在电子控制电路(例如微处理器或微控制器)的控制下提供将流体移动通过一系列腔室的能力。使用排气口、热不稳定材料来密封排气口(而不是密封流体室或流体微通道本身)以及用热量破坏密封件的电子手段提供了一种控制流体流动通过设备以实现流体在预定时间或在特定事件(例如，达到一个温度、温度变化或一系列温度变化、或者完成一个或多个温育时间或其它事件)之后的运动的手段。在一些实施例中，当气相水必须从由通道连接的腔室中绝缘时，可以在腔室之间的通道中引入堵塞物。堵塞物可以是在排气口开口后与液态水接触时溶解的可溶性材料或通过将热量引入堵塞物位置而可以被除去的容易熔化的材料(例如石蜡)。

另外，与密封流体室本身相比，排气方法具有许多优点。排气凹穴可以位于流体布局的任何地方并简单地与它们经由通气口通道调节的腔室进行连通。从制造的观点来看，排气凹穴可以是局部化的，以使得用于所有排气凹穴(其可以包括排气凹穴歧管)的唯一密封膜被固定到流体部件上，优选地通过完善的方法，例如粘合剂、高温层压、超声波焊接、激光焊接等。相反，直接密封流体室需要将密封材料安置在对应于每个腔室位置的不同位置，这更难以制造。与用单个膜密封单排气凹穴歧管相比，这提出了在制造过程中更具挑战性的方案。此外，如果腔室被直接密封，熔化的密封材料可以保留在腔室之间的通道中，阻塞流动。密封材料的粘度可能在流体柱中需要比在小型重力驱动装置中获得的更多的压力。

在本发明的实施例中，试剂混合不需要比其它系统更复杂。核酸扩增所必需的试剂如缓冲剂、盐、脱氧核糖核苷酸、寡核苷酸引物和酶优选地通过使用冻干丸粒或块状而稳定地加入。这些密封在流体室、流体室中的凹槽或通道中的凹槽中的冻干试剂在与水溶液接触时可以容易地溶解。在需要额外混合的情况下，本发明的实施例的竖直方向提供了混合溶液的新方法的机会。当溶液含有热敏组分时，通过利用流体室下方的加热器，可以加热气体，将气泡传送到上方腔室中的反应溶液。或者，在溶液不含热敏成分的情况下，可以使用加热器直接加热溶液至发生沸腾的程度。在先前公开的流体和微流体设备中，气泡的发生通常是不期望的，因为它们可能积聚在流体腔室和通道中并转移反应溶液或阻碍流体在设备内的运动。本发明的实施例的竖直设计允许气泡上升到流体表面，仅产生最小和瞬时的流体移位，有效地改善气泡对流体或微流体系统的任何不利的影响。通过这种竖直设计也使通过煮沸进行混合变得方便，因为在加热过程中被转移的流体在加热元件关闭之后利用重力简单地返回到原始流体室。

在本发明的实施例中，使用比色检测条检测扩增的核酸。横向流动化验由于其易用性、可靠性和低成本而通常用于免疫化验检测。现有技术包含使用多孔材料作为样品接收区的使用横向流动条来检测核酸的描述，该样品接收区位于或接近也包括多孔材料的标记区域处并且被安置在横向流动化验设备一端或附近。在这些现有发明中，标记部分位于标记区。使用多孔材料作为样品接收区和标记区，可以保留一些样品溶液以及检测颗粒在多孔材料中。尽管在本发明的实施例中可以使用包括具有可逆固定化部分的多孔材料的标记区，但本发明的实施例优选地利用保持在与横向流动条的样品接收区不同的设备区域中的检测颗粒或部分并包括具有低流体保留特性的无孔材料。该方法允许在引入设备的横向流动组件的样品接收端的多孔组件之前标记包含样品的靶核酸，从而消除了多孔标记区中样品材料和检测颗粒的驻留和/或损失。该方法还使得在检测部分存在的情况下能够使用样品的各种处理，例如高温处理，以实现双链靶标或单链靶标内的二级结构的变性而不考虑温度对多孔样品接收区材料或标记区材料或横向流动检测条材料的影响。此外，标记区域不与样品接收区域横向流动接触但受流体部件(例如排气口)的控制的使用允许靶标和标记在由流体流动控制系统控制的一段时间保持接触。因此，本发明的实施例可以不同于传统的横向流动检测条，其中，样品和检测颗粒相互作用的时间和条件由材料的毛细管运输性能决定。通过将检测颗粒结合到温度调节室中，双链体核酸的变性是可能的，从而允许有效的基于杂交的检测。在另一个实施例中，荧光被用来检测核酸扩增，使用LED、光电二极管和滤光片的组合。这些光学检测系统可以用于在扩增期间执行实时核酸检测和定量以及在扩增之后执行终点检测。

本发明的实施例包括低成本的使用点的系统，其中，核酸样品可以被选择性扩增和检测。进一步的实施例包括与核酸样品制备设备的集成，例如国际公开No.WO 2009/137059 A1、发明名称为“Highly Simplified Lateral Flow-Based Nucleic Acid SamplePreparation and Passive Fluid Flow Control(高度简化的基于横向流动的核酸样品制备和被动流体流动控制)”中所描述的那样。设备的实施例优选地包括塑料流体部件和印刷电路装配件(PCA)和/或柔性电路，并且可选地容纳在保护活动组件的壳体中。温度调节、流体和试剂混合优选地由微控制器协调。反应盒优选地竖直取向并竖直运行使得重力、静水压力、毛细管力和表面张力连同微控制器触发的排气口一起控制设备内的流体运动。

在本发明的实施例中，制备的样品或粗样品流体进入样端品口并填充或部分填充样品杯。样品可以在烘干或冻干的试剂可以与样品混合的样品杯中保留不同的时间。例如阳性对照试剂、对照模板或化学试剂的对检测性能有益的试剂可以通过在样品杯中包含烘干、液态或冻干形式而被引入到样品溶液中。其它处理，例如细菌或病毒分析物的受控温度温育或高温溶解可选地通过与温度控制电子器件连接的基础的微型加热器和温度传感器系统在样品杯中完成。流体网络包括：样品端口，通过该样品端口将样品或者通过使用者手动地或者经由自动系统(例如与对接单元或样品处理子系统集成的子系统)引入检测盒；样品杯，样品被保持在样品杯中以促进样品引入期间的积聚以及以添加试剂、组件以在样品进一步移动到流体网络的下游部分之前执行所需的处理(例如高温处理以执行细菌细胞或病毒的溶解)；再循环排气通道，其用于平衡流体通道和/或腔室的空气、气体或溶液压力与检测盒的膨胀室的压力；珠粒凹槽(bead recess)，其中，处于烘干的/变干的或冻干的或半干的状态的试剂珠粒(例如材料、试剂、化学制品、生物试剂、蛋白质、酶或其它物质或这些物质的混合物的珠粒或球体)可以通过在添加样品之前引入检测盒的样品溶液或缓冲溶液被再水化，以使其中所含的珠粒或球体再水化，从而使其中的材料与样品溶液混合；一组可以打开以控制检测盒内的流体运动的一个或多个排气口；样品可以经受温度方案的第一腔室；可选的屏障，其在将第一腔室与第二腔室连接以排除液体和/或气体过早入侵到第二腔室中或暂时控制溶液或气体移动进入第二腔室的流体通道内；第二腔室，其中，可选地从可选地位于第一腔室和第二腔室之间的可选的试剂珠粒凹槽添加试剂之后，样品溶液可以经受进一步的温度方案；形成腔室的检测条凹槽，其中，安装检测条以检测指示分析物存在的分析物或报道分子或其它物质。在一些实施例中，将检测盒插入执行密封检测盒、洗脱、检测和数据传输的功能的对接单元。优选地，一旦检测盒插入对接单元中，就不需要用户介入，样品被装载并且盖子关闭。

参考图1至图2中的检测盒2500的典型图，通过样品端口20将核酸样品添加到流体部件5中的样品杯10中。在化验开始时，滑动密封件91通过对接单元盖的关闭移动到关闭位置。盖子25将滑动件91保持在适当的位置以便密封膨胀室52。核酸样品可以来源于在线的(例如集成的核酸制备子系统)、独立的核酸制备过程(例如许多商业可用方法中的一种方法，例如离心柱)，随后通过移液器将纯化的核酸或者包含样品的粗核酸添加至设备。已经存在于样品杯中或优选地存在于在样品杯内或邻近样品杯的凹槽13中的是试剂混合物16，该试剂混合物可以是液体或干燥的形式并且包含可以用于促进细胞和病毒溶解和/或稳定释放的核酸的成分。可以采用例如二硫苏糖醇和/或pH缓冲试剂来稳定核酸并抑制核糖核酸酶。类似地，可以使用用于实现酸或碱介导溶解的试剂。在一些实施例中，将试剂混合物冻干以形成冻干试剂。在一些实施例中，阳性对照例如病毒、细菌或核酸存在于试剂混合物中。将样品引入样品杯导致试剂和样品混合使得试剂作用于样品。可选地执行可选的气泡混合步骤以进一步将样品与试剂混合或使试剂回溶。然后可选地在样品杯10中加热流体以溶解细胞和病毒颗粒。然后，当设备处于竖直方向时，流体优选地被引导通过通道40到达位于样品杯下方的第一腔室30。试剂凹槽15优选地沿着入口通道布置，使得流体在进入第一腔室30之前穿过凹槽与容纳在凹槽中的烘干的或冻干的试剂混合。在其中第一室是逆转录室的实施例中，优选地存在于试剂凹槽15中的是逆转录反应所必需的全部成分，例如烘干的或冻干形式的缓冲试剂、脱氧核苷酸(dNTP)、寡核苷酸引物和/或酶(例如逆转录酶)。逆转录室优选地与加热器元件接触以提供支持RNA逆转录为cDNA所必需的温度调节手段。通道35将腔室30连接到试剂凹槽37。腔室30中的cDNA合成之后，排气口50被打开以允许逆转录反应经由通道35流入试剂凹槽37。随着流体经由入口39穿过凹槽到达第二腔室90存在于试剂凹槽37的烘干的或冻干的试剂与流体混合使得试剂作用于第二腔室中的样品，第二腔室优选地是扩增室。优选地存在于试剂凹槽37中的是扩增反应所必需的全部成分，例如缓冲试剂、盐、dNTP、rNTP、寡核苷酸引物和/或酶。在一些实施例中，将试剂混合物冻干以形成冻干试剂。为了促进其中产生多重扩增子的多路复用检测，可通过在扩增室内或优选地在扩增室上游的试剂凹槽内沉积多重引物组来实现多路复用扩增。此外，多重扩增和检测室被并入到设备中的电路板和流体设计支持可以是单重或多重反应的多重并行扩增反应。这种方法减少或消除了本领域技术人员已知的由在同一反应中使用多对引物的多路复用扩增造成的并发症。此外，使用多重扩增反应室允许在不同的温度方案下的同时扩增以适应最佳扩增的要求，例如不同的靶标和/或引物序列所需的不同熔解或退火温度。

在核酸扩增之后，排气凹穴150被打开以允许扩增反应产物经由通道135流入腔室230。位于腔室230中的检测条235能够检测由位于检测条235的区域上或者可选地位于毛细管池93中的检测颗粒标记的靶核酸。

从样品杯10到第一腔室30的流体运动发生了因为腔室30经由开口51连通到膨胀室52。从设备的第一腔室到第二腔室的流体运动优选地通过连接到第二腔室的排气口的打开来实现。当流体进入第一腔室30时，连接到下游腔室的排气凹穴50是密封的，因此流体不会穿过连接两个腔室的通道35。现在参考图2A，通过使覆盖在排气凹穴50上的密封件破裂而允许腔室90内的空气与膨胀室52中的空气连通，由此可以实现流体从腔室30到腔室90的运动。排气凹穴50处的密封件的破裂允许腔室90中的空气经由排气通道60与膨胀室52中的空气连通，膨胀室52经由开口51连接到排气凹穴54。排气凹穴54处的密封件优选地是敞开的或者是先前破裂的，如图2B所示。如图2C所示，排气凹穴50的密封件的破裂允许排气凹穴50(并且因此腔室90)与排气凹穴54(并且因此膨胀室52)连通。这种流体运动的方法优选地实施在气密密封的空间内以在检测盒内容纳生物有害样品和扩增的核酸。为了实现气密密封的检测盒，选择性的耐热的和热不稳定的材料以在图2B至2C的横截面中图示地表示的方式分层。现在参考图2B至图2C，印刷电路板或PCA 75上的优选地包括电阻器的热源70被安置成与排气凹穴50和54对齐并且靠近热不稳定的排气凹穴密封材料80。排气凹穴密封件可以包括例如聚烯烃或聚苯乙烯的热不稳定材料。热稳定材料(例如聚酰亚胺)72优选地设置在热源70和热不稳定排气凹穴密封材料80之间以形成密封的屏障。在一些实施例中，排气凹穴之间或周围的密封空间55通过包含可选的包括将热稳定材料72结合到热不稳定材料80和/或流体部件5的粘合剂层的垫圈或垫片56被扩张并且在一个或多个排气口被打开之后在排气口的区域内保持检测盒的气密密封，同时优选地还为打开的排气口和/或可选的膨胀室之间的空气连通提供空气间隙。在本实施例中，热量从热源70通过热稳定材料72和密封空间55传递到热不稳定排气凹穴密封材料80，使其破裂并打开排气凹穴50。微控制器优选地负责将电流发送到热源70。排气凹穴50优选地开向封闭的空间使得检测盒内的气体可相对于检测盒外部的环境保持密封。该封闭的空间可以包括检测盒内的空气，其可选地包括允许气体膨胀的空的空气室，例如膨胀室。如图2C所示，因为排气凹穴54先前被热源71破裂，并且排气凹穴54与膨胀室气体连通，所以排气凹穴50的打开导致排气的流体腔室中的气体与膨胀室的气体连通。在排气流体腔室中产成的减压允许流体在重力作用下从位于上方的腔室流入排气腔室。排气凹穴的其它实施例可以包括除热敏膜之外的密封件，并且可以利用其它破坏密封件的方法，例如刺穿、撕裂或分解。图2E中示出了这种检测盒的照片。

与排气凹穴的敞开面相对的面可选地包括凹坑、突起部、凹凸部或其它类似结构，例如图45的凹坑7004，以便于在排气口密封材料破裂期间开口的形成。这样的结构还优选地防止在密封件破裂之后排气口被重新密封。这可以在包括具有表面安装组件的电路板的实施例中发生。在这样的实施例中，表面安装的电阻器可以拉伸聚酰亚胺薄膜，将其推入垫圈的开口中并抵靠热不稳定材料。一旦密封件破裂，熔化的密封材料可以与该聚酰亚胺形成二次密封，从而关闭排气口。在具有包括形成加热元件的金属线迹的柔性电路的实施例中，加热器可导致聚酰亚胺柔性电路局部变形，通常形成延伸到垫圈中的开口中的突起(通常包括加热器材料)，由于熔化的密封件材料可能使排气口开口闭塞。凹坑7004可以帮助防止这种情况的出现。

密封空间55可选地提供到其它排气口、排气凹穴或腔室(例如膨胀室52)的渠道。在排气口打开之后，流体部件5保持与外部环境59密封。膨胀室52优选地通过缓冲空气/水蒸气体积来适应在加热期间的气体膨胀，或者通过提供充分大的体积使得由温度变化产生的气体膨胀不会显著地影响系统的压力，或者通过活塞(图3)、柔性气囊(图4)、波纹膜(图5)或允许气体而不是大分子自由穿过屏障的疏水屏障(图6)的移位来适应气体膨胀。在图3中，膨胀室使用因密封流体系统内渐增的压力而移位的活塞。膨胀室用于减少或消除密封系统内的压力积聚。活塞的移位响应于气密密封的检测盒内的增加的压力而发生，从而减少由加热期间的气体膨胀等过程产生的检测盒内的内部压力。在图4中，气囊的偏转响应于气密密封的检测盒内的增加的压力而发生。气囊的移位减少了由加热期间的气体膨胀等过程产生的检测盒内的内部压力。在图5中，波纹膜的拉伸响应于气密密封的检测盒内的增加的压力而发生。波纹膜的拉伸减小了由加热期间的气体膨胀等过程产生的检测盒内的内部压力。

膨胀室可以作为空的空气体积被合并，例如在图1所示的检测盒的顶部的膨胀室52中所示的包括体积。如图7所示，为了便于制造最小厚度的检测盒，膨胀室也可以被合并到由适当设计的垫圈420被密封到热不稳定材料410和热稳定材料430以形成流体部件400的背面时形成的空气间隙440中。最小化检测盒的物理尺寸对减少运输成本、降低热容量并提供美观和方便的设计是可取的。除了形成用于气体膨胀的空气体积之外，垫圈420在热稳定材料430和热不稳定材料410之间产生空间以促进空气通过敞开的排气口的自由移动，同时保持密封的系统以防止暴露于环境。垫圈420优选地足够厚以提供足够的空气间隙来平衡敞开的排气口之间的压力，但也充分薄以便基本上不影响加热器和相应的排气凹穴之间的交界面或热稳定材料对检测盒的密封。在包括柔性电路的本发明的实施例中，柔性电路可以包括例如聚酰亚胺的热稳定材料，在这种情况下，不需要热稳定材料430的单独的薄片，例如图8C所示。使用膨胀室来减少或平衡密封的检测盒内的压力确保了压力不平衡不会导致检测盒内的不适宜的或过早的溶液运动以及压力积聚不会不利地影响期望的流体运动，例如腔室之间的或通过通道的运动。这种压力控制，即在整个设备中建立指定的压力分布，使系统能够按照设计工作而不管大气压力如何。膨胀室因此能够实现取决于要采用的系统内的稳定压力的可控的流体运动，并且还能够使用气密密封的检测盒，从而避免了将检测盒排放到大气中的缺点，例如扩增子可能释放到大气中。此外，通过减少流体下游的压力(例如通过打开到膨胀室的排气口)来使流体流动的方法消除了对泵的需要，例如在流体上游产生正压的那些泵，或具有活动件的其它设备。通过将流体下游的区域与和下游的区域基本相同的压力的相对较大的蓄池(例如膨胀室)连通，从而使得流体在重力作用下流动(假设设备在适当的方向上)，类似的优点是可能的。膨胀室的尺寸优选地充分大以容纳化验过程中产生的反应蒸气，而不会将系统的压力增加到克服流体流动所需的毛细管力或重力的程度。

在第二腔室是扩增室的实施例中，腔室优选地与加热器元件接触以提供支持核酸扩增所必需的温度调节手段。在本发明的一些实施例中，扩增室可以在内表面的至少一部分上包含寡核苷酸。如图2D所示，在腔室30的壁95与一个或多个加热元件100之间的交界面处安置例如散热膏或化合物的导热材料可能是有利的。基于从PCA 75上的温度传感器110收集的数据，微控制器优选地借助于金属氧化物半导体场效应晶体管(MOSFET)来调制到电阻加热元件的电流，使用简单的开/关或比例积分微分(PID)温度控制方法或本领域技术人员已知的其它算法的温度控制。

将加热元件以及在一些实施例中相应的温度传感器安置在一次性部件上，能够在温度控制子系统和它们所连接的扩增室和检测室之间制造高度可再生的热耦合。这种方法能够实现在制造期间通过形成导热交界面来将流体子系统耦合到电子热控制子系统的高度可靠的手段。电子温度控制组件和流体子系统之间所产生的优异的热接触导致快速的温度平衡，并因此实现快速化验。使用柔性电路来提供直接地或者用居间的垫圈熔合到流体部件背面的后部的一次性电阻加热元件允许了获得优异的热接触、快速的温度循环和可再生的制造的低成本手段。用于逆转录、扩增和流体流动排气口控制的电阻加热元件可以通过蚀刻柔性电路的导电层以形成陈列所需电阻的几何形状直接在柔性电路上形成。这种方法消除了对额外的电子组件的需求，并且在降低成本的同时简化了制造过程。

在本发明的实施例中，用于电阻加热和排气口打开的柔性电路799在图8中示出。使用柔性加热器作为一次性检测盒的组件允许检测盒的盒背被构造成使得加热的流体腔室中的流体能够与包括柔性加热器电路的材料直接接触。例如，如图8C所示，形成检测盒后部的热不稳定材料807(其优选地包括BOPS)中的窗口806可位于流体腔室上方以允许流体与柔性电路799直接接触。柔性电路层和由柔性电路上的加热器进行温度控制的流体之间的直接接触提供了能够快速温度变化的低热容量系统。为了能够收集用于温度调节的温度数据，可以将温度传感器可选地结合到柔性电路中，和/或可以采用例如红外传感器的非接触式温度监测手段。柔性电路中的电阻加热元件，例如加热元件800，当它们位于与排气口对准时可以用于排气口破裂。电衬垫812向加热元件800提供电流。类似地，一个或多个柔性电路可以包括用于加热流体腔室的电阻加热元件802和803，以及用于调节检测条的温度的可选的电阻加热元件804。

在本实施例中，柔性电路799也优选地用作热稳定密封件以保持一个气密密封的检测盒，类似于上述热稳定材料72。可选地，可以在柔性电路799和后壳或板805之间安置额外的热稳定层(例如包括聚酰亚胺)。垫片或垫圈808优选地安置在热不稳定材料807和柔性电路799之间的排气口电阻器800周围以确保空气通过敞开的排气口自由移动，同时保持密封的检测盒。后壳或板805优选地包括薄塑料并且优选地安置在柔性电路的暴露的表面上以在操作期间对其进行保护。后壳或板805可以包括在柔性电路799上的加热器元件上方的窗口以便于冷却和温度监控。与对接单元的控制电子器件(下面描述)的电接触可选地由一组电衬垫810提供，电衬垫810优选地包括边缘连接器或例如弹簧加载销的连接器销。

检测盒腔室的实施案例优选地包括能够经受反复加热和冷却至约30℃至约110℃范围内的温度的材料。更优选的是，腔室包括能够以每秒约10℃至约50℃的级别的温度变化率经受反复加热和冷却至约30℃至约110℃范围内的温度的材料。腔室优选地能够在适合于高温介导溶解和生物化学反应(例如逆转录、热循环或等温扩增协议)的温度下保持溶液在其中，优选地通过微控制器的编程来控制。在一些核酸扩增应用中，期望在升高的温度(例如在温度约37℃和约110℃之间，为期1秒至5分钟)下提供初始温育以使靶核酸变性和/或激活热启动聚合酶。随后，反应溶液在扩增室中保持在扩增温度用于等温扩增，或者用于基于热循环的扩增，反应溶液在至少两个温度之间变化，两个温度包括但不限于导致核酸双链体变性的温度和适合于通过与靶核酸杂交以及引物通过聚合酶催化的核酸聚合作用的延伸的引物退火的温度。在热循环方案中在每个必需温度下温育的持续时间可以随着靶核酸的序列组成和反应混合物的组成而变化，但优选地在约0.1秒和约20秒之间。重复加热和冷却通常进行约20次循环至约50次循环。在涉及等温扩增方法的实施例中，取决于所使用的扩增技术，将反应溶液的温度保持在恒定的温度(在一些情况下在升高的温度下的初始温育之后)达约3分钟至约90分钟之间。一旦扩增反应完成，扩增反应溶液通过打开与用于扩增的腔室下方的腔室连通的排气口而被运输到下面的腔室以完成对扩增的核酸的进一步操作。在本发明的一些实施例中，操作包括扩增的核酸的变性和与共轭至检测颗粒的检测寡核苷酸的杂交。在本发明的一些实施例中，扩增的核酸与共轭至检测颗粒的检测寡核苷酸杂交并捕获固定在检测条上的探针。

在一些实施例中，可以在扩增反应之前、期间或之后在扩增室中进行另外的生物学化反应。这样的过程可以包括但不限于RNA被转录成cDNA的逆转录、其中，多重引物对同时扩增多重靶核酸的多路复用以及在扩增反应过程期间检测扩增产物的实时扩增。在后者的情况下，扩增室可以不包含阀或出口通道，并且扩增室将优选地包括光学窗口或以其它方式构造成在扩增反应过程期间能够感测扩增子浓度。在一个实时扩增实施例中，借助于例如LED或二极管激光器的激发光源和例如光电二极管的检测器以及包括但不限于光学滤波器的适当的光学部件监测与靶核酸互补的荧光标记的寡核苷酸或对双链DNA特异性的荧光染料的荧光强度。

检测

检测室230的实施例优选地提供在扩增室中产生的扩增靶核酸的特异性标记。如图2A所示，检测室230优选地包括毛细管池或空间93以及检测条235。包含染料聚苯乙烯微球体、胶乳、胶体金、胶体纤维素、纳米金或半导体纳米晶体的检测颗粒优选地存在于毛细管池93中。检测颗粒可以包括与靶分析物互补的寡核苷酸或者可以包括针对标记能够结合到扩增靶核酸的配体(例如生物素、链霉抗生物素蛋白、半抗原或抗体)，例如存在于扩增靶核酸上的半抗原。检测室230可以包含烘干的、冻干的或作为检测颗粒在例如多糖、清洁剂、蛋白质或本领域技术人员已知的其它化合物的载体中的干燥混合物存在于内表面的至少一部分上以促进检测颗粒的再悬浮的检测颗粒。在一些实施例中，横向流动检测条可以包括检测颗粒。在其它实施例中，通向检测室的试剂凹槽通道135可以包括检测颗粒。检测室能够被加热和/或冷却。

合适的检测颗粒包括但不限于对双链核酸特异的荧光染料、荧光修饰的寡核苷酸或共轭寡核苷酸的染料微粒或胶体金或胶体纤维素。扩增子的检测涉及与待测的扩增子互补的或以其它方式能够与待检测的扩增子特异性结合的“检测寡核苷酸”或其它“检测探针”。检测寡核苷酸与微粒的共轭可以通过使用链霉亲和素包被的颗粒和生物素化的寡核苷酸或者通过碳化二亚胺化学过程发生，羧化颗粒通过碳化二亚胺化学过程在碳化二亚胺的存在下被激活并与存在于检测寡核苷酸上的伯胺特异性反应。检测寡核苷酸与可检测一半的共轭可以发生在内部或在5′端或3′端。检测寡核苷酸可以直接附接到微粒，或者更优选地通过例如乙二醇或多核苷酸的垫片一半。在本发明的一些实施例中，检测颗粒可以结合到由多路复用扩增等过程产生的多重种类的扩增核酸。在这些实施例中，各种类型的扩增核酸的特异性检测可以通过使用特异于每个待检测种类的方法在检测条上进行检测来实现。在这样的实施例中，在扩增期间引入靶核酸的标签可以用于标记存在的所有扩增种类，而标记的核酸与固定在检测条上的种类特定捕获探针的后续杂交用于确定存在哪种扩增DNA的特定种类。

至于双链DNA扩增产物，在引入检测室之后加热反应溶液可以促进检测。熔解双链DNA或使单链DNA的二级结构变性，然后在检测寡核苷酸存在下的冷却导致扩增靶核酸的序列特定标记。放在检测室下面的加热元件可以用于加热流体体积约1秒至约120秒以启动双链DNA熔解或单链DNA二级结构的变性。当溶液被允许冷却至室温时，扩增靶核酸可以与检测微粒特异性杂交。然后优选地通过打开检测室的排气口将反应体积引导到检测室的位于标记室下方的区域。

为了使有效的标记发生，优选地将溶解的检测颗粒与反应溶液充分混合。在本发明的实施例中，检测颗粒可以定位在通道135的出口处的毛细管池93中以在溶液进入腔室230时促进与溶液的混合。毛细管池93中的检测颗粒可选地是冻干的检测颗粒。毛细管池提供颗粒的改善的混合和分散以促进检测颗粒与核酸的混合，检测颗粒结合到核酸。如图9所示，毛细管池还增加了检测条上的颗粒迁移的均匀性。毛细管池对于小体积化验尤其有利，例如体积小于200μL、或者更具体地小于约100μL、甚至更具体地小于约60μL、甚至更具体约40μL的那些化验。

本发明的检测室的实施例提供了扩增靶核酸的特定检测。在本发明的某些实施例中，通过吸收条通过毛细管芯吸包含标记的扩增子的溶液来完成检测，吸收条由以线、点、微阵列或其它视觉可辨别的元件图案化的多孔材料(例如纤维素、硝基纤维素、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙或聚四氟乙烯)构成，多孔材料包括能够直接或间接特异性结合到标记的扩增子的结合基。在一些实施例中，设备的吸收条组件包括多达三个物理接触的多孔基板：包括两亲性试剂以增强芯吸的表面活性剂衬垫；包括至少一个能够选择性结合标记的扩增子的结合基固定在其上的多孔材料(如纤维素、硝化纤维素、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙或聚四氟乙烯)的检测区；和/或提供额外的吸收能力的吸收衬垫。尽管检测颗粒可以可选择地合并在检测室内的横向流动多孔材料内，与先前描述的横向流动检测设备不同，检测颗粒优选地反而保持在被大体上增强的毛细管池中的上游，扩增子和检测颗粒之间的结合复合物的形成可以在将所得标记的核酸引入设备的多孔组件之前或伴随着将所得标记的核酸引入装置的多孔组件进行。

“捕获寡核苷酸”或“捕获探针”优选地通过本领域技术人员已知的多种方式中的任一种方式(例如UV照射)被固定到设备的检测条元件上。捕获探针被设计为当包含标记的核酸的溶液通过捕获区时捕获标记的核酸，导致在捕获探针固定点处的标记浓度增加，从而产生表明标记的靶核酸扩增子存在的可检测信号。单个检测条可以与一个或多个捕获探针相配，以实现多重扩增子的多路复用检测、扩增子序列的判定、通过延伸检测信号的线性关系的扩增子的定量以及化验质量控制(正控制和负控制)。

流体部件

流体部件的实施案例优选地包括塑料，例如丙烯酸、聚碳酸酯、PETG、聚苯乙烯、聚酯、聚丙烯和/或其它类似材料。这些材料是容易获得的并且能够通过标准方法制造。流体部件包括腔室和通道。流体腔室包括四壁、两个表面并且连接到一个或多个通道，例如入口、出口、凹槽或排气口。通道可以连接两个流体腔室或一个流体腔室和一个凹槽，并且由壁和两个表面组成。流体腔室设计优选地使表面积与体积之比最大化以促进加热和冷却。腔室的内部体积优选地在约1μL和约200μL之间。与溶液接触的腔室表面的区域优选地与加热元件连接的区域相对应以确保加热期间均匀的流体温度。流体腔室的形状可以被选择成与加热元件紧密配合并且为溶液进入和流出提供有利的几何形状。在一些实施例中，腔室的体积可以大于流体体积以便为在设备操作过程中出现的气泡提供空间。流体腔室可以具有通向排气通道的扩大的延伸部分，以确保流体不会通过毛细管作用侵占通道或以其它方式阻塞排气口机构。

在一些实施例中，可能需要在溶液释放之前减少或消除液相或气相水侵入腔室。在一些实施例的过程中采用的升高的温度产生蒸汽(例如气相水)，其可以导致水分过早侵入通道、腔室或凹槽。可能需要减少液相或气相入侵以保持例如存在于腔室或凹槽中的烘干试剂或冻干试剂的干燥状态。在一些实施例中，通道可能被可被例如热量、湿气和/或压力之类的外力移除的材料完全地或部分地暂时阻塞。适合于暂时堵塞通道的材料包括但不限于胶乳、纤维素、聚苯乙烯、热胶、石蜡、蜡和油。

在一些实施例中，检测盒包括优选地注塑成型的流体部件，流体部件包括样本杯、腔室、通道、排气凹穴和导能管。注塑成型的检测盒流体部件优选地由适合于超声波焊接到相似组件的背面塑料的塑料组成。在本发明的实施例中，检测盒流体部件包括超声波焊接到背面材料的单个注塑成型件。导能管是流体部件的可选特征，其将超声能量仅引导到打算结合到流体部件的热不稳定层的那些区域。注塑成型的流体部件可选地容纳在壳体中。图7示出了包括优选地注塑成型的流体部件400(优选地包括聚合物，例如高抗冲聚苯乙烯(HIPS)、聚乙烯、聚丙烯或NAS30(苯乙烯丙烯酸共聚物))、热不稳定材料410(包括例如具有约239℃的相对较低熔解温度和约100℃的玻璃化转变温度(其足以承受变性过程中的升高的温度)的BOPS或具有265℃熔解温度和150℃玻璃化转变温度的聚碳酸酯)、粘合剂垫片420(包括例如优选地不含载体的有机硅转移粘合剂、具有聚酯载体的丙烯酸粘合剂或能够承受装置升高的温度的任何粘合剂)以及耐热层430的检测盒。热不稳定材料410经由优选地通过上覆盖的耐热层430(例如包括聚酰亚胺或具有高耐热性的其它聚合物)传输的热量破裂。将热不稳定材料熔化在检测盒的排气口特征上打开了通向膨胀室的排气口和排气通道，从而允许检测盒内的压力平衡。上覆盖的耐热层430优选地保持完好，从而使得检测盒在排气口打开之后保持气密密封。

在一些实施例中，粘合剂垫片包括空的区域440，其可以用作膨胀室以在加热期间缓冲气体的膨胀以降低密封的检测盒的内部压力。热不稳定层410通过例如超声波焊接或使用粘合剂的结合方法或过程结合到流体部件400。然后将所得部件与垫片和耐热层结合。在一些实施例中，耐热层以不存在于加热室上的方式构造。在其它实施例中，耐热层存在于加热器腔室上。但在其它的实施例中，粘合剂垫片和耐热层仅存在于与流体部件的排气凹穴特征对齐的区域上。在本实施例中，耐热层可选地直接安置在与被加热的腔室对齐的区域中的热不稳定材料上。

在本发明的一些实施例中，流体腔室和通道壁的厚度在约0.025mm至约1mm的范围内，并且优选地在约0.1mm至约0.5mm的范围内。该厚度优选地同时满足流体部件的结构完整性和支持在高温和相关压力下密封腔室的密封的要求。通道壁、特别是排气通道壁的厚度优选地小于腔室的厚度并且在约0.025mm至约0.25mm的范围内。入口和出口通道的宽度优选地被选择以增强毛细管作用。浅薄的排气通道赋予流体部件改善的刚性且对排气没有不利影响。流体部件的塑性成形表面优选地比形成壁的塑性成形表面更薄以便使热传递最大化。可选的热断层穿过流体部件的一些组件并围绕扩增室和检测室，有助于温控室的热绝缘。

在本发明的一些实施例中，在将流体部件400与热不稳定背面材料410结合之前，可以合并检测盒的附加组件，例如冻干试剂16、检测条装配件230和检测颗粒。在一些实施例中，可以通过施加压力将组件层压以确保良好的粘附。在一些实施例中，可以通过例如压敏粘合剂和超声波焊接的方法的组合来结合组件。必须避免已知或发现对核酸扩增反应的性能产生负面影响的粘合剂。丙烯酸或硅基粘合剂已经成功地用于本发明中。一种优选的粘合剂膜是由Advanced Adhesives Research提供的SI7876。其它粘合剂如果发现与所用缓冲剂、塑料和反应化学成分化学兼容同时在设备操作期间遇到的温度下提供牢固的密封，则可以使用。

参考图2和图7，排气凹穴优选地与其它腔室在结构上有区别。在如上构造流体部件之后，排气凹穴在流体部件的侧面上具有敞开的表面，该敞开的表面将直接地或者在一些实施例中通过居间的空气间隙420或排气凹穴54和耐热材料430间接地与PCA 75会合。为了形成排气凹穴，附加的塑料组件被结合以密封腔室，优选地包括与PCA的排气口电阻器70邻近的薄的热不稳定膜410。尽管可以使用其它类似的材料，但膜410包括适合于超声波焊接到注塑成型的流体部件的例如聚苯乙烯的材料。这种膜非常适合于既密封排气凹穴又允许容易的穿孔，因此当电流通过排气口电阻器产生迅速的温度升高时，将气体排放到较低的压力室。优选地，膜在加热时足够稳定使得材料能够承受检测盒的其它操作(例如高温溶解、逆转录和核酸扩增)中所使用的温度。使用在用于变性、标记、逆转录、核酸扩增和检测的温度范围内具有稳定性但具有电阻器70容易获得的熔解温度的材料允许单一材料被用于注塑成型的流体部件400的背面以既用作腔室的一个表面又用作排气口的一个表面。在一些实施例中，温控室的区域中的附加的温度稳定性可以通过例如聚酰亚胺的耐热材料的上覆盖的膜来实现。在本发明的其它实施例中，热不稳定膜中的窗口与温控室对齐以允许腔室内的流体与熔合到检测盒后部的柔性电路基板之间的直接接触。

流体部件的附加部件

如上所述，在最终结合之前，若干附加成分优选地合并在本发明的流体部件内。包括缓冲剂、盐、dNTP、NTP、寡核苷酸引物和酶(例如DNA聚合酶和逆转录酶)的试剂可以在设备装配之前被冻干或冷冻干燥成丸粒、球体或块状。试剂冻干是本领域众所周知的并涉及在施加的真空下通过升华使冷冻试剂等分部分脱水。通过在冷冻之前向试剂中加入冻干保护剂(例如糖(二糖和多糖)和多元醇)的特定制剂，可以保持酶的活性并且可以增加再水化的速率。冻干试剂丸粒、球体或块状通过标准方法加工，并且一旦形成，就相当耐用并且可以在层压最终表面之前被容易地放进流体部件的特定腔室中。更优选地，凹槽被合并到流体网络中以允许在将流体部件结合到背面材料之前将冻干试剂的丸粒、球体或块状放进流体部件中。通过选择流体网络几何形状和凹槽的位置和顺序，样品可以在期望的时间与期望的冻干试剂反应以优化性能。例如，通过将冻干的(或烘干的)逆转录(RT)和扩增试剂球体沉积到RT反应室和扩增室的流路中的两个单独的凹槽中能够在不受扩增酶的干扰的情况下实现最佳的逆转录反应。另外，为了使RT酶对随后的扩增反应的干扰最小化，存在于RT反应中的RT反应后的RT酶可以在引入扩增试剂之前被热灭活以使其对扩增的干扰最小化。可选地，可以将其它盐、表面活性剂和其它增强化学制品添加到不同的凹槽中以调节化验的性能。此外，这些凹槽促进了冻干试剂在液体通过凹槽时与液体的多根并合而且有助于在超声波焊接期间使冻干材料与超声波能量绝缘以及有助于在冻干试剂的增溶之前在检测的加热步骤期间使冻干试剂与温度极限绝缘。此外，凹槽确保冻干球体在制造过程中不被压缩或压碎，使其能够保持多孔以使再水化时间最小化。

在本发明的一些实施例中，检测微粒是流体部件的另一附加成分。在一些实施例中，可以如上述反应试剂将这些微粒冻干。在其它实施例中，液体缓冲液中的微粒可以直接施加到流体腔室的内表面并在检测盒的最终装配之前烘干。包含微粒的液体缓冲液优选地还包括有助于再水化的糖或多元醇。在烘干之前将缓冲溶液中的微粒直接合并到流体部件中可以精简和减少最终制造成本，并且完成冻干颗粒与反应溶液的多根并合以及通过加热或核沸腾可以促进将核酸的双链核酸或双链区域变性为单链核酸。在一些实施例中，冻干的检测颗粒被安置在流体网络的凹槽中。在其它实施例中，将冻干的或烘干的检测颗粒安置在检测条正下方的空间93中。在其它实施例中，将检测颗粒烘干或冻干成与检测条毛细管连通的吸水基板或直接在检测条上烘干或冻干。毛细管连通可以是吸水基板与检测条的直接或间接的物理接触，其中，毛细管连通在由通道或腔室区域组成的居间距离上，通过该居间距离实现毛细管运输，以将流体从装载检测颗粒的吸水基板运输到检测条。

在本发明的一些实施例中，横向流动检测条装配件也被合并到流体部件中。检测条优选地包括由至少一个多孔组件构成的膜装配件并且可选地可以包括吸收衬垫、检测膜、表面活性剂衬垫和背面膜。检测膜优选地由硝酸纤维素、纤维素、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙或聚四氟乙烯制成并且可以受塑料膜支持。如上所述，捕获探针可以以线、点、微阵列或任何可由无辅助的人眼或自动检测系统(例如成像系统)可视化的图案被沉积并不可逆地固定在检测膜上。在捕获探针沉积之后，沉积的寡核苷酸可以通过检测膜的紫外光照射被永久固定。表面活性剂衬垫可以包括优选地具有最小的核酸结合和液体保留特性的多孔基板，其允许核酸产物和检测微粒的无障碍迁移。表面活性剂衬垫可以包括例如玻璃纤维、纤维素或聚酯的材料。在本发明的实施例中，包括至少一种两亲试剂的制剂在表面活性剂衬垫上被烘干以允许样品通过检测膜均匀迁移。吸收衬垫可以包括任何吸收材料，并有助于通过检测膜组件引起样品芯吸。使用例如双面粘合剂膜的粘合剂背面膜作为基底，检测膜组件通过首先安置检测膜、随后通过可选的吸收衬垫和/或表面活性剂衬垫与检测膜物理接触(具有约1mm和约2mm之间的重叠)被装配。在本发明的一些实施例中，检测膜可以与表面活性剂衬垫间接毛细管连通，其中，在表面活性剂衬垫和检测衬垫之间存在物理间隔，其中，间隔空间由毛细管空间构成，其中，流体可以借助于毛细管作用穿过该空间。在一些实施例中，表面活性剂衬垫或表面活性剂衬垫的区域可以包括检测颗粒、干燥的检测颗粒或冻干的检测颗粒。

三腔室检测盒

在本发明的一些实施例中，用于烘干的或冻干的试剂的附加的反应室和/或附加的凹槽可以被合并。在一些实施例中，这样的设计促进了在逆转录和扩增之前需要提供初始的单独的溶解反应的检测。如图37A、图37B和图38所示，检测盒5000包括密封膨胀室5021的盖子5020、优选地设置成与流体部件5023紧密接触的柔性加热器电路5022以及将电路向用户隐藏的后盖5024。包含核酸的样品通过样品端口5001被引入到样品杯5002中。样品自由流入凹槽5003中，在凹槽5003中，在沿通道5005向下流入第一反应室5006之前样品重新组成优选地包括溶解试剂的第一冻干珠粒5004。这种自由流动由连接到样品杯5002的顶部的排气通道5007促进。排气通道5007可以另外经由孔5008连接到膨胀室5021。由于流体流动，第一反应室5006下方的密封空气空间稍微加压并且使流动正好停止在第一反应室5006下方。然后优选地将第一反应室5006加热至一定温度以促进与溶解试剂的适当反应，溶解样品中的生物颗粒和/或细胞，使其中存在的任何核酸均暴露。

连接到第二反应室5011的顶部的排气阀5009的打开然后促进样品流入第二凹槽，在第二凹槽优选地包括用于逆转录的试剂的第二冻干珠粒5010被重新组成。然后流体进入由于在流体下面的封闭空气体积中的空气压力增加流体流动停止的第二反应室5011。然后优选地，第二反应室5011随后被加热到合适的温度以促进逆转录过程。

连接到第三反应室5013的顶部的下一个排气阀5009的打开启动样品从第二反应室5011流过第三凹槽，在第三凹槽优选地包括冻干的PCR扩增试剂的冻干珠粒5012被重新组成。然后样品流入第三反应室5013，在此经受热循环以扩增存在于样品中的靶向分析物。

随后，连接到横向流动条5014的远端的最终排气阀5009打开，使得现在包含扩增的分析物的样品能够流动到横向流动条5014，以便如前文所述地检测分析物。

流动控制特征

流体部件的设计可选地包括在反应室内或出口处的流动控制特征。在流动进入出口之前，这些特征将进入腔室的流动偏转到腔室的与出口相对的一侧。结果，流动以较低的速度进入出口通道，从而减小了流体在停止前沿通道向下流动的距离。此外，流路的水平分量增加了通道的长度而不增加腔室之间的竖直间距，因而增加了流路的有效长度并充分地基于流动的减小的速度在所需的位置停止流动。由于需要较少的竖直通道，所以使得检测盒的腔室之间的竖直间隔更近。另外，流动穿过反应室的重新取向在腔室内的流动中产生漩涡作用，改善了试剂与样品流体的混合。流动控制特征可以包括任何形状。

在图39所示的实施例中，流体从入口通道4002进入反应室4003并流动到反应室的底部，在那里通过三角形流动控制特征被重新取向到与入口通道4002的开口相对的反应室4003的一侧。当流动继续进行到对角4004时，流动与一些进入出口4005的流动分开，而其余部分接触壁并被向上取向，产生改善混合的漩涡效应。流入出口的流动优选地形成弯月面并且通过出口通道4006朝向下一个反应室或冻干珠粒凹槽前进。由于出口通道4006被密封在反应室4003下方，随着流体沿着出口通道4006前进，在流动下面的通道中的空气压力增加直到与流体压头达到平衡，从而停止流动。在本实施例中，出口4005从反应室4003到出口通道4006逐渐变细以便有效地形成随后可以在流动下游的封闭空气空间中增加压力的弯月面。出口通道的这个较大的开口优选地提供增加的可压缩空气体积，使得弯月面可以在较宽的开口处可靠地形成。

在图40所示的实施例中，流体从入口通道4102进入反应室4103并流到反应室的底部，在那里通过三角形流动控制特征被重新取向到与入口通道4102的开口相对的反应室4103的一侧。随着流动继续进行到对角4104时，流动与一些进入出口4105的流动分开，而其余部分接触壁并被向上取向，产生改善混合的漩涡效应。流入出口的流动优选地形成弯月面并且通过出口通道4106朝向下一个反应室或冻干珠粒凹槽前进。由于出口通道4106被密封在反应室4103下方，随着流体沿着出口通道4106前进，在流动下面的通道中的空气压力增加直到与流体压头达到平衡，从而停止流动。在本实施例中，出口4105和出口通道4106具有均匀的宽度。在本实施例中，由于较窄的通道，反应室处的弯月面的形成可能稍微更可靠一些。随后，弯月面在流动下游的封闭空气空间中增加压力。

在图41所示的实施例中，流体从入口通道4202进入反应室4103并流到反应室的底部，在那里通过梯形流动控制特征被重新取向到与入口通道4202的开口相对的反应室4203的一侧。随着流动继续进行到对角4204，流动与一些进入出口4205的流动分开，而其余部分接触壁并被向上取向，产生改善混合的漩涡效应。在本实施例中，出口4205基本上竖直地取向。流入出口的流动优选地形成弯月面并且通过出口通道4206朝向下一个反应室或冻干珠粒凹槽前进。由于出口通道4206被密封在反应室4203下方，随着流体沿出口通道4206前进，在流动下面的通道中的空气压力增加直到与流体压头达到平衡，从而停止流动。在本实施例中，出口4205和出口通道4206具有均匀的宽度。在本实施例中，由于较窄的通道，反应室处的弯月面的形成可能稍微更可靠一些。随后，弯月面在流动下游的封闭空气空间中增加压力。

在图42所示的实施例中，流体从入口通道4304进入反应室4305并流到反应室的底部，在那里通过三角形流动控制特征被重新取向到与入口通道4304的开口相对的反应室4305的一侧。随着流动继续前进到对角4306，流动与一些进入出口4307的流动分开，而其余部分接触壁并被向上取向，产生改善混合的漩涡效应。进入出口的流体优选地形成弯月面并且通过出口通道4306朝向下一个反应室或冻干珠粒凹槽前进。在本实施例中，出口通道4306通过提供流体流动的曲折路线的堆叠串联的流动控制特征4303、4302和4301前进，从而在小的竖直空间中提供增加的出口通道长度。

在图43所示的实施例中，流体从入口通道4402进入反应室4403，并通过设置在反应室底部上方优选地约沿着反应室4403的长度的一半的流动控制特征4401被重新取向到与入口通道4402的开口相对的反应室4403的一侧。与之前的实施例相反，流动控制特征4401不形成反应室4403的出口。流动控制特征4401将流动远离出口通道4405偏转到对角4404，从而在离开腔室之前减少流动速度。类似于之前的实施例，流体的重新取向促进湍流和试剂混合。

化验的多路复用

在本发明的一些实施例中，可以通过采用能够将输入的流体样品分成两个或多个穿过装置的并行的流路的流体设计来并行地执行多重独立的化验。图10是表示将流体体积(例如80μL)以两个连续步骤分成首先两个单独的40μL体积并随后分成四个20μL体积的示意图。所示方案对于在分割体积上进行例如生物化学反应的分开的独立操作是有用的。这样的构造对于通过促进多重靶标(例如多路复用核酸逆转录和/或扩增反应中的核酸序列)的多路复用的检测来增加可在单个设备中检测到的分析物的数量是有用的。类似地，在独立流路的末端使用多个检测条可以提供用于检测多重靶标或区分核酸分析物中的序列差异或突变的检测条的增强的可读性。此外，提供用于多重扩增反应产物的独立感测的附加的检测条可以通过减少在检测的检测步骤期间的假交叉反应(例如交叉杂交)的可能性来增强特异性。图11示出了在单个检测盒中包括两个流路的检测盒。每个流路可以相对于时间、反应类型等被独立地控制。现在参考图12，引入到样品杯1000中的样品被分成大致相等的体积并且流入体积拆分室1001和1002中，流入拆分室通过排气阀1003和1004调节。拆分室1001和1002通过被动地平衡每个腔室中的样品量来控制每个检测路径中的样品的体积。在体积拆分之后，通过打开排气口1005和1006，允许溶液流过试剂凹槽1007和1008。试剂(例如冻干的试剂)设置在凹槽1007和1008中并随着样品流过凹槽并进入第一组优选的温控室1009和1010中而与样品混合。由试剂凹槽1007和1008中提供的试剂促进的反应(例如高温溶解、逆转录和/或核酸扩增)在第一组被加热的腔室中的每一个中进行。这样的试剂可以包括但不限于冻干的阳性对照剂(例如核酸、病毒、细菌细胞等)、RNA逆转录为DNA和/或使用冻干的DNA聚合酶或热稳定的冻干的DNA聚合酶和必需的辅助试剂(例如核苷酸、缓冲剂和盐)的DNA扩增所需的冻干的逆转录酶和相关辅助试剂，例如核苷酸、缓冲剂、DTT、盐等。

在第一组腔室中的例如逆转录、核酸扩增或伴随的逆转录和核酸扩增(例如单管逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)或一步RT-PCR或一步RT-Oscar)的生物化学反应完成后，排气凹穴1011和1012的密封件被破裂以允许流体从第一组腔室流过第二组试剂凹槽1013和1014并进入第二组优选的温度控制腔室1015和1016。试剂(例如冻干的试剂)可设置在凹槽1013和1014中，使得随着流体从腔室1009和1010流到腔室1015和1016而与样品溶液混合。试剂(例如用于核酸扩增的冻干的试剂或烘干的或冻干的检测颗粒(例如探针共轭的染料的聚苯乙烯微球体或探针共轭的胶体金))可选地安置在试剂凹槽1013和/或1014中。在被加热的腔室中的反应或其它操作(例如结合到共轭的检测颗粒或与探针共轭的检测颗粒杂交)完成之后，通过打开排气阀1019和1020允许溶液流入检测条腔室1017和1018中。在一些实施例中，第三组试剂凹槽可以安置在来自腔室1015和1016的流路中，使得例如包含检测颗粒、盐和/或表面活性剂的检测剂和可以用于促进杂交或其它检测形式的其它物质的附加的试剂可以与流入到检测条腔室1017和1018中的溶液混合。检测条腔室1017和1018可以被加热并且优选地包括用于检测例如扩增的核酸的分析物的例如横向流动条的检测条。检测条可以包括掺杂或配有烘干的或冻干的检测剂(例如检测颗粒(例如染料的微球轭合物和/或胶体金轭合物))、用于捕获分析物的捕获探针(例如用于通过序列特定杂交捕获核酸分析物的杂交捕获寡核苷酸)、用于捕获适当更改的分析物的配体(例如生物素或链霉亲和素)和吸收材料的一系列吸收材料以提供充分地确保样品溶液体积通过毛细管作用或芯吸等方法通过检测条彻底迁移的吸收能力。

样品制备

在本发明的一些实施例中，可能需要将样品制备系统合并到检测盒中。样品制备系统(例如核酸纯化系统)可以包括用于完成样品制备和将纯化的分子(例如纯化的DNA、RNA或蛋白质)洗脱到检测盒中的封装的溶液。图13描绘了设计为与检测盒集成的核酸样品制备子系统1300。样品制备子系统包括主壳体1302和壳体盖子1301以容纳子系统的组件。溶液区室化组件1303包括粗样品池1312，其优选地在上表面是敞开的但在下面由下密封件1305密封。溶液区室化组件1303还优选地包括包含第一清洗缓冲液的蓄池1314和包含第二清洗缓冲液的蓄池1315，这两者优选地借助上密封件1304和下密封件1305密封。核酸结合基质1306安置在由吸收材料1307和1308提供的溶液毛细管流路中。表现出核酸结合性质和芯吸性质的玻璃纤维或硅胶是适合于用作结合基质1306的材料的例子。范围广泛的吸收材料可以包括吸收材料1307和1308，包括聚酯、玻璃纤维、硝化纤维素、聚砜、纤维素、棉花或它们的组合以及其它芯吸材料，只要它们提供足够的毛细管作用和最小限度地结合待子系统纯化的分子。任何能够被密封到溶液区室化组件1303并且与封装的溶液化学兼容的容易破裂或易碎的材料适合用作密封材料1304和1305。密封材料1305与样品或样品溶解产物接触，并且必须另外与样品或样品溶解产物化学兼容。合适的密封材料的例子是可热密封的金属膜和塑料膜。密封材料1305在使用时通过溶液区室化组件1303的移位，使得密封件1305被存在于壳体1302中的结构1311刺穿而破裂。粗样品或与裂解缓冲液(例如由离液剂组成的缓冲液)混合的粗样品在使用时经由盖子1301中的样品端口1309被引入样品池1312。在一些实施例中，裂解缓冲液可选地通过延伸密封件1304，以覆盖样品池1312的上部孔口而封装在样品池1312中。在这样的实施例中，可能需要包括用于部分去除覆盖样品池1312的密封件1304的区域的标签或其它手段以允许将粗样品添加到样品池1312，使得粗样品可以与其中包含的裂解缓冲液混杂或混合。样品溶液或包含样品材料的溶解产物被引入到样品添加端口1309中，并被保留在缓冲液池1303的样品池1312中，直到启动样品制备过程。

在样品制备启动时，溶液区室化组件1303被推到密封穿孔结构1311上，导致蓄池1312中的溶液或溶解产物以及蓄池1314和1315中的第一清洗缓冲液和第二清洗缓冲液分别同时释放。组件1303的机械移位可以手动地或者通过使用存在于可重复使用的器械中的一个或多个致动器来完成，在使用时一次性检测盒安置在可重复使用的器械中。优选地通过壳体盖子1301的进入端口1310提供致动器进入或手动移位机构进入蓄池1303。样品或溶解产物溶液以及第一清洗缓冲液和第二清洗缓冲液通过毛细管作用移动通过材料1307、1306和1308。蓄池的物理排列和吸收材料1307的几何构造确保了粗溶解产物、第一清洗缓冲液和第二清洗缓冲液顺序流动通过结合基质1306。用于确保所有溶液体积通过系统的持续毛细管运输的附加的吸收能力由与吸收芯1308接触安置的吸收垫1313提供。在通过吸收材料完成溶液运输时，废溶液停留在吸收垫1313中。在所有溶液通过系统的毛细管运输衰竭之后，纯化的核酸与结合基质1306结合，如图15所示，核酸可从结合基质1306洗脱到集成检测盒的样品杯1402中。

在样品制备过程期间发生的样品制备子系统组件的移动如图14所示，图中的横截面描绘了在样品处理之前和之后的样品制备子系统的实施例。洗脱之前是在相关的可重复使用的检测器械中的致动器的作用下将结合基质1306移出毛细管流路并通过密封部件1316。密封部件1316与洗脱缓冲液导管1318的一部分形成密封以允许将洗脱缓冲液通过结合基质1306注射到样品杯1402中，而没有溶液损失到样品制备子系统的毛细管流路。导管1318附接到由洗脱缓冲液池1317和柱塞1319组成的洗脱缓冲液注射器组件或洗脱缓冲液注射器组件的一部分。柱塞1319可选地包括O形环以便于将洗脱缓冲液密封在蓄池1317内。在纯化的核酸的洗脱期间，致动器移动洗脱池组件1317，使得附接的导管1318与密封部件1316形成密封并且将结合基质1306移位到腔室1321。通过致动器接入端口1320提供压下洗脱池1317的机械进入。在将结合基质1306从样品制备子系统的主毛细管溶液流路中移出之后，结合基质1306位于洗脱室1321中。将纯化的核酸洗脱到样品杯1402中是通过这样实现的：通过致动器以类似注射器的动作移动柱塞1319穿过蓄池1317来推动来自洗脱缓冲液池1317的洗脱缓冲液，致动器通过致动器端口1322作用。洗脱缓冲液经由导管1318通过结合基质1306继续前进，导致包含洗脱的纯化的核酸的洗脱缓冲液注入样品杯1402中。

现在参考图15，样品制备子系统1300优选地通过广泛使用的制造方法(例如超声波焊接)与检测盒1500的流体部件1403结合以形成集成的一次性使用的样品到结果的检测盒。在一些实施例中，在引入包含纯化的核酸的洗脱液之后，期望气密密封检测盒流体以便减少扩增的核酸从检测盒逸出的可能性。滑动密封件1404可选地但优选地被安置在样品制备子系统和检测盒流体的壳体1403之间以在样品杯1402的入口处将检测盒密封。在致动器的作用下将滑动密封件1404移动到密封位置以形成包括O形圈1405的气密密封。在引入烘干的试剂和检测条之后，将检测盒的盒背1406与流体的壳体结合。如上面对于其它检测盒实施案例的背面所描述的，背面1406包括用于排气口功能、气密密封维护、热界面、(一个或多个)膨胀室的材料并且可选地包括承载流体和温度控制电气部件的印刷电路板或柔性电路层。电气部件可选地容纳在可重复使用的对接单元中。包括电气部件的PCA1501优选地由低热容量材料和表面安装的电气部件构造。表面安装的电阻器阵列和位于近端的温度传感器提供了一种调节检测盒中腔室温度的方法。当检测盒被装入对接单元中时，PCA 1501的表面安装的电阻器和温度传感器阵列位于与检测盒对齐的位置。图16示出了样品到结果的集成盒。图17示出了具有基于传统印刷电路板和表面安装的组件的基础电子层的集成盒。在一些实施例中，柔性电路可以与检测盒的后部结合。

电子器件

在一些实施例中，期望将电气部件安置在可重复使用的组件中，使得加热器、传感器和其它电气部件通过能够建立有利的热界面以及电气部件与它们必须与之连接的一次性检测盒的上覆盖的元件准确的对齐的手段与一次性检测盒相连接。在其它实施例中，期望使用可重复使用的组件和一次性部件的组合用于温度控制。例如，可以使用安置在可重复使用的对接单元中的红外传感器来完成隔离温度监测，同时用于温度控制和流体控制的电阻加热器被安置在集成到一次性检测盒中的柔性电路中。

在一些实施例中，印刷电路板(PCB)包括标准的0.062英寸厚的FR4覆铜层压板材料，但也可以使用其它标准的板材料和厚度。例如电阻器、热敏电阻器、LED和微控制器的电气部件优选地包括现成的表面安装设备(SMD)并且根据工业标准方法来安置。

在替代实施例中，PCA可以与盒壁集成并且包括柔性塑料电路。如图8所示，可以使用例如PET和聚酰亚胺的柔性电路材料。柔性塑料电路的使用在本领域是众所周知的。在另一个实施例中，加热元件和温度传感器可以利用例如Soligie公司开发的技术被丝网印刷到塑料流体部件上。

在本发明的一些实施例中，PCB厚度以及在围绕电阻加热器的区域中的铜的数量和安置专门适合流体部件中的反应溶液的热管理。这可以通过使用已经提到的标准制造技术来完成。

在本发明的一些实施例中，电阻器是厚膜2512封装，但也可以使用其它电阻器。流体部件中的加热室优选地具有与电阻器的尺寸类似的尺寸以确保贯穿整个腔室的均匀加热。假设流体部件厚度为0.5mm，则这种尺寸的单个电阻器足以加热约15μL的溶液。假设流体部件厚度为0.5mm，图2D中的图示出了形成足以加热约30μL的溶液的加热器的两个电阻器100。在这种情况下，电阻器优选地每个40欧姆并且以并行构造排列。

在本发明的一些实施例中，温度传感器110优选地包括例如0402NTC设备的热敏电阻器或者例如Atmel AT30TS750的温度传感器，其中的每一个具有与2512电阻器封装的高度类似的高度。在分别一个电阻器或两个电阻器设置的情况下，热敏电阻器优选地被排列成与电阻加热器邻近或位于电阻加热器之间。通过紧密地排列这些电气部件，它们之间只产生非常薄的空气间隙结果。此外，在将流体与电子层装配之前应用散热膏确保了流体部件、电阻器和热敏电阻之间的良好的热接触。

在本发明的一些实施例中，排气口电阻器70和71包括厚膜0805封装，但也可以使用类似的电阻器。为代替电阻器，也可以使用小规格镍铬合金线加热元件，例如40规格镍铬合金线。

在本发明的一些实施例中，微控制器是Microchip Technologies PIC16F1789。微控制器优选地与流体系统的复杂性相匹配。例如，多路复用时，单个排气口和加热器的数量与微控制器I/O线的数量相当。可以选择内存大小以适应程序大小。

在本发明的某些实施例中，以开-关(ON-OFF)模式操作的SOT-23封装中的N沟道金属氧化物半导体场效应管(MOSFET)被用于调制通向排气口和加热器电阻器的电流负载。调制信号经由微控制器发送。在替代实施例中，脉宽调制方案和/或其它控制算法可以用于流体的更高级的热管理。这通常将由微控制器来处理，并且可能需要本领域技术人员已知的附加的硬件和/或软件特征。

根据用途，一些实施例包括在中小型控制对接单元或对接单元操作较小的一次性单元的设备，较小的一次性单元包括与生物材料接触的流体系统(称为检测盒)。在一个这样的实施例中，对接单元包括电气部件。从一次性检测盒中消除电气部件降低了成本，并且在一些情况下降低了对环境的影响。在另一个实施例中，一些电气部件被既包括在对接单元中又在检测盒中。在该特定实施例中，检测盒优选地包括低成本PCA或优选地包括柔性电路以提供由对接单元通过合适的接口供电、控制和/或感测的一些电气功能，例如温度控制、流体流动控制和温度感测。如上所述，这种设备的电气功能优选地分成两个单独的子组件。一次性检测盒2500优选地包括被设计成与对接单元的电阻加热和感测元件相连接的后表面。包括检测盒的背面的材料优选地被选择为提供合适的导热性和热稳定性，同时能够通过排气口破裂来控制流体流动。在一些实施例中，检测盒的背面或其一部分包括在例如聚酰亚胺的基板上制造的柔性电路。可以使用柔性电路来提供具有低热容量的低成本电阻加热元件。柔性电路基板可以优选地安置成与存在于检测盒的流体网络中的溶液直接接触以实现高效且快速的加热和冷却。如图8所示的连接器810优选地将电流提供给电阻加热器连同功率和信号线提供给可选的热敏电阻。

如果使用柔性电路799，则位于对接单元中的一个或多个红外传感器可通过穿过背面805中的窗口或直接从柔性电路799的后部读取信号来监测被加热的腔室(例如扩增室或检测室)的温度。可选地，可以使用PCA或柔性电路799上的热敏电阻来监测温度。可选地，执行红外传感器和热敏电阻的输出的加权平均值改善了读数与盒中的流体温度之间的相关性。此外，传感器还可以检测环境温度，使系统能够对其进行校正以确保样品流体迅速平衡到所需的温度。

现在参考图33，对接单元优选地包括可重复使用的组件子组件3980，组件子组件3980包括微控制器、MOSFET、开关、电源或电源插孔和/或电池、可选的冷却风扇903、可选的用户交界面、红外线温度传感器901和902以及与检测盒2500的连接器810兼容的连接器900。当子组件经由连接器810和900配对时，对接单元优选地将一次性检测盒2500以大体上竖直或近似竖直的方向支撑。尽管在本文描述的一些实施例中大体上竖直的方向是优选的，但如果设备倾斜着操作，特别是如果某些路径被包被以减小所使用的溶液的润湿角度，则可以获得类似的结果。

通过消除位于一次性部件上的所有电子电路来减少系统的易损件的成本，通过减少系统的易损件的成本，该设备的另一个实施例可以被使用以最小化操作成本。微控制器、加热器、传感器、电源和所有其它电路位于多重PCA上并经由高导体数量的工业标准带状电缆相互电连接。还可以添加显示器以帮助用户操作设备。还可以使用可选的串行控制端口以允许用户上传检测参数的变化，并监测任何检测的进度。本实施例的一个版本包括五个不同的PCA。主板PCA包含控制电路、串口、电源和连接到系统中的其它板的连接器。加热板PCA包含加热电阻元件、温度传感器和排气口燃烧加热元件。为了促进该加热器板和一次性流体检测盒之间的热界面，该板被安装在弹簧加载的载体上，该弹簧加载的载体通过盖子的关闭动作朝向流体检测盒的背面移动，直到与流体检测盒的接触形成。薄的导热加热垫被固定在腔室加热器电阻器和温度传感器的顶部，改善加热器板和流体盒之间的热传递。使用包裹在小陶瓷载体上的镍铬合金线可以实现耐用的排气口燃烧加热元件。红外传感器板PCA安装在距离检测盒的相对侧的一小段距离处并用于监测加热室的温度。这允许加热和冷却过程的闭环温度控制，并适应环境温度变化。多重反射式感测光学耦合器也安装在红外传感器板上，其允许感测检测盒的存在，并且可以用于识别由位于检测盒上的可配置的反射图案指示的检测盒的类型。显示板PCA可大约位于红外线板后面以允许用户从设备正面看到显示。最终的PCA、快门板位于检测盒的顶部边缘对面并包含一个开关和用于感测检测盒是否已被使用的反射式光学耦合器，并且当盖子关闭时，将检测盒保持在用于检测的适当位置。

只有在检测的冷却阶段期间才使用由微控制器启动的例如松饼型风扇的风扇来增强系统冷却。排气口系统优选地用于将较冷的外部空气引导至加热室并将其排出设备的侧面。

为了提供完整的样品到结果的分子检测，本发明的上述实施例中的任何一个可以与提供核酸作为输出到样品室1402的样品制备系统1300连接。这已经使用在发明名称为“Highly Simplified Lateral Flow-Based Nucleic Acid Sample Preparation andPassive Fluid Flow Control(高度简化的横向流动型核酸样品制备和被动的流体流动控制)”的国际公开No.WO 2009/137059 A1中描述的样品制备技术证明了。图15和图16示出了所得到的集成装置的一个实施例。

对接单元

可重复使用的对接单元包括实现检测盒功能的必需电气部件。已经发明了各种对接单元实施例以与检测盒设计方案中的相应变化对接。在一个实施例中，如图18和图19所示，对接单元包括运行检测所需的全部电气部件，从而消除了在检测盒中对电气部件的需要。现在参考图18，在添加样品之前，将检测盒2500插入对接单元2501。对接单元2501包括例如LCD显示器2502之类的显示器以向用户传递例如检测协议和检测状态之类的信息。在将检测盒插入对接单元2501之后，将样品引入到检测盒2500的样品端口20，并且关闭对接单元盖2503以开始检测。图19中示出了具有插入的检测盒的对接单元，图18B中示出了盖子处于关闭位置的对接单元2501。

在对接单元的一些实施例中，将检测盒的滑动密封件91移动到关闭位置的机构被合并到盖子2503的铰链中。密封的检测盒有助于确保扩增的核酸保留在检测盒中。现在参考图20，可以采用手动或自动方法滑动样品端口上方的阀以密封检测盒。在一些实施例中，滑块通过接合O形环来密封样品端口。膨胀室盖将阀保持在样品端口O形环上方适当的位置。通过伺服电机或通过手动操作(例如关闭可重复使用的对接单元盖)将密封件移动到适当的位置，密封件移动到适当的位置继而驱动机构关闭检测盒盒密封件。在图示的实施例中，齿条和小齿轮机构2504采用滑动密封件致动器3979将滑动密封件91移动到关闭位置。齿条和小齿轮机构2504可以通过对接单元盖2503的闭合动作通过到盖子铰链的机械耦合而被机动化或移动。可选地，例如光学传感器2505的传感器可以位于感测滑动密封件91的位置以确保在化验开始之前适当的密封安置，如图21所示。光学传感器检测检测盒样品端口密封件的状态(即位置)。光学传感器允许对接单元被编程以检测先前使用的检测盒的意外插入以及检测检测盒密封件的成功关闭。可以在显示器2502上显示指示密封件故障的错误消息，并且如果传感器2505未能检测到密封件关闭，则中止检测程序。在检测盒和对接单元的其它实施例中，如图22所示，密封机构可以包括机械地密封腔室的其它手段，例如旋转阀。但在另一个实施例中，检测盒密封件可以被安置在铰链式的盒盖子中，安置成使得如果没有首先关闭盒盖子并因此将密封件就位，则不能插入对接单元。在又一个实施例中，检测盒密封件可以被安置在铰接式的盒盖子中，安置成使得如果没有首先关闭盒盖子并因此使密封件就位，则不能插入对接单元。在本实施例中，在插入对接单元之前将样品添加到检测盒。图23中示出了包括具有密封件的铰接式的盖子的检测盒。通常，在将检测盒插入对接单元中并且将样品装入检测盒中之后，优选地关闭对接单元的盖子既自动地密封检测盒又开始化验，优选地不使用伺服器或其它机械设备。

在一些对接单元的实施例中，一组组件优选地促进适当的检测盒插入同时确保必须与检测盒连接的电气部件不会物理干扰检测盒插入，还在检测期间形成可靠的热界面。这些组件形成用于保持PCA75远离检测盒插入路径直到盖子2503关闭的机构。现在参考图24，在对接单元内，加热器板安装在PCA保持器2506上，该PCA保持器2506优选地用作低热容量的脚手架，而检测盒被装载到低热容量的检测盒保持器2507中，其中，导轨2509引导检测盒进入对接单元并将其保持在正确的位置，例如平行于加热器板表面，以与安装在PCA保持器2506上的PCA 75连接。在盖子打开位置，检测盒保持器2507上的突出部2508妨碍PCA保持器2506，以维持用于检测盒插入的沿轨道2509的开放路径。优选地，倾斜表面跨越了突出物2508的表面和组件2507的下部隆起之间的距离以促进在盖子2503关闭期间突出物2508平滑地移动到PCA保持器2506上的凹陷部2511中。在对接单元盖关闭时，突出物2508与凹陷部2511接合，由此将加热器板底座移动靠近检测盒2500的后表面。盖子2503的闭合在检测盒保持器2507上施加向下的力，由此将检测盒保持器2507移动到突出物2508停留在凹陷部2511中的位置，导致PCA保持器2506的移动，使得PCA75被压靠在检测盒2500的后部。优选地，PCA保持器2506处于恒定的力(例如弹簧力)下，以使得在盖子关闭之后能够通过PCA 75对检测盒的后部施加可再生的压力。将PCA 75安置在检测盒2500的后部形成将来自PCA上的电阻加热器元件的热量传导到检测盒的温控室和排气口的热界面。优选地，组件2506和2507被构造成向系统贡献最小的热容量并且提供通向检测盒表面用于冷却例如风扇的装置的入口以及通过传感器(例如红外传感器)的温度监测。因此，在盖子关闭之后，加热器板优选地稳固地压靠在检测盒的后部，形成使得加热器板上的微加热器能够加热检测盒的流体腔室中的溶液并且熔化检测盒的热不稳定排气口膜的热界面，优选地根据微控制器或微处理器控制。图25以横截面图示出了在松开(盖子打开)位置和接合(盖子关闭)位置的检测盒-PCA连接机构。

在一些实施例中，对接单元包括用于例如温度感测的应用的附加传感器，检测检测盒的存在或移除以及检测用于实现检测参数的自动选择的特定检测盒。现在参考图26，红外传感器2600在覆盖温控室(例如腔室30和90)的区域中检测检测盒的温度。除了或代替由PCA 75局部的温度传感器(例如传感器110)收集的温度数据，这些传感器能够收集温度数据。光学传感器可选地但优选地用于检测特定的检测盒以识别用于特定疾病或病症的检测盒以及允许自动选择适合于特定检测的温度分布。现在参考图27A和图27B，光学传感器或光学传感器阵列(例如光学传感器阵列2601)可以与检测盒上的条形码或像条形码的特征2602配合使用以确定检测盒的类型并确认检测盒的完全插入和正确就位。与传感器2505相呼应的传感器阵列2602可以被用来通过在盖子关闭之前检测封闭的密封件来检测先前使用的检测盒的插入。对接单元可以包括传感器以检测插入到对接单元中的检测盒的类型和/或确认对接单元内的检测盒的正确插入、定位和对准。在图19所示的对接单元和检测盒系统中示出了甲型流感/乙型流感检测盒的检测。对接单元优选地还可以读取每个盒上的条形码或其它符号并根据用于不同化验的存储程序改变其编程。

在本发明的一些实施例中，期望加热检测盒的两侧。图28A和图28B示出了检测盒被插入在两个加热器PCA之间的双加热器PCA构造。

在另一个实施例中，对接单元包括伺服致动器、用于自动结果读出的光学子系统、无线数据通信子系统、触摸屏用户界面、可再充电电池电源以及接受包括集成的样品制备子系统的检测盒的检测盒接收器。现在参考图29A、图29B和图30，对接单元2700接受检测盒1500并将检测盒与PCA1501热接触以实现检测盒的温度控制和流体流动控制。检测盒1500被插入绕轴旋转的对接单元门2702的检测盒接收器槽3605中。在将粗样品或溶解产物添加到检测盒之后，对接单元门的关闭将检测盒的后部安置成与PCA1501对齐并接触以及与伺服致动器排列整齐。伺服致动器3602位于通过检测盒1500的致动器端口1310进入溶液区室化组件1303并提供破裂密封材料1305所需的机械力。如上所述，机械密封件1305的破裂释放粗溶解产物和清洗缓冲液以流过样品制备子系统的样品制备毛细管材料。在完成毛细管流体输送之后，伺服致动器3601(其位于通过检测盒1500的致动器端口1320进入洗脱池1317)提供机械力以移动组件1317，使得附接的导管1318与密封件1316形成密封并且将结合基质1306移位到洗脱隔室1321。位于通过检测盒1500的致动器端口1322进入洗脱柱塞1319的伺服致动器3604然后向柱塞1319提供机械力以从洗脱池1317排出洗脱缓冲液通过结合基质1306，导致核酸洗脱到检测盒1500的样品杯1402中。如上所述，伺服致动器3603在洗脱之后密封检测盒。致动器控制优选地由控制电子器件PCA 3606上的微控制器或微处理器根据固件或软件指令提供。类似地，检测盒内的温度和流体流动控制根据存储在微控制器或微处理器存储器中的固件或软件例程中提供的指令。包括图31所示，LED光源3608和CMOS传感器3609的光学子系统3607将检测条信号数据数字化。收集的检测条图像被存储在对接单元内的存储器中，其中，结果解释可以使用机载处理器来完成并被报告给LCD显示器2701。LED环在使用基于CMOS的数码相机的图像采集过程中提供均匀的照明。使用邮票大小的设备收集的图像可以提供适用于比色的横向流动信号分析的高分辨率数据(500万像素，10位)。优选地，低剖面设计(～1cm)以及短工作距离光学器件使系统能够被集成到薄设备外壳中。

可选地，数字化结果可以经由并入到使用标准WiFi或蜂窝通信网络的对接单元中的无线通信系统而被传输用于离线分析、存储和/或可视化。图32A和图32B示出了该对接单元实施例的照片。

实例

实例1：纯化病毒RNA(甲型流感/乙型流感(inf A/B))和内部阳性对照病毒的多路 复用扩增和检测方法

将甲型流感和乙型流感检测盒安置在对接单元中。将40μL样品溶液加入样品端口。样品溶液包括浓度等于5000TCID₅₀/mL的纯化的A/波多黎各流感病毒RNA、浓度等于500TCID₅₀/mL的纯化的B/布里斯班流感病毒RNA或分子级水(无模板对照样品)。在进入样品端口时，40μL样品在流入检测盒的第一腔室时与冻干珠粒混合。冻干珠粒由MS2噬菌体病毒颗粒(作为阳性内部对照)和DTT组成。在检测盒的第一腔室中，将样品加热至90℃达1分钟以促进病毒细胞溶解，然后在打开连接到第二腔室的排气口之前冷却至50℃。打开连接到第二腔室的排气口允许样品通过使第二腔室中的空气移位到膨胀室而流入第二腔室。随着样品移动到第二腔室，它与针对甲型流感、乙型流感和MS2噬菌体的寡核苷酸扩增引物以及作为冻干球体存在于第一腔室和第二腔室之间的流路的凹槽中的逆转录和核酸扩增试剂和酶混合。

将扩增室加热至47℃达6分钟，在此期间RNA模板逆转录成cDNA。逆转录完成后，在第二腔室中进行40个循环的热循环扩增。热循环结束后，打开连接到第三腔室的排气口以允许反应物溶液流入第三腔室。第三腔室包括检测条和冻干珠粒，冻干珠粒包括用作检测颗粒的三种蓝染聚苯乙烯微球体轭合物的。轭合物由与寡核苷酸探针共价连接的300nm聚苯乙烯微球体组成，寡核苷酸探针与甲型流感或乙型流感或MS2噬菌体的扩增序列互补。当溶液流入第三腔室时，溶液重新组成冻干的检测颗粒。将三条捕获线固定在横向流动膜上，从设备的底部它们是：不与任何化验的靶标互补的阴性对照寡核苷酸；与乙型流感扩增产物互补的捕获探针；与甲型流感扩增产物互补的捕获探针；和与MS2噬菌体的扩增产物互补的寡核苷酸。在可视化解读结果之前，横向流动条被允许显影6分钟。在横向流动条显影时，甲型流感阳性样品在甲型流感和MS2噬菌体位置显示蓝色检测线的形成，乙型流感阳性样品在乙型流感和MS2噬菌体位置显示蓝色检测线的形成，阴性样品仅在MS2噬菌体位置显示蓝色检测线的形成，如图34所示。

实例2：缓冲液中的病毒溶解产物和内部阳性对照病毒的多路复用扩增和检测方 法

将甲型流感和乙型流感检测盒安置在对接单元中。将40μL样品溶液加入样品端口。样品溶液包括浓度等于5000TCID₅₀/mL的A/波多黎各流感病毒、浓度等于500TCID₅₀/mL的B/布里斯班流感病毒或分子级水(无模板对照样品)。在进入样品端口时，40μL样品在流入检测盒的第一腔室时与冻干珠粒混合。冻干珠粒由MS2噬菌体病毒颗粒(作为阳性内部对照)和DTT组成。在检测盒的第一腔室中，将样品加热至90℃达1分钟以促进病毒细胞溶解，然后在打开连接到第二腔室的排气口之前冷却至50℃。打开连接到第二腔室的排气口允许样品通过使第二腔室中的空气移位到膨胀室而流入第二腔室。随着样品移动到第二腔室，它与针对甲型流感、乙型流感和MS2噬菌体的寡核苷酸扩增引物以及作为冻干球体存在于第一腔室和第二腔室之间的流路的凹槽中的逆转录和核酸扩增试剂和酶混合。

将扩增室加热至47℃达6分钟，在此期间RNA模板逆转录成cDNA。逆转录完成后，在第二腔室中进行40个循环的热循环扩增。热循环结束后，打开连接到第三腔室的排气口以允许反应物溶液流入第三腔室。第三腔室包括检测条和冻干珠粒，冻干珠粒包括用作检测颗粒的三种蓝染聚苯乙烯微球体轭合物的。轭合物由与寡核苷酸探针共价连接的300nm聚苯乙烯微球体组成，寡核苷酸探针与甲型流感或乙型流感或MS2噬菌体的扩增序列互补。当溶液流入第三腔室时，溶液重新组成冻干的检测颗粒。将三条捕获线固定在横向流动膜上，从设备的底部它们是：不与任何化验的靶标互补的阴性对照寡核苷酸；与乙型流感扩增产物互补的捕获探针；与甲型流感扩增产物互补的捕获探针；和与MS2噬菌体的扩增产物互补的寡核苷酸。在可视化解读结果之前，横向流动条被允许显影6分钟。在横向流动条显影时，甲型流感阳性样品在甲型流感和MS2噬菌体位置显示蓝色检测线的形成，乙型流感阳性样品在乙型流感和MS2噬菌体位置显示蓝色检测线的形成，阴性样品仅在MS2噬菌体位置显示蓝色检测线的形成，如图35所示。

实例3：加入阴性临床鼻腔样品中的流感病毒(纯化的)和内部阳性对照病毒的多 路复用扩增和检测方法

将从人类受试者收集的鼻拭子样品放入3mL 0.025％TritonX-100、10mM Tris、pH8.3溶液中，并使用FDA批准的实时RT-PCR检测来检测甲型流感和乙型流感的存在。在本研究中使用前，样本被确认为甲型流感和乙型流感呈阴性。确认的流感阴性鼻腔样品中加入浓度等于5000TCID₅₀/mLA/波多黎各流感病毒，或者在不添加病毒的情况下作为阴性对照使用。将40μL所得的加入的或阴性对照样品加入甲型流感和乙型流感检测盒的样品端口。在进入样品端口时，40μL样品在流入检测盒的第一腔室时与冻干珠粒混合。冻干珠粒由MS2噬菌体病毒颗粒(作为阳性内部对照)和DTT组成。在检测盒的第一腔室中，将样品加热至90℃达1分钟以促进病毒细胞溶解，然后在打开连接到第二腔室的排气口之前冷却至50℃。打开连接到第二腔室的排气口允许样品通过使第二腔室中的空气移位到膨胀室而流入第二腔室。随着样品移动到第二腔室，它与针对甲型流感、乙型流感和MS2噬菌体的寡核苷酸扩增引物以及作为冻干球体存在于第一腔室和第二腔室之间的流路的凹槽中的逆转录和核酸扩增试剂和酶混合。

将扩增室加热至47℃达6分钟，在此期间RNA模板逆转录成cDNA。逆转录完成后，在第二腔室中进行40个循环的热循环扩增。热循环结束后，打开连接到第三腔室的排气口以允许反应物溶液流入第三腔室。第三腔室包括检测条和冻干珠粒，冻干珠粒包括用作检测颗粒的三种蓝染聚苯乙烯微球体轭合物的。轭合物由与寡核苷酸探针共价连接的300nm聚苯乙烯微球体组成，寡核苷酸探针与甲型流感或乙型流感或MS2噬菌体的扩增序列互补。当溶液流入第三腔室时，溶液重新组成冻干的检测颗粒。将三条捕获线固定在横向流动膜上，从设备的底部它们是：不与任何化验的靶标互补的阴性对照寡核苷酸；与乙型流感扩增产物互补的捕获探针；与甲型流感扩增产物互补的捕获探针；和与MS2噬菌体的扩增产物互补的寡核苷酸。在可视化解读结果之前，横向流动条被允许显影6分钟。在横向流动条显影时，甲型流感阳性样品在甲型流感和MS2噬菌体位置显示蓝色检测线的形成，乙型流感阳性样品在乙型流感和MS2噬菌体位置显示蓝色检测线的形成，阴性样品仅在MS2噬菌体位置显示蓝色检测线的形成，如图36所示。

尽管已经具体参考公开的实施例详细描述了本发明，但其它实施例可以实现相同的结果。本发明的变型和修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且意图涵盖所有这些变型和等同物。以上引用的所有专利和出版物的全部内容以引用的方式并入本文中。

Claims (37)

1.一种用于检测靶核酸的盒子，所述盒子包括：

多个腔室；

多个排气凹穴，其连接到所述腔室；以及

热不稳定材料，其用于密封所述排气凹穴中的一个或多个排气凹穴；

其中，至少一个所述排气凹穴包括突起部。

2.根据权利要求1所述的盒子，其中，所述突起部包括凹坑或凹凸部。

3.根据权利要求1所述的盒子，其中，所述突起部充分地防止熔化的热不稳定材料附接到邻近所述热不稳定材料设置的热稳定材料上，以防止在所述热不稳定材料破裂之后所述排气凹穴被重新密封。

4.一种用于检测靶核酸的盒子，所述盒子包括：

多个腔室；

多个排气凹穴，其连接到所述腔室；

热不稳定材料，其用于密封所述排气凹穴中的一个或多个排气凹穴；

热稳定材料；以及

垫圈，其设置在所述热不稳定材料和所述热稳定材料之间，所述垫圈包括开口，所述开口包围所述多个排气凹穴。

5.根据权利要求4所述的盒子，其中，所述垫圈足够厚，以提供足够的空气体积来平衡压力并确保敞开的排气凹穴之间的自由空气移动。

6.根据权利要求4所述的盒子，还包括柔性电路，所述柔性电路包括设置在所述热稳定材料上的图案化的金属电气部件。

7.根据权利要求6所述的盒子，其中，所述垫圈包括第二开口或者尺寸受到限制，使得所述柔性电路直接接触所述腔室中的至少一个腔室中的流体。

8.根据权利要求6所述的盒子，其中，所述电气部件包括电阻加热元件或导电迹线。

9.根据权利要求8所述的盒子，其中，所述电阻加热元件对准所述排气凹穴和所述腔室。

10.根据权利要求4所述的盒子，包括：一个或多个环境温度传感器，其用于调节所述腔室中的一个或多个腔室的加热温度、加热时间和/或加热速率。

11.一种用于检测靶核酸的盒子，所述盒子包括：

竖直地取向的检测室；

横向流动检测条，其设置在所述检测室中并且取向成使得所述检测条的样品接收端位于所述检测条的底端；以及

所述检测室中的空间，其位于所述横向流动检测条的下方，用于接收包括扩增靶核酸的流体；

所述空间包括足够的容量，以便在一定高度处容纳所述流体的全部体积，所述高度使得所述流体能够通过毛细管作用向上流动到所述检测条上，而不会淹没或者以其它方式绕过所述检测条的区域。

12.根据权利要求11所述的盒子，其中，所述空间包括检测颗粒。

13.根据权利要求12所述的盒子，其中，所述检测颗粒选自由染料聚苯乙烯微球体、胶乳、胶体金、胶体纤维素、纳米金和半导体纳米晶体组成的组。

14.根据权利要求12所述的盒子，其中，所述检测颗粒包括与所述扩增靶核酸的序列互补的寡核苷酸或者能够结合到所述扩增靶核酸上的配体。

15.根据权利要求14所述的盒子，其中，所述配体选自由生物素、链霉亲和素、半抗原或抗体组成的组。

16.根据权利要求12所述的盒子，其中，所述检测颗粒已被烘干，冻干，或者作为载体中的检测颗粒的干燥混合物存在于内表面的至少一部分上，以促进所述检测颗粒的再悬浮。

17.根据权利要求16所述的盒子，其中，所述载体包括多糖、清洁剂或蛋白质。

18.根据权利要求12所述的盒子，其中，在所述空间中形成所述流体的毛细管池，以改善所述检测颗粒的混合和分散，以促进所述检测颗粒和所述扩增靶核酸的混合。

19.根据权利要求11所述的盒子，所述盒子用于执行体积小于约200μL的化验。

20.根据权利要求19所述的盒子，其中，所述化验具有小于约60μL的体积。

21.一种用于检测靶核酸的盒子，所述盒子包括：一个或多个凹槽，其用于容纳至少一种冻干的或烘干的试剂，所述凹槽中的至少一个凹槽包括用于引导流体的一个或多个结构，以促进所述至少一种烘干的或冻干的试剂的再水化，所述凹槽设置在连接到腔室的一个或多个通道中或者设置在所述通道中的一个或多个通道中。

22.根据权利要求21所述的盒子，其中，所述结构包括脊部、凹部、凹坑或其组合。

23.一种用于检测靶核酸的盒子，所述盒子包括至少一个腔室，所述腔室包括如下特征：所述特征用于防止竖直地进入所述腔室的顶部的流体直接流入所述腔室的出口中。

24.根据权利要求23所述的盒子，其中，所述特征使所述流体偏转到所述腔室的与所述出口相对的一侧。

25.根据权利要求23所述的盒子，其中，所形成的所述流体的流路包括水平分量，从而使所述流路的有效长度充分地增大，并使所述流体的流速充分地减小，以限制离开所述出口的流体的量。

26.根据权利要求23所述的盒子，其中，所述特征在所述腔室内产生流体的漩涡，由此促进所述流体中的试剂的混合。

27.根据权利要求23所述的盒子，其中，所述特征呈三角形或梯形。

28.根据权利要求23所述的盒子，其中，所述出口呈渐缩形。

29.根据权利要求23所述的盒子，其中，位于所述出口的下游的通道包括转弯部，用以增大所述通道的有效长度。

30.根据权利要求23所述的盒子，其中，所述特征靠近所述腔室的底部，或位于所述腔室的底部处，或靠近所述腔室的中部。

31.一种对流经用于检测靶核酸的盒子中的腔室的流体的竖直流动进行控制的方法，所述方法包括：使进入所述腔室的顶部的流体的流动偏转，由此防止所述流体直接流入所述腔室的出口。

32.根据权利要求31所述的方法，包括：降低所述流体的流速，以使在所述流体停止之前所述流体沿着连接到所述出口的通道向下流动的距离减小。

33.根据权利要求31所述的方法，包括：将流入所述腔室中的流体流分成第一流体流和第二流体流，所述第一流体流接触所述腔室的壁并且被向上引导，所述第二流体流进入所述出口。

34.根据权利要求33所述的方法，还包括：在所述腔室中的所述第一流体流中形成所述流体的漩涡，由此促进所述流体中的试剂的混合。

35.根据权利要求33所述的方法，其中，所述第二流体流形成弯月面并且经由连接到所述出口的通道而前进，所述弯月面使所述流体的下游的通道中的封闭空气空间中的压力增大，直到所述压力使所述通道中的流体的流动停止。

36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述出口呈渐缩形，由此增大所述出口的入口处的可压缩空气体积。

37.根据权利要求31所述的方法，包括：在连接到所述出口的通道中设置转弯部，由此增大所述通道的有效路径长度并减小所述通道中的流体的流速。