CN107807242A - 基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及应用 - Google Patents
基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107807242A CN107807242A CN201710957185.9A CN201710957185A CN107807242A CN 107807242 A CN107807242 A CN 107807242A CN 201710957185 A CN201710957185 A CN 201710957185A CN 107807242 A CN107807242 A CN 107807242A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- selective
- oxidase
- gold nanoparticle
- mimetic
- characteristic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 79
- 239000010931 gold Substances 0.000 title claims abstract description 79
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 79
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 title abstract 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- WTWWXOGTJWMJHI-UHFFFAOYSA-N perflubron Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)Br WTWWXOGTJWMJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 23
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 75
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 75
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 74
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 57
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 57
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 150000003904 phospholipids Chemical group 0.000 claims description 14
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 11
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 9
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 9
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 8
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 6
- 229960001217 perflubron Drugs 0.000 claims description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000011837 N,N-methylenebisacrylamide Substances 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 4
- ILOJFJBXXANEQW-UHFFFAOYSA-N aminooxy(phenyl)borinic acid Chemical compound NOB(O)C1=CC=CC=C1 ILOJFJBXXANEQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 4
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- OHDRQQURAXLVGJ-UHFFFAOYSA-N azane;3-ethyl-2-[(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C1=NN=C1SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 abstract description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 abstract description 2
- -1 perfluoro bromide octane Chemical compound 0.000 abstract 2
- XIPRTRJDLZVSHO-UHFFFAOYSA-N aminooxy(phenoxy)borinic acid Chemical compound NOB(O)OC1=CC=CC=C1 XIPRTRJDLZVSHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 56
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical group [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical group [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 3
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 3
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 3
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 3
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical group [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical group OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920000344 molecularly imprinted polymer Polymers 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DUNGBIVDBVTLAH-UHFFFAOYSA-N FC(C(C(C(C(F)(F)Br)(F)F)(F)F)(F)F)(C(C(C(F)(F)F)(F)F)(F)F)F.[O] Chemical compound FC(C(C(C(C(F)(F)Br)(F)F)(F)F)(F)F)(C(C(C(F)(F)F)(F)F)(F)F)F.[O] DUNGBIVDBVTLAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000021443 coca cola Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004186 food analysis Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Chemical group 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/02—Food
- G01N33/14—Beverages
- G01N33/143—Beverages containing sugar
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶构建及应用。该选择性模拟酶为全氟溴辛烷PFOB增强的通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶PFOB‑MIP，基于金纳米颗粒的类氧化酶特性，利用氨基苯硼酸实现对糖类分子的结合与亲和力提升，并进一步结合分子印迹技术构建针对底物分子的选择性壳层，同时采用全氟溴辛烷作为氧供给池，从而构建出能对糖类进行选择性识别催化并具有更强催化活性的模拟氧化酶，并将其应用于血糖及食品中糖类的检测。
Description
技术领域
本发明涉及基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及其在糖类检测中的应用，属于纳米材料及生物医学纳米技术领域。
背景技术
和天然酶相比，金纳米颗粒等金属模拟酶具有价格低、产量高、稳定性好等优点，但是其最大的缺陷之一就是缺乏选择性。自阎锡蕴提出Fe3O4具有类过氧化物酶活性后，越来越多的人被金属纳米材料的类酶特性吸引。而相比于其他纳米材料，AuNPs有着独特的优势，比如其催化活性可随粒径改变发生很大的变化。由于其在Glu酶解中的巨大潜力，AuNPs更是被广泛应用于工业生产、科学研究与生物医学检测中。一方面，当颗粒小到一定程度时，葡萄糖氧化酶与AuNPs能发生电子传递，进而增强葡萄糖氧化酶的催化能力。另一方面，AuNPs本身也可以表现出类酶活性，直接催化Glu氧化，和相同尺寸和剂量的铂、铜、银等金属纳米颗粒相比，AuNPs对Glu的催化能力强得多。
虽然金属纳米颗粒作为模拟酶，具有比天然酶稳定性好、来源充足等优势，但因为没有特异性结合位点，无法实现选择性，催化活性也大多有限。对于模拟酶的显著缺陷，鲜有工作能够解决。目前提出的一些解决方案，例如抗体酶等，普遍具有制备过程过于复杂、成本较高等明显的局限性，也大多无法在提升选择性和催化活性两方面同时得到改善。
虽然裸的AuNPs可以对Glu以及类似的糖类表现出类酶活性，但是缺乏选择性，催化活性方面也有提升空间。由于APBA可以在中性或碱性条件下能识别邻位羟基并与之结合，因而有望用于提升AuNPs在催化中对糖类分子的选择性，同时也能够通过增强对糖类分子的亲和力获得更高的催化效率。
分子印迹技术是构建选择性结构的优良手段，在解决模拟酶选择性方面有着可观的应用前景。其基本原理是选择合适的功能单体与印迹分子相结合形成分子印迹聚合物，然后洗脱掉印迹分子，再利用分子印迹聚合物上的结合位点选择、识别、记忆目标分子。利用分子印迹技术，有望在发挥金属模拟酶特有的优越性的基础上，改善其在选择性和催化效率上的缺陷。
发明内容
技术问题：为了发挥模拟酶的优势同时克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及其在糖类检测中的应用。该方法通过将金纳米颗粒与氨基苯硼酸与全氟溴辛烷结合，利用分子印迹技术，提高金纳米颗粒模拟酶的催化活性，并实现对底物的选择性。
技术方案：为实现上述目的，本发明提供一种基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建方法，该选择性模拟酶为全氟溴辛烷PFOB增强的通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶PFOB-MIP，该构建方法包括以下步骤：
1)将巯基或氨基末端磷脂溶于氯仿，80-100℃下与纯水混合，并滴入PFOB，冷却后超声分散获得巯基或氨基末端磷脂包覆的PFOB；
2)将聚苯乙烯微球PS与牛血清白蛋白BSA混合，于中性或偏酸性体系中孵育后离心去除游离BSA；
3)加入金纳米颗粒AuNPs，孵育后离心去除多余AuNPs；
4)同时加入氨基苯硼酸APBA和巯基或氨基末端磷脂包覆的PFOB，室温静置；
5)加入葡萄糖Glu，4-40℃震荡；
6)加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺，室温震荡；
7)加入过硫酸铵水溶液和磷酸缓冲液PBS，充氮后37-80℃震荡12-24h；
8)用PBS洗涤去除印迹分子，每次离心中间室温震荡，得到基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶。
其中；
所述步骤3)中的金纳米颗粒粒径为1-100nm。
所述基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶，粒径为10-5000nm。
步骤3)所述加入金纳米颗粒AuNPs，其方法是将金纳米颗粒AuNPs溶于超纯水，浓度为5-200μg/ml。
步骤7)中，所述过硫酸铵水溶液浓度为4-100mg/ml。
步骤7)中，所述磷酸缓冲液PBS浓度为0.01-0.2M，pH＝7-9。
本发明的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的应用该基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在糖类催化氧化中的应用。
该基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在糖类检测中的应用包括以下步骤：将糖溶液与辣根过氧化物酶、2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐和基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶混合，室温静置3-120min后读取405nm处吸光度。
所述基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在含糖食品检测中的应用。
所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在血糖与尿糖检测中的应用。
有益效果：本发明构建了基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶，将其用于催化糖类分子氧化，同时得到了对底物的选择性和对催化活性的增强，并应用于含糖食品和血糖、尿糖的检测。
相对于现有技术，具有以下突出的优势：
(1)本发明利用APBA对糖类的特异性识别与结合功能，将APBA偶联到AuNPs表面有效提升了AuNPs对糖类分子的亲和力，初步实现了对糖类分子的选择性，并提高了催化活性。
(2)本发明在利用APBA对糖类分子的识别与结合的基础上，又结合了分子印迹技术构建了能对以Glu为例的单一分子进行选择识别的壳层，并在该多层复合物中加入具有载氧能力的PFOB以进一步促进氧化反应的进行，获得了对单一底物具有选择性且催化活性显著增强的增强型选择性模拟酶。
(3)本发明将基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶用于催化糖类分子氧化，在保留了金属模拟酶稳定、低价等优点的同时，改善了通常无底物选择性且活性较低的缺陷，并成功用于含糖食品及血糖、尿糖的检测。
附图说明
图1为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建原理图。
图2为全氟溴辛烷增强的通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的扫描电镜照片。
图3为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶催化葡萄糖氧化催化动力学结果。
图4为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶与金纳米颗粒对葡萄糖的浓度依赖催化曲线比较。
图5为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶与金纳米颗粒对葡萄糖亲和力(Km)比较。
图6为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶与金纳米颗粒对葡萄糖催化效率(kcat/Km)比较。
图7为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶及增强的选择性模拟酶与金纳米颗粒对葡萄糖催化效率增强倍数比较。
图8为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶催化选择性结果，显著提升对模板分子的催化活性的情况下，对其他糖类催化活性无明显改变。
图9为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在血糖检测中的应用。
图10为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在常见饮料中糖分检测中的应用。
具体实施方式
本发明提供了一种基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及其应用方法，该方法基于金纳米颗粒氧化酶特性，结合分子印迹技术和全氟溴辛烷供氧来制备具有选择性和高活性模拟酶的方法，包括以下步骤：
1)将10-100mg巯基或氨基末端磷脂溶于1-10ml氯仿，100℃下与10-100ml纯水混合，并滴入100-5000μl PFOB，冷却后超声分散获得巯基或氨基末端磷脂包覆的PFOB。
2)将1-10mg PS与0.1-10mg BSA混合，于10ml中性或偏酸性体系中孵育10-24h后离心去除游离BSA。
3)加入10ml AuNPs(溶于超纯水，浓度为5-200μg/ml)，孵育0.5-12h后离心去除多余AuNPs。
4)同时加入1-25mgAPBA和1-20ml巯基或氨基末端磷脂包覆的PFOB，室温静置1-12h。
5)加入1-20mg Glu，4-40℃震荡1-3h。
6)加入10-200mgN,N-亚甲基双丙烯酰胺，室温震荡1-3h。
7)加入0.1-2ml过硫酸铵水溶液(浓度为4-100mg/ml)和5-20ml PBS(浓度为0.02M，pH9)，充氮10min后60℃震荡12-24h。
8)用PBS(浓度为0.02M，pH5)洗涤3次去除印迹分子，每次离心中间室温震荡1-12h。
所述基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶中金纳米颗粒粒径为1-100nm。
所述基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶粒径为10-5000nm。
所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在糖类催化氧化中的应用。
所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在糖类检测中的应用，包括以下步骤：将糖溶液(50μl)与辣根过氧化物酶(1μl，1-20mg/ml)、ABTS(1μl，1-20mg/ml)和基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶混合，室温静置3-120min后读取405nm处吸光度。
所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在含糖食品检测中的应用。
所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在血糖与尿糖检测中的应用。
本发明所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶可以用于构建对糖类分子具有选择性的模拟酶，包括但不限于葡萄糖。
本发明所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶可以用于检测混合物中的糖类成分，包括但不限于对含糖食品及血糖、尿糖的检测。
实施例1：全氟溴辛烷增强的通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建
以蛋白作为偶联媒介将AuNPs包覆到PS上，通过静电吸附或化学吸附将APBA与氨基末端磷脂包被的PFOB偶联到AuNPs上，令APBA充分结合特定糖类印迹分子，在N,N-亚甲基双丙烯酰胺存在下由过硫酸铵引发APBA聚合成壳层，在酸性条件下离心洗脱印迹分子即得PFOB-MIP。
1.试剂及设备：
金纳米颗粒，聚苯乙烯微球，牛血清白蛋白，氨基苯硼酸，全氟溴辛烷，巯基或氨基末端磷脂，葡萄糖，过硫酸铵，氯仿，N,N-亚甲基双丙烯酰胺，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钾，封闭电炉，精密增力电动搅拌器，冷冻离心机。
2.实施方法：
将50mg氨基末端磷脂溶于2ml氯仿，100℃下与20ml纯水混合，并滴入500μl PFOB，冷却后超声分散获得巯基或氨基末端磷脂包覆的PFOB。将10mg PS与10mg BSA混合，于10ml接近中性体系中孵育12h后离心去除游离BSA。加入10ml金纳米颗粒溶液(粒径为10nm，溶于超纯水，浓度为50μg/ml)，孵育12h后离心去除多余AuNPs。同时加入10mg APBA和10ml氨基末端磷脂包覆的PFOB，室温静置2h。加入4mg葡萄糖，37℃震荡1h。加入40mg N,N-亚甲基双丙烯酰胺，室温震荡2h。加入0.7ml过硫酸铵水溶液(浓度为10mg/ml)和10ml PBS(浓度为0.02M，pH9)，充氮10min后60℃震荡12h。用PBS(浓度为0.02M，pH5)洗涤3次去除印迹分子，前次离心前室温震荡1h，第三次离心前室温震荡12h，保存于PBS(浓度为0.02M，pH7.4)中。
3.实施结果：
如图1构建PFOB-MIP。如图2扫描电镜照片可见，APBA在聚苯乙烯微球表面形成粗糙壳层，该壳层上具有可选择性结合模板分子的孔洞，从而实现对Glu的选择性催化氧化。
实施例2：全氟溴辛烷增强的通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在糖类催化中的应用
将PFOB-MIP与待测样品混合，体系调整至中性或碱性条件，60℃催化反应3-120min，用ABTS显色，于相应波长下检测。
1.试剂及设备：
磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钠，辣根过氧化物酶，2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，葡萄糖，麦芽糖，果糖，半乳糖，酶标仪。
2.实施方法：
将糖溶液(50μl)与辣根过氧化物酶(1μl，10mg/ml)、ABTS(1μl，10mg/ml)、PBS(50μl，0.02M，pH7.4)和PFOB-MIP或未加入PFOB制备的模拟酶MIP(100μl)混合，室温静置30min后读取405nm处吸光度。
3.实施结果：
如图3-7所示，通过分子印迹技术构建的选择性模拟酶相比于AuNPs本身对Glu具有显著提升的催化活性，加入用于载氧的PFOB后催化效率得到进一步提升(图3及图4)，对底物的亲和力更强(图5)，进而可提升催化效率至约270倍(图6及图7)。如图8所示，通过分子印迹技术构建的选择性模拟酶表现出明显的底物选择性，在大幅提升对Glu的催化活性的同时，对其他糖类的催化活性没有显著改变。
实施例3：通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在血糖检测中的应用
将MIP与待测样品混合，体系调整至中性或碱性条件，60℃催化反应3-120min，用ABTS显色，于相应波长下检测。
1.试剂及设备：
磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钠，辣根过氧化物酶，ABTS，血清样本，酶标仪。
2.实施方法：
将血清样本(50μl)与辣根过氧化物酶(1μl，10mg/ml)、ABTS(1μl，10mg/ml)、PBS(50μl，0.02M，pH7.4)和PFOB-MIP(100μl)混合，室温静置30min后读取405nm处吸光度。
3.实施结果：
如图9所示，PFOB-MIP用于血糖检测，可以获得良好的线性结果，能够达到和天然酶类似的检测效果。
实施例4：通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在食品分析中的应用
1.试剂及设备：
磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钠，辣根过氧化物酶，ABTS，血清样本，酶标仪。
2.实施方法：
将几种市面常见饮料(屈臣氏矿泉水、百威啤酒、可口可乐、七喜、瓶装雀巢咖啡、速溶立顿奶茶)、10％葡萄糖溶液和纯水(50μl)与辣根过氧化物酶(1μl，10mg/ml)、ABTS(1μl，10mg/ml)、PBS(50μl，0.02M，pH7.4)和PFOB-MIP及葡萄糖氧化酶溶液(100μl)混合，室温静置30min后读取405nm处吸光度。
3.实施结果：
如图10所示，将PFOB-MIP用于饮料中葡萄糖的检测，可以获得和天然酶一致的检测结果。
Claims (10)
1.一种基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建方法，其特征在于：该选择性模拟酶为全氟溴辛烷PFOB增强的通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶PFOB-MIP，该构建方法包括以下步骤：
1)将巯基或氨基末端磷脂溶于氯仿，80-100℃下与纯水混合，并滴入PFOB，冷却后超声分散获得巯基或氨基末端磷脂包覆的PFOB；
2)将聚苯乙烯微球PS与牛血清白蛋白BSA混合，于中性或偏酸性体系中孵育后离心去除游离BSA；
3)加入金纳米颗粒AuNPs，孵育后离心去除多余AuNPs；
4)同时加入氨基苯硼酸APBA和巯基或氨基末端磷脂包覆的PFOB，室温静置；
5)加入葡萄糖Glu，4-40℃震荡；
6)加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺，室温震荡；
7)加入过硫酸铵水溶液和磷酸缓冲液PBS，充氮后37-80℃震荡12-24h；
8)用PBS洗涤去除印迹分子，每次离心中间室温震荡，得到基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶。
2.如权利要求1所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中的金纳米颗粒粒径为1-100nm。
3.如权利要求1所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建方法，其特征在于：所述基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶，粒径为10-5000nm。
4.如权利要求1所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建方法，其特征在于：步骤3)所述加入金纳米颗粒AuNPs，其方法是将金纳米颗粒AuNPs溶于超纯水，浓度为5-200μg/ml。
5.如权利要求1所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建方法，其特征在于：步骤7)中，所述过硫酸铵水溶液浓度为4-100mg/ml。
6.如权利要求1所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建方法，其特征在于：步骤7)中，所述磷酸缓冲液PBS浓度为0.01-0.2M，pH＝7-9。
7.一种如权利要求1所述方法构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的应用，其特征在于：该基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在糖类催化氧化中的应用。
8.如权利要求7所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的应用，其特征在于：该基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在糖类检测中的应用包括以下步骤：将糖溶液与辣根过氧化物酶、2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐和基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶混合，室温静置3-120min后读取405nm处吸光度。
9.如权利要求7所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的应用，其特征在于：所述基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在含糖食品检测中的应用。
10.如权利要求7所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的应用，其特征在于：所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在血糖与尿糖检测中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710957185.9A CN107807242B (zh) | 2017-10-16 | 2017-10-16 | 基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710957185.9A CN107807242B (zh) | 2017-10-16 | 2017-10-16 | 基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107807242A true CN107807242A (zh) | 2018-03-16 |
| CN107807242B CN107807242B (zh) | 2019-12-10 |
Family
ID=61584979
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710957185.9A Active CN107807242B (zh) | 2017-10-16 | 2017-10-16 | 基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107807242B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110836971A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-02-25 | 电子科技大学 | 用于血糖检测纳米标志物、基于其的动态近红外光谱无损血糖仪及其制备方法 |
| CN110859633A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-03-06 | 电子科技大学 | 一种基于纳米标志物的动态光声特征谱无损血糖仪及其纳米标志物的制备方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101706504A (zh) * | 2009-11-27 | 2010-05-12 | 东南大学 | 金纳米粒子模拟酶应用于生物检测的方法 |
| CN102854181A (zh) * | 2012-09-07 | 2013-01-02 | 南京工业大学 | 一种纳米金比色测糖方法 |
| CN103751106A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-04-30 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 一种水溶性全氟溴辛烷-脂质体纳米球及其制备方法 |
| CN105548153A (zh) * | 2015-12-01 | 2016-05-04 | 安徽师范大学 | 金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器及其制备方法和应用 |
| CN107140750A (zh) * | 2017-06-28 | 2017-09-08 | 曲阜师范大学 | 一种多功能模拟酶复合球的制备方法及其应用 |
-
2017
- 2017-10-16 CN CN201710957185.9A patent/CN107807242B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101706504A (zh) * | 2009-11-27 | 2010-05-12 | 东南大学 | 金纳米粒子模拟酶应用于生物检测的方法 |
| CN102854181A (zh) * | 2012-09-07 | 2013-01-02 | 南京工业大学 | 一种纳米金比色测糖方法 |
| CN103751106A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-04-30 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 一种水溶性全氟溴辛烷-脂质体纳米球及其制备方法 |
| CN105548153A (zh) * | 2015-12-01 | 2016-05-04 | 安徽师范大学 | 金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器及其制备方法和应用 |
| CN107140750A (zh) * | 2017-06-28 | 2017-09-08 | 曲阜师范大学 | 一种多功能模拟酶复合球的制备方法及其应用 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110836971A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-02-25 | 电子科技大学 | 用于血糖检测纳米标志物、基于其的动态近红外光谱无损血糖仪及其制备方法 |
| CN110859633A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-03-06 | 电子科技大学 | 一种基于纳米标志物的动态光声特征谱无损血糖仪及其纳米标志物的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107807242B (zh) | 2019-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Enzyme hybrid nanoflowers and enzyme@ metal–organic frameworks composites: fascinating hybrid nanobiocatalysts | |
| Avnir et al. | Enzymes and other proteins entrapped in sol-gel materials | |
| Jia et al. | Materials‐based strategies for multi‐enzyme immobilization and co‐localization: a review | |
| Netto et al. | Superparamagnetic nanoparticles as versatile carriers and supporting materials for enzymes | |
| Torabizadeh et al. | Nano co-immobilization of α-amylase and maltogenic amylase by nanomagnetic combi-cross-linked enzyme aggregates method for maltose production from corn starch | |
| Seenuvasan et al. | Magnetic nanoparticles: a versatile carrier for enzymes in bio‐processing sectors | |
| Zheng et al. | Effect of molecular mobility on coupled enzymatic reactions involving cofactor regeneration using nanoparticle-attached enzymes | |
| Zhou et al. | One‐step selective affinity purification and immobilization of His‐tagged enzyme by recyclable magnetic nanoparticles | |
| Zhou et al. | Immobilization of β-glucosidase onto Magnetic Nanoparticles and Evaluation of the Enzymatic Properties. | |
| Li et al. | Molecular imprinting and immobilization of cellulase onto magnetic Fe3O4@ SiO2 nanoparticles | |
| CN107140750A (zh) | 一种多功能模拟酶复合球的制备方法及其应用 | |
| CN110160975A (zh) | 一种氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶及其检测葡萄糖的方法 | |
| CN107807242B (zh) | 基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及应用 | |
| Demir et al. | α‐Amylase immobilization on functionalized nano CaCO3 by covalent attachment | |
| Zhang et al. | Nanomaterials for co‐immobilization of multiple enzymes | |
| CN105950604A (zh) | 一种酶的固定化方法 | |
| Myung et al. | Recyclable cellulose-containing magnetic nanoparticles: immobilization of cellulose-binding module-tagged proteins and a synthetic metabolon featuring substrate channeling | |
| Alnadari et al. | Reusability of immobilized β-glucosidase on sodium alginate-coated magnetic nanoparticles and high productivity applications | |
| CN109810969B (zh) | 一种基于镧系核苷酸配合物和dna定向固定技术构建人造多酶系统的方法 | |
| Hooe et al. | Benzaldehyde lyase kinetic improvements, potential channeling to alcohol dehydrogenase, and substrate scope when immobilized on semiconductor quantum dots | |
| Lin et al. | Assembly of graphene oxide‐formate dehydrogenase composites by nickel‐coordination with enhanced stability and reusability | |
| Mislovičová et al. | Biospecific immobilization of mannan–penicillin G acylase neoglycoenzyme on Concanavalin A-bead cellulose | |
| CN107034206B (zh) | 一种酶-凝集素结合物纳米颗粒及其制备方法 | |
| CT et al. | Preparation of nano-immobilised β-galactosidase using mesoporous silicon dioxide nanoparticles and its efficiency in production of galactooligosaccharides | |
| Yao et al. | Metal ions coordinated immobilization of phenylalanine dehydrogenase by GO‐PEI with high activity recovery and enhanced stability |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |