CN105548153A

CN105548153A - 金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105548153A
Application number: CN201510894078.7A
Authority: CN
Inventors: 钟敏; 阚显文
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Normal University
Priority date: 2015-12-01
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2035-12-01
Also published as: CN105548153B

Abstract

本发明公开了一种金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器及其制备方法和应用，该制备方法包括：1)将氯金酸与柠檬酸三钠于溶剂中进行接触反应制得金胶溶液；2)将金胶溶液的pH调节至6.0-7.5，然后加入3-氨基苯硼酸(APBA)和氨基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM-NH₂)进行静电作用以制得金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器。该传感器对葡萄糖的检测具有良好的灵敏度、选择性和抗离子干扰能力，同时制备方法简单易操作、检测结果裸眼可读。

Description

金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及可视化传感器，具体地，涉及一种金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器及其制备方法和应用。

背景技术

金胶溶液即金纳米粒子溶液(AuNPs)。金纳米粒子具有非常高的消光系数，其中，13nm金纳米粒子的消光系数高达2.7×10⁸mol/(L·cm)，比一般的染料分子高1000倍以上，根据Beer-Lambert定律可知，金纳米粒子所能达到的检测限远低于染料分子。另一方面，由于金纳米粒子体系在不同状态下会有不同的颜色变化，因此在可视化检测中占有重要的地位。基于金纳米粒子的可视化检测机理是：单分散金纳米粒子在溶液中呈现红色，当加入被检测物时，金纳米粒子发生聚集，从而使粒子间的等离子体耦合发生改变，吸收峰发生红移，溶液的颜色由红色变为紫色或蓝色。

金纳米粒子除了具有上述的光学特性外，其表面易于进行化学修饰也为金纳米粒子在分析检测中的广泛应用提供了便捷条件，例如金纳米粒子表面可以通过修饰小分子、蛋白质、多肽、DNA等实现对不同靶标物质的特异性检测，包括小分子、重金属离子、蛋白质、核酸、肿瘤细胞和病原体等。基于金纳米粒子的可视化检测方法不依赖任何大型仪器，溶液颜色变化即可作为读出信号，信号检出速度较快，所需材料成本较为低廉，尤其适用于有快速检测、现场检测需求和条件相对落后不具备大型仪器的区域。

葡萄糖是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，其结构中含五个羟基，一个醛基，具有多元醇和醛的性质。葡萄糖是生物体最基本的物质和生物过程中普遍存在的能量供给物，但是许多研究表明，肾性糖尿、囊性纤维化病、糖尿病等都与葡萄糖输送障碍有关。因此葡萄糖的快速准确检测是非常重要的。目前有许多基于金纳米粒子可视化检测葡萄糖的方法。如文献“RadhakumaryC,SreenivasanK.Nakedeyedetectionofglucoseinurineusingglucoseoxidaseimmobilizedgoldnanoparticles[J].Analyticalchemistry,2011,83(7):2829-2833.”报道的：采用碳化二亚胺，将葡萄糖氧化酶修饰在金纳米粒子的表面，加入葡萄糖，使金纳米粒子聚集，当葡萄糖的含量大于100mg/L时，金纳米粒子溶液的颜色变为蓝色。也例如“JiangY,ZhaoH,LinY,etal.Colorimetricdetectionofglucoseinratbrainusinggoldnanoparticles[J].AngewandteChemie,2010,122(28):4910-4914.”报道的：利用金纳米粒子的光学性质和串联反应，可以构建一种快速简便可视化检测脑脊液中葡萄糖的方法。利用硼酸与邻羟基化合物可以发生共价结合的特性，将硼酸及其衍生物作为识别元件用于检测葡萄糖的传感器已有一定的研究基础。再例如“BiX,LiuZ.Facilepreparationofglycoprotein-imprinted96-wellmicroplatesforenzyme-linkedimmunosorbentassaybyboronateaffinity-basedorientedsurfaceimprinting[J].Analyticalchemistry,2013,86(1):959-966.”报道的：利用4-氨基苯硼酸修饰石墨烯，增大对单糖类物质的检测信号，效果显著。还例如“Ma,YandYang,X,Onesaccharidesensorbasedonthecomplexoftheboronicacidandthemonosaccharideusingelectrochemicalimpedancespectroscopy[J].JournalofElectroanalyticalChemistry,2005,580:348-352.”报道的：在酸性条件下,将具有较高电子传递效率的3-氨基苯硼酸(APBA)电聚合到金电极表面,得到聚氨基苯硼酸(PABA)膜。PABA膜可共价结合不同的单糖,糖的种类及浓度的各异引发膜介电特性不同程度的改变。结合交流阻抗(EIS)可识别葡萄糖、果糖、甘露糖醇、山梨糖醇四种单糖,且具有良好的线性关系,灵敏度高,线性范围较宽。最后例如“LiYP,JiangL,ZhangT,etal.ColorimetricdetectionofglucoseusingaboronicacidderivativereceptorattachedtounmodifiedAuNPs[J].ChineseChemicalLetters,2014,25(1):77-79.”报道的：将金纳米粒子的可视化传感与硼酸的亲和作用相结合，实现对葡萄糖的高选择性、快速灵敏检测也有相关报道，单纯将硼酸衍生物修饰到裸金纳米粒子表面，制备一种比色传感，分别在酸性和碱性条件下对葡萄糖进行定量检测。

上述检测方法中，要么利用硼酸与邻羟基化合物可以发生共价结合的特性，将硼酸及其衍生物作为识别元件用于检测葡萄糖的传感器。要么是为了进一步提高检测灵敏度，将金纳米粒子与硼酸与邻羟基化合物的结合来检测葡萄糖。然而由于金纳米粒子是纳米级材料，不可避免的面临着团聚的问题，尤其是在检测环境中存在的离子浓度过高的盐溶液时，团聚现象明显，严重干扰检测结果。

发明内容

本发明的目的是提供一种金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器及其制备方法和应用，该传感器对葡萄糖的检测具有良好的灵敏度、选择性和抗离子干扰能力，同时制备方法简单易操作、检测结果裸眼可读。

为了实现上述目的，本发明提供了一种金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，包括

1)将氯金酸与柠檬酸三钠于溶剂中进行接触反应制得金胶溶液；

2)将金胶溶液的pH调节至6.0-7.5，然后加入3-氨基苯硼酸(APBA)和氨基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM-NH₂)进行静电作用以制得金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器。

本发明还提供了一种金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器，该传感器通过上述的方法制备而得。

本发明进一步提供了一种上述的金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器在葡糖检测中的应用。

通过上述技术方案，本发明采用柠檬酸钠还原法直接合成粒径分布在13nm左右的金胶溶液，该方法制备的金纳米粒子表面分布着过量的柠檬酸根离子，带负电荷，其作用是一方面通过静电排斥作用来抵消金纳米粒子间的范德华力，从而保证金纳米粒子分散均匀、不易团聚；另一方面，是能与氨基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM-NH₂)和3-氨基苯硼酸(APBA)中的氨基基团发生静电作用，从而使的两种化合物成功的修饰到金纳米粒子表面。其中，3-氨基苯硼酸的作用是作为传感器的识别元件，利用其硼酸基团去选择性结合含有邻羟基基团的葡萄糖，实现对葡萄糖的高灵敏、高选择性检测。氨基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺是一种链状高分子化合物，在25℃下，它呈现一种舒展状态，使得溶液保持亲水性，即使在离子浓度较高的盐溶液中也能稳定金纳米粒子不发生团聚，提高了该传感器的抗离子干扰能力，为该传感器在复杂环境中的检测提供了可能。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1是检测例1中传感器A1检测不同浓度葡萄糖的紫外光谱图；

图2是检测例2中传感器A1对Glu、Lcy、Gly、His、AA、DA和UA的选择性检测的光学图；

图3是检测例2中传感器A1对K⁺、Na⁺、Cl^-和Ca²⁺的抗离子干扰检测的光学图；

图4是检测例2中传感器B1对K+、Na+、Cl-和Ca2+的抗离子干扰检测的光学图；

图5是检测例1中传感器A1检测不同浓度葡萄糖的光学图。

具体实施方式

本发明提供了一种金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，包括

在本发明的步骤1)中，溶剂的具体种类可以在宽的范围内选择，但是从成本上考虑，优选地，溶剂为去离子水。

在本发明的步骤1)中，各物质的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高金纳米粒子的产率，优选地，相对于100重量份的水，氯金酸的用量为0.015-0.02重量份，柠檬酸三钠的用量为0.25-0.3重量份。

在本发明的步骤1)中，接触反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高金纳米粒子的产率，优选地，接触反应至少满足以下条件：反应温度98-105℃，反应时间为20-40min。

在本发明的步骤2)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高PNIPAM-NH₂、APBA与金纳米粒子的结合的数量，优选地，在步骤2)中，相对于1mL的金胶溶液，APBA的用量为1.5×10^-4-2.5×10^-4mmol，PNIPAM-NH₂的用量为3.5×10^-5-4.5×10^-5mmol。

在本发明的步骤2)中，静电作用的具体步骤以及条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高PNIPAM-NH₂、APBA与金纳米粒子的结合的数量，优选地，静电作用是通过先将金胶溶液、APBA和PNIPAM-NH₂混合，然后静置；其中静置至少满足以下条件：静置温度为15-30℃，静置时间为10-20min。

在本发明的步骤2)中，pH的调节的方法可以是本领域中任何一种常规的调节方法，但是为了提高调节的效率，优选地，在步骤2)中，pH的调节为：先将金胶溶液稀释至原浓度的40％-60％，然后通过氢氧化钠溶液调节pH。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，三水合氯金酸为阿拉丁公司市售品，柠檬酸三钠为国药集团的市售品，3-氨基苯硼酸为上海伯卡化学的市售品，氨基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺为西格玛奥德里奇的数均分子量为2500的市售品。

实施例1

1)按照“FrensG.Controllednucleationfortheregulationoftheparticlesizeinmonodispersegoldsuspensions[J].Nature,1973,241(105):20-22.”记载的方法进行金胶溶液的制备：先将玻璃仪器用王水(HCl：HNO₃＝3：1，体积比)清洗除杂，再用去离子水淋洗干净，自然晾干待用；接着将5mLHAuCl₄(0.01mol/L)加入到100mL去离子水中，磁力搅拌均匀；然后将所得溶液加热至回流(100℃)，再将5mL的柠檬酸三钠溶液(1重量％)快速加入到上述溶液中。观察到溶液的颜色在几分钟内由无色变为紫色最终变为酒红色，继续加热30min，即获得均一的柠檬酸稳固的金胶溶液，移去加热装置，25℃下冷却，封闭储存在4℃的冰箱中待用。

2)在25℃下，取用0.5mL的金胶溶液加入去离子水稀释至1mL，再加入NaOH溶液(0.05mol/L)调节pH至7.0；接着加入10μL的PNIPAM-NH₂溶液(10mmol/L)和20μL的APBA溶液(1mmol/L)至上述的金胶溶液中混合均匀，静置15min以制得金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器A1。

实施例2

按照实施例1的方法进行制得传感器A2，所不同的是：步骤2)中pH调节至6.0。

实施例3

按照实施例1的方法进行制得传感器A3，所不同的是：步骤2)中pH调节至7.5。

实施例4

按照实施例1的方法进行制得传感器A4，所不同的是：步骤2)中PNIPAM-NH₂溶液(10mmol/L)的用量为12.5μL。

实施例5

按照实施例1的方法进行制得传感器A5，所不同的是：步骤2)中PNIPAM-NH₂溶液(10mmol/L)的用量为7.5μL。

实施例6

按照实施例1的方法进行制得传感器A6，所不同的是：步骤2)中APBA溶液(1mmol/L)的用量为22.5μL。

实施例7

按照实施例1的方法进行制得传感器A7，所不同的是：步骤2)中APBA溶液(1mmol/L)的用量为17.5μL。

对比例1

按照实施例1的方法进行制得传感器B1，所不同的是：步骤2)中未使用PNIPAM-NH₂溶液。

检测例1

在pH＝7.0，T＝25℃的条件下，向传感器A1中加入不同浓度的葡萄糖溶液(0.25mM-3mM)，接着通过UV-vis、光学照片(见图5，其中，a-g依次表示0.25mM的葡萄糖溶液、0.75mM的葡萄糖溶液、1mM的葡萄糖溶液、1.5mM的葡萄糖溶液、2mM的葡萄糖溶液、2.5mM的葡萄糖溶液和3mM的葡萄糖溶液加入至传感器A1中光学效果图)来表征，金胶团聚程度与糖类物质浓度之间的关系。

根据金纳米粒子的特征峰分别在520nm和610nm处的吸光度之比(A₅₂₀/A₆₁₀)可以对葡萄糖进行定量检测，建立A₅₂₀/A₆₁₀与葡萄糖的浓度之间的线性关系是定性检测的依据。如图1所示，其中，内插图表示该传感器检测葡萄糖的校正曲线，葡萄糖的检测范围是0.25-3mM，线性方程：Y(A₅₂₀/A₆₁₀)＝7.52-2.08c_glu(mmol/L)。由此可知，本发明提供的金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器能够对葡萄糖溶液进行高效地定量检测。

同样地，通过上述的方法可知A2-A7也能够对葡萄糖溶液进行高效地定量检测。而B1(由图3可知)由于无法抗离子干扰，金胶溶液容易发生团聚，无法对葡萄糖进行定量检测。

检测例2

1)将3mM的Glu(葡萄糖)加至显示红色的传感器A1(见图2中的a)，观察到传感器A1的颜色变成蓝色(见图2中的b)；将3mM的Lcy(L-半胱氨酸)溶液、3mM的Gly(甘氨酸)溶液、3mM的His(组氨酸)溶液、3mM的AA(抗坏血酸)溶液、30μM的DA(多巴胺)溶液和30μM的UA(尿酸)溶液分别加至传感器A1中，具体结果见图2，其中图2中的c指的是Lcy加入至传感器A1中的效果图，d指的是Gly加入至传感器A1中的效果图，e指的是His加入至传感器A1中的效果图，f指的是AA加入至传感器A1中的效果图，g指的是DA加入至传感器A1中的效果图，h指的是UA加入至传感器A1中的效果图；由结果可知，相对于传感器A1，c-e、g-h中溶液的颜色几乎没有变化，而加入了AA后，溶液颜色有了轻微的加深，这可能是由于一方面AA的浓度较大，另一方面可能是因为AA也是邻羟基化合物。由此可知，传感器A1对于Glu具有优异的选择性。同样地，A2-A7也具有优异的选择性。

2)由于葡萄糖是生物体内重要的供能物质，因此，在实际检测过程中可能会受到来生物体中常见离子的干扰，为了验证该传感器的抗离子干扰能力，本实验选用人体内常见的离子K⁺，Na⁺，Cl^-，Ca²⁺，结果如图3所示，分别向a、b、c、d依次代表四个制备好的传感器A1中加入了5mM的K⁺溶液，100mM的Na⁺溶液，100mM的Cl^-溶液，2mM的Ca²⁺溶液，溶液仍保持红色，没有团聚现象产生，这是由于该传感器中含有PNIPAM高分子链能有效的阻碍离子对于金胶的影响。同样地，A2-A7与A1的检测结果保持一致。

3)图4的e、f、g、h代表向四个制备好的传感器B1中加入了5mM的K⁺溶液，100mM的Na⁺溶液，100mM的Cl^-溶液，2mM的Ca²⁺溶液，观察到明显的团聚现象。这进一步从反面证明了本发明提供的传感器不仅具有良好的选择性，还具有良好的抗离子干扰能力。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，包括

2)将所述金胶溶液的pH调节至6.0-7.5，然后加入3-氨基苯硼酸(APBA)和氨基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM-NH₂)进行静电作用以制得所述金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述溶剂为水。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，相对于100重量份的水，所述氯金酸的用量为0.015-0.02重量份，所述柠檬酸三钠的用量为0.25-0.3重量份。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述接触反应至少满足以下条件：反应温度为98-105℃，反应时间为20-40min。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的制备方法，其中，在步骤2)中，相对于1mL的所述金胶溶液，所述APBA的用量为1.5×10^-4-2.5×10^-4mmol，所述PNIPAM-NH₂的用量为3.5×10^-5-4.5×10^-5mmol。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述静电作用是通过先将所述金胶溶液、APBA和PNIPAM-NH₂混合，然后静置；其中所述静置至少满足以下条件：静置温度为15-30℃，静置时间为10-20min。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其中，在步骤2)中，pH的调节为：先将所述金胶溶液稀释至原浓度的40％-60％，然后通过氢氧化钠溶液调节pH。

8.一种金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器，其特征在于，所述传感器通过权利要求1-7中任意一项所述的方法制备而得。

9.一种权利要求8所述的金纳米粒子可视化检测葡萄糖传感器在葡糖检测中的应用。