CN107796809A - 一种用于指尖血湿法检测的方法及其试剂盒与装置 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生化检测领域，具体涉及一种用于指尖血湿法检测的方法及其试剂盒与装置。本发明所述检测的方法，采用本发明所述方法进行指尖血湿法检测，指尖血样本中的红细胞被第一溶液中的红细胞凝集试剂沉积，使血细胞快速凝结，从而达到血清与红细胞分离，避免因血细胞破裂干扰目标分析物。经第一溶液稀释后的指尖血样本与含有血红蛋白的检测试剂的第二溶液进行第二反应，采用比色法检测血红蛋白浓度，计算获得血细胞压积。根据获得的血细胞压积结果计算目标分析物浓度的校正值，避免因血细胞压积不同造成最终测试结果存在偏差的问题，提供检测结果的准确性。本发明所述用于指尖血湿法检测的装置和试剂盒组成简单，广泛适用于各种目标物的检测。
Description
技术领域
本发明属于生化检测领域，具体涉及一种血液检测的方法，尤其是一种用于指尖血湿法检测的方法及其试剂盒与装置。
背景技术
体外诊断，即IVD(In Vitro Diagnosis)，是指在人体之外，通过对人体样本(血液、体液、组织等)进行检测而获取临床诊断信息，进而判断疾病或机体功能的产品和服务。
体外诊断的检验方法基本可分为湿法与干法，湿法的反应体系是液相，这种方法应用是最广的，如目前的生化仪大部分均采用湿法进行检验。干法的反应体系为固体，如干化学试纸等。目前检验分析中，大部分的分析物为血清中的分析物，因此进行检测前需要进行血细胞与血清的分离。现在临床上，会采集静脉血液后离心，取上清液进行测试。在干法的检测中，可使用血清进行检测，也可使用全血检测，当使用全血时，试纸条上会有过滤层，去掉血细胞。而湿法检测的指标在血清中时，基本不能直接测量全血，都需要进行血细胞血清分离，但这需要的样本量大，基本需要2ml以上，患者不易接受，而且需要离心机等设备。而指尖血采血量少，患者更易接受。但指尖血为全血，且样本量过小很难分离。而且指尖血直接利用湿法检测，会存在两个方面的问题：一是在反应过程中，血细胞破裂，释放出血红蛋白等成分干扰测试；二是不同人的血液，其血细胞压积不同，同样体积的全血，不同血压积下，其血清量不同，最终测试结果会出现较大偏差。因此，目前的湿法检测中几乎不能使用指尖血。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种用于指尖血湿法检测的方法，避免血红蛋白等成分干扰测试以及血细胞压积不同造成的结果偏差，从而使得指尖血可以用于湿法检测。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于指尖血湿法检测的方法，包括以下步骤：
A、取指尖血与第一溶液混合后得第一混合液，立即取第一混合液与第二溶液混合进行第二反应，采用比色法检测血红蛋白浓度，计算血细胞压积，剩余的第一混合液进行第一反应；
B、取第一反应液与第三溶液混合进行第三反应，采用比色法获得目标分析物浓度的检测值，根据血细胞压积计算目标分析物浓度的校正值；
其中，所述第一溶液含有红细胞的凝集试剂；所述第二溶液含有血红蛋白的检测试剂；所述第三溶液含有目标分析物的检测试剂。
本发明所述用于指尖血湿法检测的方法步骤A取指尖血与第一溶液混合形成第一混合溶液，其中的第一溶液含有红细胞的凝集试剂，指尖血样本与其进行反应(第一反应)后，指尖血样本中的红细胞被第一溶液中的红细胞凝集试剂沉积，使血细胞快速凝结，从而达到血清与红细胞分离，避免因血细胞破裂干扰目标分析物。在指尖血与第一溶液混合后，即第一反应前，立即取第一混合液，指尖血样本与第一溶液混合时间较短，仅是被第一溶液稀释，此时取部分第一混合液与第二溶液混合，所述第二溶液含有血红蛋白的检测试剂，稀释后的指尖血样本与含有血红蛋白的检测试剂的第二溶液进行第二反应，采用比色法检测血红蛋白浓度，计算血细胞压积。
在一些实施方案中，所述第一溶液中的红细胞的凝集试剂优选为含植物凝集素或抗红细胞抗体的溶液。
进一步的，在一些具体实施例中，所述第一溶液为含抗红细胞抗体的生理盐水。
作为优选，所述第一反应为静置2-3min。
在一些实施方案中，所述第二溶液中的血红蛋白的检测试剂由高铁氰化钾、磷酸氢二钾和曲拉通组成。
进一步的，在一些具体实施例中，所述第二溶液由高铁氰化钾、50Mm，pH7.0磷酸氢二钾、0.1％曲拉通组成。
作为优选，所述第二反应为静置2min。
作为优选，步骤A所述血细胞压积按下式计算：
HCT＝Hb×3………………………………….公式1
其中，HCT为血细胞压积；Hb为测得的血红蛋白浓度，单位为g/dL；
本发明所述用于指尖血湿法检测的方法步骤B取第一反应液与第三溶液混合。所述第一反应液为分离去除血细胞的血清，所述第三溶液含有目标分析物的检测试剂，所述第一反应液与第三溶液混合后进行第三反应，采用比色法获得目标分析物浓度的检测值。根据步骤A获得的血细胞压积结果计算目标分析物浓度的校正值，避免因血细胞压积不同造成最终测试结果存在偏差的问题。
本发明所述用于指尖血湿法检测的方法是对目标分析物浓度进行检测的过程，不同的目标分析物，各步反应中加入的反应液的体积不同。
其中，本发明所述目标分析物可以为全血的临床生化检测中的任意分析物，包括但不限于血尿酸、甘油三脂、胆固醇、葡萄糖。
在一些实施方案中，所述目标分析物为甘油三脂时，所述第三溶液中的目标分析物的检测试剂由哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、LPL、GK、POD、氯化镁、胆酸钠、ATP、4-氨基安替比林、4-氯酚、亚铁氰化钾和曲拉通组成。
进一步的，在一些具体实施例中，所述目标分析物为甘油三脂时，所述第三溶液中的目标分析物的检测试剂由50mM pH6.8哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、2200U/L LPL、250U/LGK、1000U/L POD、40mM氯化镁、3.5mM胆酸钠、1.5μM ATP、1mM 4-氨基安替比林、3.5mM 4-氯酚、10μM亚铁氰化钾、0.1％曲拉通组成。
在一些实施方案中，目标分析物为葡萄糖时，所述第三溶液中的目标分析物的检测试剂由三乙醇胺盐缓冲液、硫酸镁、ATP、NADP、己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成。
进一步的，在一些具体实施例中，所述目标分析物为葡萄糖时，所述第三溶液中的目标分析物的检测试剂由50mM pH7.5三乙醇胺盐缓冲液、2mM硫酸镁、2mM ATP、2mM NADP、1500U/L己糖激酶、2500U/L葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成。
本发明所述第三反应是对目标分析物浓度进行检测的过程，不同的目标分析物，其反应条件各不相同。在一些实施方案中，目标分析物为甘油三脂时，所述第三反应为静置3min；在一些实施方案中，目标分析物为葡萄糖时，所述第三反应为静置30s。
作为优选，步骤B所述目标分析物浓度的校正值按下式2计算：
其中，Y为目标分析物浓度的校正值；HCT0为建立标准方程时血样本的血细胞压积，为已知参数，可通过其他专业仪器或方法测得，如血红蛋白检测仪，或毛细管离心等方法；V0为建立标准方程时血样本的体积，为已知参数；HCT1为步骤A测得的血细胞压积，由公式1计算得到；V1为指尖血样本的体积；X为目标分析物浓度的检测值。
仪器检测所得到的是原始信号，比如吸光度，吸光度值要转换成浓度值，则需要标准方程来转换。标准方程的建立方法是选取已知浓度的多个样本，利用仪器检测可得到对应的吸光度，将吸光度与浓度进行线性拟合，即可得到标准方程。如X为目标分析物浓度的检测值，是仪器测得原始信号经代入标准方程计算得到的校正前所测得的目标分析物值。本发明所述检测方法中建立标准方程时不用指尖血，一般用静脉血或血清。血清的HCT为0。
本发明还提供了一种用于指尖血湿法检测的装置，包括指尖血样本稀释凝固区、血红蛋白检测区和目标分析物检测区。
指尖血样本稀释凝固区用于盛放含有红细胞凝集的试剂的第一溶液，稀释指尖血样本以及使指尖血样本中血细胞凝固。血红蛋白检测区用于盛放含有血红蛋白的检测试剂的第二溶液，与稀释的指尖血样本反应检测血红蛋白。目标分析物检测区用于盛放含有检测目标分析物对应的检测试剂的第三溶液，与血细胞凝固后的溶液(第一反应液)反应检测血红蛋白。
本领域技术人员可以理解，所述指尖血样本稀释凝固区、血红蛋白检测区和目标分析物检测区的形状不受限制，只要可以盛放溶液用于液体反应即可。所述指尖血样本稀释凝固区、血红蛋白检测区和目标分析物检测区可以连接在一起组成试剂卡，也可以各自独立存在。
进一步的，在一些实施方案中，所述用于指尖血湿法检测的装置，还包括指尖血吸取装置和/或移液装置。
所述指尖血吸取装置用于定量吸取血液，可以为毛细管。所述移液装置用于液体的吸取与移动，如吸取一定量第一混合液加入到血红蛋白检测区的第二溶液中，或吸取第一反应液加入到目标分析物检测区的第三溶液中，可以为移液枪及枪头。移液装置还可用于吸取第一溶液将指尖血吸取装置中的血液冲洗入指尖血样本稀释凝固区。
进一步的，在一些具体实施例中，所述指尖血样本稀释凝固区、血红蛋白检测区和目标分析物检测区连接在一起形成试剂卡，所述指尖血吸取装置和移液装置固定于试剂卡上，卡于指尖血样本稀释凝固区上，形成一个整体装置。
本发明还提供了一种用于指尖血湿法检测的试剂盒，包括红细胞的凝集试剂、血红蛋白的检测试剂和目标分析物的检测试剂。
进一步的，在一些实施方案中，所述用于指尖血湿法检测的试剂盒，还包括上述用于指尖血湿法检测的装置、指尖血吸取装置和/或移液装置。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种用于指尖血湿法检测的方法及其试剂盒与装置。本发明所述用于指尖血湿法检测的方法，包括以下步骤：A、取指尖血与第一溶液混合后得第一混合液，立即取第一混合液与第二溶液混合进行第二反应，采用比色法检测血红蛋白浓度，计算血细胞压积，剩余的第一混合液进行第一反应；B、取第一反应液与第三溶液混合进行第三反应，采用比色法获得目标分析物浓度的检测值，根据血细胞压积计算目标分析物浓度的校正值；其中，所述第一溶液含有红细胞的凝集试剂；所述第二溶液含有血红蛋白的检测试剂；所述第三溶液含有目标分析物的检测试剂。采用本发明所述方法进行指尖血湿法检测，指尖血样本中的红细胞被第一溶液中的红细胞凝集试剂沉积，使血细胞快速凝结，从而达到血清与红细胞分离，避免因血细胞破裂干扰目标分析物。经第一溶液稀释后的指尖血样本与含有血红蛋白的检测试剂的第二溶液进行第二反应，采用比色法检测血红蛋白浓度，计算获得血细胞压积。根据获得的血细胞压积结果计算目标分析物浓度的校正值，避免因血细胞压积不同造成最终测试结果存在偏差的问题，提供检测结果的准确性。本发明所述用于指尖血湿法检测的装置和试剂盒组成简单，广泛适用于各种目标分析物直接利用指尖血的全血进行湿法检测，无需进行血细胞血清分离，而且不受血细胞压积的不同的影响，检测结果偏差小。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示用于指尖血湿法检测的装置的组合图；
图2示用于指尖血湿法检测的装置的爆炸图；其中1为移液装置、2为指尖血吸取装置、3为指尖血样本稀释凝固区、4为血红蛋白检测区、5为目标分析物检测区。
具体实施方式
本发明公开了一种用于指尖血湿法检测的方法及试剂盒与装置。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1：一种用于指尖血湿法检测的装置
如图1和2，所述用于指尖血湿法检测的装置包括指尖血样本稀释凝固区3、血红蛋白检测区4和目标分析物检测区5，所述指尖血样本稀释凝固区3、血红蛋白检测区4和目标分析物检测区5连接在一起，所述指尖血吸取装置2和移液装置1固定于指尖血样本稀释凝固区上，形成一个整体装置。
实施例2、用于指尖血湿法检测的试剂盒：
包括实施例1所述用于指尖血湿法检测的装置、红细胞的凝集试剂、血红蛋白的检测试剂和目标分析物的检测试剂。
实施例3、甘油三脂的检测：
采用实施例2所述试剂盒进行检测，
检测的装置中指尖血样本稀释凝固区3、血红蛋白检测区4和目标分析物检测区5含有对应的试剂，各区域的溶液配方如下：
指尖血样本稀释凝固区3：红细胞凝集试剂为含抗红细胞抗体的生理盐水；
血红蛋白检测区4:血红蛋白的检测试剂由高铁氰化钾、50Mm，pH7.0磷酸氢二钾、0.1％曲拉通组成；
目标分析物检测区5：甘油三酯的检测试剂由哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液(pipis缓冲液)(50mM，pH6.8)，LPL(2200U/L)，GK(250U/L)，POD(1000U/L)，氯化镁(40mM),胆酸钠(3.5mM)，ATP(1.5μM)，4-氨基安替比林(1mM)，4-氯酚(3.5mM)，亚铁氰化钾(10μM)，曲拉通(0.1％)组成。
分别采用三种测试方式进行检测：
将全血液样本配置成不同血细胞压积，配置成30％，40％，45％，50％，60％这5个血细胞压积的样本。方法一取20μL、方法二取10μL进行测试，方法三取5μL血清进行测试。
1)方法一、毛细管吸取20μL全血样本加入指尖血样本稀释凝固区3(含100μL红细胞凝集试剂)，移液枪吸取其中的试剂冲洗毛细管，混合后立即吸取10μL混合液加入血红蛋白检测区4(含500μL血红蛋白的检测试剂)静止反应2min，指尖血样本稀释凝固区3中剩余的混合液静止反应2min后，移液枪吸取60μL上清液加入目标分析物检测区5(含500μL甘油三酯的检测试剂)混合静置3min后检测。
2)方法二、毛细管吸取10μL全血样本直接将全血样本加入目标分析物检测区5(含500μL甘油三酯的检测试剂)混合静置3min后检测。
3)方法三、全血样本静置后取5μL血清，直接将血清样本加入目标分析物检测区5(含500μL甘油三酯的检测试剂)混合静置3min后检测。
比色法检测，其中目标分析物甘油三脂的检测波长为520nm，血红蛋白检测波长540nm。
测试结果如下表1。
表1甘油三脂检测结果
| 样本 | 血细胞压积 | 方法一 | 方法二 | 方法三 |
| 样本1 | 30％ | 388mg/dL | 550mg/dL | 378mg/dL |
| 样本2 | 40％ | 380mg/dL | 450mg/dL | 380mg/dL |
| 样本3 | 45％ | 376mg/dL | 500mg/dL | 376mg/dL |
| 样本4 | 50％ | 382mg/dL | 330mg/dL | 378mg/dL |
| 样本5 | 60％ | 375mg/dL | 620mg/dL | 380mg/dL |
由于是同一个样本，即使血细胞压积不同，但其测试值应该是一致的。如果只测试血清，即方法三所测，其测试值基本一致。但如果直接测全血，本来应该一致的值，出现较大偏差，主要是由于溶血以及血细胞压积不同导致血清量不同而引起的，尤其是溶血的影响大，因为血红蛋白吸收峰与目标分析物吸收峰重叠，因此，严重干扰测试。本发明所使用的方法，测试值与直接测血清一致，不同的血细胞压积，其测试结果基本一致。表明本发明所述方法使得微量指尖血可直接用于湿法检测。
实施例4、葡萄糖的检测：
采用实施例2所述试剂盒进行检测，
检测的装置中指尖血样本稀释凝固区3、血红蛋白检测区4和目标分析物检测区5含有对应的试剂，各区域的溶液配方如下：
指尖血样本稀释凝固区3：红细胞凝集试剂为含抗红细胞抗体的生理盐水；
血红蛋白检测区4:血红蛋白的检测试剂由高铁氰化钾、50Mm，pH7.0磷酸氢二钾、0.1％曲拉通组成；
目标分析物检测区5：葡萄糖的检测试剂由三乙醇胺盐缓冲液(50mM，pH7.5)、硫酸镁(2mM)、ATP(2mM)、NADP(2mM)、己糖激酶(1500U/L)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(2500U/L)组成。
分别采用三种测试方式进行检测：
将全血液样本配置成不同血细胞压积，配置成30％，40％，45％，50％，60％这5个血细胞压积的样本。方法一取20μL、方法二取10μL进行测试，方法三取5μL血清进行测试。
1)方法一、毛细管吸取20μL全血样本加入指尖血样本稀释凝固区3(含100μL红细胞凝集试剂)，移液枪吸取其中的试剂冲洗毛细管，混合后立即吸取10μL混合液加入血红蛋白检测区4(含500μL血红蛋白的检测试剂)静止反应3min，指尖血样本稀释凝固区3中剩余的混合液静止反应2min后，移液枪吸取60μL上清液加入目标分析物检测区5(含500μL甘油三酯的检测试剂)混合静置30s后检测。
2)方法二、毛细管吸取10μL全血样本直接将全血样本加入目标分析物检测区5(含500μL甘油三酯的检测试剂)混合静置30s后检测。
3)方法三、全血样本静置后取5μL血清，直接将血清样本加入目标分析物检测区5(含500μL甘油三酯的检测试剂)混合静置30s后检测。
比色法检测，其中目标分析物葡萄糖检测波长为340nm，且检测时采用速率法，而血红蛋白检测波长540nm。血红蛋白对目标分析物检测不干扰。
测试结果如下表2。
表2葡萄糖检测结果
| 样本 | 血细胞压积 | 方法一 | 方法二 | 方法三 |
| 样本1 | 30％ | 85mg/dL | 124mg/dL | 87mg/dL |
| 样本2 | 40％ | 87mg/dL | 105mg/dL | 87mg/dL |
| 样本3 | 45％ | 86mg/dL | 97mg/dL | 86mg/dL |
| 样本4 | 50％ | 88mg/dL | 87mg/dL | 88mg/dL |
| 样本5 | 60％ | 86mg/dL | 70mg/dL | 87mg/dL |
由于目标分析物的检测方法为速率法，且波长为340nm，因此溶血对检测干扰不大。测试结果表明本发明的方法测试全血的结果与直接利用血清进行检测的结果基本一致，但方法二，同一样本不同血细胞压积的测试结果偏差大，且有一定规律，主要原因是血细胞压积不同时，血清量不一样，未进行校正，因此血细胞压积越小，则血清越多，测试值越高。
Claims (10)
1.一种用于指尖血湿法检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、取指尖血与第一溶液混合后得第一混合液，取第一混合液与第二溶液混合进行第一反应，采用比色法检测血红蛋白浓度，计算血细胞压积，剩余的第一混合液进行第一反应；
B、取第一反应液与第三溶液混合进行第三反应，采用比色法获得目标分析物浓度的检测值，根据血细胞压积计算目标分析物浓度的校正值；
其中，所述第一溶液含有红细胞的凝集试剂；所述第二溶液含有血红蛋白的检测试剂；所述第三溶液含有目标分析物的检测试剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红细胞的凝集试剂为含植物凝集素或抗红细胞抗体的溶液；所述血红蛋白的检测试剂由高铁氰化钾、磷酸氢二钾和曲拉通组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标分析物为血尿酸、甘油三脂、胆固醇、葡萄糖。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，目标分析物为甘油三脂时，目标分析物的检测试剂由哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、LPL、GK、POD、氯化镁、胆酸钠、ATP、4-氨基安替比林、4-氯酚、亚铁氰化钾和曲拉通组成；目标分析物为葡萄糖时，目标分析物的检测试剂由三乙醇胺盐缓冲液、硫酸镁、ATP、NADP、己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一反应为静置2-3min；所述第二反应为静置2min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A所述血细胞压积按下式计算：
HCT＝Hb×3………………………………….公式1
其中，HCT为血细胞压积；Hb为测得的血红蛋白浓度，单位为g/dL；
步骤B所述目标分析物浓度的校正值按下式计算：
其中，Y为目标分析物浓度的校正值，HCT0为建立标准方程时血样本的血细胞压积，V0为建立标准方程时血样本的体积，HCT1为步骤A测得的血细胞压积，V1为指尖血样本的体积；X为目标分析物浓度的检测值。
7.一种用于指尖血湿法检测的装置，其特征在于，包括指尖血样本稀释凝固区(3)、血红蛋白检测区(4)和目标分析物检测区(5)。
8.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，还包括指尖血吸取装置2和/或移液装置1。
9.一种用于指尖血湿法检测的试剂盒，其特征在于，包括红细胞的凝集试剂、血红蛋白的检测试剂和目标分析物的检测试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括权利要求7或8所述的装置、指尖血吸取装置和/或移液装置。
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