CN107760636A

CN107760636A - 以低品质碳源苯酚为电子供体的反硝化菌株及其应用

Info

Publication number: CN107760636A
Application number: CN201711249248.1A
Authority: CN
Inventors: 沈锦优; 王静; 江心白; 王连军; 马方平; 邱伟; 雷波; 梁骥; 孙秀云; 李健生; 刘晓东; 韩卫清
Original assignee: CHUANNAN MACHINERY WORKS OF CASC; Nanjing University of Science and Technology
Current assignee: Nanjing University of Science and Technology; Sichuan Aerospace Chuannan Initiating Explosive Technology Ltd
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2018-03-06
Anticipated expiration: 2037-12-01
Also published as: CN107760636B

Abstract

本发明公开了一株以低品质碳源苯酚为电子供体的反硝化菌株及其应用。本发明以反硝化活性污泥为菌源，以苯酚为唯一碳源、硝酸钠为唯一氮源的无机盐培养基作为筛选培养基，采用划线方法进行分离纯化，得到了一株以低品质碳源苯酚为电子供体的反硝化菌，经分子生物学鉴定为Enterobacter，命名为Enterobacter sp.NJUST15，保藏编号为CCTCC NO：M:2017557。本发明的反硝化菌可以苯酚为唯一电子供体进行缺氧反硝化脱氮反应，同步实现苯酚的矿化降解。将Enterobacter sp.NJUST15接种至预处理后的焦化废水中，硝酸根离子和苯酚分别在72h和120h内实现完全去除。Enterobacter sp.NJUST15具有高效的有机物降解能力和反硝化能力，对苯酚的生物毒性具有很好的耐受性能，适用于高浓度硝态氮废水的缺氧反硝化脱氮和低品质碳源的去除处理。

Description

以低品质碳源苯酚为电子供体的反硝化菌株及其应用

技术领域

本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一株以低品质碳源苯酚为电子供体的反硝化菌株及其应用。

背景技术

硝酸盐氮的存在会引起水体的富营养化，为藻类的生长繁殖提供有利条件，引起严重的环境污染和生态破坏。当前废水中硝酸盐氮的去除主要依赖生物反硝化工艺，反硝化反应也称为脱氮反应，其电子供体为易降解碳源，往往需要外加，引起较高的碳源投加成本。然而，工业废水中经常含有较高浓度的难降解污染物，例如焦化废水中含有苯酚、吡啶、呋喃等难降解芳香族化合物和杂环化合物，同时含有较高浓度的硝酸盐氮。如果能利用这些低品质碳源如苯酚等难降解污染物作为电子供体进行反硝化脱氮，将可以有效降低外加碳源成本。

然而，大部分反硝化微生物主要以葡萄糖、甲醇、乙酸等易降解有机物作为电子供体，苯酚等低品质碳源难以利用，因此筛选可以苯酚等低品质碳源作为电子供体的反硝化菌株，在含高浓度苯酚等低品质碳源及硝态氮废水处理中具有良好的应用前景。

苯酚作为一种重要的化工原料，广泛应用于杀菌剂、防腐剂以及药物等化学品的合成，是炼焦、印染、制药、石油化工等工业废水中常见的污染物，具有高毒性、致癌性及难生物降解特性，是废水处理领域广泛关注的难降解污染物。

目前，含苯酚废水的处理方法包括电化学法、光催化法等高级氧化法、吸附法、生物处理法等。其中，高级氧化和吸附等物理化学方法处理含苯酚废水成本较高，二次污染严重。生物处理技术具有低成本、二次污染小等诸多优点，由于苯酚的难降解特性，苯酚污染生物处理的前提是获得能够耐受苯酚生物毒性并能实现苯酚矿化降解的特殊菌株。但是现有的可降解苯酚的菌株，不仅降解周期较长、降解效率不高，还需在耗氧条件下培养。在实际应用中大大增加了耗电曝气等工艺运行成本。如能获得可以苯酚为电子供体、硝态氮为电子受体的高效菌株，在缺氧反硝化脱氮的同时实现苯酚的降解，将对含苯酚和硝态氮的工业废水的低成本和无害化处理产生重要意义(Wang Yujing et al.2011.In situdegradation of phenol and promotion of plant growth in contaminatedenvironments by a single Pseudomonas aeruginosa strain.Journal of HazardousMaterials.192,354-360；Sun Jiquan et al.2012.Simultaneous degradation ofphenol and n-hexadecane by Acinetobacter strains.Bioresource Technology.123,664-668；Acikgoz Eda et al.2016.Phenol biodegradation by halophilicarchaea.International Biodeterioration&Biodegradation.107,140-146.)

发明内容

本发明的目的在于提供一株以低品质碳源苯酚为电子供体的反硝化菌株，该菌株为首株可以利用低品质碳源苯酚进行反硝化脱氮的Enterobacte菌株。

发明人从用于反硝化脱氮的污泥为菌源，利用以低品质碳源苯酚为唯一碳源、硝酸钠为唯一氮源的筛选培养基，进行菌株的纯化和分离，得到了一株可以利用低品质碳源苯酚为电子供体的反硝化脱氮菌株，经分子生物学鉴定为Enterobacter，命名为Enterobacter sp.NJUST15，GenBank登录号为MF993052。该菌株已于2017年09月27日在中国典型物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2017557。

本发明还提供上述反硝化菌株的培养方法，具体步骤为：将反硝化菌株Enterobacter sp.NJUST15接种在含有苯酚和硝酸钠的无机盐培养基中，培养基pH为6.5-7.5，培养温度为30～35℃。

优选地，所述的含有苯酚和硝酸钠的无机盐培养基中，苯酚浓度为98.9～102.4mgL^-1，硝酸钠浓度为128.3-132.4mg L^-1。

本发明还提供上述反硝化菌株Enterobacter sp.NJUST15在同时含有硝态氮和苯酚的废水处理中的应用。

上述反硝化菌株Enterobacter sp.NJUST15在同时含有硝态氮和苯酚的废水处理中的应用，具体方法为：将Enterobacter sp.NJUST15种子液接种到同时含有硝态氮及苯酚的废水中，厌氧培养，培养温度为30℃～35℃，培养pH为6.5-7.5。

优选地，所述的反硝化菌株Enterobacter sp.NJUST15种子液的接种量为5％～10％。

本发明所提供的Enterobacter sp.NJUST15，在缺氧条件下，可以利用苯酚为唯一电子供体，硝态氮为唯一电子受体进行代谢和生长，同时具有高效的苯酚降解能力和反硝化脱氮能力。相比于耗氧条件，反硝化菌Enterobacter sp.NJUST15对生存环境的适应能力和耐受能力更强，应用于焦化废水的工艺处理中可减少耗氧曝气工段，节约经济成本。在经预处理后实际含有硝态氮和苯酚的焦化废水中加入Enterobacter sp.NJUST15进行处理，硝态氮和苯酚分别可以在72小时和120小时内实现完全去除。

附图说明

图1是反硝化菌株Enterobacter sp.NJUST15的扫描电镜图。

图2是反硝化菌株Enterobacter sp.NJUST15在硝态氮初始浓度为128.3-132.4mgL^-1、苯酚初始浓度为98.9-102.4mg L^-1的液体培养基中的脱氮效果和对苯酚的降解效果。

图3是反硝化菌株Enterobacter sp.NJUST15在实际含硝态氮及苯酚的焦化废水中的脱氮效果及对苯酚的降解效果。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步描述，使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

Enterobacter sp.NJUST15的筛选分离及鉴定。

(1)菌株的筛选及分离

从现有的用于反硝化脱氮的活性污泥中取样5g，加入到100mL生理盐水中搅拌均匀后静置两个小时。取1mL上清液加入到121℃高温灭菌后的无机盐培养基中，180转/分钟摇床富集培养三天，连续三次富集后，取培养液用无菌水梯度稀释至10^-4-10^-10倍。制备无机盐琼脂固体培养基，将稀释后的培养液20μL分别涂布于无机盐琼脂固体培养基上，置于生化培养箱中30℃培养三天。挑选培养皿上具有明显差异的单菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化培养，连续纯化五次后，得到单一菌株，进行斜面保存。配制含有硝态氮及苯酚的无机盐液体培养基装入血清瓶中，用纯氮气进行曝气以去除溶解氧，接种分离纯化得到的菌株，在恒温震荡培养箱中180转/分钟和35℃的条件厌氧培养，监测硝态氮及苯酚的浓度变化。选取能有效去除培养基中硝态氮和苯酚的菌株，命名为NJUST15，将其进行斜面保存和-80℃低温保存。

LB培养基的组成如下：胰蛋白胨(10g L^-1)，酵母提取物(5g L^-1)，氯化钠(10g L^-1)。

无机盐培养基的组成如下：NaHPO₄·12H₂O(1.53g L^-1),KH₂PO₄(0.38g L^-1),MgSO₄(0.1g L^-1),CaCl₂(0.05g L^-1),微量元素溶液SL-4(10mL)。微量元素SL-4组成：EDTA(0.5gL^-1)，FeSO₄·7H₂O(0.2g L^-1)，微量元素SL-6(100mL L^-1)。微量元素SL-6组成：ZnSO₄·7H₂O(0.01g L^-1)，MnCl₂·4H₂O(0.03g L^-1)，H₃BO₄(0.3g L^-1)，CoCl₂·6H₂O(0.2g L^-1)，CuCl₂·2H₂O(0.01g L^-1)，NiCl₂·6H₂O(0.02g L^-1)，Na₂MoO₄·2H₂O(0.03g L^-1)，苯酚和硝酸钠的量根据实验需要投加。

在液体培养基的基础上加入2g/L的琼脂，在灭菌锅内121度高压灭菌20分钟后，倒入无菌培养皿中冷却至室温后获得无机盐琼脂固体培养基。

(2)菌株的鉴定

对菌株进行形态学、生理生化测试。测定菌株的16S rRNA基因序列，将菌株的16SrRNA基因序列与GenBank数据库中的基因序列进行同源性比较并分析结果，从分子生物学水平上确定该菌的种属。

①形态学特征：NJUST15菌落成乳白色，表面光滑透明，边缘整齐，有光泽，在液体培养基中程扩散性混浊。该菌株细胞呈杆状，尺寸为0.3-0.4μm×1.2-1.6μm。图1为细菌NJUST15的扫描电镜照片。

②生理生化特征：革兰氏阴性，非发酵型细菌。

③分子生物学鉴定：以NJUST15菌株的核DNA为模板，以细菌扩增的通用引物进行PCR扩增，测定菌株NJUST15的基因序列。将菌株的16S rRNA基因序列提交到GenBank数据库(GenBank登录号为MF993052)进行同源性比较，结果表明，NJUST15与Enterobactersp.CZBSA2的序列相似度达96％以上。

根据NJUST15的形态学、生理生化测试以及分子生物学分析，NJUST15鉴定为Enterobacter sp.，命名为Enterobacter sp.NJUST15。

实施例2

Enterobacter sp.NJUST15菌株的反硝化脱氮及对苯酚的降解性能。

将Enterobacter sp.NJUST15接种至含有100mg L^-1苯酚的LB培养基中，35℃条件下180转/分钟摇床培养，进行NJUST15菌株富集，待菌株进入对数生长期后(约48小时)，将所得菌液用离心机离心10分钟(6000转/分钟)，得到沉积菌体，用灭菌后的无机盐液体培养基重悬，离心，重复洗涤三次，将菌体重悬于无菌液体无机盐培养基中，得到种子液(控制OD₆₀₀约为1.5)。

配制含有128.3-132.4mg L^-1硝态氮和98.9-102.4mg L^-1苯酚的无机盐液体培养基作为模拟废水，将上述种子液加入到经过曝氮气除氧的模拟硝态氮和苯酚的废水中，接种量为5％，35℃、180转/分钟的条件下厌氧培养，监测废水中硝态氮及苯酚的浓度变化。设立未接种NJUST15的空白对照。实验结果如图2所示。结果显示，128.3-132.4mg L^-1硝态氮在72小时内实现完全脱氮，98.9-102.4mg L^-1苯酚在192小时内被完全降解。而在未接种NJUST15的空白对照中，硝态氮和苯酚没有明显的变化。

实施例3

Enterobacter sp.NJUST15在实际含硝态氮及苯酚的焦化废水中的脱氮效果及对苯酚的降解效果。

将Enterobacter sp.NJUST15种子液以5％接种量接入经预处理后同时含硝态氮和苯酚的实际焦化废水(含硝态氮73.2-84.5mg L^-1，苯酚47.3-52.7mg L^-1)中，在35℃、180转/分钟的条件下厌氧培养。监测废水处理前后硝态氮和苯酚的浓度变化。

如图3所示，经预处理后实际同时含硝态氮和苯酚的焦化废水中接种Enterobacter sp.NJUST15菌株，经72小时左右的处理后，硝态氮去除率为100％，120小时后苯酚被完全去除。

本实施例说明分离得到的Enterobacter sp.NJUST15可成功应用于同时含有硝态氮和苯酚的工业废水的生化处理，实现废水中氮和苯酚的高效去除。

序列表

<110> 南京理工大学

中国航天科技集团公司川南机械厂

<120> 以低品质碳源苯酚为电子供体的反硝化菌株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1305

<212> DNA

<213> 肠杆菌(Enterobacter)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1305)

<223> 16S rDNA

<400> 1

tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgtgacattc tgattcacga 60

ttactagcga ttccgacttc atggagtcga gttgcagact ccaatccgga ctacgacgca 120

ctttatgagg tccgctagct ctcgcgagat tgcttctctt tgtatgcgcc attgtagcac 180

gtgtgtagcc ctggtcgtaa gggccatgat gacttgacgt catccccacc ttcctccagt 240

ttatcactgg cagtctcctt tgagttcccg gcctaaccgc tggcaacaaa ggataagggt 300

tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatt tcacaacacg agctgacgac agccatgcag 360

cacctgtctc acagttcccg aaggcaccaa tccatctctg gaaagttctg tggatgtcaa 420

gaccaggtaa ggttcttcgc gttgcatcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 480

gcccccgtca attcatttga gttttaacct tgcggccgta ctccccaggc ggtcgactta 540

acgcgttagc tccggaagcc acgcctcaag ggcacaacct ccaagtcgac atcgtttacg 600

gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcac ctgagcgtca 660

gtcttcgtcc agggggccgc cttcgccacc ggtattcctc cagatctcta cgcatttcac 720

cgctacacct ggaattctac ccccctctac gagactcaag cctgccagtt tcggatgcag 780

ttcccaggtt gagcccgggg atttcacatc cgacttgaca gaccgcctgc gtgcgcttta 840

cgcccagtaa ttccgattaa cgcttgcacc ctccgtatta ccgcggctgc tggcacggag 900

ttagccggtg cttcttctgc gggtaacgtc aatcgacgcg gttattaacc gcatcgcctt 960

cctccccgct gaaagtactt tacaacccga aggccttctt catacacgcg gcatggctgc 1020

atcaggcttg cgcccattgt gcaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg agtctggacc 1080

gtgtctcagt tccagtgtgg ctggtcatcc tctcagacca gctagggatc gtcgcctagg 1140

tgagccgtta ccccacctac tagctaatcc catctgggca catctgatgg caagaggccc 1200

gaaggtcccc ctctttggtc ttgcgacgtt atgcggtatt agctaccgtt tccagtagtt 1260

atccccctcc atcaggcagt ttcccagaca ttactcaccc gtccg 1305

Claims

1.以低品质碳源苯酚为电子供体的反硝化菌株，为Enterobacter sp.NJUST15，保藏编号为CCTCC NO：M 2017557。

2.根据权利要求1所述的反硝化菌株的培养方法，其特征在于，具体步骤为：将反硝化菌株Enterobacter sp.NJUST15接种在含有苯酚和硝酸钠的无机盐培养基中，培养基pH为6.5-7.5，培养温度为30～35℃。

3.根据权利要求2所述的反硝化菌株的培养方法，其特征在于，所述的含有苯酚和硝酸钠的无机盐培养基中，苯酚浓度为98.9～102.4mg L^-1，硝酸钠浓度为128.3-132.4mgL^-1。

4.根据权利要求1所述的反硝化菌株在含有硝态氮和苯酚的废水处理中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体方法为：将Enterobacter sp.NJUST15种子液接种到同时含有硝态氮及苯酚的废水中，厌氧培养，培养温度为30℃～35℃，培养pH为6.5-7.5。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的反硝化菌株Enterobactersp.NJUST15种子液的接种量为5％～10％。